CN112409446A - 一种非变性人h铁蛋白装载药物的方法 - Google Patents

一种非变性人h铁蛋白装载药物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于铁蛋白封装药物技术领域，具体公开了一种非变性人H铁蛋白装载药物的方法。本发明通过HFn‑小分子药物晶体结构分析，鉴定发现HFn的蛋白壳上存在12条药物通道，决定该通道的关键氨基酸是Asp89‑Cys90‑Asp91‑Asp92，同时，该小分子药物通道的氨基酸具有温度因子调控的性质。基于上述发现，本发明在保证铁蛋白结构不变，非变性条件下，通过探索不同孵育温度和/或不同的孵育条件，在保持铁蛋白结构完整前提下，实现了对HFn包载药物最优条件的确定。利用本发明所获得的非变性条件下的包载条件，可以方便、快捷、高效、足量的利用HFn包载不同的小分子药物。

Description

一种非变性人H铁蛋白装载药物的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年07月16日提交的中国专利申请CN2020106856800的优先权，并且通过引用将其全部并入。
技术领域
本发明属于铁蛋白封装药物技术领域，具体涉及一种非变性人H铁蛋白装载药物的方法。
背景技术
铁蛋白(ferritin)是一种铁储存蛋白，在细胞的铁稳态和抗氧化中起重要作用。由于其独特的24个亚基自组装形成的、可通过基因和化学修饰来实现附加功能的蛋白质外壳和能够封装药物的中空腔的结构，铁蛋白已经成为一种很有转化前景的药物递送载体1。最近的研究表明，人重链铁蛋白(Heavy-chain ferritin，HFn)的受体是转铁蛋白受体1(Transferrin receptor1，TfR1)，即无需任何靶向修饰，铁蛋白可通过与受体TfR1相互作用主动靶向包括肺癌和乳腺癌在内的不同类型的肿瘤细胞(ZL201110122433.0，PCT/CN2012/075291)，表明了铁蛋白在肿瘤靶向应用中的潜在用途2-6。可见，铁蛋白作为化疗药物载体在肿瘤治疗领域具有巨大的潜力7,8。
目前已有众多化疗药物被成功装载入铁蛋白内部并用于肿瘤治疗中。然而，其载药效率仍相对较低。目前，铁蛋白的载药方法主要分为三种，包括直接将药物化学偶联到铁蛋白表面，pH介导铁蛋白的解聚/复聚法和脲介导的铁蛋白解聚/复聚法(ZL201410230829.0，PCT/CN2014/140159)。化学偶联法制备的药物暴露在铁蛋白表面，可能会造成对铁蛋白理化性质的影响，同时容易因linker的断裂造成潜在毒性。铁蛋白解聚/复聚法将药物封装到蛋白壳内部，可以避免以上问题。pH介导的铁蛋白解聚/复聚装载体系中，因为剧烈的pH变化会损伤蛋白的结构，因此造成药物装载后，铁蛋白-药物复合体不稳定，难以实现产业化转化9；脲介导的铁蛋白解聚/复聚体系，孵育时间长，蛋白梯度透析损失大，最重要的是药物装载效率有限，不能满足临床需求。因此，本领域亟需开发温和、稳定、便捷的新型H Fn载药方法。
参考文献：
1.He,J.；Fan,K.；Yan,X.,Ferritin drug carrier(FDC)for tumor targetingtherapy.Journal of Controlled Release 2019.
2.Fan,K.；Cao,C.；Pan,Y.；Lu,D.；Yang,D.；Feng,J.；Song,L.；Liang,M.；Yan,X.,Magnetoferritin nanoparticles for targeting and visualizing tumourtissues.Nat Nanotechnol 2012,7(7),459-64.
3.Liang,M.；Fan,K.；Zhou,M.；Duan,D.；Zheng,J.；Yang,D.；Feng,J.；Yan,X.,H-ferritin-nanocaged doxorubicin nanoparticles specifically target and killtumors with a single-dose injection.Proc Natl Acad Sci U S A 2014,111(41),14900-5.
4.Fan,K.；Jia,X.；Zhou,M.；Wang,K.；Conde,J.；He,J.；Tian,J.；Yan,X.,Ferritin Nanocarrier Traverses the Blood Brain Barrier and Kills Glioma.ACSNano 2018,12(5),4105-4115.
5.Cheng,X.；Fan,K.；Wang,L.；Ying,X.；Sanders,A.J.；Guo,T.；Xing,X.；Zhou,M.；Du,H.；Hu,Y.；Ding,H.；Li,Z.；Wen,X.；Jiang,W.；Yan,X.；Ji,J.,TfR1 binding withH-ferritin nanocarrier achieves prognostic diagnosis and enhances thetherapeutic efficacy in clinical gastric cancer.Cell Death Dis 2020,11(2),92.
6.Jia,X.；Fan,K.；Zhang,R.；Zhang,D.；Zhang,J.；Gao,Y.；Zhang,T.；Li,W.；Li,J.；Yan,X.；Tian,J.,Precise visual distinction of brain Glioma from Normaltissues via targeted Photoacoustic and fluorescence navigation.Nanomedicine:Nanotechnology,Biology and Medicine 2020,102204.
7.Fan,K.；Gao,L.；Yan,X.,Human ferritin for tumor detection andtherapy.WIREs Nanomedicine and Nanobiotechnology 2013,5(4),287-98.
8.Jin,Y.；He,J.；Fan,K.；Yan,X.,Ferritin variants:inspirations forrationally designing protein nanocarriers.Nanoscale 2019,11(26),12449-12459.
9.Kim,M.；Rho,Y.；Jin,K.S.；Ahn,B.；Jung,S.；Kim,H.；Ree,M.,pH-dependentstructures of ferritin and apoferritin in solution:disassembly andreassembly.Biomacromolecules 2011,12(5),1629-40.
发明内容
为实现上述目的，本发明通过晶体学结构方法，鉴定了天然人重链铁蛋白表面存在的小分子药物通道，并发现该小分子药物通道受温度调控，可在非变性条件下，实现对铁蛋白空腔的有效药物装载。该发明为铁蛋白药物载体的药物装载提供了一种温和、有效、便捷的新思路和新方法。
第一方面，本发明提供了一种人H铁蛋白载药通道，所述载药通道包含氨基酸Asp89-Cys90-Asp91-Asp92(SEQ ID NO:1)。
在某些实施例中，所述载药的人H铁蛋白可为基因工程的全人重链铁蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，也可为铁蛋白的所有变体，所述变体包括不限于表面修饰、偶联任何功能性配体或荧光分子的铁蛋白，以及通过基因工程改造在其表面或者内部展示功能性肽段、纳米抗体等等的铁蛋白。
在某些实施例中，所述药物为小分子药物，包括但不限于小分子药物，优选为小分子化疗药物及小分子核酸药物。所述小分子化疗药物包括亲水性和双亲性小分子药物，优选为抗生素类肿瘤药物、天然来源类抗肿瘤药、金属化合物、放射性同位素、烷化剂、抗代谢类抗肿瘤药，激素类抗肿瘤药物，更优选为阿霉素、表阿霉素(Epirubicin)、顺铂(Cisplatin)、奥沙利铂(Oxaliplatin)；所述小分子核酸药物优选为siRNA，lncRNA。
第二方面，本发明提供了一种人H铁蛋白装载药物的方法，所述人H铁蛋白在天然状态下通过离子/疏水通道实现药物的装载。
在某些实施例中，所述载药的人H铁蛋白也可为铁蛋白的所有变体，所述变体包括不限于表面修饰、偶联任何功能性配体或荧光分子的铁蛋白，以及通过基因工程改造在其表面或者内部展示功能性肽段、纳米抗体等等的铁蛋白。
在某些实施例中，所述离子/疏水通道包含氨基酸Asp89-Cys90-Asp91-Asp92(SEQID NO:1)。
在某些实施例中，所述方法还包括添加非变性剂，所述非变性剂包括多羟基化合物、糖类、氨基酸类、聚合物类等，优选为甘油、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露糖、肝素、2-羟丙基-β环糊精、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、吐温-80、柠檬酸钠、十二烷基磺酸钠，更优选为甘油。其中，所述非变性剂的添加量为15％，20％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，优选为15％。
在某些实施例中，所述药物包括但不限于小分子药物，优选为小分子化疗药物及小分子核酸药物。
在某些实施例中，所述小分子化疗药物包括亲水性和双亲性小分子药物，优选为抗生素类肿瘤药物、天然来源类抗肿瘤药、金属化合物、放射性同位素、烷化剂、抗代谢类抗肿瘤药，激素类抗肿瘤药物，更优选为阿霉素、表阿霉素(Epirubicin)、顺铂(Cisplatin)、奥沙利铂(Oxaliplatin)；所述小分子核酸药物优选为siRNA，lncRNA。
在某些实施例中，所述装载的孵育温度为20-70℃，优选为25-70℃，更优选为30-70℃，更优选为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃，更优选为55-65℃，更优选为56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃。
在某些实施例中，所述装载的孵育时间为0.1-24h，优选为1-12h，更优选为1h-6h，更优选为1h、2h、3h、4h、5h、6h。
在某些实施例中，在装载反应体系中，所述人H铁蛋白的浓度为0.1～90mg/mL,优选为0.5～9mg/mL，更优选为1～5mg/mL，更优选为1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、3mg/mL、3.5mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL，。
在某些实施例中，装载反应体系包含缓冲液，缓冲体系为Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液(PBS)、碳酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液或柠檬酸盐缓冲液，所述缓冲液的pH值为6-8，9.所述缓冲液浓度为20～500mM，更优选地，25～100mM，更优选地，25～50mM。
在某些实施例中，在装载反应体系中，所述人H铁蛋白与小分子药物装载质量比为1:10～10:1，优选为1:1～5:1，更优选为1:1～3:1。
第三方面，本发明还提供了基于本发明提供的药物装载方法制备获得的载药人H铁蛋白。
第四方面，本发明还提供了包含上述第三方面所述的人H铁蛋白的药物组合物，其中还含有药学上可接受的载体。这些药物组合物可以用药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其他已知的赋形剂根据常规技术配制，这些常规技术是例如在以下中披露的技术：Remington:The Science and Practice of Pharmacy，第22版，Gennaro编，MackPublishing Co.，2013。
第五方面，本发明还提供了上述第四方面提供的药物组合物在制备靶向治疗肿瘤药物中的应用。所述肿瘤包括但不限于，人体实体肿瘤和血液恶性癌变细胞，如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、结直肠癌、卵巢癌、食管癌、胃癌、胸腺癌、T淋巴细胞白血病、红细胞白血病等。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
1)本发明通过晶体学结构方法，鉴定发现HFn的蛋白壳上存在12条药物通道，该通道不同于铁蛋白壳上经典的亲水性三重对称轴及疏水性四重对称轴，决定该通道的关键氨基酸是Asp89-Cys90-Asp91-Asp92。该药物通道的氨基酸具有温度因子调控的性质，随着温度升高，氨基酸残基摆动加大，发生侧移，导致药物通道扩大。
2)本发明在保证铁蛋白结构不变，非变性条件下，通过探索不同孵育温度和/或不同的孵育条件，如孵育时间为1h-6h、孵育缓冲液pH为6-8、孵育温度为30-70℃，在保持铁蛋白结构完整前提下，最终实现了高效率人H铁蛋白的载药。通过利用本发明所获得的非变性条件下的包载条件，可以方便、快捷、高效、足量的利用HFn包载不同的小分子药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1铁蛋白壳上存在天然的小分子药物通道
其中，图A为HFn-Dox的分子排阻分析，280nm吸收峰为HFn吸收峰，485nm为Dox吸收峰；图B为HFn及HFn-Dox的Native Page分析；图C为对HFn-Dox中的Dox在native page上额直接观察，Dox分子的红色在Native Page上肉眼可见。
图2HFn-Dox的晶体学结构，表明HFn蛋白壳上存在小分子药物通道，关键氨基酸为Asp89-Cys90-Asp91-Asp92。
图3HFn蛋白表面存在Dox药物装载通道的突变验证。其中，图A-D分别为HFn、Block-HFn(C90S)、Enlarged-HFn-1(D92G)和Enlarged-HFn-2(R43G+R79G)突变体的示意图。
图4HFn蛋白表面存在Dox药物装载通道的突变验证。其中，图A为HFn突变体与HFn的SEC分析，图B为HFn及HFn突变体的SDS-PAGE及Native Page分析，图C为HFn及HFn突变体装载阿霉素效率的对比。
图5通过加热能够控制小分子药物装载通道的开关程度，促进小分子药物的装载。其中，图A为HFn上小分子药物通道的温度因子图。结构表明，该通道随着温度增加，可增加通道的开关程度。图B为孵育温度对HFn装载Dox的影响。图C为孵育温度对HFn回收率的影响。图D为孵育温度对HFn装载Dox装载率及回收率的综合影响。图E为孵育时间对HFn装载Dox的影响。图F为孵育时间对HFn回收率的影响。图G为孵育时间对HFn装载Dox装载率及蛋白回收率的综合影响。星号表示最优条件。
图6加温方法能够稳定装载Dox在HFn内腔，且不影响铁蛋白HFn结构。其中，图A为不同温度处理，装载药物前后，不改变HFn的二级结构。图B、C为不同温度处理，装载Dox前后，均不改变HFn的分子排阻位置。图D为不同温度处理，装载药物前后，不影响HFn在NativePage的位置。
图7与Urea、pH变复性法相比，非变性温度装载方法的装载效率大大提高。温度、脲、pH三种方法装载阿霉素的装载量(A)，HFn回收率(B)，装载后的颜色(C)，装在前后的圆二色(D)，在血清中的稳定性(E)和在酸性条件下的药物释放(F)分析对比。
图8非变性温度装载方法也同样适用于其他小分子药物。图A为非变性温度法处理条件下，HFn对表阿霉素、顺铂，奥沙利铂的装载对比。图B为非变性温度处理法装载不同药物后，HFn回收率的分析。
图9LFn表面不具有类似的药物装载通道。图A为同样的非变性温度装载法中，LFn不具有特别强的装载能力。图B为t同样方法处理后，HFn与LFn装载阿霉素的颜色对比。
图10与基于脲解聚/复聚装载药物的方法相比，非变性的温度装载药物方法合成的HFn-Dox表现出极好的生物安全性(A，C)和高效杀伤肿瘤的能力(B，D)。
图11非变性温度装载方法可有效将siRNA装载入HFn，并在体内脑瘤抗肿瘤实验中表现出非常好的抗肿瘤效果。每组三只脑瘤原位癌小鼠，荧光信号为采集的肿瘤细胞自身Luciferase催化底物的荧光信号。
图12HFn及HFn突变体装载阿霉素效率的对比。
图13非变性温度装载其他抗肿瘤药物的HPLC标曲法药物浓度检测，其中，A-G分别为药物舒尼替尼(sunitinib)、克唑替尼(crizotinib)、帕博西尼(Palbociclib)、伊立替康(irinotecan)、美登素(maytansine)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、己酮可可碱(Pentoxiphyline)。
图14非变性温度法处理条件下，HFn对其他抗肿瘤药物装载对比。
图15非变性温度处理法装载不同药物后，HFn回收率的分析。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。实施例中所用试剂除非特殊说明，均为市售常规产品。
定义
本发明的铁蛋白是指可以形成笼状结构的任何铁蛋白，其可以是天然来源的铁蛋白，也可以是重组表达的铁蛋白，或其突变体，其可以来源于原核生物、原生生物、真菌、植物或动物，例如来源于细菌、真菌、昆虫、爬行动物、禽类、两栖动物、鱼类、哺乳动物，例如来源于啮齿类动物、反刍动物、非人灵长类动物或人类，例如小鼠、大鼠、豚鼠、犬类、猫、牛、马、羊、猴、大猩猩、人。从细菌到人类，尽管不同生物的铁蛋白氨基酸序列具有极大的差别，但其结构相似，均可以形成蛋白壳结构。在一些实施方案中，本发明的铁蛋白是人铁蛋白，在一些实施方案中，本发明的铁蛋白是基因工程全人重链铁蛋白，其核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示。
本发明的药物或包载药物是指可以包载在铁蛋白中的任何药物，只要所述药物的分子尺寸小于8纳米。在一些实施方案中，本发明的药物或包载药物选自抗生素类肿瘤药物、天然来源类抗肿瘤药、金属化合物、放射性同位素、烷化剂、抗代谢类抗肿瘤药，激素类抗肿瘤药物。其中抗生素类抗肿瘤药选自阿霉素(盐酸多柔比星)，盐酸佐柔比星，戊柔比星，硫酸博莱霉素，丝裂霉素，盐酸表柔比星，盐酸依达比星，放线菌素D，光辉霉素，柔红霉素，吡柔比星，表阿霉素，依达比星，阿克拉霉素，博来霉素A5，色霉素A3，盐酸博来霉素，棕霉素，盐酸平阳霉素，柔红霉素，盐酸阿柔比星，含氮霉素，匹来霉素，盐酸吡柔比星，放线菌素C；天然来源类抗肿瘤药选自盐酸拓扑替康，10-羟基喜树碱，7-乙基-10-羟基喜树碱，10-羟基喜树碱，鲁比特康，白藜芦醇，喜树碱，紫杉醇，秋水仙素，依托泊甙，多西他赛，硫酸长春碱，斑蝥素，伊立替康，舒尼替尼，鬼臼毒素，拓扑替康，克唑替尼，高三尖杉酯碱，埃博霉素，替尼泊甙，帕博西尼，野百合碱，长春新碱，长春瑞宾，硫酸长春地辛，靛玉红，硫酸长春新碱，去甲斑蝥素，去甲斑蝥素，鬼臼毒素，多西他赛，秋水仙碱，三尖杉碱，埃博霉素C，埃博霉素E，华蟾素，硫酸长春地辛，去甲斑蝥酸钠，美登素，肿节风，足叶草脂，重酒石酸长春瑞宾，马蔺子素，鸦胆子油，米托肼，三尖杉酯碱，秋裂胺，羟喜树碱，甲基斑蝥胺；金属化合物选自卡铂，顺铂，奈达铂，奥沙利铂等；放射性同位素选自钋，氡，钫，镭，锕，钍，镤，铀，镎，钚，锝，钷，镅，锔，锫，锎，锿，镄，钔，锘，铹，104，105，106，107，108和109号元素；烷化剂选自盐酸苯达莫司汀，咪唑司汀，苯磺酸贝托司汀，白消安，恩比兴，达卡巴嗪，洛莫司汀，苯丁酸氮，芥卡莫司汀，三亚乙基硫代磷酰胺，盐酸尼莫司汀，美法仑尼莫司汀，苯达莫司汀，雌莫司汀，磷酸钠2,3-二溴-1,4-丁烯二醇，雌莫司汀，六甲蜜胺，福莫司汀，尼莫司汀，加莫司汀，泼尼莫司汀，雌莫司汀，磷酸依考莫司汀，他莫司汀，氨莫司汀，雌莫司汀，盐酸苯达莫司汀杂质A，奈莫司汀，波呋莫司汀，盐酸依匹司汀，盐酸苯达莫司汀杂质C，洛莫司汀胶囊，盐酸倍他司汀，盐酸倍它司汀，二硫莫司汀，牛磺莫司汀，依莫司汀，螺莫司汀，盐酸苯达莫司汀杂质B，泼尼莫司汀，司莫司汀，雷莫司汀，卡波醌，甲尿嘧啶氮芥，氮芥，依匹司汀，碱乌拉莫司汀，二溴甘露醇，盐酸氧氮芥，氧氮芥，依匹哌啶，邻脂苯芥，去水卫矛醇，亚胺醌，甲氧芳芥，恩普氨酯，甘磷酰芥，硝卡芥，异芳芥，氮甲，三亚胺醌，甘露醇氮芥，2，4，6-三亚乙基亚胺-1，3，5-三嗪；抗代谢类抗肿瘤药选自甲氨蝶呤，5-氟-2'-脱氧脲核苷，吉西他滨，去氧氟尿苷，阿糖胞苷，6-硫鸟嘌呤，盐酸吉西他滨，磷酸氟达拉滨，酒石酸长春瑞滨，氟达拉宾，替莫唑胺，己酮可可碱，克罗拉滨，奈拉滨，盐酸环胞苷，替加氟，盐酸阿糖胞苷，6-巯基嘌呤，4-羟基-5-氟嘧啶，5-氟尿嘧啶，氨基蝶呤，米替福新，雷替曲塞，脱氧助间型霉素，卡莫氟，安吖啶，乙嘧替氟，替加氟，环胞啶，甲异靛，氟尿嘧啶，肌苷二醛，1-乙烯基-1-甲基-2，4-二(丙-1-烯-2-基)环己烷，磺巯嘌呤钠；激素类抗肿瘤药选自依西美坦，雷洛昔芬，氟维司群，来曲唑，阿那曲唑，氟他胺，枸橼酸他莫昔芬，屈洛昔芬，艾多昔芬，尼鲁米特，氨鲁米特，福美司坦，他莫昔芬，托瑞米芬，氨鲁米特。
不受限于任何理论，本发明的包载药物的铁蛋白可以靶向肿瘤，与肿瘤结合后释放包载的药物，药物从而作用于肿瘤，实现对肿瘤的预防和/或治疗。例如，人铁蛋白可能通过结合其受体转铁蛋白受体(Transferrin Recep tor 1，TfR1)特异性靶向人体实体肿瘤和血液恶性癌变细胞，如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、结直肠癌、卵巢癌、食管癌、胃癌、胸腺癌、T淋巴细胞白血病、红细胞白血病等。
在一些实施方案中，本发明的药物或包载药物选自抗肿瘤药物之外的药物，即，非抗肿瘤药物。例如，这样的药物可以是不需要靶向性的药物，例如全身性施用的药物，例如难溶的、不稳定的和/或易发生相互作用而失效的药物。在一些实施方案中，这样的药物选自两性霉素B、醋酸格拉替雷、复合葡萄糖酸钠铁、雷帕霉素、盐酸司维拉姆硫酸根结合剂、注射用维替泊芬、蔗糖铁、聚乙二醇干扰素α-2a/2b、非诺贝特、培非格司亭、利培非格司亭、阿米卡星、芬太尼、环孢霉素、西替利嗪、辣椒素、神经酰胺等。在一些实施方案中，本发明的非抗肿瘤药物选自放射性药物、神经递质类药物、多巴胺受体激动剂、神经中枢抗胆碱药、胆碱受体激动剂类药物、γ分泌酶抑制剂、抗氧剂或麻醉剂，更优选地，放射性药物选自64Cu、235U，神经递质类药物选自碳酰胆碱、阿托品、东莨菪碱、多巴胺及其衍生物，多巴胺受体激动剂选自溴隐亭、培高利特、阿扑吗啡等麦角碱类衍生物及非麦角碱类衍生物，神经中枢抗胆碱药选自苯海索、苯扎托品及丙环定，胆碱受体激动剂类药物选自毒蕈碱、毛果芸香碱，γ分泌酶抑制剂选自双氟酮类，抗氧剂选自褪黑激素，麻醉剂选自蒽胺。
在一些实施方案中，在将药物包载到铁蛋白中时需要在孵育溶液中加入添加剂，以促进药物的溶解和/或铁蛋白的聚集，从而实现和/或改善药物包载效果。例如，在一些实施方案中，涉及包载铂类药物，此时需要在孵育溶液中加入DMA、DMF、DMSO或其混合物。根据待包载药物的不同，需要添加的添加剂也可能相应不同。
在一些实施方案中，孵育溶液的缓冲体系为Tris-HCl缓冲液、磷酸盐缓冲液(PBS)、碳酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液或柠檬酸盐缓冲液，缓冲液的pH介于6-8，例如6.5、7、7.5，缓冲液的浓度介于20～500mM，更优选地，25～100mM，更优选地，25～50mM。根据使用的缓冲液的不同，其缓冲能力、pH范围、所需浓度等可能需要进行调整。
实施例1HFn蛋白壳上小分子药物阿霉素(Dox)通道的结构解析
本实施例采用以下方法步骤针对HFn蛋白壳上小分子药物阿霉素(Dox)的通道进行结构解析：
步骤(1)HFn表达质粒的构建：HFn的DNA序列(如SEQ ID No：2所示，其氨基酸序列如SEQ ID No：3所示)经全基因合成(Generay,Shanghai)后，使用NdeI和BamHI限制性内切酶酶切，将其克隆到具有NdeI和BamHI限制酶切位点的大肠杆菌(E.coli)表达载体pET22b(+)质粒(Novagen)中，经DNA测序鉴定序列正确。
步骤(2)HFn的表达和纯化：将上述获得的质粒转入E.coli BL21(TransGen)表达菌株，转化后的大肠杆菌在含100mg/L氨苄的LB培养基中生长过夜，然后用0.8mM的IPTG(Sigma-Aldrich)，30℃培养8h来诱导蛋白表达。
步骤(3)蛋白纯化：4000×g离心15min收集菌体，并在Tris缓冲液(20mM Tris，pH8.0)中重悬。重悬的大肠杆菌菌体高压匀浆破碎后，12000×g离心30min收集上清。上清液80℃热处理20min，使大部分大肠杆菌杂蛋白变性沉淀下来，再次12000×g离心30min收集上清。随后用阴离子交换柱Q-Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)纯化分离HFn及其突变体蛋白，最后用superdex 200(10/300GL，GE Healthcare)分子筛纯化分离。以牛血清白蛋白为标准，采用BCA蛋白检测试剂盒(Pierce)测定HFn及其突变体蛋白的浓度，三次重复。将得到的蛋白浓缩到10mg/mL，以坐滴法在48孔坐滴板中进行晶体生长。晶体生长池液为100mM Bicine，pH 9.0，1.6-2.0M MgCl2。以1：1比例混合1mL蛋白和1mL池液，置于坐滴孔中，291K下避光进行晶体生长。其后，将可用于数据收集的晶体转入含0.5mM阿霉素的池液中，291K下避光浸泡2-5天后经冻存液处理，保存在液氮罐中。
步骤(4)数据收集和结构解析：冻存的晶体进行衍射数据的收集。收集的数据经HKL-3000软件处理后，以HFn晶体结构(5N27)为模型，用分子置换法破解了相位，经过多轮的优化，最终解析了1.6埃内含阿霉素的HFn晶体结构。
结果显示：24聚体铁蛋白分子可以在天然状态下不经亚基解聚过程包载Dox分子(如图1所示)，但完整的铁蛋白分子仅有的三重轴或四重轴处的通道很小，不能通过Dox分子，因此Dox分子进入铁蛋白内核的作用机理仍然未知。同时，可以少量装载Dox的HFn的晶体结构与原有的结构几乎相同(root mean standard deviation(r.m.s)为0.09埃)，在新解析的结构中，我们发现位于铁蛋白loop区的89-92位残基与原有的HFn结构一样，与附近的残基或其他分子的相互作用较少，且片段柔性远远高于未装载铁离子的铁蛋白，表现在Fo-Fc密度图中(如图2所示)，这部分残基的主链为负密度，这暗示在Dox的装载过程中该片段残基很可能发生了局部的构象变化，参与了Dox的通道形成。
实施例2HFn蛋白表面存在Dox药物装载通道的突变验证
为了验证HFn蛋白表面存在Dox药物装载通道，我们合成HFn的系列突变体。包括证明通道存在的HFn C90S/C102S/C130S(SEQ ID No：4)突变体，以及扩大通道的Enlarged-HFn-1(D92G)(SEQ ID No：5)、Enlarged-HFn-2(R43G+R79G)(SEQ ID No：6)和封闭通道的Block-HFn(C90S)(SEQ ID No：7)。HFn蛋白壳上，89-91部分的残基可发生侧移，其中Cys90和Asp91和周围残基或水分子几乎没有相互作用，柔性尤其高。C90S/C102S/C130S突变体的C90S与C102S间的区域形成了由相邻残基和结合的水分子形成的氢键网，这个氢键网相对固定了89-91位残基的构象，使89-91位残基很稳定，抑制了野生型HFn中柔性导致的侧移，包药实验中发现这个突变体在非变性条件下很难包载Dox，这可以证明通道确实存在，其开启需要89-91位残基保持一定的柔性。通过将Dox通道上的92位的天冬氨酸D突变为甘氨酸G，去除天冬氨酸D上的氨基酸侧链与其他残基间的相互作用，这个D92G的突变将进一步加大89-91位残基的柔性，使得Dox通道更易于打开，从而设计出突变体Enlarged-HFn-1(D92G)。通过将小分子药物通道另一侧上的R43和R79突变为甘氨酸G，去掉精氨酸R上的氨基酸侧链，扩大药物通道，从而设计出突变体Enlarged-HFn-2(R43G+R79G)。通过将Dox通道上的90位的半胱氨酸C突变为丝氨酸S，增强了该区域的亲水性，结合的水分子和周围残基形成了一个完整的氢键环，将这段残基稳定在Dox通道关闭状态，从而设计出突变体Block-HFn(C90S)。
具体方法：HFn C90S/C102S/C130S、Enlarged-HFn-1(D92G)、Enla rged-HFn-2(R43G+R79G)和Block-HFn(C90S)突变体的DNA序列经全基因合成(Generay,Shanghai)后，使用NdeI和BamHI限制性内切酶酶切，将其克隆到具有NdeI和BamHI限制酶切位点的大肠杆菌(E.coli)表达载体pET22b(+)质粒(Novagen)中，经DNA测序鉴定序列正确。之后的实验步骤按照实施例1中步骤(2)-(4)中操作。
结果显示：WT-HFn、Enlarged-HFn-1、Enlarged-HFn-2和Block-HFn蛋白均可以通过原核表达纯化的方法获取，如SDS-PAGE结果所示(如图2B所示)。透射电镜、Native-PAGE和分子排阻SEC的结果显示，Enlarged-HFn-1、Enlarged-HFn-2、Block-HFn和WT-HFn在天然状态下的分子量保持一致，都通过自组装形成了24聚体球壳状结构(如图3所示)。Enlarged-HFn-1、Enlarged-HFn-2、Block-HFn和WT-HFn的水合粒径分别为13.50nm、13.77nm、13.74nm、12.38nm。
我们通过将HFn和Dox直接混合孵育的方法来验证Dox能够通过HFn蛋白表面存在的药物装载通道进入铁蛋白内腔。我们发现，在37摄氏度条件下，通过将HFn和Dox直接混合孵育4小时后，铁蛋白HFn就能够装载25.8个左右Dox分子，而相同条件下Block-HFn的Dox装载量仅为3.4个，显著低于HFn，为HFn的12.67％；Enlarged-HFn-1的Dox装载量为58.2个，显著高于HFn，为HFn的225.7％；Enlarged-HFn-2的Dox装载量为53.1个，显著高于HFn，为HFn的205.7％(如图4C所示)。
实施例3通过控制温度促进小分子药物的装载
基于铁蛋白结构的分析结果，我们推测通过加热的方法能够促进铁蛋白药物通道的进一步打开，更利于药物装载。
方法：
1.温度梯度实验
在1mL反应体系中分别加入15％甘油，WT-HFn 2mg，阿霉素Dox0.75mg，50mM Trisbuffer补至1mL，pH 8.0。分别在4℃，25℃，37℃，42℃，50℃，60℃，65℃，72℃条件下孵育4h。12000rpm，4℃条件下离心10min，取上清液，脱盐柱HiprepTM 26/10Desalting处理去除游离阿霉素，获得HFn-Dox铁蛋白阿霉素样品。分别测定HFn-Dox样品中HFn和Dox的浓度来计算Dox装载量和HFn蛋白收率。
2.时间梯度实验
在1mL反应体系中分别加入15％甘油，WT-HFn 2mg，阿霉素Dox0.75mg，50mM Trisbuffer补至1mL，pH 8.0。分别在60℃条件下孵育0.5h，1h，2h，4h，6h，8h，12h，16h，20h，24h。12000rpm，4℃条件下离心10min，取上清液，脱盐柱HiprepTM 26/10Desalting处理去除游离阿霉素，获得HFn-Dox铁蛋白阿霉素样品。分别测定HFn-Dox样品中HFn和Dox的浓度来计算Dox装载量和HFn蛋白收率。
3.反应体系中甘油浓度梯度实验
在1mL反应体系中分别加入不同甘油浓度梯度(0％，5％，10％，15％，20％，25％，30％)，WT-HFn 2mg，阿霉素Dox 0.75mg，50mM Tris buffer补至1mL，pH 8.0。分别在60℃条件下孵育4h。12000rpm，4℃条件下离心10min，取上清液，脱盐柱HiprepTM 26/10Desalting处理去除游离阿霉素，获得HFn-Dox铁蛋白阿霉素样品。分别测定HFn-Dox样品中HFn和Dox的浓度来计算Dox装载量和HFn蛋白收率。
结果如图5显示：
1.在低温或室温条件下(4℃、25℃)，Dox会吸附在HFn表面，导致HFn全部变性沉淀。随着温度升高，Dox开始从通道进入HFn内腔，HFn的Dox装载量逐步提升，并在65℃时达到了装载峰值(约100个)，不过在温度超过60℃后，HFn-Dox的稳定性开始下降，HFn开始出现沉淀，蛋白收率开始下降。综合比较装载量和装载稳定性后，我们发现在60℃孵育条件下，HFn能够稳定装载90个左右阿霉素分子，而且HFn蛋白回收率达到了90％左右。
2.在60℃条件下，孵育4-6h后Dox装载量达到了峰值(90-100个)，尤其在孵育4h时HFn还保持90％左右的回收率，时间增长，HFn的回收率开始有所下降。
3.在HFn-Dox装载体系中添加一定比例的甘油作为促溶剂，也能够进一步提高HFn的稳定性，提高HFn的回收率，在15％甘油条件下装载效果最佳。
以上结果都表明，除了突变Dox装载通道外，通过加热的方法，也能够进一步打开Dox通道，在HFn内腔快速的装载更多的Dox分子。
实施例4非变性温度装载方法
1.圆二色光谱(CD)：
在25℃下，HFn和不同温度条件下装载的HFn-Dox样品通过Chirasca n-Plus圆二色光谱仪(Applied Photophysics)获得CD光谱。样品重悬于PBS，使用浓度为0.2mg/mL。用1cm光程长度的石英比色皿，测定0.1nm分辨率下的从260nm到200nm的光谱。
2.高效液相层析分子排阻(SEC)：
分别取相同蛋白浓度(0.5mg/mL)的HFn和不同温度条件下装载的HFn-Dox样品，使用TSKgel G4000SWXL Column进行高效液相层析分子排阻分析，流动相为50mM Tris-HCl,pH7.2，检测280nm和485nm紫外吸收。上样量100μL。
3.非变性凝胶电泳(Native-PAGE)：
分别取相同蛋白量(50μg)的HFn和不同温度条件下装载的HFn-Do x样品进行Native-PAGE分析。
4.动态光散射(DLS)
准备HFn-Dox样品(100μL,0.25mg/mL)，PBS缓冲液。使用DynaPro Titan(WyattTechnology)，设置25℃，进行DLS分析。
结果如图6显示：
1.通过60摄氏度孵育4h的方法得到HFn-Dox后，我们通过分子排阻和Native-PAGE的方法证实了Dox稳定装载在了HFn内腔。SEC数据结果显示，HFn蛋白A280nm吸收峰与DoxA485nm吸收峰出峰位置重叠，表明HFn与Dox形成了稳定复合物。Native-PAGE的数据结果显示，在未染色条件下，红色条带指示的Dox位置与考马斯亮蓝染色条件下，HFn蛋白条带位置相同，且HFn-Dox与HFn条带位置基本一致，表明Dox稳定装载在了HFn内腔。
2.通过分子排阻SEC分析，我们发现在60摄氏度孵育4h的条件下，Dox本身不会发生降解，保持稳定，这近一步证明了加温方法装载Dox的可行性。
3.通过圆二色光谱(CD)分析，我们发现，HFn和不同温度条件下装载的HFn-Dox样品均表现出明显的α螺旋结构特点，且Dox装载前后HFn的二级结构没有发生变化。
4.SEC的检测结果显示，Dox装载前后，HFn的分子量和尺寸没有改变，不同温度条件下装载的HFn-Dox样品在485nm处检测到了Dox的特异性吸收峰，而在对照组HFn中则没有检测到Dox信号。
Native-PAGE的结果显示，与HFn对照相比，不同温度条件下装载的HFn-Dox样品的蛋白分子量和组装状态没有改变。
实施例5与Urea、pH变复性法相比，非变性温度装载方法装载效率大大提高
1.脲变复性法装载阿霉素
将HFn以1mg/mL的浓度溶解于8M尿素溶液(Amredco)中，室温下轻轻搅拌30min，确保HFn完全变性和溶解。以1mg/mL的浓度加入Dox(Sangon Biotech)。在室温避光条件下孵育30min后，将该混合物转移到透析袋中(截留分子量3KDa，Thermofisher Scientific)，在含1mg/mL Dox的梯度尿素溶液中(6、5、4、3、2、1和0M)依次透析，使蛋白复性。然后在PBS缓冲液(pH 7.4)中进行透析，去除游离Dox。最后，在Supe rdexTM 200pg凝胶过滤柱(GEHealthcare)上，通过分子筛纯化HFn-Dox蛋白。以牛血清白蛋白为标准品，采用BCA蛋白检测试剂盒测定HFn-Dox的浓度，平行测定三组。在485nm处(ε＝1.00×104·M-1·cm-1)测定了HFn-Dox中Dox的摩尔消光系数，并用于测定HFn-Dox纳米粒子中Dox的浓度。
2.pH变复性法装载阿霉素
利用pH变复性法在铁蛋白内腔装载阿霉素的方法是根据文献(Kilic,M.A.；Ozlu,E.；Calis,S.,A novel protein-based anticancer drug encaps ulating nanosphere:apoferritin-doxorubicin complex.Journal of biomedical nanotechnology 2012,8(3),508-14.)中描述的方法进行的，简要操作过程如下：在40mL 10mM甘氨酸乙酸缓冲液Gly-Acetate buffer(pH 2.5)中加入20mg HFn蛋白，终浓度为3mM的Dox，在4摄氏度条件下混合孵育15min，使得铁蛋白充分解体。然后缓慢加入pH 9.2的0.1M Tris buffer约50mL，将反应体系的pH值调整至4.0左右，使得铁蛋白开始逐渐重组。然后将该反应体系分别在20mM Tris buffer和PBS buffer中透析过夜，使得铁蛋白重新自组装形成天然球壳状结构，并将阿霉素装载到其内腔。4℃，12000rpm离心30min取上清，即可得到HFn-Dox样品。
3.HFn-Dox的pH5.0体外药物释放实验和稳定性分析实验
将保存在PBS缓冲液(600μM Dox当量,800μL)中的HFn-Dox纳米颗粒转移到D-Tube透析管中(截流分子量6-8KDa，Novagen)，在37℃、避光条件下温和搅拌，分别在乙酸乙酸钠缓冲液(pH 5.0)、PBS缓冲液(pH7.4)、胎牛血清(Fetal bovine serum，加1/1000NaN3)中进行透析。在不同时间点，根据在485nm处的吸收峰值，用NanoDrop 2000(ThermoScientific)测定透析缓冲液中游离Dox的释放。
4.圆二色光谱(CD)：
在25℃下，HFn和不同条件装载的HFn-Dox样品通过Chirascan-Plus圆二色光谱仪(Applied Photophysics)获得CD光谱。样品重悬于PBS，使用浓度为0.2mg/mL。用1cm光程长度的石英比色皿，测定0.1nm分辨率下的从260nm到200nm的光谱。
5.高效液相层析分子排阻(SEC)：
分别取相同蛋白浓度(0.5mg/mL)的HFn和不同条件装载的HFn-Dox样品，使用TSKgel G4000SWXL Column进行高效液相层析分子排阻分析，流动相为50mM Tris-HCl,pH7.2，检测280nm和485nm紫外吸收。上样量100μL。
结果如图7显示：
我们将加温装载Dox的方法与脲、pH变复性装载Dox的方法进行了比较分析，我们发现加温方法Dox装载效率大大提升。与脲(33个)、pH(30个)变复性装载Dox相比，加温方法的Dox装载量(90个)显著提高。而且加温装载Dox方法更加稳定，铁蛋白回收率(90％)显著高于脲变复性法(35％)和pH变复性法(15％)(如图7A-B)。
圆二色光谱(CD)和SEC的检测结果显示，与现有的Urea、pH变复性法相比，加温方法Dox装载后蛋白二级结构没有改变，而且Dox装载后铁蛋白的均一性保持良好。
我们进一步分析比较了三种Dox装载方法生产的HFn-Dox的稳定性和药物释放能力。我们发现加温装载Dox和脲变复性法装载Dox时，HFn-Dox在PBS和胎牛血清中的稳定性要显著好于pH变复性法装载Dox。尤其是加温装载Dox在37摄氏度条件下，在PBS和胎牛血清中透析7天也能保证药物基本没有漏出。并且，在室温放置1个月的条件下，加温装载Dox的HFn-Dox也无明显的沉淀出现，表明加温装载Dox的HFn-Dox样品表现出极好的稳定性。
同时，我们发现，在pH 5.0的酸性条件下，三种Dox装载方式合成的HFn-Dox样品都能实现药物释放。
以上结果表明，加温方法的Dox装载效率要显著高于现有的Urea、pH变复性法，且加温方法合成的HFn-Dox具有更好的稳定性和酸性条件下的药物释放能力。
实施例6非变性温度装载方法也同样适用于其他小分子药物
利用相同的装载方法，我们尝试在60摄氏度孵育4h的条件下，装载其他的小分子药物，如表阿霉素(Epirubicin)、顺铂(Cisplatin)、奥沙利铂(Oxaliplatin)，以证明HFn表面小分子药物装载通道的普适性。以Dox装载为例，在1mL反应体系中分别加入15％甘油，WT-HFn 2mg，阿霉素Dox 0.75mg，50mM Tris buffer补至1mL，pH 8.0。在60℃条件下孵育4h。12000rpm，4℃条件下离心10min，取上清液，脱盐柱HiprepTM 26/10Desalting处理去除游离阿霉素，获得HFn-Dox铁蛋白阿霉素样品。
通过实验我们发现，如图8所示，加温方法也同样能够用来装载表阿霉素(Epirubicin)、顺铂(Cisplatin)、奥沙利铂(Oxaliplatin)，装载量分别达到了45个、130个、117个，且蛋白回收率分别达到了83％、63％、60％。上述结果进一步证实了HFn表面药物装载通道的存在。
实施例7LFn表面不具有类似的药物装载通道
从结构分析结果，我们发现LFn蛋白表面并不存在与HFn一样的药物装载通道，为了证实结构分析的结果，我们尝试用加温方法在60摄氏度孵育4h的条件下，向LFn内腔装载Dox。在1mL反应体系中分别加入15％甘油，LFn 2mg，阿霉素Dox 0.75mg，50mM Tris buffer补至1mL，pH 8.0。在60℃条件下孵育4h。12000rpm，4℃条件下离心10min，取上清液，脱盐柱HiprepTM 26/10Desalting处理去除游离阿霉素，获得LFn-Dox铁蛋白阿霉素样品。
结果如图9显示：在相同的装载条件下，LFn的Dox装载量只有25个左右，显著低于HFn。上述结果表明，LFn表面不具有类似的药物装载通道，因此无法通过加温的方法大量装载Dox。
实施例8非变性温度装载方法合成的HFn-Dox表现出极好的生物安全性和高效杀伤肿瘤的能力
由于pH变复性法装载的HFn-Dox稳定性不好，我们无法大量合成HFn-Dox用于动物实验，因此我们分析比较了加温方法和脲变复性法合成的HFn-Dox在体内应用中的效果。
方法：
1.最大耐受实验
分别对BALB/c野生型小鼠(维通利华)尾静脉注射不同剂量的Heat-HFn-Dox(40、35、30、20、10mg/kg，Dox当量/体重)、Urea-HFn-Dox(20、10mg/kg，Dox当量/体重)、HFn(400mg/kg，蛋白/体重)，每组3只小鼠，注射药物后，每天测定各组小鼠的体重。
2.肿瘤治疗实验
本研究中的所有小鼠及其相应研究均经中国科学院动物保护与使用委员会批准。对皮下种植HepG2肿瘤模型进行治疗评估，在6周龄雌性BALB/c裸鼠(维通利华)右侧皮下植入1×106个HepG2肿瘤细胞。当肿瘤体积约为80mm3时，小鼠被随机分到5组(n＝6只/组)，分别静脉注射Heat-HFn-Dox(10mg/kg，Dox当量/体重)、Urea-HFn-Dox(10mg/kg，Dox当量/体重)、游离Dox(5mg/kg，Dox当量/体重)、HFn(200mg/kg，蛋白/体重)、PBS(200μL/只)。在实验期间，每隔一天测定各组小鼠的体重和肿瘤体积。肿瘤体积用L×W2/2计算，其中L代表肿瘤的最大直径，W代表肿瘤的最小直径。
结果如图10显示：
从实验结果中，我们发现，当尾静脉注射10mg/kg Dox当量的Heat-HFn-Dox和Urea-HFn-Dox时，小鼠均没有出现明显的体重下降；当尾静脉注射20mg/kg Dox当量的Heat-HFn-Dox和Urea-HFn-Dox时，小鼠均出现了体重下降，Heat-HFn-Dox组在第3天实现了体重恢复，而Urea-HFn-Dox组在第6天实现体重恢复；当给药量提升为25mg/kg Dox当量的Urea-HFn-Dox时，Urea-HFn-Dox组小鼠出现死亡，表明Urea-HFn-Dox的最大耐受剂量为20mg/kg Dox当量；而Heat-HFn-Dox组的最大耐受剂量则提升到了35mg/kg Dox当量。以上结果表明了Heat-HFn-Dox与Urea-HFn-Dox相比，在体内表现出了更好的生物安全性。在接下来的动物治疗实验中，我们选择了安全剂量10mg/kg Dox当量。
为了证实Heat-HFn-Dox在肿瘤治疗实验中的优越性，我们首先构建了人肝癌小鼠皮下荷瘤模型。在肿瘤生长达到大约80mm3大小时，将小鼠按照肿瘤体积平均分为5组，分别静脉注射Heat-HFn-Dox(10mg/kg，Dox当量/体重)、Urea-HFn-Dox(10mg/kg，Dox当量/体重)、游离Dox(5mg/kg，Dox当量/体重)、HFn(200mg/kg，蛋白/体重)、PBS(200μL/只)。每周给药两次，Dox组在给药两次后出现了持续的体重下降，因此停止给药；Urea-HFn-Dox组在给药3次后出现了持续的体重下降，因此停止给药；而Heat-HFn-Dox组则持续给药6次，直至对照组(Dox组、HFn组、PBS组)肿瘤全部超过1000mm3时，小鼠体重都维持平稳。Heat-HFn-Dox抑制肿瘤生长效果显著，并好于Urea-HFn-Dox。
实施例9非变性温度装载方法向HFn中装载siRNA合成的HFn-siRNA表现出极好的抗脑肿瘤活性
利用相同的装载方法，我们尝试在60摄氏度孵育4h的条件下，装载核酸药物。以靶向EGFR的siRNA装载为例，在1ml反应体系中分别加入15％甘油，WT-HFn 2mg，靶向EGFR的siRNA(Sense strand 5′-GGAGCUGCCCAUGAGAAAUtt-3′；Antisense strand 5′-AUUUCUCAUGGGCAGCUCCtt-3′，Invitrogen)20mg，50mM Tris buffer补至1mL，pH 8.0。在60℃条件下孵育4h。12000rpm，4℃条件下离心10min，取上清液，加入RNA酶(1mg/mL)于37度水浴0.5h。脱盐柱HiprepTM 26/10Desalting将蛋白样品置换于生理盐水，获得HFn-siRNA样品。
培养Luciferase标记的人神经胶质瘤细胞U87-MG-Luc(购自中国医学科学院基础医学院细胞库)至1×105左右(培养条件如下：DMEM培养基(Sigma-Aldrich)，10％胎牛血清(Sigma-Aldrich)，青霉素(100U/mL,Sigma-Aldrich)及链霉素(100μg/mL,Sigma-Aldrich)，37℃，5％CO2条件下培养)。
通过对Balb/c裸鼠(购自北京维通利华)进行脑定位仪(MouseTMSter eotaxicInstrument,Stoelting30 Co.)定位、微量注射器(10μL,Hamilton)微量注射(10μL)神经胶质瘤U87MG细胞以及手术缝合的技术手段，发明人成功构建了小鼠神经胶质瘤原位癌模型。尾静脉注射10mg/Kg铁蛋白等剂量的HFn-siRNA及其对照(HFn)，给药三次，每隔一天给药一次。然后利用小动物成像系统IVIS(PerkinElmer)进行活体小动物成像(如图11所示)。
与对照相比，装载有siRNA的HFn-siRNA可以特异性靶向脑瘤，并显著抑制脑瘤的生长。本实施例证明，非变性温度装载方法，适用于核酸药物，包括，但是不限于siRNA，并可以有效靶向脑瘤，抑制脑瘤的生长。
实施例10铁蛋白载药通道附近的R63、E67、Y39、L35、M70、F81氨基酸残基对铁蛋白载药无显著影响
为了验证铁蛋白上存在一条从外至内的完整的载药通道，我们通过结构分析，发现R63、E67、Y39、L35、M70、F81这6个氨基酸残基可能分别组成了载药通道的内部、中部和外部通道区域。其中R63、E67、Y39组成了通道的内部区域，L35、M70组成了通道的中间区域，F81位于通道的外部区域。因此，我们通过突变体设计，将上述6个氨基酸残基分别突变为丝氨酸(S)和丙氨酸(A)，去除这些氨基酸残基的侧链，从而使得通道区域被完全打开。如果这6个氨基酸残基处于药物装载通道上的话，通过该突变能够使得药物装载量提升。因此，我们分别设计了针对通道内部、中部和外部的铁蛋白突变体：HFn-Inner1(R63S)、HFn-inner2(E67S)、HFn-Inner3(Y39A)、HFn-Innergroup(R63S+E67S+Y39A)、HFn-Midgroup(L35A+M70A)、HFn-outer4(F81A)。
方法：
1.HFn-Inner1(R63S)、HFn-inner2(E67S)、HFn-Inner3(Y39A)、HFn-Innergroup(R63S+E67S+Y39A)、HFn-Midgroup(L35A+M70A)、HFn-outer4(F81A)突变体表达质粒的构建
HFn-Inner1(R63S)(SEQ ID NO:8)、HFn-inner2(E67S)(SEQ ID NO:9)、HFn-Inner3(Y39A)(SEQ ID NO:10)、HFn-Innergroup(R63S+E67S+Y39A)(SEQ ID NO:11)、HFn-Midgroup(L35A+M70A)(SEQ ID NO:12)、HFn-outer4(F81A)(SEQ ID NO:13)突变体的DNA序列经全基因合成(Generay,Shanghai)后，使用NdeI和BamH1限制性内切酶酶切，将其克隆到具有NdeI和BamHI限制酶切位点的大肠杆菌(E.coli)表达载体pET30a(+)质粒(Novagen)中，经DNA测序鉴定序列正确。
2.HFn-Inner1(R63S)、HFn-inner2(E67S)、HFn-Inner3(Y39A)、HFn-Innergroup(R63S+E67S+Y39A)、HFn-Midgroup(L35A+M70A)、HFn-outer4(F81A)突变体的表达和纯化
将上述获得的质粒转入E.coli BL21(TransGen)表达菌株，转化后的大肠杆菌在含50mg/L卡那霉素的LB培养基中生长过夜，然后用0.8mM的IPTG(Sigma-Aldrich)，30℃培养8h来诱导蛋白表达。
3.蛋白纯化：4000g离心15min收集菌体，并在Tris缓冲液(20mM Tris,pH 8.0)中重悬。重悬的大肠杆菌菌体在高压匀浆破碎后，12000g离心30min收集上清。上清液在80℃热处理20min，使大部分大肠杆菌杂蛋白变性沉淀下来，再次12000g离心30min收集上清。随后用阴离子交换柱Q-Sepharose Fast Flow(GE Healthcare)纯化分离HFn及其突变体蛋白，最后用superdexTM 20010/300GL分子筛(GE Healthcare)纯化分离。以牛血清白蛋白为标准，采用BCA蛋白检测试剂盒(Pierce)测定HFn突变体蛋白的浓度，三次重复。
4.HFn-Dox制备：纯化好的HFn突变体蛋白与0.5mg/ml的Dox混合，缓冲液为20mMTris,pH8.0，0.15M NaCl，10％甘油，37℃，4小时，其后经脱盐柱去除未结合的Dox，并将缓冲液更换为20mM Tris，pH8.0，0.15M NaCl，浓缩至10mg/ml。通过Nanodrop检测A280nm和A485nm吸收值。
结果：
4.1.HFn-Inner1(R63S)、HFn-inner2(E67S)、HFn-Inner3(Y39A)、HFn-Innergroup(R63S+E67S+Y39A)、HFn-Midgroup(L35A+M70A)、HFn-outer4(F81A)蛋白均可以通过原核表达纯化的方法获取。分子排阻SEC的结果显示，HFn-Inner1(R63S)、HFn-inner2(E67S)、HFn-Inner3(Y39A)、HFn-Inner group(R63S+E67S+Y39A)、HFn-Midgroup(L35A+M70A)、HFn-outer4(F81A)在天然状态下的分子量保持一致，都通过自组装形成了24聚体球壳状结构。HFn-Inner1(R63S)、HFn-inner2(E67S)、HFn-Inner3(Y39A)、HFn-Innergroup(R63S+E67S+Y39A)、HFn-Midgroup(L35A+M70A)、HFn-outer4(F81A)的水合粒径分别为13.70nm、13.57nm、13.24nm、12.88nm、13.84nm、12.68nm。
2.我们通过将HFn突变体和Dox直接混合孵育的方法来验证R63、E67、Y39、L35、M70、F81这6个氨基酸残基是否与HFn蛋白表面存在的药物装载通道相关。我们发现，在37摄氏度条件下，通过将HFn和Dox直接混合孵育4小时后，铁蛋白HFn就能够装载25.8个左右Dox分子，而相同条件下HFn-Inner1(R63S)、HFn-inner2(E67S)、HFn-Inner3(Y39A)、HFn-Innergroup(R63S+E67S+Y39A)、HFn-Midgroup(L35A+M70A)、HFn-outer4(F81A)的Dox装载量分别仅为10.2、8.4、8.1、9.7、7.2、10.5，显著低于HFn。
实施例11非变性温度装载其他抗肿瘤药物
利用相同的装载方法，我们尝试在60度孵育4h的条件下，装载其他的抗肿瘤药物，包括：舒尼替尼(sunitinib)、克唑替尼(crizotinib)、帕博西尼(Palbociclib)、伊立替康(irinotecan)、美登素(maytansine)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、己酮可可碱(Pentoxiphyline)。其中己酮可可碱为亲水性药物，其余药物均为疏水性药物。以sunitinib装载为例，在1ml反应体系中分别加入15％甘油，WT-HFn 2mg，sunitinib0.75mg，50mM Tris buffer补至1ml，pH 8.0。在60℃条件下孵育4h。12000rpm，4℃条件下离心10min，取上清液，脱盐柱HiprepTM 26/10Desalting处理去除游离sunitinib，获得HFn-sunitinib铁蛋白舒尼替尼样品。使用胃蛋白酶酶解掉HFn，使装载药物泄露，HPLC标曲法检测药物浓度(检测结果如图13)。以牛血清白蛋白为标准，采用BCA蛋白检测试剂盒(Pierce)测定HFn突变体蛋白的浓度，三次重复。
通过实验我们发现，加温方法也同样能够用来装载天然(植物类)抗癌药物：舒尼替尼(sunitinib)、克唑替尼(crizotinib)、帕博西尼(Palbociclib)、伊立替康(irinotecan)、美登素(maytansine)、抗代谢类药物：5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、己酮可可碱(Pentoxiphyline)。结果如图14所示，装载量分别为14.9、17.6、7.5、32.8、3.0、25.6、2.3。结果如图15所示，铁蛋白回收率分别达到了86％、79％、84％、81％、86％、80％、82％。上述结果进一步证实了HFn表面药物装载通道的存在。
综上，通过利用本发明所获得的非变性条件下的包载条件，可以方便、快捷、高效、足量的利用HFn包载不同的小分子药物。
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

Claims (10)

1.一种人H铁蛋白载药通道，其特征在于，所述载药通道包含氨基酸Asp89-Cys90-Asp91-Asp92(SEQ ID NO:1)。
2.一种非变性人H铁蛋白装载药物的方法，其特征在于，所述人H铁蛋白在天然状态下通过离子/疏水通道实现药物的装载。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述离子/疏水通道包含氨基酸Asp89-Cys90-Asp91-Asp92(SEQ ID NO:1)。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括添加非变性剂，所述非变性剂包括多羟基化合物、糖类、氨基酸类、聚合物类等，优选为甘油、甘露醇、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、蔗糖、乳糖、甘露糖、肝素、2-羟丙基-β环糊精、二甲基亚砜、N，N-二甲基甲酰胺、吐温-80、柠檬酸钠、十二烷基磺酸钠，更优选为甘油。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述药物包括但不限于小分子药物，优选为小分子化疗药物及小分子核酸药物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述小分子化疗药物包括亲水性和双亲性小分子药物，优选为抗生素类肿瘤药物、天然来源类抗肿瘤药、金属化合物、放射性同位素、烷化剂、抗代谢类抗肿瘤药，激素类抗肿瘤药物，更优选为阿霉素、表阿霉素(Epirubicin)、顺铂(Cisplatin)、奥沙利铂(Oxaliplatin)；所述小分子核酸药物优选为siRNA、lncRNA。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述装载的孵育温度为20-70℃，优选为25-70℃，更优选为30-70℃，更优选为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃，更优选为55-65℃，更优选为56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述装载的孵育时间为0.1-24h，优选为1-12h，更优选为1h-6h，更优选为1h、2h、3h、4h、5h、6h。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在装载反应体系中，所述人H铁蛋白的浓度为0.1～90mg/mL，优选为0.5～9mg/mL，更优选为1～5mg/mL，更优选为1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL、3mg/mL、3.5mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL，装载反应体系还包含缓冲液，所述缓冲液的pH值为6-8，优选为6.5、7、7.5，所述缓冲液浓度为20～500mM，更优选地，25～100mM，更优选地，25～50mM。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在装载反应体系中，所述人H铁蛋白与小分子药物装载质量比为1:10～10:1，优选为1:1～5:1，更优选为1:1～3:1。
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