CN112409463B - 蛋白质在提高苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白毒力中的用途 - Google Patents

蛋白质在提高苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白毒力中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明提出了具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质在提高苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白毒力中的用途，增效蛋白与伴孢晶体蛋白共同作用后，可以有效地提高伴孢晶体蛋白的毒力，尤其是杀虫能力，从而减少伴孢晶体蛋白的使用量，降低杀虫成本，提高杀虫效率，适于规模化推广应用。

Description

蛋白质在提高苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白毒力中的用途
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及蛋白质在提高苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白毒力中的用途。
背景技术
苏云金芽孢杆菌(Bacillius thuringiensis，Bt)为革兰氏阳性昆虫病原细菌，可以产生具有杀虫活性的伴孢晶体蛋白，又称杀虫晶体蛋白(insecticide crystalproteins，ICPs)或δ-内毒素。此外，α-外毒素、β-外毒素、γ-外毒素、热不稳定性外毒素和营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal protein，VIP)以及芽孢都有一定的杀虫活性。然而，Bt毒素具有多样性，如根据Bt毒素晶体状态的不同可将其分为Cry毒素和Cyt毒素，而Bt又可分为不同的亚种，其毒素的种类和性质也不相同，从而使得其杀虫活性有较大差异。鉴于人们对环境保护、食品安全和病虫害对化学农药抗药性认识的逐步深入，生物农药的研究和应用有了突飞猛进的发展。苏云金芽孢杆菌制剂以其高效、特异性强以及对环境、人畜安全等优势已经成为世界范围内应用最广、用量最大、效果最好的生物杀虫剂，因此，被广泛应用于农业、林业和贮藏等领域的害虫防治。
目前，为了提高伴孢晶体蛋白杀菌特性，采用的技术手段主要有分离筛选杀虫活性高、特异性强的高效菌株和遗传改良现有高毒菌株。然而，大规模筛选高效菌株效率极其低下，且极为困难；而遗传改良菌株的稳定性差，并且改造成功率低、研究投入成本高，在实践应用中难以实现。因此，快速、稳定、有效的增效物质、制剂和因子等的开发和应用受到越来越多的关注。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题。为此，本发明提出了具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质在提高苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白毒力中的用途、组合物、杀虫剂、获得具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质的方法、增强苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白毒力的方法和杀虫方法，SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质与伴孢晶体蛋白共同作用后，可以有效地提高伴孢晶体蛋白的毒力，尤其是杀虫能力，从而减少伴孢晶体蛋白的使用量，降低杀虫成本，提高杀虫效率，适于规模化推广应用。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
两效霉素(Zwittermicin)是目前已知具有提高苏云金芽孢杆菌伴孢晶体毒力的物质(刘建国等.几种常见Bt菌株中的Zwittermicin A活性比较[J].食品研究与开发,2014.)，其为小分子化合物。
Figure BDA0002724381760000021
发明人在研究如何提高伴孢晶体蛋白毒力时发现，苏云金芽孢杆菌上清液与伴孢晶体蛋白混合作用时，可以提高伴孢晶体的毒力。基于上述现有技术给出的小分子物质具有增强毒力的技术启示下，发明人采用超滤技术收集上清液中的小分子物质。但是，研究发现其增强毒力效果不显著。相反地，采用透析技术收集上清液中的大分子物质，其具有明显增效作用。进一步地，发明人对上清液中的蛋白质进行分离和研究筛选，发现具有SEQ IDNO：1所示氨基酸序列的蛋白质(本发明亦简称“增效蛋白”)本身并没有杀虫活性，但是与伴孢晶体蛋白共同作用时，可以显著提高伴孢晶体蛋白的毒力，尤其是杀虫能力，从而减少伴孢晶体蛋白的使用量，降低杀虫成本，提高杀虫效率。
为此，在本发明的一个方面，本发明提出了具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质在提高苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白毒力中的用途。
发明人为了研究如何提高伴孢晶体蛋白毒力时发现，苏云金芽孢杆菌上清液与伴孢晶体蛋白混合作用时，可以提高伴孢晶体的毒力。进而，发明人推断可能是上清液中含有某些蛋白质所起到的作用。进一步地，发明人对上清液中的蛋白质进行分离和研究筛选，发现具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质(本发明亦简称“增效蛋白”)本身并没有杀虫活性，但是与伴孢晶体蛋白共同作用时，可以显著提高伴孢晶体蛋白的毒力。尤其是杀虫能力，从而减少伴孢晶体蛋白的使用量，降低杀虫成本，提高杀虫效率，适于规模化推广应用。
MYRLMANTSDDYLFADYDVQVADHEGINTEAEETQLGVANKNDEAHYLYATQLYAVDWNALGQLDVNELKHENKNVEKAALKAIIYSNALNINTNSATDLIVSMQSTGVIDYVDIQSYLYDSTVRKAPKDLVTVEKNESPNNSFQLTANKLTQLDNQVLRASNASVGHKLVDKADTTNKPLLLVDGKEVEMNTLVESKLNFYTAKEDKNAGSITTLADDFTFDASALQGKESVYVVFEELIYQVDLLNILVAIHATEIIEDSLKGAHQTVKFKEGKSVTIEVTKTGLETGAVQIVNISNVNKFVKGNHAIETFIKHIVKLSDSGLSTKIALPNVEFFTTVEAFETLSEDGYKEVKAKVVLNLTKSENAGITATNVVEDLTYGKLYMHYFLETKTSSPNGYIHGNKSTKYPFELKESMHTNNSTKTLTFTNVENTEVMHKGSVLSDDLYLLANHASYKPVSSDIIADHEITTAEAKLKNYVSFVKKNKMSQFLFNTFTLQGTYTGMAAKFGEYSEDWKTITQESNVNDTAELYKRADSAKEWTGYKHTTVTAYSSLAFVHNIYRVNTSGTFQESSEAYDVVSFDHGINTEEGAENKAPFNLVAVINGPYSGDLMNEAISFTSDGSSKDEDGKITISYHKWNEFGDGFAVSNEQNPTHVYVTTKELGTYTTKFHLTFVTDDKGATNTATFATVTVQKAKEDKFRIQIPLKANTKTGEFNLASVYAANLTLQVVQAIAYARTGTDTVDQNHATVLMLERNEEKLSHGSDLSAFVNWEAAGSFLKIKKTVLGENGEVLAHMFYEVFNIANNSESVYNGKILETTGADGMAELNNLPTIGTYTTLLKEIKSAPTGYVSDDKPQTIEVKTDGETGAVQIVSNNKVKGNIEIKKLSDSGKSILPNFVEFTVFTEDGKEVKKVVHTKENGIANVMEYDLTYGSKYLYFLELTKTPNGYIGNKTKYPDFEIKEHNKTSLTDFTEVELNTFEKMEPVFGVQLPVQSELAHSSKVLESKSFEKRLFQFNADLSFQRPLPEVTKKESKQLAVAKTYHTIAELNQLSNQQLSVDLLVLTIDWEQTDITGLFQFNTDSLALFYQNDSSRMQTIIDKLKQQGQAYTKDSHLDSKGIETFDLHVEVLRSGFYLGFYNSSELSTKLNERLSYHDKSCLPALKHAMANNSNFKLGTLEQNRMLVVSSYGKLIGNASSDMVETITSAAKIFKQYEENMDNFSTLDVDMNLSAGKEYVMVLKGKLVTDKDATTNKPLLVDGKEDDVTVESKFTAKEKHNGSITLSDFTFNASASLQTGKEVVVFEELYQDNILVAIHAEIEDKLGQTLVKLFKEGKSEQPKPEHPNSGKNTPTPEQPNMEQVKEQMKKEFEIQSKIGWLPQTMSGTNLTSSWISMAAGALLLIVGGVIFLKRKLNA(SEQ ID NO：1)
根据本发明的实施例，所述蛋白质用于提高所述伴孢晶体蛋白的杀虫能力。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种组合物。根据本发明的实施例，所述组合物包括：具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质和苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白。增效蛋白和苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白共同作用，可以有效地提高伴孢晶体蛋白的毒力，尤其是杀虫能力，从而减少伴孢晶体蛋白的使用量，降低杀虫成本，提高杀虫效率，适于规模化推广应用。
根据本发明的实施例，所述伴孢晶体蛋白与所述蛋白质的质量比为1：(1～5)，优选1：(1～2)。发明人经过大量实验得到上述较佳配比，由此，可以进一步提高伴孢晶体蛋白的毒力，尤其是杀虫能力。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种杀虫剂。根据本发明的实施例，所述杀虫剂包括：前面所述的组合物。根据本发明实施例的杀虫剂杀虫效果好，效率高，使用量低。
本发明的又一方面，本发明提出了一种获得具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：步骤1：将苏云金芽孢杆菌进行发酵培养，所得发酵液离心，收集上清液；步骤2：将所述上清液进行透析，收集截留物；步骤3：将所述截留物通过层析柱，收集预定时间段流出的馏分，得到所述蛋白质。
增效蛋白存在于苏云金芽孢杆菌的发酵上清液中，将上清液进行透析，以除去小分子物质和盐类，再经过层析柱分离得到蛋白质。在采用层析柱分离时，对收集的不同时间的馏分进行研究，发现SEQ ID NO：1所示氨基酸的蛋白质具有较好的提高伴孢晶体蛋白活性的作用，并且其含量高，且分离度较高，因此，选择增效蛋白作为目标蛋白。由此，根据本发明实施例的方法操作简便，蛋白质的分离度高，收率高，馏分中蛋白质含量高，杂质少。
根据本发明的实施例，所述发酵培养的时间为40～60小时。发明人发现，在此发酵培养时间内，增效蛋白产量高。
根据本发明的实施例，所述透析所采用的截留分子量为2000～4000。由此，可以有效地除去小分子物质和盐类，截留目标蛋白。盐类的去除有助于后续层析。
根据本发明的实施例，所述层析柱包括阴离子交换柱与阳离子交换柱，所述阳离子交换柱选自GE SuperoseTM 6Increase，所述阴离子交换柱选自GE Capto IEX阴离子交换柱。发明人经过大量实验发现，采用阳离子交换柱和阴离子交换柱共同作用，可以有效地分离出目标蛋白，所得馏分中目标蛋白含量高、杂质少。进一步地，发明人优化筛选了上述具体的阴离子交换柱与阳离子交换柱，其分离效果更佳。
根据本发明的实施例，步骤3包括：将所述截留物先通过阳离子交换柱，收集特定时间段流出的馏分，再将所述馏分通过阴离子交换柱，收集特定时间段流出的馏分，得到所述蛋白质。由此，以便进一步提高分离效果，所得馏分中蛋白含量高、杂质少、收率高。
根据本发明的实施例，步骤3进一步包括：将所述蛋白质进行冷冻干燥，制成透析冻干粉。由此，方便保存。
根据本发明的实施例，步骤3进一步包括：将收集的馏分和上清液一同进行冷冻干燥，制成上清和透析混合冻干粉。由于伴孢晶体蛋白与上清液共同作用时，也可以提高伴孢晶体蛋白的毒力，只是其效果没有伴孢晶体蛋白与增效蛋白效果好。进而，通过将收集的流份和上清液一同进行冷冻干燥，所得上清和透析混合冻干粉可以进一步提高伴孢晶体蛋白的毒力。
需要说明的是，本发明对于苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白的获得方式不做严格限定，可以采用本领域的常规技术手段获得。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种增强苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白毒力的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白与具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质进行混合处理。增效蛋白和苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白共同作用，可以有效地提高伴孢晶体蛋白的毒力，尤其是杀虫能力，从而减少伴孢晶体蛋白的使用量，降低杀虫成本，提高杀虫效率，适于规模化推广应用。
根据本发明的实施例，所述伴孢晶体蛋白与所述蛋白质的质量比为1：(1～5)，优选1：(1～2)。由此，可以进一步提高伴孢晶体蛋白的毒力，尤其是杀虫能力。
根据本发明的实施例，具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质是以前面所述获得具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质的方法中的透析冻干粉或上清和透析混合冻干粉的形式提供的。由此，可以进一步提高伴孢晶体蛋白的毒力，尤其是杀虫能力。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种杀虫方法。根据本发明的实施例，所述杀虫方法包括：将前面所述杀虫剂施加于待处理的昆虫。由此，根据本发明实施例的方法可以高效杀虫，减少杀虫剂的使用量，提高杀虫效率，适于规模化应用。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
在50L发酵罐对苏云金杆芽孢杆菌(Bacillus thruingiensis aizawai_HD133)进行发酵，50小时后结束培养，收集发酵液，分别获得伴孢晶体蛋白和具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质：
1、获得伴孢晶体蛋白
放罐发酵液静置24小时，12000rpm离心，取沉淀。用生理盐水洗涤/离心三次，冻干即可。
2、获得具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质
将发酵液于10000rpm转30分钟，4℃离心，收集发酵上清液。将发酵上清液分两部分，其中一部分置于-60℃冻干机过夜，冻干制成发酵上清液冻干粉，另一部分进行如下操作：将发酵上清液进行透析，截留分子量为3000，4℃透析24小时，总稀释倍数为10000倍，每隔8小时换一次水，收集截留物。将截留物用GE SuperoseTM 6Increase过柱，流动相为Tris，0.05mol，pH＝7.8，选择41min至43min馏分。将馏分用GE Capto IEX阴离子交换柱过柱，流动相为MOPS，0.05mol，pH＝7.3，选择12min馏分，掐峰收集。将馏出液置于-60℃冻干机过夜，冻干制成透析冻干粉。密封保存。
实施例2
在50L发酵罐对苏云金杆芽孢杆菌(Bacillus thruingiensis aizawai_HD133)进行发酵，60小时后结束培养，收集发酵液，分别获得伴孢晶体蛋白和具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质：
1、获得伴孢晶体蛋白
同实施例1。
2、获得具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质
将发酵液于10000rpm转30分钟，4℃离心，收集发酵上清液。将发酵上清液分两部分，其中一部分置于-60℃冻干机过夜，冻干制成发酵上清液冻干粉，另一部分进行如下操作：将发酵上清液进行透析，截留分子量为4000，4℃透析24小时，总稀释倍数为8000倍，每隔8小时换一次水，收集截留物。将截留物用GE SuperoseTM 6Increase过柱，流动相为Tris，0.05mol，pH＝7.8，选择41min至43min馏分。将馏分用GE Capto IEX阴离子交换柱过柱，流动相为MOPS，0.05mol，pH＝7.3，选择12min馏分，掐峰收集。将馏出液置于-60℃冻干机过夜，冻干制成透析冻干粉。密封保存。
生物活性实验
下面以实施例1为例，将制备好的伴孢晶体蛋白粉(简称孢晶粉)、发酵上清液冻干粉和透析冻干粉进行生物活性实验，实施例2的结果与实施例1相近，不再赘述。
生物效价检测方法参考论文：《棉铃虫作供试虫的苏云金杆菌制剂毒力生物测定的研究(DOI：CNKI:SUN:ZSWF.0.1990-S1-000)》。
结果如表1所示。由第1组、第2组和第3组数据可以看出，增效蛋白自身没有杀虫活性。由第4组和第5组数据可以看出，当增效蛋白与孢晶粉混合后，孢晶粉杀虫活性可提高三倍多，显著提高了孢晶粉毒力，从而可以减少孢晶粉的使用量，降低使用成本。由于小分子物质存在于发酵上清液中，经透析后除去，并不存在于透析冻干粉中，第5组和第6组实验的效价接近，表明起到增强伴孢晶体毒力的物质并非小分子物质，而是大分子物质。经过透析处理以除去小分子物质，可以进一步提高透析冻干粉中增效蛋白含量，由此，在减少伴孢晶体蛋白和透析冻干粉的添加量下，可以达到相近的增强毒力效果。
表1生物活性
Figure BDA0002724381760000071
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉科诺生物科技股份有限公司
<120> 蛋白质在提高苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白毒力中的用途
<130> PIDC3205375
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1416
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 1
<400> 1
Met Tyr Arg Leu Met Ala Asn Thr Ser Asp Asp Tyr Leu Phe Ala Asp
1 5 10 15
Tyr Asp Val Gln Val Ala Asp His Glu Gly Ile Asn Thr Glu Ala Glu
20 25 30
Glu Thr Gln Leu Gly Val Ala Asn Lys Asn Asp Glu Ala His Tyr Leu
35 40 45
Tyr Ala Thr Gln Leu Tyr Ala Val Asp Trp Asn Ala Leu Gly Gln Leu
50 55 60
Asp Val Asn Glu Leu Lys His Glu Asn Lys Asn Val Glu Lys Ala Ala
65 70 75 80
Leu Lys Ala Ile Ile Tyr Ser Asn Ala Leu Asn Ile Asn Thr Asn Ser
85 90 95
Ala Thr Asp Leu Ile Val Ser Met Gln Ser Thr Gly Val Ile Asp Tyr
100 105 110
Val Asp Ile Gln Ser Tyr Leu Tyr Asp Ser Thr Val Arg Lys Ala Pro
115 120 125
Lys Asp Leu Val Thr Val Glu Lys Asn Glu Ser Pro Asn Asn Ser Phe
130 135 140
Gln Leu Thr Ala Asn Lys Leu Thr Gln Leu Asp Asn Gln Val Leu Arg
145 150 155 160
Ala Ser Asn Ala Ser Val Gly His Lys Leu Val Asp Lys Ala Asp Thr
165 170 175
Thr Asn Lys Pro Leu Leu Leu Val Asp Gly Lys Glu Val Glu Met Asn
180 185 190
Thr Leu Val Glu Ser Lys Leu Asn Phe Tyr Thr Ala Lys Glu Asp Lys
195 200 205
Asn Ala Gly Ser Ile Thr Thr Leu Ala Asp Asp Phe Thr Phe Asp Ala
210 215 220
Ser Ala Leu Gln Gly Lys Glu Ser Val Tyr Val Val Phe Glu Glu Leu
225 230 235 240
Ile Tyr Gln Val Asp Leu Leu Asn Ile Leu Val Ala Ile His Ala Thr
245 250 255
Glu Ile Ile Glu Asp Ser Leu Lys Gly Ala His Gln Thr Val Lys Phe
260 265 270
Lys Glu Gly Lys Ser Val Thr Ile Glu Val Thr Lys Thr Gly Leu Glu
275 280 285
Thr Gly Ala Val Gln Ile Val Asn Ile Ser Asn Val Asn Lys Phe Val
290 295 300
Lys Gly Asn His Ala Ile Glu Thr Phe Ile Lys His Ile Val Lys Leu
305 310 315 320
Ser Asp Ser Gly Leu Ser Thr Lys Ile Ala Leu Pro Asn Val Glu Phe
325 330 335
Phe Thr Thr Val Glu Ala Phe Glu Thr Leu Ser Glu Asp Gly Tyr Lys
340 345 350
Glu Val Lys Ala Lys Val Val Leu Asn Leu Thr Lys Ser Glu Asn Ala
355 360 365
Gly Ile Thr Ala Thr Asn Val Val Glu Asp Leu Thr Tyr Gly Lys Leu
370 375 380
Tyr Met His Tyr Phe Leu Glu Thr Lys Thr Ser Ser Pro Asn Gly Tyr
385 390 395 400
Ile His Gly Asn Lys Ser Thr Lys Tyr Pro Phe Glu Leu Lys Glu Ser
405 410 415
Met His Thr Asn Asn Ser Thr Lys Thr Leu Thr Phe Thr Asn Val Glu
420 425 430
Asn Thr Glu Val Met His Lys Gly Ser Val Leu Ser Asp Asp Leu Tyr
435 440 445
Leu Leu Ala Asn His Ala Ser Tyr Lys Pro Val Ser Ser Asp Ile Ile
450 455 460
Ala Asp His Glu Ile Thr Thr Ala Glu Ala Lys Leu Lys Asn Tyr Val
465 470 475 480
Ser Phe Val Lys Lys Asn Lys Met Ser Gln Phe Leu Phe Asn Thr Phe
485 490 495
Thr Leu Gln Gly Thr Tyr Thr Gly Met Ala Ala Lys Phe Gly Glu Tyr
500 505 510
Ser Glu Asp Trp Lys Thr Ile Thr Gln Glu Ser Asn Val Asn Asp Thr
515 520 525
Ala Glu Leu Tyr Lys Arg Ala Asp Ser Ala Lys Glu Trp Thr Gly Tyr
530 535 540
Lys His Thr Thr Val Thr Ala Tyr Ser Ser Leu Ala Phe Val His Asn
545 550 555 560
Ile Tyr Arg Val Asn Thr Ser Gly Thr Phe Gln Glu Ser Ser Glu Ala
565 570 575
Tyr Asp Val Val Ser Phe Asp His Gly Ile Asn Thr Glu Glu Gly Ala
580 585 590
Glu Asn Lys Ala Pro Phe Asn Leu Val Ala Val Ile Asn Gly Pro Tyr
595 600 605
Ser Gly Asp Leu Met Asn Glu Ala Ile Ser Phe Thr Ser Asp Gly Ser
610 615 620
Ser Lys Asp Glu Asp Gly Lys Ile Thr Ile Ser Tyr His Lys Trp Asn
625 630 635 640
Glu Phe Gly Asp Gly Phe Ala Val Ser Asn Glu Gln Asn Pro Thr His
645 650 655
Val Tyr Val Thr Thr Lys Glu Leu Gly Thr Tyr Thr Thr Lys Phe His
660 665 670
Leu Thr Phe Val Thr Asp Asp Lys Gly Ala Thr Asn Thr Ala Thr Phe
675 680 685
Ala Thr Val Thr Val Gln Lys Ala Lys Glu Asp Lys Phe Arg Ile Gln
690 695 700
Ile Pro Leu Lys Ala Asn Thr Lys Thr Gly Glu Phe Asn Leu Ala Ser
705 710 715 720
Val Tyr Ala Ala Asn Leu Thr Leu Gln Val Val Gln Ala Ile Ala Tyr
725 730 735
Ala Arg Thr Gly Thr Asp Thr Val Asp Gln Asn His Ala Thr Val Leu
740 745 750
Met Leu Glu Arg Asn Glu Glu Lys Leu Ser His Gly Ser Asp Leu Ser
755 760 765
Ala Phe Val Asn Trp Glu Ala Ala Gly Ser Phe Leu Lys Ile Lys Lys
770 775 780
Thr Val Leu Gly Glu Asn Gly Glu Val Leu Ala His Met Phe Tyr Glu
785 790 795 800
Val Phe Asn Ile Ala Asn Asn Ser Glu Ser Val Tyr Asn Gly Lys Ile
805 810 815
Leu Glu Thr Thr Gly Ala Asp Gly Met Ala Glu Leu Asn Asn Leu Pro
820 825 830
Thr Ile Gly Thr Tyr Thr Thr Leu Leu Lys Glu Ile Lys Ser Ala Pro
835 840 845
Thr Gly Tyr Val Ser Asp Asp Lys Pro Gln Thr Ile Glu Val Lys Thr
850 855 860
Asp Gly Glu Thr Gly Ala Val Gln Ile Val Ser Asn Asn Lys Val Lys
865 870 875 880
Gly Asn Ile Glu Ile Lys Lys Leu Ser Asp Ser Gly Lys Ser Ile Leu
885 890 895
Pro Asn Phe Val Glu Phe Thr Val Phe Thr Glu Asp Gly Lys Glu Val
900 905 910
Lys Lys Val Val His Thr Lys Glu Asn Gly Ile Ala Asn Val Met Glu
915 920 925
Tyr Asp Leu Thr Tyr Gly Ser Lys Tyr Leu Tyr Phe Leu Glu Leu Thr
930 935 940
Lys Thr Pro Asn Gly Tyr Ile Gly Asn Lys Thr Lys Tyr Pro Asp Phe
945 950 955 960
Glu Ile Lys Glu His Asn Lys Thr Ser Leu Thr Asp Phe Thr Glu Val
965 970 975
Glu Leu Asn Thr Phe Glu Lys Met Glu Pro Val Phe Gly Val Gln Leu
980 985 990
Pro Val Gln Ser Glu Leu Ala His Ser Ser Lys Val Leu Glu Ser Lys
995 1000 1005
Ser Phe Glu Lys Arg Leu Phe Gln Phe Asn Ala Asp Leu Ser Phe
1010 1015 1020
Gln Arg Pro Leu Pro Glu Val Thr Lys Lys Glu Ser Lys Gln Leu
1025 1030 1035
Ala Val Ala Lys Thr Tyr His Thr Ile Ala Glu Leu Asn Gln Leu
1040 1045 1050
Ser Asn Gln Gln Leu Ser Val Asp Leu Leu Val Leu Thr Ile Asp
1055 1060 1065
Trp Glu Gln Thr Asp Ile Thr Gly Leu Phe Gln Phe Asn Thr Asp
1070 1075 1080
Ser Leu Ala Leu Phe Tyr Gln Asn Asp Ser Ser Arg Met Gln Thr
1085 1090 1095
Ile Ile Asp Lys Leu Lys Gln Gln Gly Gln Ala Tyr Thr Lys Asp
1100 1105 1110
Ser His Leu Asp Ser Lys Gly Ile Glu Thr Phe Asp Leu His Val
1115 1120 1125
Glu Val Leu Arg Ser Gly Phe Tyr Leu Gly Phe Tyr Asn Ser Ser
1130 1135 1140
Glu Leu Ser Thr Lys Leu Asn Glu Arg Leu Ser Tyr His Asp Lys
1145 1150 1155
Ser Cys Leu Pro Ala Leu Lys His Ala Met Ala Asn Asn Ser Asn
1160 1165 1170
Phe Lys Leu Gly Thr Leu Glu Gln Asn Arg Met Leu Val Val Ser
1175 1180 1185
Ser Tyr Gly Lys Leu Ile Gly Asn Ala Ser Ser Asp Met Val Glu
1190 1195 1200
Thr Ile Thr Ser Ala Ala Lys Ile Phe Lys Gln Tyr Glu Glu Asn
1205 1210 1215
Met Asp Asn Phe Ser Thr Leu Asp Val Asp Met Asn Leu Ser Ala
1220 1225 1230
Gly Lys Glu Tyr Val Met Val Leu Lys Gly Lys Leu Val Thr Asp
1235 1240 1245
Lys Asp Ala Thr Thr Asn Lys Pro Leu Leu Val Asp Gly Lys Glu
1250 1255 1260
Asp Asp Val Thr Val Glu Ser Lys Phe Thr Ala Lys Glu Lys His
1265 1270 1275
Asn Gly Ser Ile Thr Leu Ser Asp Phe Thr Phe Asn Ala Ser Ala
1280 1285 1290
Ser Leu Gln Thr Gly Lys Glu Val Val Val Phe Glu Glu Leu Tyr
1295 1300 1305
Gln Asp Asn Ile Leu Val Ala Ile His Ala Glu Ile Glu Asp Lys
1310 1315 1320
Leu Gly Gln Thr Leu Val Lys Leu Phe Lys Glu Gly Lys Ser Glu
1325 1330 1335
Gln Pro Lys Pro Glu His Pro Asn Ser Gly Lys Asn Thr Pro Thr
1340 1345 1350
Pro Glu Gln Pro Asn Met Glu Gln Val Lys Glu Gln Met Lys Lys
1355 1360 1365
Glu Phe Glu Ile Gln Ser Lys Ile Gly Trp Leu Pro Gln Thr Met
1370 1375 1380
Ser Gly Thr Asn Leu Thr Ser Ser Trp Ile Ser Met Ala Ala Gly
1385 1390 1395
Ala Leu Leu Leu Ile Val Gly Gly Val Ile Phe Leu Lys Arg Lys
1400 1405 1410
Leu Asn Ala
1415

Claims (14)

1.SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质在提高苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白毒力中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述蛋白质用于提高所述伴孢晶体蛋白的杀虫能力。
3.一种组合物，其特征在于，包括：SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质和苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白。
4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述伴孢晶体蛋白与所述蛋白质的质量比为1：(1～5)。
5.一种杀虫剂，其特征在于，包括：权利要求3或4所述的组合物。
6.一种获得SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质的方法，其特征在于，包括：
步骤1：将苏云金芽孢杆菌进行发酵培养，所得发酵液离心，收集上清液；
步骤2：将所述上清液进行透析，收集截留物；
步骤3：将所述截留物依次通过阳离子交换柱和阴离子交换柱，收集预定时间段流出的馏分，得到所述蛋白质；
其中，所述透析所采用的截留分子量为2000～4000，所述阳离子交换柱选自GESuperoseTM 6Increase，所述阴离子交换柱选自GE Capto IEX阴离子交换柱。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养的时间为40～60小时。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤3包括：将所述截留物先通过阳离子交换柱，收集特定时间段流出的馏分，再将所述馏分通过阴离子交换柱，收集特定时间段流出的馏分，得到所述蛋白质。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤3进一步包括：将收集的所述馏分进行冷冻干燥，制成透析冻干粉。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤3进一步包括：将收集的所述馏分和所述上清液一同进行冷冻干燥，制成上清和透析混合冻干粉。
11.一种增强苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白毒力的方法，其特征在于，包括：将苏云金芽孢杆菌的伴孢晶体蛋白与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质进行混合处理。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述伴孢晶体蛋白与所述蛋白质的质量比为1：(1～5)。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质是以权利要求8所述获得SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的蛋白质的方法中的所述透析冻干粉或所述上清和透析混合冻干粉的形式提供的。
14.一种杀虫方法，其特征在于，包括：将权利要求5所述杀虫剂施加于待处理的昆虫。
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