CN112410368A

CN112410368A - 芝麻SiOASA基因在植物雄性不育中的应用

Info

Publication number: CN112410368A
Application number: CN202011332162.7A
Authority: CN
Inventors: 周婷; 杨远霄; 赵应忠; 李田雨; 刘红艳; 周芳
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2020-11-24
Filing date: 2020-11-24
Publication date: 2021-02-26
Anticipated expiration: 2040-11-24
Also published as: CN112410368B

Abstract

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及芝麻SiOASA基因在调控植物雄性不育中的应用。本发明包括芝麻SiOASA基因的分离克隆、载体构建、功能验证及在调控植物雄性不育中的应用。所述的芝麻SiOASA基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示。本发明还公开了该基因在影响拟南芥绒毡层和小孢子的发育进而导致植株雄性不育中的应用。

Description

芝麻SiOASA基因在植物雄性不育中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域。具体涉及一种从芝麻中分离、鉴定的乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶SiOASA基因的功能验证与应用。功能验证表明SiOASA基因能调控拟南芥花粉的发育，导致拟南芥花粉败育。利用本发明克隆的SiOASA基因，通过遗传转化可应用于创制雄性不育材料，应用于杂交育种，提高作物产量。

背景技术

随着全球人口的持续增长，如何在有限的资源下维持食物的充足供给，成为全世界关注的一个主要问题。因此，在环境友好、可持续发展的前提下提高粮食产量尤为重要。杂种优势可以显著提高作物产量，改善作物品质、增强植株抗逆性和抗病性，是可持续发展条件下增加粮食产量的有效途径。目前，已在多个作物中建立了杂交育种系统。利用杂种优势，水稻增产55％(Chen et al.,2007,Progress in research and development onhybrid rice:A super-domesticate in China.Annual Botany,100:959–966)，小麦增产3.5％-15％(Whitford et al.,2013,Hybrid breeding in wheat:technologies toimprove hybrid wheat seed production.Journal of Experimental Botany,64:5411-5428)，大麦增产11％(Mühleisen et al.,2013,Hybrid Breeding in Barley.CropScience,53:819-824)，油菜增产200％(Chen and Liu,Male Sterility and FertilityRestoration in Crops.Annual Review of Plant Biology,65:579-606)。杂交育种对农业增产做出了巨大贡献。

雄性不育系统是作物杂种优势利用的重要途径。同时，雄性不育也是影响作物种子生产的重要因子。雄性生殖器官发育不良，则会导致雄性不育(Guo and Liu,2012,Molecular Control of Male Reproductive Developmentand Pollen Fertility inRice.Journal of Integrative Plant Biology,54:967-978)。雄性生殖器官发育是一个复杂的生物学过程，包括雄蕊原基分化、造孢细胞的产生、花粉母细胞分化、有丝分裂到小孢子产生与成熟，花粉的释放等一系列发育事件，涉及了一系列基因以及基因与环境间的相互作用(Ma,2005,Molecular genetic analyses of microsporogenesis andmicrogametogenesis in flowering plants.Annual Review of Plant Biololgy,56:393-434)。因此，深入了解植物育性以及导致正常花粉形成和释放的机制和基因网络，对于通过基因工程创制雄性不育材料、选配优势杂交组合、提高作物产量具有重要的意义。

氨基酸是生命活动的必需成分，对雌雄配子体的正常发育至关重要。在花药的绒毡层中，检测到氨基酸转运体的表达，并且观察到氨基酸从孢子体向雄配子体的转运(Tegeder and Rentsch,2010,Uptake and partitioning of amino acidsandpeptides.Molecular Plant,3:997-1011)。研究表明，从孢子体向雄配子体转运的组氨酸、赖氨酸或者色氨酸，能满足花粉发育过程中对此三种氨基酸的需求(Hudson et al.,2006,An L-diaminopimelate aminotransferase defines a novel variant of thelysine biosynthesis pathway in plants.Plant Physiology,140:292-301；Muralla etal.,2007,Genetic dissection of histidine biosynthesis in Arabidopsis.PlantPhysiology,144:890-903；Song et al.,2004,Divergent roles in Arabidopsisthaliana development and defense of two homologous genes,ABERRANT GROWTH ANDDEATH 2 and AGD2-LIKE DEFENSE RESPONSE PRO-TEIN1,encoding novelaminotransferases.Plant Cell,16:353-366)，然而，孢子体向雄配子体转运的半胱氨酸则无法满足花粉发育需求，需要在花粉中自行合成，表明半胱氨酸在花粉发育中具有重要的作用(Birke et al.,2013,Successful Fertilization Requires the Presence of atLeast One Major O-Acetylserine(thiol)lyase for Cysteine Synthesis in Pollenof Arabidopsis.Plant physiology,163:959-972)。半胱氨酸不仅是蛋白质的重要组成成分，也是许多重要生物分子的前体，如维生素、辅助因子以及细胞氧化还原平衡的重要调节因子谷胱甘肽(Wirtz and Droux,2005,Synthesis of the sulfur amino acids:cysteine and methionine.Photosynthesis Research,86:345-362)。半胱氨酸由于其生化功能，在植物代谢中具有重要的作用。半胱氨酸的合成首先是通过丝氨酸-酰基转移酶(SAT)催化生成中间产物乙酰丝氨酸(OAS)，然后经乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶(OASTL)，将硫化物与OAS结合生成半胱氨酸。通过OASTL合成的半胱氨酸是碳氮代谢(OAS)和硫(硫化物)代谢之间的直接联系，在植物初级代谢中处于中心地位(Heeg et al.,2008,Analysis ofthe Arabidopsis O-Acetylserine(thiol)lyase Gene Family DemonstratesCompartment-Specific Differences in the Regulation of CysteineSynthesis.Plant Cell,20:168-185)。植物细胞内具有多种乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶异构型。在拟南芥中共有9个编码乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶的基因，编码OASA、OASB、OASC、CS-LIKE和CAS五类异构型。其中OASA、OASB、OASC为主要的亚型，分别定位于胞质、质体和线粒体，催化半胱氨酸的生物合成，进而形成多个亚细胞半胱氨酸池(Birke et al.,2013,Successful Fertilization Requires the Presence of at Least One Major O-Acetylserine(thiol)lyase for Cysteine Synthesis in Pollen ofArabidopsis.Plant physiology,163:959-972)。研究表明，拟南芥oasa和oasb的单突变体和野生型拟南芥相比，均无明显差异，而oasc突变体与野生型相比表现出生长迟缓。oastlAB，oastlAC，oastlBC双突变体分别表现出花粉部分不育的表型，oastlABC三重突变体则表现出配子致死的表型(Birke et al.,2013,Successful Fertilization Requiresthe Presence of at Least One Major O-Acetylserine(thiol)lyase for CysteineSynthesis in Pollen of Arabidopsis.Plant physiology,163:959-972)。DES1编码L-半胱氨酸脱硫酶，属于CS-LIKE异构型。Des1插入突变体表现出叶片衰老提前，参与体内半胱氨酸稳态维持(A ′lvarez et al.,2010,An O-Acetylserine(thiol)lyase Homolog withL-Cysteine Desulfhydrase Activity Regulates Cysteine Homeostasis inArabidopsis.Plant Physiology,152,656-669)。目前，对于乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶参与生长发育的分子机制了解知之甚少，仅有极少数报道。在芝麻中，尚未有关乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶的报道。

本发明通过克隆得到一种芝麻SiOASA基因，该基因编码乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶，申请人发现，在拟南芥中超量表达SiOASA导致拟南芥绒毡层程序化死亡(PCD)延迟，小孢子空泡化，花粉壁异常，进而导致花粉败育。利用本发明克隆的基因可望创制植物雄性不育材料，为杂交育种提供新的种质资源和育种材料。

发明内容

本发明的目的在于从芝麻中分离克隆一个与芝麻雄性不育相关的基因，通过转化拟南芥，验证其在花粉发育中的功能，进而用于转化芝麻，以期通过基因工程创制雄性不育材料，用于芝麻的杂交育种，提高芝麻的产量。

本发明的技术方案如下所述：

(1)本发明从芝麻中分离得到一个与芝麻雄性不育相关的乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶基因，申请人将这个基因命名为SiOASA，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ NO:1所示，该序列的第1-1191位所示的序列是该基因的编码区(CDS)。其编码的蛋白与拟南芥OASA具有73％的同源性。聚类分析表明SiOASA基因编码的蛋白与OASA聚为一类(图1)，故将这个基因命名为SiOASA。根据测序验证后的该基因全长cDNA序列信息构建了该基因的超表达载体，该超表达载体含有序列表SEQ NO:2所示的氨基酸序列。

如SEQ ID NO:1所示的乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶基因SiOASA来源于芝麻，由1191个碱基组成，推测的蛋白质编码序列为396个氨基酸，是序列SEQ ID NO:1自5’端第1位碱基到1191位碱基组成。该基因在芝麻中尚未有任何报道。组织表达模式分析表明，SiOASA基因在营养器官和生殖器官中均有表达，且在生殖器官中的表达量高于营养器官(图2中的A图)。通过比较该基因在可育与不育芝麻花药发育过程中的表达，发现该基因在不育植株花药四分体时期的表达高于可育花药，在小孢子和成熟花粉时期，SiOASA基因在可育与不育花药中的表达无明显差异(图2中的B图)。通过构建该基因的超量表达载体，获得转化载体PRI101-AN-SiOASA(图3中的B图)，将所得转化载体PRI101-AN-SiOASA转化到哥伦比亚生态型拟南芥中，得到SiOASA超表达转基因阳性拟南芥植株。检测其表达量并选取具有合适表达量的四个家系进行后续试验(图4中的A图)。通过对野生型(非转基因植株，下同)和转基因植株的生长发育过程比较发现，在营养生长阶段，二者间无明显差异，但转基因植株的生殖发育受到影响，转基因植株角果显著变短，且角果瘦瘪(图4中的B图至E图)。利用醋酸洋红染色检测花粉活力，结果表明，野生型植株花粉染色深，花粉为椭圆形且形态饱满(图4中的F图)，而转基因植株的花粉基本无染色，花粉变小，花粉皱缩，表明转基因植株花粉活力降低(图4中的G图)。扫描电镜观察表明，可育花粉饱满，呈椭圆形或圆形，大小一致，花粉表面具有规则的立体纹饰结构(图4中的H图)，而转基因植株花粉凹陷，皱瘪，花粉形态各异。花粉的表面也没有规则的立体纹饰(图4中的I图)，表明转基因植株花粉败育。通过石蜡切片观察表明，在单核靠边期，小孢子形态在野生型和SiOASA超表达植株间无明显差异(图5中的A图至B图)，在随后的花粉成熟时期，野生型植株的小孢子经有丝分裂形成成熟的三核花粉粒(图5中的C图，E图)，而SiOASA超表达植株花粉空泡化，最终败育(图5中的D图，F图)。进一步的透射电镜观察绒毡层和小孢子的发育表明，在stage9-10时期，野生型绒毡层含有丰富的质体和囊泡(图6中的A图)，小孢子胞质内含有丰富的内含物(图6中的B图)。超表达植株绒毡层细胞与野生型绒毡层相比，无明显差异(图6中的C图)，而SiOASA超表达植株小孢子胞质内含有较少的细胞器(图6中的D图)。在stage10-11时期，绒毡层细胞逐渐降解，绒毡层细胞形态不完整(图6中的E图)，小孢子经历有丝分裂，花粉壁物质有序的沉积在小孢子表面(图6中的F图)，而SiOASA超表达植株绒毡层细胞较完整，小孢子胞质内含物逐渐解体(图6中的G图，H图)，在stage11-12时期，野生型绒毡层细胞已基本降解，只看到少数的残片，小孢子发育成成熟的花粉粒(图6中的I图)，而SiOASA超表达植株绒毡层细胞仍具有较完整的细胞器结构，小孢子空泡化(图6中的J图)，在stage12-13时期，基本观察不到野生型绒毡层，由绒毡层降解产生的含油层嵌入花粉外壁之间和覆盖于花粉表面，形成成熟花粉(图6中的K图)，而在SiOASA超表达植株中，仍存在降解的绒毡层细胞物质转运到小袍子表面，在皱缩的小孢子表面存在花粉外壁，但花粉内壁和含油层覆盖异常(图6中的L图)。这些结果表明，SiOASA基因导致绒毡层PCD延迟，小孢子有丝分裂异常，最终导致小孢子空泡化，花粉内壁和含油层覆盖异常，花粉败育。

具体操作步骤如下所述：

(1)通过芝麻基因组信息，设计cDNA扩增引物SiOASA-F和SiOASA-R，以芝麻花蕾cDNA为模板，扩增SiOASA的cDNA序列(如SEQ ID NO:1所示)。通过TA克隆的方法，将目标序列连接到PGEM-T(购自Promega公司，美国)载体上，通过测序获得无突变的阳性克隆T-SiOASA。设计超量表达载体构建引物SiOASA-MF和SiOASA-MR，以获得的无突变的阳性克隆T-SiOASA为模板进行扩增，获得带有酶切位点的目标片段，并通过TA克隆连接到PGEM-T载体上(购自Promega公司，美国)，测序获得无突变的阳性克隆T-ovSiOASA。所用引物的DNA序列如下：

SiOASA-F：5'-ATGGCGTCCGTGGTGAACAAGC-3'(SEQ ID NO:3)

SiOASA-R：5'-TCACACTTCAGGTTGCATCTTCTCAC-3'(SEQ ID NO:4)

SiOASA-MF：5'-GGAATTCCATATG(NDE1)ATGGCGTCCGTGGTGAACAAGC-3'(SEQ ID NO:5)

SiOASA-MR：5'-CGCGGATCC(BAMH1)TCACACTTCAGGTTGCATCTTCTCAC-3'(SEQ ID NO:6)

(2)将获得的T-ovSiOASA质粒以及PRI101-AN载体质粒(购自宝生物工程有限公司,日本)(载体质粒见图3中的A图)进行酶切连接反应，将目的基因片段连接到载体PRI101-AN上，再通过热激转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，获得含有目的基因的重组载体，申请人将这个重组载体命名为植物重组载体PRI101-AN-SiOASA(载体构建图见图3中的A图)。利用农杆菌介导的转基因方法，将所述的载体导入拟南芥中，获得转化植株。

(3)借助卡那霉素抗性筛选及分离比统计的方法获得转基因阳性植株，通过RT-PCR的方法，检测转基因植株的表达量，鉴定转基因植株的表型。

(4)通过醋酸洋红染色法鉴定野生型植株花粉和转基因植株的花粉育性。

(5)取生长8周的SiOASA超表达转基因阳性植株和野生型植株的新鲜花粉，通过扫描电镜观察花粉的形态。

(6)通过石蜡切片和透射电镜观察SiOASA超表达转基因阳性植株和野生型植株的花药不同发育时期的细胞学特征。

本发明的优点在于：

本发明克隆的SiOASA基因可影响花粉的育性，因此能够利用基因工程技术的方法有目的创制植物雄性不育植株，可用于植物杂交育种，并能用于研究花药发育的分子机制。

附图说明

图1：采用ClustalW软件和MEGA4.0软件(公开使用软件)对SiOASA编码序列与拟南芥中的乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶聚类分析的结果。通过聚类分析表明，本发明克隆的SiOASA基因与拟南芥OASA基因同源关系较近。

图2：利用RT-PCR的方法检测SiOASA基因的组织表达模式。附图标记说明：图2中的A图为RT-PCR检测SiOASA在芝麻根、茎、叶、花中的表达。图2B为RT-PCR检测SiOASA在芝麻可育与不育花药四分体时期、小孢子时期和花粉成熟时期的表达差异。

图3：构建超表达载体所用的起始载体。附图标记说明：图3中的A图为本发明所使用的超量表达载体PRI101-AN-SiOASA的构建示意图；图3中的B图为本发明所使用的超量表达载体pRI-101-AN DNA的示意图；。

图4：SiOASA超量表达转基因拟南芥的表达量及表型示意图。附图标记说明：图4中的A图为RT-PCR检测转基因拟南芥植株的表达量。其中，左起第一个泳道为SiOASA在野生型植株中的表达，第二个泳道为SiOASA在空载转化植株中的表达，第三至第六个泳道为SiOASA在四个不同超表达家系中的表达。以拟南芥Atactin2作为内参对照。图4中的B图为生长8周的野生型拟南芥和转基因拟南芥的表型图，其中左边为超量表达转基因拟南芥植株，中间为野生型拟南芥植株，右边为空载转化植株。图4中的C图为超量表达转基因拟南芥植株的角果表型放大图，图4中的D图为野生型拟南芥植株植株角果表型放大图。图4中的E图为空载转化植株的角果表型放大图。图4中的F图为野生型花粉醋酸洋红染色图，图4中的G图为超量表达转基因拟南芥花粉醋酸洋红染色图。图4中的H图-I图为野生型拟南芥成熟花粉扫描电镜图。图4中的J图-K图为转基因拟南芥成熟花粉扫描电镜图。

图5：野生型与SiOASA超表达植株花药不同发育时期的细胞学特征。附图标记说明：图5中的A图为野生型花药stage9-10时期的横切图，图5中的B图为SiOASA超表达植株花药stage9-10时期的横切图。图5中的C图为野生型花药stage11-12时期的横切图，图5中的D图为SiOASA超表达植株花药stage11-12时期的横切图。图5E为野生型花药stage13-14时期的横切图，图5中的F图为SiOASA超表达植株花药stage13-14时期的横切图。

图6：透射电镜观察野生型与SiOASA超表达植株的绒毡层和小孢子发育。附图标记说明：图6中的A图为野生型花药stage9-10时期绒毡层细胞的超微结构。图6中的B图为野生型花药stage9-10时期的小孢子。图6中的C图为SiOASA超表达植株花药stage9-10时期绒毡层细胞的超微结构。图6中的D图为超表达植株花药stage9-10时期小孢子形态结构。图6中的E图为野生型花药stage10-11时期绒毡层和小孢子的超微结构。图6中的F图为野生型花药stage10-11时期小孢子。图6中的G图为SiOASA超表达植株花药stage10-11时期的绒毡层。图6中的H图为SiOASA超表达植株花药stage10-11时期的小孢子形态。图6中的I图为野生型stage11-12时期花药绒毡层和花粉粒的超微结构。图6中的J图为SiOASA超表达植株stage11-12时期花药绒毡层和花粉粒的形态。图6中的K图为野生型stage12-13时期花药绒毡层和成熟花粉粒结构。图6中的L图为SiOASA超表达植株stage12-13时期花药绒毡层和花粉粒的结构。

具体实施方式

对序列表的说明

序列表SEQ ID NO:1是本发明分离克隆SiOASA基因的核苷酸序列。其中1-1191bp是ORF(编码阅读框)，该基因对应的氨基酸序列是1-1191bp所示的序列。该基因编码396个氨基酸残基。

序列表SEQ ID NO:2是SiOASA基因编码的蛋白质序列。

以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离克隆包含有SiOASA基因完整编码区段的核苷酸片段，以及验证SiOASA基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。

实施例1 SiOASA基因的分离克隆及表达模式分析

本发明的具体步骤如下所述：

A.芝麻不同组织总RNA的提取及cDNA的获得

分别提取芝麻的根、茎、叶、花蕾各组织样品，以及芝麻95ms-5四分体时期、小孢子时期和成熟花粉时期的可育与不育花药的RNA。RNA的提取采用Trizol试剂盒(购自Invitrogen公司，美国)。利用反转录酶SuperscriptⅢ(购自Invitrogen公司，美国)将其反转录合成cDNA，反应条件为：65℃ 5min，50℃ 60min，70℃ 10min。

B.SiOASA基因的分离克隆

以芝麻基因组为参考序列(http://ocri-genomics.org/Sinbase_v2.0/)，设计SiOASA的cDNA扩增引物，引物序列为SiOASA-F：5'-ATGGCGTCCGTGGTGAACAAGC-3'和SiOASA-R：5'-TCACACTTCAGGTTGCATCTTCTCAC-3'。以花蕾cDNA为模板，通过PCR扩增SiOASA的cDNA序列。通过TA克隆的方法，将目标序列连接到PGEM-T载体(购自Promega公司，美国)上，并通过测序获得无突变的阳性克隆T-SiOASA，其序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

C.SiOASA的表达模式分析

分别以上述反转录合成的根、茎、叶、花蕾的cDNA为模板，采用RT-PCR检测SiOASA的表达模式，所用引物为：SiOASA-RT-F：(5'-CCAACAAGTCCGACCTCCGCT-3')和SiOASA-RT-R：(5'-TTCCCGTATTTCCACTTGTAGGTT-3')。同时用引物SiUbiquitin6-F：(5'-CACCAAGCCGAAGAAGATCAAG-3')和SiUbiquitin6-R：(5'-CCTCAGCCTCTGCACCTTTC-3')对芝麻SiUbiquitin6基因(基因序列见GenBank登陆号：JP631638)做特异扩增，作为内参对照进行相对定量分析。结果表明：SiOASA基因在根、茎、叶以及花蕾中均表达，且在花蕾中表达量最高(见图2中的A图)。以上述四分体时期、小孢子时期和成熟花粉时期的可育与不育花药的cDNA为模板，采用RT-PCR检测SiOASA在不育与可育花药中的表达模式，所用引物为：SiOASA-RT-F：(5'-CCAACAAGTCCGACCTCCGCT-3')和SiOASA-RT-R：(5'-TTCCCGTATTTCCACTTGTAGGTT-3')。SiActin7(NM_001304413)作为内参对照，引物为SiActin7-F：(TTTGAGCAGGAACTGGACACT)和SiActin7-R：(ACAACACTTCTGGACAACGGA)。结果显示，在四分体时期，SiOASA在不育花药中的的表达高于可育花药，其他时期二者无显著差异。表达模式表明，SiOASA可能参与了生殖发育。

实施例2：SiOASA基因植物超量表达载体的构建

根据得到的SEQ ID NO:1的核苷酸序列设计引物用于构建表达载体，具体步骤是在引物两端分别加上酶切位点，所述的引物序列分别为SiOASA-MF：5'-GGAATTCCATATG(NDE1)ATGGCGTCCGTGGTGAACAAGC-3'和SiOASA-MR：5'-CGCGGATCC(BAMH1)TCACACTTCAGGTTGCATCTTCTCAC-3'，以T-SiOASA质粒为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为：10×buffer 2μl；dNTP 0.4μl；正，反向引物(上，下游引物)各0.2μM；pfu聚合酶0.2μl，加ddH₂O补足至20μl体系。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃ 30sec，58℃ 30sec，72℃1min，共28个循环；72℃延伸至7min，PCR产物经TA克隆连接到PGEM-T载体上，连接产物经热激转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，以SiOASA的特异引物SiOASA-MF：5'-GGAATTCCATATG(NDE1)ATGGCGTCCGTGGTGAACAAGC-3'和SiOASA-MR：5'-CGCGGATCC(BAMH1)TCACACTTCAGGTTGCATCTTCTCAC-3'进行PCR检测来挑取阳性克隆，并活化提取质粒。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃1min，25个循环；72℃延伸7min。通过测序获得无突变的阳性克隆T-ovSiOASA。将T-ovSiOASA和表达载体pRI101-AN(宝生物工程公司，日本)分别用NDE1和BAMH1限制性内切酶(购自宝生物工程大连有限公司)进行双酶切，酶切反应体系为：10×Fastdigest Buffer 2μl，DNA 1μg，NDE1和BAMH1各1μl，加ddH₂O至20μl，充分混匀后，于37℃恒温箱中放置1h，随后将酶切产物分别通过凝胶电泳检测，并使用DNA凝胶回收试剂盒(购自Axygen公司，美国)分别回收目的基因片段(目标片段为小片段)和目的载体片段(目标片段为大片段)，后将回收后的目标基因片段与目的载体片断进行连接反应，连接反应体系为：按目的载体片段100ng，目标基因片段50ng，加入10×T4连接酶Buffer 2μl，T4连接酶1μl(购自Thermo公司，美国)，无菌水补充至20μl混匀，22℃ 10min后，于4℃过夜连接反应。然后通过常规热激法转化大肠杆菌感受态细胞TOP10，以SiOASA的特异引物SiOASA-MF：5'-GGAATTCCATATG(NDE1)ATGGCGTCCGTGGTGAACAAGC-3'和SiOASA-MR：5'-CGCGGATCC(BAMH1)TCACACTTCAGGTTGCATCTTCTCAC-3'进行PCR检测来挑取阳性克隆，将阳性克隆进行测序。PCR反应体系为：10×buffer 2μl；dNTP 0.4μl；上下游引物各0.2μM；Taq聚合酶0.2μl，加ddH₂O补足至20μl体系。PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 1min，25个循环；72℃延伸7min。确定为阳性的克隆即为获得了用于转化的重组载体PRI101-AN-SiOASA(见图3中的A图)。

将构建的PRI101-AN-SiOASA载体转化农杆菌菌株GV3101(Roger et al.,2000,Aguide to Agrobacterium binary Ti vectors.Trends in Plant Sci,5,1360-1385)，挑取单菌落接于含50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的LB液体培养基中于150rpm、28℃摇48h，按菌液和甘油体积比1：1加入1.5mL离心管混匀，-70℃保存。再通过农杆菌介导的转化方法转化拟南芥。

以上及以后所述的LB培养基配方为：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl 10g/L；用5mM NaOH调pH＝7.2；用蒸馏水定容至1L；在高温121-125℃高压灭菌15-20min。LB固体培养基为每升加入8g琼脂。

实施例3 SiOASA基因的遗传转化及筛选鉴定

具体步骤如下：

A.拟南芥的准备

供试材料为野生型拟南芥(即非转基因，简称WT，下同)(Arabidopsis thalianaL.Columbia ecotype)。将野生型拟南芥种子点播入拟南芥种植专用营养土(商品名称：培蕾，购自江苏省镇江市)并放入人工培养室(16小时光照，8小时黑暗，培养温度22±2℃)生长。待拟南芥长到4叶左右进行定苗，以控制拟南芥的生长密度。待拟南芥生长6周左右开始开花时即可转化，转化前一天给拟南芥浇足水。

B.农杆菌的活化

从超低温冰箱内取出保存的含有目标基因(即本发明克隆的SiOASA基因)的GV3101菌株的甘油管在冰上融化，后于含50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的LB固体培养基上划线，28℃暗培养36-48h，待皿内长出清晰的单菌落，挑取单菌落在加50mg/L利福平和100mg/L卡那霉素的LB液体培养基中过夜培养(26.5℃，100rpm)，其OD600＝0.8-1.0时即可用于转化；

将菌液转移到离心管中5000rpm离心5min，弃上清培养基。加入100ml浓度为5％(W/V)的蔗糖溶液，重悬农杆菌GV3101，在28℃摇床中复苏1-2h。加入表面活性剂0.05％(V/V)Silwet L-77，震荡摇混匀。

C.农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥及转基因拟南芥的筛选

农杆菌介导的花器浸醮法转化拟南芥的转化方法和程序参照参考(Zhang etal.,2006,Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana usingthe floral dip method.Nature Protocols,1,641-646)。具体步骤如下：

(1)将拟南芥花器浸入农杆菌悬液，并轻轻搅动约30s，用纸巾吸掉过多的菌液，并用黑色塑料袋将拟南芥植株包裹起来，保湿避光处理24h。

(2)将塑料袋逐渐揭开透气，正常培养。

(3)一个星期之后重复上述(1)的操作。

(4)待种子成熟可以停止浇水并收获种子，即T0代种子。

(5)将收获的种子消毒：先用70％(V/V)乙醇浸泡1min，在上述处理时要不时地使种子悬浮；然后用无菌水洗四次。

(6)处理后的种子用Top agar(0.1％(W/V)琼脂水溶液)均匀涂布在含卡那霉素的拟南芥生长培养基(含有100mg/L卡那霉素的1/2MS培养基)表面。

(7)移入培养室培养10天后，选取具有卡那霉素抗性植株移栽到土壤培养，待成熟后按单株收取种子，即T1代种子；

(8)将收取的T1代种子按操作步骤(5)-(6)进行操作1次。

(10)正常培养10天后计算具有卡那霉素抗性植株与非抗性植株的分离比例，并进行统计分析。

(11)将符合抗性与非抗性植株的分离比为3:1的株系选为单拷贝株系，并移栽至土壤中培养，成熟后按单株收取种子，即为T2代种子。

D.转基因拟南芥植株的纯系检测

将收取的T2代种子按实施例3中农杆菌介导的花序浸染法转化拟南芥及转基因拟南芥筛选的操作步骤(5)-(6)操作1次；然后移入培养室培养10天后查看转基因植株在固体筛选培养基(含有100mg/L卡那霉素的MS培养基)上是否发生抗性分离，不发生抗性分离的株系即认为是转基因纯系，用作下一步表型分析和功能鉴定。

实施例4：转基因拟南芥的表达分析

(1)收集T3代拟南芥植株的地上部分以提取RNA，RNA的抽提采用Trizol试剂盒(购自Sigma公司，美国)(具体操作步骤见该试剂盒的说明书)。

(2)以3μg总RNA为模版合成cDNA，与1μl 500μg/ml oligo-dT(15)引物(购自Promega公司，美国)，1μl 10mM dNTP，DEPC水混合，总体积为12μl；然后65℃变性5min后冰上骤冷；再加入8μl含有4μl RT buffer，2μl 0.1M dithiothreitol，40units of

Ribonuclease Inhibitor(购自Promega公司，美国)，和200units of SuperscriptⅢ反转录酶(购自Invitrogen公司，美国)的混合液；50℃温浴1h合成第一链；反应结束后75℃处理15min使SuperscriptⅢ反转录酶失活。每份cDNA稀释到200μl后-20℃保存待用。

(3)以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物SiOASA-F和SiOASA-R对SiOASA基因进行特异的PCR扩增(扩增产物长1191bp)。同时用拟南芥Atactin2(GenBank登陆号：NM_179953)基因作为内参基因做特异扩增(扩增产物长216bp)。PCR反应体系的总体积为20μl，DNA模板1μl(约50ng)、1×Taq酶反应缓冲液、25mM MgCL₂ 1.2μl、2mM dNTP 1.5μl、10μM引物0.2μl、0.3单位Taq酶，加ddH₂O至20μl。反应程序为：94℃变性5min，94℃30s、55℃30s、72℃30s 30cycles，72℃延伸5min。获得的PCR产物取10μl以0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。

所用引物为：

SiOASA-F：5'-ATGGCGTCCGTGGTGAACAAGC-3'

SiOASA-R：5'-TCACACTTCAGGTTGCATCTTCTCAC-3'

Atactin2-F：5'-CACTGTGCCAATCTACGAGGGT-3'

Atactin2-R：5'-CACAAACGAGGGCTGGAACAAG-3'

实施例5：利用转基因拟南芥对SiOASA基因进行功能验证

A.SiOASA超表达拟南芥的表型鉴定

将野生型拟南芥(简称WT)、空载体转化植株(简称EV)和超表达家系的T3代植株种于拟南芥种植专用营养土(商品名称为培蕾，产地：江苏省镇江市)并放入人工培养室(16h光照，22±2℃)。通过与野生型、空载体转化植株相比，观察转基因植株营养和生殖发育的变化。待植株生长8周，拍照。

B.醋酸洋红染色

取转基因植株和野生型植株各10朵当天开放的花朵，于载玻片上分离出花粉，采用0.5％醋酸洋红染色花粉。每朵花观察3个视野。其中：饱满、暗红色的计为正常(可育)花粉；瘦小、染色浅或未染上色的计为不育花粉。

C.利用扫描电镜观察花粉形态

分别取转基因植株和野生型植株上各5朵成熟花的花药，用2.5％戊二醛固定，抽真空，各级酒精梯度脱水，每次30min。酒精梯度依次为30％、50％、70％、80％、90％、100％乙醇(共处理两次)。然后用液态CO₂进行临界点干燥法干燥(为常规方法)，将干燥的样品用导电性很好的粘合剂粘在金属品台上，用离子溅射镀膜机喷镀金属。最后在JSM-6390扫描电子显微镜下观察花药、花粉并拍照。

D.石蜡切片观察野生型和SiOASA超表达植株花药发育

分别取野生型和转基因植株不同发育时期的花药，固定于FAA固定液中，抽真空至花药沉入管底，固定过夜。依次按50％、70％、85％、95％、100％梯度酒精脱水，每级2h后，经二甲苯透明，梯度石蜡(50％、75％、100％)后，包埋于纯石蜡中。利用Leica RM2235microtome切片机将蜡块切成4um厚度，然后将切片于42℃展片5min后，于37℃恒温箱中过夜。随后，依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ10min-无水乙醇Ⅱ10min-95％酒精5min-90％酒精5min-80％酒精5min-70％酒精5min-蒸馏水洗进行脱蜡。切片入60℃预热的固绿染液染6min，蒸馏水急洗1次。切片入饱和苦味酸水溶液浸泡10min,蒸馏水漂洗。置1％磷钼酸水溶液中1min，蒸馏水漂洗1min。片子入番红染液着色3min。70％、95％、100％乙醇分别脱水两次，每次5min，在二甲苯中透明两次，每次5min，最后中性树胶封片。

E.透射电镜观察野生型和SiOASA超表达植株绒毡层和小孢子发育

分别取野生型(WT)和SiOASA超表达植株不同发育时期的花药，于2.5％戊二醛固定液中抽气固定至材料沉底，然后于室温放置过夜，随后使用锇酸进行后固定。固定后的材料经酒精梯度脱水后包埋于Spurt树脂，使用徕卡超薄切片机(Leica EM UC7)切成50nm厚度切片，将切片捞在200目的铜网上，然后再用醋酸铀酰和柠檬酸铅溶液进行双染色。在透射电子显微镜(Tecnai)下观察切片结果并拍照。

特别说明：本发明创造(专利申请)获得中国《国家自然科学基金(编号31701468)》的资助。

序列表

<110> 中国农业科学院油料作物研究所

<120> 芝麻SiOASA基因在植物雄性不育中的应用

<141> 2020-11-24

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1191

<212> DNA

<213> 芝麻(Sesamum indicum)

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1191)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1191)

<400> 1

atg gcg tcc gtg gtg aac aag ccg ttt act tct ttc tgc gcc gcc aac 48

Met Ala Ser Val Val Asn Lys Pro Phe Thr Ser Phe Cys Ala Ala Asn

1 5 10 15

aag tcc gac ctc cgc tcg ccg gaa tta ttc gtt ggc aaa cgc tgc cgt 96

Lys Ser Asp Leu Arg Ser Pro Glu Leu Phe Val Gly Lys Arg Cys Arg

20 25 30

atc cga ggc agg agg tct ggc aat agt gtt aga att gcc acc aat gct 144

Ile Arg Gly Arg Arg Ser Gly Asn Ser Val Arg Ile Ala Thr Asn Ala

35 40 45

gtt gtt agt aga aag aat cac gat agt gac tgt ggg att gtg tgt aag 192

Val Val Ser Arg Lys Asn His Asp Ser Asp Cys Gly Ile Val Cys Lys

50 55 60

gct ctc tcc gtg gag cca cag acg gag att gaa ggc ctt aac atc gcc 240

Ala Leu Ser Val Glu Pro Gln Thr Glu Ile Glu Gly Leu Asn Ile Ala

65 70 75 80

gaa gat gtt act cag ctc att ggg aag aca ccg atg gtt tac ttg aat 288

Glu Asp Val Thr Gln Leu Ile Gly Lys Thr Pro Met Val Tyr Leu Asn

85 90 95

aat att gta aaa ggt tgt gtt gca aat ata gca gca aag ctt gag att 336

Asn Ile Val Lys Gly Cys Val Ala Asn Ile Ala Ala Lys Leu Glu Ile

100 105 110

atg gag ccg tgt tgc agt gtc aaa gat agg ata ggg tac agt atg atc 384

Met Glu Pro Cys Cys Ser Val Lys Asp Arg Ile Gly Tyr Ser Met Ile

115 120 125

act gat gct gag cag aaa ggg ctt ata act cca ggg aag agt gta ttg 432

Thr Asp Ala Glu Gln Lys Gly Leu Ile Thr Pro Gly Lys Ser Val Leu

130 135 140

gtt gaa cct aca agt gga aat acg gga att ggc ctt gca ttt att gct 480

Val Glu Pro Thr Ser Gly Asn Thr Gly Ile Gly Leu Ala Phe Ile Ala

145 150 155 160

gct tca aaa ggc tac aag ctc atc tta aca atg cct gcg tcc atg agt 528

Ala Ser Lys Gly Tyr Lys Leu Ile Leu Thr Met Pro Ala Ser Met Ser

165 170 175

ctt gag aga agg gtt ctc ttg aaa gct ttt gga gct gaa cta gtt tta 576

Leu Glu Arg Arg Val Leu Leu Lys Ala Phe Gly Ala Glu Leu Val Leu

180 185 190

act gac gca gcc aaa ggc atg aaa gga gct gtc caa aag gca gaa gaa 624

Thr Asp Ala Ala Lys Gly Met Lys Gly Ala Val Gln Lys Ala Glu Glu

195 200 205

ata gtg aat agc acc cag aac gca tac atg ctt caa caa ttt gac aac 672

Ile Val Asn Ser Thr Gln Asn Ala Tyr Met Leu Gln Gln Phe Asp Asn

210 215 220

cct gca aat ccc aag att cac tat gaa acc acc ggc cct gag att tgg 720

Pro Ala Asn Pro Lys Ile His Tyr Glu Thr Thr Gly Pro Glu Ile Trp

225 230 235 240

gaa gat aca aaa ggc aag gtg gac atc ctt gtt gct ggg att ggc act 768

Glu Asp Thr Lys Gly Lys Val Asp Ile Leu Val Ala Gly Ile Gly Thr

245 250 255

ggt gga acc att tca ggg gtt ggt cgt tat ctc aaa aaa tat aat cct 816

Gly Gly Thr Ile Ser Gly Val Gly Arg Tyr Leu Lys Lys Tyr Asn Pro

260 265 270

aat ata aag gtt att ggc gtg gaa ccc act gaa agc aac ata cta tca 864

Asn Ile Lys Val Ile Gly Val Glu Pro Thr Glu Ser Asn Ile Leu Ser

275 280 285

ggt gga aaa cct ggc cct cac aaa att caa ggg att gga gca ggt ttt 912

Gly Gly Lys Pro Gly Pro His Lys Ile Gln Gly Ile Gly Ala Gly Phe

290 295 300

att ccg aag aat tta gat caa gat gtg atg gat gaa gtt ata gag ata 960

Ile Pro Lys Asn Leu Asp Gln Asp Val Met Asp Glu Val Ile Glu Ile

305 310 315 320

tca agt gat gaa gct gta gag act gcg aag caa tta gct ctt caa gag 1008

Ser Ser Asp Glu Ala Val Glu Thr Ala Lys Gln Leu Ala Leu Gln Glu

325 330 335

ggc ctg ctg gtg ggt att tct tca gga gca gca gca gct gct gct att 1056

Gly Leu Leu Val Gly Ile Ser Ser Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ile

340 345 350

aag gtt gga aag aga cct gaa aat gct gga aag ctt ata gcg gtt gtg 1104

Lys Val Gly Lys Arg Pro Glu Asn Ala Gly Lys Leu Ile Ala Val Val

355 360 365

ttc cct agc ttc ggg gaa cga tac tta tcc aca gtc ctc ttc cag tca 1152

Phe Pro Ser Phe Gly Glu Arg Tyr Leu Ser Thr Val Leu Phe Gln Ser

370 375 380

ata agg gaa gaa tgt gag aag atg caa cct gaa gtg tga 1191

Ile Arg Glu Glu Cys Glu Lys Met Gln Pro Glu Val

385 390 395

<210> 2

<211> 396

<212> PRT