CN112439001A - 一种从空心莲子草中提取黄酮类化合物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从空心莲子草中提取黄酮类化合物的方法，具体涉及天然产物生物分离领域，该方法包括空心莲子草的采集和清洗、压榨、榨汁除杂、浓缩、醇浸提、醇提液除醇、催化水解、浓缩结晶等步骤，还可以包括压榨后水洗、低温气爆、萃取等步骤，催化水解还可以采用相应的生物酶。采用该方法能够从空心莲子草新鲜植株中提取纯度较高黄酮类物质。既消除空心莲子草对自然环境的危害，又能得到具有抗肿瘤活性、抗病毒、抑菌和抗氧化等能力的黄酮类物质，克服了现有技术中只能从干燥植株中提取黄酮类物质和黄酮苷类物质的混合物，黄酮类物质纯度不高、品质不高的缺陷，一举两得。

Description

一种从空心莲子草中提取黄酮类化合物的方法
技术领域
本发明涉及天然产物生物分离领域，更具体地说，本发明涉及一种从空心莲子草中提取黄酮类化合物的方法。
背景技术
空心莲子草为苋科莲子草属多年生宿根草本植物，又名空心苋、喜旱莲子草、水花生等。原产于巴西，中国引种后，变为野生，广泛生长于池沼、水沟内。繁殖能力强，可成为亚热带、温带某一区域优势植物，并危害区域的生物多样性，已被生态环保部列为中国外来入侵物种初步名单。
空心莲子草可以以全草入药，具有抗病毒、抗菌、保肝等作用。其中含有浓度较高的黄酮类物质及其糖苷衍生物。研究表明，其具有较强的抗病毒作用，例如能够抗呼吸道合胞病毒、乙型肝炎病毒、流感病毒、汉坦病毒和疱疹病毒等，还具有抗癌、抑菌、抗氧化作用等。
目前，从空心莲子草中提取黄酮类物质的方法为将空心莲子草干草放入一定量的乙醇等极性溶剂中，保持一定温度下回流提取。其具有以下不足：以干草为原料，鲜草则不适用该方法；提取周期长，往往需要耗费数十小时的时间；提取的黄酮类物质包括黄酮及其糖苷类衍生物，纯度较低，品质的稳定性难以保证。
因此，需要开发一种可以从鲜草植株中提取黄酮类物质，提取周期短，能够获得较为纯净的黄酮类物质。
在所述背景技术部分公开的上述信息仅用于加强对本公开的背景的理解，因此它可以包括不构成对本领域普通技术人员已知的现有技术的信息。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种从空心莲子草中提取黄酮类化合物的方法，该方法直接从空心莲子草新鲜植株中提取黄酮类化合物及其糖苷衍生物，然后将其糖苷衍生物经过催化水解得到相应的黄酮类化合物，可以得到纯度较高的黄酮类化合物。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种从空心莲子草中提取黄酮类化合物的方法，该方法包括以下步骤：
步骤1)空心莲子草的采集和清洗：从自然保护区中采集新鲜空心莲子草植株，用水洗去泥沙等杂质，去除表面水；
步骤2)压榨：将步骤1)得到的清洗后的新鲜空心莲子草植株放入压榨装置中进行压榨，得到榨汁和固体渣；
步骤3)榨汁除杂：将步骤2)得到的榨汁进行微滤过滤，得到榨汁滤液，再用石油醚萃取法去除榨汁滤液中的叶绿素杂质，再用醇沉法去除榨汁滤液中的多糖等杂质，得到净化后的榨汁滤液；
步骤4)榨汁浓缩：将步骤3)得到的净化后的榨汁滤液泵入旋转蒸发装置中，去除其中的醇和多余的水，得到榨汁浓缩液；
步骤5)醇浸提：将步骤2)得到的固体渣投入到80％～90％的乙醇溶液中，进行醇浸提，得到醇提液；
步骤6)醇提液除醇：将步骤5)得到的醇提液加入等体积的去离子水，然后泵入旋转蒸发装置中，去除其中的乙醇，得到醇提物溶液；
步骤7)催化水解：将步骤4)的榨汁浓缩液和步骤6)的得到醇提物溶液合并，在其中加入固体酸，使其中的黄酮苷类物质水解为黄酮类物质，得到催化水解液；
步骤8)浓缩结晶：将步骤7)得到的催化水解液放置于旋转蒸发装置中，减压浓缩，使其中的黄酮类物质结晶出来，固液分离后得到黄酮类物质。
所述步骤2)压榨装置包括市售的对辊压榨机，压榨辊直径10～20cm，辊间压力为30～60N/cm，压榨温度为12～23℃。将新鲜空心莲子草进行压榨处理，将其中的大部分水分与植株分离，可以实现从新鲜空心莲子草植株中提取黄酮类物质，省略了植株干燥步骤，节省干燥能耗；且省略水浸提步骤后仍然能够实现水浸提的效果，将其中水溶性的黄酮苷类物质提取出来，节省了水浸提的水耗和能量消耗；还能够最大限度的破坏空心莲子草植株各个组织的结构，有利于后续提取步骤浸提速度的加快。
优选地，压榨步骤在惰性气体保护下进行。例如将压榨装置设置在封闭空间内，所述封闭空间内充满惰性气体(如氮气)，并使封闭空间保持微正压，防止外界空气中氧气进入所述封闭空间，所述微正压是指气体压力比大气压力大1000Pa至2000Pa。进一步优选地，新鲜空心莲子草植株进入压榨装置所在的封闭空间前，使用惰性气体对其进行吹扫，以减少空气中氧气进入封闭空间的可能性。
在惰性气体保护下进行压榨，能够大幅减少黄酮类物质中羟基的氧化反应，保持其抗氧化能力维持较高水平，有利于提高黄酮类物质品质的提高。
进一步优选地，压榨后还可以增加水洗步骤，将残留在植株间隙中的榨汁洗出，提高收率。水洗的固液比为1:3～1:7，温度16～28℃，水洗浸泡时间20～50min，完成后用100～200目尼龙滤布过滤，挤压除去固体间隙中的水。
所述步骤3)微滤操作采用0.45微米孔径的醋酸纤维素微滤膜，采用石油醚萃取叶绿素的油水相比1:3～2:3，温度20～32℃，搅拌转速100～300转/min，萃取时间40～60min，采用醇沉法除多糖的乙醇质量百分数浓度为76％～79％，10～20转/min，搅拌8～10min，然后过滤去除沉淀。
所述步骤4)榨汁浓缩操作分为三个阶段，第一阶段：真空度-50～-63kPa，温度45～56℃，时间1～1.5h；第二阶段：真空度-70～-79kPa，温度53～64℃，时间1.6～2.1h；第三阶段：真空度-78～-92kPa，温度74～87℃。将其中的乙醇去除到质量百分数1.3％以下；浓缩至步骤2)得到的榨汁体积的0.1～0.2倍。第一阶段的主要作用是将醇沉步骤加入的乙醇蒸出；第二阶段的主要作用是将部分乙醇和水以醇水共沸物的形式蒸出；第三阶段的主要作用是将多余的水蒸出。
所述步骤5)醇浸提的固液比1:7～1:16，温度70～82℃，时间24～48h。
进一步优选地，步骤5)前还可以增加低温汽爆预处理步骤，将步骤2)得到的固体渣放入密闭金属承压容器中，缓慢通入压缩氮气(目的是降低黄酮类物质被氧化的程度)，使容器中的气体压力达到2.0MPa以上，升压时间大于60s(目的是防止温度过高)，压力维持90s以上(目的是确保高压气体能够渗透到空心莲子草细胞内)，温度维持在60～80℃(目的是为气压瞬间降低时为细胞内水分气化提供足够的能量)，在0.1s内将容器中气压降至101kPa(作用是破坏细胞完整结构，加快醇浸提速度)。上述过程循环7次以上。
所述步骤6)除醇的真空度-56～-68kPa，温度48～59℃，将其中的乙醇去除到质量百分数0.9％以下。
所述步骤7)固体酸包括H型大孔强酸性阳离子交换树脂，所述H型大孔强酸性阳离子交换树脂包括牌号为D001的树脂。
所述将大孔强酸性阳离子交换树脂转化为H型的条件为：将按照现有技术的方法预处理完全的树脂浸入硫酸浓度为1.5～2.0mol/L、硫酸锌浓度为0.001～0.002mol/L的转型溶液中，溶液的体积为树脂体积的2～4倍，搅拌转速20～30转/min，浸泡时间为3～5h，然后使用去离子水冲洗至中性，循环3次以上，保证树脂被充分转化为H型。
发明人发现，在转型溶液中加入微量硫酸锌可以加快黄酮苷类物质被固体酸催化转化的速率。
所述步骤7)固体酸的添加量为待催化液体质量的10％～24％，温度80～86℃，搅拌转速28～33转/min，催化时间4～8h。
进一步优选地，所述步骤7)催化水解的催化剂还可以包括糖苷酶。采用生物酶将黄酮苷类物质水解为黄酮类物质和糖的条件为：葡萄糖苷酶：鼠李糖苷酶＝2:1～3:1；总酶加入量为液体质量的1％～2％，pH为4.8～5.3，温度56～63℃，酶水解时间10～16h。所述生物酶为市售的商品酶。
所述步骤8)减压浓缩的真空度为-81～-93kPa，蒸发温度为72～83℃，浓缩倍数为8～19倍。
进一步优选地，所述步骤7)之后还可以增加萃取步骤，将催化水解产生的黄酮类物质萃取出来。所述萃取剂为乙醇和乙酸乙酯的混合物，乙醇和乙酸乙酯的质量比为1:9～1:12，萃取温度为12～15℃，萃取时间3.4～6.1h。静置分相，然后将萃取液中的萃取剂蒸出，得到黄酮类物质粉末。
本发明的技术效果和优点：
采用本发明的从空心莲子草中提取黄酮类化合物方法的有益效果是：以新鲜空心莲子草为原料，提取其中具有生物活性的黄酮类物质，既消除空心莲子草对植物生态环境的危害，又能得到具有抗肿瘤活性、抗病毒、抑菌和抗氧化等能力的黄酮类物质，克服了现有技术中只能从干燥植株中提取黄酮类物质和黄酮苷类物质的混合物，黄酮类物质纯度不高、品质不高的缺陷，一举两得。
附图说明
图1为本发明的从空心莲子草中提取黄酮类化合物的方法的流程示意图；
图2为本发明的从空心莲子草中提取黄酮类化合物的方法的一个实施例流程示意图。
具体实施方式
为了进一步了解本发明，下面结合实施例对本发明的技术方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限定。
实施例1-6
采用如下方法从空心莲子草中提取黄酮类化合物：
步骤1)空心莲子草的采集和清洗：从自然保护区中采集新鲜空心莲子草植株，用水洗去泥沙等杂质，去除表面水；
步骤2)压榨：将步骤1)得到的清洗后的新鲜空心莲子草植株放入压榨装置中进行压榨，得到榨汁和固体渣，所述步骤2)压榨装置包括市售的对辊压榨机，压榨辊直经、辊间压力和压榨温度等参数如表1所示；
步骤3)榨汁除杂：将步骤2)得到的榨汁进行微滤过滤，得到榨汁滤液，再用石油醚萃取法去除榨汁滤液中的叶绿素杂质，再用醇沉法去除榨汁滤液中的多糖等杂质，得到净化后的榨汁滤液，微滤膜孔径、萃取油水比、萃取温度、搅拌速度，萃取时间、醇沉的乙醇浓度、转速、搅拌时间等参数如表1和表2所示；
步骤4)榨汁浓缩：将步骤3)得到的净化后的榨汁滤液泵入旋转蒸发装置中，去除其中的醇和多余的水，得到榨汁浓缩液，所述步骤4)榨汁浓缩操作分为三个阶段，三个阶段的真空度、温度和时间等参数如表3和表4所示；
步骤5)醇浸提：将步骤2)得到的固体渣投入到80％～90％的乙醇溶液中，进行醇浸提，得到醇提液，醇提固液比、温度和时间等参数如表5所示；
步骤6)醇提液除醇：将步骤5)得到的醇提液加入等体积的去离子水，然后泵入旋转蒸发装置中，去除其中的乙醇，得到醇提物溶液，除醇真空度、温度和除醇效果等参数如表6所示；
步骤7)催化水解：将步骤4)的榨汁浓缩液和步骤6)的得到醇提物溶液合并，在其中加入固体酸，使其中的黄酮苷类物质水解为黄酮类物质，得到催化水解液，固体酸种类、转型液的硫酸浓度、硫酸锌浓度、转型液体积、搅拌转速、时间等参数如表7所示；
步骤8)浓缩结晶：将步骤7)得到的催化水解液放置于旋转蒸发装置中，减压浓缩，使其中的黄酮类物质结晶出来，固液分离后得到黄酮类物质，减压浓缩的真空度、温度和浓缩倍数等参数如表8所示。
表1本发明的实施例中提取黄酮类化合物方法的主要操作参数(一)
Figure BDA0002851193300000071
表2本发明的实施例中提取黄酮类化合物方法的主要操作参数(二)
Figure BDA0002851193300000072
表3本发明的实施例中提取黄酮类化合物方法的主要操作参数(三)
Figure BDA0002851193300000073
Figure BDA0002851193300000081
表4本发明的实施例中提取黄酮类化合物方法的主要操作参数(四)
Figure BDA0002851193300000082
表5本发明的实施例中提取黄酮类化合物方法的主要操作参数(五)
Figure BDA0002851193300000083
Figure BDA0002851193300000091
表6本发明的实施例中提取黄酮类化合物方法的主要操作参数(六)
实施例序号 除醇真空度(kPa) 温度(℃) 除醇后浓度(％)
1 -56～-58 50 0.9％
2 -59～-62 59 0.8％
3 -63～-65 56 0.7％
4 -64～-66 48 0.78％
5 -65～-67 52 0.84％
6 -66～-68 54 0.72％
表7本发明的实施例中提取黄酮类化合物方法的主要操作参数(七)
Figure BDA0002851193300000092
表8本发明的实施例中提取黄酮类化合物方法的主要操作参数(八)
Figure BDA0002851193300000093
Figure BDA0002851193300000101
采用上述实施例的方法，得到空心莲子草的黄酮类化合物，黄酮类化合物的收率、纯度及其中黄酮苷类化合物的含量等参数如表9所示，黄酮类化合物的收率以空心莲子草中含有的所有黄酮类化合物为基准。
表9本发明的各实施例取得的技术效果(一)
Figure BDA0002851193300000102
实施例7-8
实施例7-8中采用的基础操作参数与实施例5相同。
实施例7-8在步骤2)压榨步骤在惰性气体氮气保护下进行，压榨装置设置在封闭空间内，所述封闭空间内充满惰性气体，并使封闭空间保持微正压，防止外界空气中氧气进入所述封闭空间。
实施例7的封闭空间内的气体压力比大气压力大1000Pa。因为减少了黄酮类化合物被氧化的程度，所以提取得到的黄酮类化合物的纯度达到88.7％，比实施例5的结果提高5.3个百分点。
实施例8的新鲜空心莲子草植株进入压榨装置所在的封闭空间前，使用惰性气体对其进行吹扫，封闭空间内的气体压力比大气压力大2000Pa。因为进一步减少了黄酮类化合物被氧化的程度，提取得到的黄酮类化合物的纯度达到91.5％，比实施例5的结果提高8.1个百分点。
实施例8-9
实施例8-9中采用的基础操作参数与实施例3相同。
实施例8-9的步骤2)后增加水洗步骤，将残留在植株间隙中的榨汁洗出，提高收率。
实施例8的水洗的固液比为1:3，温度28℃，水洗浸泡时间20min，完成后用200目尼龙滤布过滤，挤压除去固体间隙中的水。因为回收植株间隙中水溶性的黄酮苷类物质，所以提取的黄酮类化合物的收率达到81.1％，比实施例3的结果提高6.2个百分点。
实施例9的水洗的固液比为1:7，温度16℃，水洗浸泡时间50min，完成后用100目尼龙滤布过滤，挤压除去固体间隙中的水。因为回收植株间隙中水溶性的黄酮苷类物质，所以提取的黄酮类化合物的收率达到82.3％，比实施例3的结果提高7.4个百分点。
实施例10-11
本实施例中采用的基础操作参数与实施例4相同。
实施例10-11的步骤5)前增加增加低温汽爆预处理步骤，将步骤2)得到的固体渣放入密闭金属承压容器中，缓慢通入压缩氮气，使容器中的气体达到一定压力，并维持一定的时间且保持一定的温度，然后在段时间内将容器中气压降至常压，将该过程循环多次。
实施例10的气体压力达到2.0MPa以上，升压时间为60s，压力维持90s，温度维持在60℃，在0.1s内将容器中气压降至101kPa，上述过程循环7次。因为破坏了植株组织和细胞的完整结构，有利于提取，醇浸提的时间缩短为30h，缩短了31％以上，提取得到的黄酮类化合物的收率达到82.8％，比实施例4的结果提高7.2个百分点。
实施例11的气体压力达到3.0MPa以上，升压时间为70s，压力维持100s，温度维持在80℃，在0.05s内将容器中气压降至101kPa，上述过程循环9次。因为更有效地破坏了植株组织和细胞的完整结构，有利于提取，醇浸提的时间缩短为20h，缩短了54％以上，提取得到的黄酮类化合物的收率达到83.9％，比实施例4的结果提高8.3个百分点。
实施例12-13
本实施例中采用的基础操作参数与实施例2相同。
实施例12-13的步骤7)改为采用生物酶催化，采用糖苷酶将黄酮苷类物质水解为黄酮类物质和糖。
实施例12的酶催化条件为：葡萄糖苷酶：鼠李糖苷酶＝2:1，总酶加入量为液体质量的1％，pH为4.8，温度63℃，酶水解时间10h，所述生物酶为市售的商品酶。因为酶催化的效果较好，提取得到的黄酮类化合物中黄酮苷类化合物的含量降低至2.7％，降低了1.2个百分点。
实施例13的酶催化条件为：葡萄糖苷酶：鼠李糖苷酶＝3:1；总酶加入量为液体质量的2％，pH为5.3，温度56℃，酶水解时间16h，所述生物酶为市售的商品酶。因为酶催化的效果较好，提取得到的黄酮类化合物中黄酮苷类化合物的含量降低至2.1％，降低了1.8个百分点。
实施例14
本实施例中采用的基础操作参数与实施例6相同。
实施例14的步骤7)后增加了萃取步骤，使用的萃取剂为乙醇和乙酸乙酯的混合物，其质量比为1:10，萃取温度为14℃，萃取时间5.6h，静置8h以上进行分相，然后将萃取液中的萃取剂蒸出，得到黄酮类物质粉末。提取得到的黄酮类化合物的纯度提高到89.2％，提高了4.6个百分点；其中黄酮苷类化合物的含量降低至2.3％，降低了1.7个百分点。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (9)

1.一种从空心莲子草中提取黄酮类化合物的方法，包括以下步骤：
步骤1)空心莲子草的采集和清洗：从自然保护区中采集新鲜空心莲子草植株，用水洗去泥沙等杂质，去除表面水；
步骤2)压榨：将步骤1)得到的清洗后的新鲜空心莲子草植株放入压榨装置中进行压榨，得到榨汁和固体渣；
步骤3)榨汁除杂：将步骤2)得到的榨汁进行微滤过滤，得到榨汁滤液，再用石油醚萃取法去除榨汁滤液中的叶绿素杂质，再用醇沉法去除榨汁滤液中的多糖等杂质，得到净化后的榨汁滤液；
步骤4)榨汁浓缩：将步骤3)得到的净化后的榨汁滤液泵入旋转蒸发装置中，去除其中的醇和多余的水，得到榨汁浓缩液；
步骤5)醇浸提：将步骤2)得到的固体渣投入到80％～90％的乙醇溶液中，进行醇浸提，得到醇提液；
步骤6)醇提液除醇：将步骤5)得到的醇提液加入等体积的去离子水，然后泵入旋转蒸发装置中，去除其中的乙醇，得到醇提物溶液；
步骤7)催化水解：将步骤4)的榨汁浓缩液和步骤6)的得到醇提物溶液合并，在其中加入固体酸，使其中的黄酮苷类物质水解为黄酮类物质，得到催化水解液；
步骤8)浓缩结晶：将步骤7)得到的催化水解液放置于旋转蒸发装置中，减压浓缩，使其中的黄酮类物质结晶出来，固液分离后得到黄酮类物质。
2.根据权利要求1所述从空心莲子草中提取黄酮类化合物的方法，其特征在于，所述步骤2)压榨装置包括市售的对辊压榨机，压榨辊直径10～20cm，辊间压力为30～60N/cm，压榨温度为12～23℃。
3.根据权利要求1所述从空心莲子草中提取黄酮类化合物的方法，其特征在于，所述步骤3)微滤操作采用0.45微米孔径的醋酸纤维素微滤膜，采用石油醚萃取叶绿素的油水相比1:3～2:3，温度20～32℃，搅拌转速100～300转/min，萃取时间40～60min，采用醇沉法除多糖的乙醇质量百分数浓度为76％～79％，10～20转/min，搅拌8～10min，然后过滤去除沉淀。
4.根据权利要求1所述从空心莲子草中提取黄酮类化合物的方法，其特征在于，所述步骤4)榨汁浓缩操作分为三个阶段，第一阶段：真空度-50～-63kPa，温度45～56℃，时间1～1.5h；第二阶段：真空度-70～-79kPa，温度53～64℃，时间1.6～2.1h；第三阶段：真空度-78～-92kPa，温度74～87℃。
5.根据权利要求1所述从空心莲子草中提取黄酮类化合物的方法，其特征在于，所述步骤5)醇浸提的固液比1:7～1:16，温度70～82℃，时间24～48h。
6.根据权利要求1所述从空心莲子草中提取黄酮类化合物的方法，其特征在于，所述步骤6)除醇的真空度-56～-68kPa，温度48～59℃，将其中的乙醇去除到质量百分数0.9％以下。
7.根据权利要求1所述从空心莲子草中提取黄酮类化合物的方法，其特征在于，所述步骤7)固体酸包括H型大孔强酸性阳离子交换树脂。
8.根据权利要求1所述从空心莲子草中提取黄酮类化合物的方法，其特征在于，所述步骤7)固体酸的添加量为待催化液体质量的10％～24％，温度80～86℃，搅拌转速28～33转/min，催化时间4～8h。
9.根据权利要求1所述从空心莲子草中提取黄酮类化合物的方法，其特征在于，所述步骤8)减压浓缩的真空度为-81～-93kPa，蒸发温度为72～83℃，浓缩倍数为8～19倍。
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