CN112409242A - 一种氨氯地平半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种氨氯地平半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用，本发明先制备得到了氨氯地平半抗原AN‑SSA，应用该半抗原得到了氨氯地平人工完全抗原和氨氯地平多克隆抗体，该抗体对氨氯地平具有高灵敏度和高特异性的识别能力，半抑制浓度为0.31μg/kg，定量检测范围为0.04758～2.078μg/kg，检测限为0.085.μg/kg，对非洛地平、尼群地平的交叉反应率均低于1％。另外，本发明利用氨氯地平抗体建立了胶体金免疫层析技术，具有较宽的检测范围和较高的灵敏度，能够特异性识别氨氯地平的检测，可视检测线为20ng/mL，在保健食品中氨氯地平的免疫快速检测中具有较大应用前景。

Description

一种氨氯地平半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及食品安全检测技术领域，更具体地，涉及一种氨氯地平半抗原、人工抗原、抗体及其制备方法和应用。

背景技术

氨氯地平是目前最常见的一种降血压药物，氨氯地平是第三代二氢吡啶钙通道阻滞剂。氨氯地平的作用机制是使动脉壁的平滑肌松弛，降低总外周阻力，从而降低血压。不法商家为了提高销量、牟取暴利，将氨氯地平等药物添加于保健食品中，以降血压达到良好的效果来吸引广大消费者，这种做法不但违反了我国《食品安全法》，而且这也严重损害消费者的权益和身心健康。2019年国务院食品安全办、公安部、市场监管总局联合公布了8起食品保健食品整治欺诈和虚假宣传重大案件，其中就涉及保健食品中非法添加氨氯地平药物。针对以上情况，加强保健食品中非法药物添加的检测亟不可待。

研究表明，氨氯地平服用过量时往往会引起-腿或脚踝肿胀，身体疲倦，胃痛，恶心，头晕等一系列副作用。由于饮食不科学，我国高血压人数增长较快，因此，我国高血压病人的OTC保健食品市场种类繁多。其中不免鱼龙混杂，其中纯食品中添加西药最为常见。保健食品中是禁止添加药物。氨氯地平在保健食品中是违禁药物。因此，建立一种可靠快速检测氨氯地平的检测方法对于监测保健食品中非法添加具有重要的意义。

目前，氨氯地平的主要检测方法有分光光度法，高效液相色谱(HPLC)，气相色谱(GC)等。例如中国专利CN111579539A公开了利用氨氯地平在酸性条件下与亚硝酸钠反应生成重氮盐，然后与N,N-二甲基-1-萘胺反应生成强荧光性衍生物，直接通过荧光法测定该衍生物；中国专利CN108051534A开了保健品中氨氯地平高效液相色谱-串联质谱检测；这些方法虽然结果可靠，准确度高，但仪器设备昂贵、样品前处理复杂繁琐、检测成本高且需要专业人员操作，不符合现场检测“低成本、快速、准确和大批量检测”的要求，而免疫检测方法具备快速、灵敏、准确、操作简便等特点，且对样品纯度要求不高，特别适用于大批量样品的检测，比起这些已有方法在现场检测氨氯地平方面具有更大优势。因此，迫切需要建立一种高灵敏、能检测氨氯地平的免疫检测方法。而上述方法建立的关键在于设计出合适的氨氯地平半抗原并获得灵敏度高、特异性强的抗体，但是现有技术中还未见有关于氨氯地平半抗原、人工抗原、抗体的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种氨氯地平半抗原。

本发明的第二个目的是提供一种氨氯地平人工完全抗原。

本发明的第三个目的是提供一种氨氯地平多克隆抗体。

本发明的第四个目的在于提供所述氨氯地平人工抗原、多克隆抗体的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

一种氨氯地平半抗原，其结构式如式(I)所示：

所述氨氯地平半抗原采用系统命名法命名为：

(4-((2-((4-(2-氯苯基)-3-(乙氧基羰基)-5-(甲氧基羰基)-6-甲基-1,4- 二氢吡啶-2-基)甲氧基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸。即 4-((2-((4-(2-chlorophenyl)-3-(ethoxycarbonyl)-5-(methoxycarbonyl)-6-methyl-1,4-dih ydropyridin-2-yl)methoxy)ethyl)amino)-4-oxobutanoic acid。

本发明还提供所述氨氯地平半抗原的制备方法，将氨氯地平溶解于无水二氯甲烷后，加入丁二酸酐和4-二甲基氨基吡啶进行反应，薄层层析硅胶板确认产物；反应产物经旋干后，加入乙酸乙酯和饱和食盐水萃取，酯层用无水硫酸钠干燥，最后浓缩后即得到氨氯地平半抗原。

优选地，所述氨氯地平与无水二氯甲烷的质量体积比为30～50mg:1mL。

更优选地，所述氨氯地平与无水二氯甲烷的质量体积比为45mg:1mL。

优选地，所述氨氯地、丁二酸酐和4-二甲基氨基吡啶的质量比为4～5:4～5:1。

更优选地，所述氨氯地、丁二酸酐和4-二甲基氨基吡啶的质量比为4.5:5:1。

优选地，所述薄层层析的展开剂为甲醇：乙酸乙酯(甲醇：乙酸乙酯＝1:5)。

本发明还提供氨氯地平完全抗原，是在上述氨氯地平半抗原的羧基上偶联载体蛋白得到。

优选地，所述偶联为通过活泼酯法。

优选地，所述载体蛋白为牛血清蛋白(BSA)、乳铁蛋白(LF)或鸡卵白蛋白(OVA)。其中偶联BSA或LF的完全抗原的结构式如下：

所示。

本发明还提供一种氨氯地平多克隆抗体，是将上述任一所述的氨氯地平完全抗原与免疫佐剂乳化后免疫动物，分离血清、纯化后得到。

优选地，是将氨氯地平半抗原与乳铁蛋白偶联后的人工抗原作为免疫原免疫动物。

作为一种优选地可实施方式，所述氨氯地平多克隆抗体的制备方法具体包括以下步骤：

(1)选择2只(雌、雄各一只)成年的新西兰大白兔进行背部免疫，每只完全抗原为半抗原-乳铁蛋白偶联物(AN-SSA-LF)(1mg/mL)500μL，初次免疫时将半抗原-乳铁蛋白偶联物(AN-SSA-LF)按体积比1:1与弗式完全佐剂乳化均匀，免疫新西兰大白兔。之后将AN-SSA-LF按体积比1:1与弗式不完全佐剂乳化，每隔三周进行一次加强免疫，共加强免疫4次；

(2)第三次免疫后间隔7天兔缘耳静脉取血，离心取上清，-20℃保存备用。

本发明还提供所述氨氯地平完全抗原或所述氨氯地平多克隆抗体在保健食品中氨氯地平的免疫快速检测中或在制备氨氯地平免疫检测产品中的应用。

本发明还提供一种检测氨氯地平的酶联免疫试剂盒，包括有：包被有包被原的酶标板、氨氯地平标准品溶液、氨氯地平克隆抗体、酶结合物浓缩液、酶结合物稀释液、底物显色液、终止液、洗涤液；所述包被原为上述任一所述氨氯地平完全抗原；所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的氨氯地平多克隆抗体；所述氨氯地平克隆抗体为上述任一所述氨氯地平克隆抗体。

本发明还提供一种氨氯地平胶体金快速检测卡，包括底板和依次排列在底板上上的样品垫、结合垫、纤维素膜和吸水垫，所述结合垫内吸附有胶体金标记的上述任一所述氨氯地平多克隆抗体，所述纤维素膜上印有隐形检测线和隐形质控线，所述隐形检测线采用包被抗原溶液印制，所述隐形质控线采用羊抗兔抗体印制；所述包被抗原为上述任一所述氨氯地平完全抗原。

优选地，所述包被原为氨氯地平半抗原与牛血清蛋白偶联后的人工抗原。

本发明还提供所述酶联免疫试剂盒或所述胶体金快速检测卡在保健食品中氨氯地平的免疫快速检测中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明制备得到了氨氯地平半抗原AN-SSA，应用该半抗原得到了氨氯地平人工完全抗原和氨氯地平多克隆抗体，该抗体对氨氯地平具有高灵敏度和高特异性的识别能力，半抑制浓度为0.31μg/kg，定量检测范围为0.04758～2.078μg/kg，检测限为0.085.μg/kg，对非洛地平、尼群地平的交叉反应率均低于1％，为建立氨氯地平的免疫层析检测方法提供了核心试剂。另外，本发明利用氨氯地平抗体建立了胶体金免疫层析技术，具有较宽的检测范围和较高的灵敏度，能够特异性识别氨氯地平的检测，可视检测线为20ng/mL。

附图说明

图1为本发明氨氯地平半抗原、人工抗原、抗体、ELISA制备流程图。

图2为本发明氨氯地平半抗原AN-SSA合成过程示意图。

图3为本发明氨氯地平完全抗原紫外扫描鉴定图。

图4为本发明氨氯地平抗体间接竞争ELISA标准曲线。

图5为本发明氨氯地平胶体金快速检测试纸条的结构示意图。

图6为本发明氨氯地平胶体金快速检测试纸条的结果示意图。

其中：A为阴性样品检测结果，B为弱阳性样品检测结果，C为阳性样品检测结果，D和E为试纸条无效结果。

图7为本发明实施案例中氨氯地平检测试纸条中保健食品加标样品的分析结果。(阴性样品N：不含药物的保健食品提取液)。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

以下实施例包括氨氯地平半抗原、氨氯地平人工抗原的合成以及氨氯地平抗体的制备，流程如图1所示。

实施例1氨氯地平半抗原AN-SSA的合成与鉴定

1、试验方法

将450mg氨氯地平溶解于10mL无水二氯甲烷中，然后将500mg丁二酸酐和100mg 4-二甲基氨基吡啶加入上述溶液中，60℃下加热搅拌20小时，通过TLC (薄层层析硅胶板)监控反应过程并最后确认产物，其展开剂为甲醇：乙酸乙酯＝1:5。反应产物经旋干后，加入适量的乙酸乙酯和饱和食盐水萃取三次，向乙酸乙酯层添加100mg无水硫酸钠进行干燥，最后浓缩后得到氨氯地平半抗原 AN-SSA，其合成过程如图2所示。

2、鉴定

用氨氯地平的标准品进行核磁鉴定，再将目标产物纯化后，溶解于氘代甲醇中，进行核磁氢谱鉴定和质谱鉴定。目标产物的核磁共振氢谱结果图如下：

¹H NMR(600 MHz,Chloroform-d)δ7.20(d,J＝7.4 Hz,1H),4.78–4.58(m, 2H),4.34–4.25(m,0H),4.10(d,J＝6.8 Hz,0H),4.02(s,2H),3.55(d,J＝49.2 Hz, 5H),2.66(s,2H),2.46(s,2H),2.32(s,2H),2.03(s,0H),1.77–1.66(m,0H),1.59(s, 0H),1.46–1.12(m,12H),0.90(d,J＝48.8 Hz,2H),0.06(s,19H).

质谱结果如下：MS:C₂₄H_29CLN₂O₈:508.95，ESI^-[M-H]:506.9。

两者结果皆表明衍生位点正确且成功。成功合成得到氨氯地平半抗原(AN-SSA)，其结构式如下所示：

所述氨氯地平半抗原采用系统命名法为：

(4-((2-((4-(2-氯苯基)-3-(乙氧基羰基)-5-(甲氧基羰基)-6-甲基-1,4- 二氢吡啶-2-基)甲氧基)乙基)氨基)-4-氧代丁酸。即 4-((2-((4-(2-chlorophenyl)-3-(ethoxycarbonyl)-5-(methoxycarbonyl)-6-methyl-1,4-dih ydropyridin-2-yl)methoxy)ethyl)amino)-4-oxobutanoic acid。

实施例2氨氯地平完全抗原的合成与鉴定

1、氨氯地平完全抗原和载体蛋白的偶联

(1)依次称取氨氯地平半抗原8mg，3mg的NHS和4mg的EDC溶解于200μL 的DMF中，室温搅拌4h，充分活化；

(2)称取10mg的牛血清蛋白(BSA)加入到2mL的PBS缓冲溶液中(0.1M， PH＝7.4)；

(3)将步骤(1)所得的溶液缓慢逐滴滴加到步骤(2)所得溶液中，搅拌 7h:

用0.1M(PH＝7.4)缓冲溶液透析两天，每天换液4次，透析结束后得到氨氯地平完全抗原(AN-SSA-BSA)，其中PBS缓冲溶液的配方为：Na2HPO4·12H2O 2.90g，NaCl 8.50g，KCl 0.20g，KH2PO4 0.20g，加蒸馏水定容至1000mL。

同理，采用乳铁蛋白(LF)、鸡卵白蛋白(OVA)替换BSA作为载体蛋白，得到目的产物AN-SSA-LF、AN-SSA-OVA，过程与制备AN-SSA-BSA完全抗原相同。

2、鉴定

取氨氯地平完全抗原，进行紫外扫描全波长，结果如图3所示，BSA、LF、 OVA完全抗原分别进行紫外扫描鉴定(200～400nm)扫描鉴定，比较偶联前后各物质的最大吸收波长，氨氯地平完全抗原的吸收曲线与载体蛋白的曲线具有明显差别，最大吸收波长发生了偏移，且在375nm处出现了氨氯地平完全抗原的特征吸收峰，故氨氯地平完全抗原的紫外吸收曲线是两者的累加吸收特征，说明了氨氯地平完全抗原偶联成功。

实施例3氨氯地平多克隆抗体的制备

(1)挑选2只(雌雄各一只)成年健康的新西兰大白兔进行免疫，每只兔子剂量为完全抗原AN-SSA-LF(1mg/mL)500μL，初次免疫时将AN-SSA-LF 按体积比1:1与弗式完全佐剂乳化，免疫新西兰大白兔。之后将AN-SSA-LF按体积比1:1与弗式不完全佐剂乳化，每隔三周进行一次加强免疫，共加强免疫四次；

(2)第三次免疫后间隔7天兔耳缘静脉取血，离心取上清，-20℃保存留用。

实施例4氨氯地平多克隆抗体的ELISA检测

1、ELISA检测

(1)将血清用PBST稀释为1:1000，同时设置空白对照孔(未加入血清，用PBST代替)；

(2)将氨氯地平人工抗原AN-SSA-OVA用包被液稀释至1μg/mL的浓度，包被96孔酶标板，每孔加入100μL，37℃温育12h，弃去包被液，用PBST洗涤2次；

(3)每孔加入120μL封闭液(1％鱼皮胶原蛋白)，37℃封闭3h，弃去封闭液，拍板甩干，37℃烘1h备用；

(4)用PBST1000倍稀释血清，并将氨氯地平药物稀释至100，33.33，11.11， 3.703，1.23，0.411，0.137，0.045，0.0152，0.005，0.00166ng/mL；

(5)每行加50μL氨氯地平药物稀释液(三组平行)，再加50μL血清稀释液/孔，在37℃温育40min，洗涤5次；

(6)加入羊抗兔二抗IgG-HRP(5000倍稀释)，37℃温育30min，洗涤5 次，拍板甩干；

(7)加入显色液37℃孵育10min；

(8)加入50μL10％H₂SO₄终止反应，并在450nm处读取OD值；

(9)将上述药物氨氯地平换成非洛地平、尼群地平，并以同样的稀释倍数进行上述试验，测定该抗体对地平其他结构类似物的交叉反应率。

2、结果，氨氯地平抗体间接竞争ELISA标准曲线如图4所示，所述氨氯地平抗体对氨氯地平的半抑制浓度(IC₅₀)为0.31ng/mL，定量检测线性范围(IC₂₀～IC₈₀)0.047～2.07ng/mL，最低检测限为0.085ng/mL，且对非洛地平、尼群地平的交叉反应率均低于1％.

实施例5一种氨氯地平胶体金快速检测试纸条

1、金标抗体和金标结合物垫的制备

(1)胶体金标记的氨氯地平多克隆抗体的制备

采用柠檬酸三钠还原氯金酸的方法，制备平均直径在40nm的胶体金悬浮液。在加热回流条件下，把200mL过膜超纯水加热至沸腾，不停的搅拌，再把8mL 1％的氯金酸溶液迅速倒入，待它再次沸腾，迅速加入9.25mL 1％的柠檬酸三钠。当反应溶液颜色变成葡萄红色时继续加热搅拌10min。冷却至室温后，加入0.05％的叠氮化钠4℃保存。

胶体金在与抗体标记前用0.2mol的K₂CO₃溶液调到pH至9.6左右，采用经典NaCl滴定法确定50μg抗体标记1mL胶体金溶液。然后按最佳标记量进行标记，标记1小时后，搅拌下加入30μL 10％BSA，室温静置封闭1小时后4℃ 10000rpm离心15min，弃去上清液体。加入胶体金溶液同体积的5％BSA溶液重悬，4℃10000rpm离心15min，重复两次。最后，用1/5胶体金溶液体积的 TB溶液(含0.5％BSA、1％蔗糖、0.5％pvp、0.01mol/L硼酸钠和0.05％叠氮化钠)重悬，超声分散均匀，放置4℃冰箱保存。

(1)金标结合物垫的制备

用XYZ-3000三维喷膜仪把把金标记抗体以0.8μL/cm的量喷在玻璃纤维棉上，干燥箱45℃干燥120min，真空干燥保存。

2、偶联抗原羊抗兔包被纤维素膜

用XYZ-3000三维喷膜仪把浓度为0.1mg/mL的包被抗原(AN-SSA-BSA) 1.0μL/cm的量喷在纤维素膜的偏下侧，作为检测线。用XYZ-3000三维喷膜仪把浓度为0.01mg/mL的羊抗兔IgG以0.8μL/cm的量喷在纤维素膜的偏上侧，作为质控线，两线之间的距离为8mm。

3、快速试纸条的组装

把纤维素膜粘贴在衬板中间部位上，吸水垫粘贴在纤维素上侧和纤维素膜重叠2mm。金标结合物垫粘贴在纤维素膜下方重叠2mm。样品垫粘贴在金标结合物垫下方重叠2mm。组装好的试纸板用斩切机切成4mm宽的试纸条，组装好的氨氯地平胶体金快速检测试纸条的结构示意图如图5所示。

当待测样品溶液滴加至试纸条或试纸卡测试端后，待测溶液通过虹吸作用带动待测物及金标结合物垫3中的金标抗体一起向纤维素膜4扩散，并最终渗入吸水垫7端。在扩散过程中，如果样品中有待测物质时，金标抗体首先与待检物质结合，进而占据了金标抗体上的抗原结合点，阻止了金标抗体与纤维素膜4上隐形检测线5(半抗原与载体蛋白的结合物)的结合，使隐形检测线5不显色或者显色很弱即表示检测样品阳性或者弱阳性；如果样品中没有待测样品时，金标抗体在上移过程中，遇隐形检测线5显示一条清晰红线即表示检测样品阴性。同样，多余的金标抗体也与纤维素膜4上的隐形质控线6(羊抗兔IgG)结合，使隐形对照线6显红色。隐形对照线6颜色的有或无分别表明此试纸条的有效或无效，如图6所示。

实施例6氨氯地平胶体金快速检测试纸条对样品的检测

1、对保健食品样品的检测

(1)检测样品液的制备

保健食品样品溶液的预处理。称取5g胶囊样品，去囊衣研磨粉碎后移入50 mL离心管中，加入20mL80％甲醇水，涡旋震荡1min，超声提取3min，4000rpm 离心5min，取1mL上清液用工作缓冲液(PBS)稀释5倍数后测定溶液中氨氯地平含量。

(2)检测及结果判断

将胶体金检测试纸条样品端插入预处理的待检测样品中，待测溶液通过虹吸作用带动待测物及金标结合物垫中的金标抗体一起向NC膜扩散，并最终渗入吸水垫。在扩散过程中，如果样品中含大量待测药物，金标抗体首先与大量待测药物结合，金标抗体就不能与T线的包被抗原结合从而使T线不显色，结果呈现阳性。当样品中含有少量的待检药物，金标抗体首先与待检药物结合，少量抗体与包被抗原结合，T线显红色，结果呈现弱阳性。当样品中不含待检药物时，金标抗体与包被抗原结合T线显红色，结果呈阴性。整个检测5～10分钟判定检测结果。

往空白保健品胶囊样本中添加一系列浓度的标准药物，经以上的样品前处理，用上述胶体金试纸条对样品液进行检测，通过肉眼定性判断，确定cut-off值，如图7所示。氨氯地平检测试纸条的可视检测线为20ng/mL，实验结果表明，该方法具有检测速度快、直观、操作方便等优点。

2、稳定性试验

将试纸条放入铝铂袋中真空排气包装，并且37℃、室温22℃、4℃保存，3 个月后各项指标均稳定，即灵敏度基本不变，检测显色深度均一，反应结果一致。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种氨氯地平半抗原，其特征在于，其结构式如式(I)所示：

2.权利要求1所述氨氯地平半抗原的制备方法，其特征在于，将氨氯地平溶解于无水二氯甲烷后，加入丁二酸酐和4-二甲基氨基吡啶进行反应，薄层层析硅胶板确认产物；反应产物经旋干后，加入乙酸乙酯和饱和食盐水萃取，酯层用无水硫酸钠干燥，最后浓缩后即得到氨氯地平半抗原。

3.一种氨氯地平完全抗原，其特征在于，是在权利要求1所述氨氯地平半抗原的羧基上偶联载体蛋白得到。

4.根据权利要求3所述的氨氯地平完全抗原，其特征在于，所述偶联为通过活泼酯法。

5.根据权利要求3所述的氨氯地平完全抗原，其特征在于，所述载体蛋白为牛血清蛋白、乳铁蛋白或鸡卵白蛋白。

6.一种氨氯地平多克隆抗体，其特征在于，是将权利要求3所述氨氯地平完全抗原与免疫佐剂乳化后免疫动物，分离血清、纯化后得到。

7.权利要求3所述氨氯地平完全抗原或权利要求6所述氨氯地平多克隆抗体在保健食品中氨氯地平的免疫快速检测中或在制备氨氯地平免疫检测产品中的应用。

8.一种检测氨氯地平的酶联免疫试剂盒，其特征在于，包括有：包被有包被原的酶标板、氨氯地平标准品溶液、氨氯地平克隆抗体、酶结合物浓缩液、酶结合物稀释液、底物显色液、终止液、洗涤液；所述包被原为权利要求3～5任一所述氨氯地平完全抗原；所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的氨氯地平多克隆抗体；所述氨氯地平克隆抗体为权利要求6所述氨氯地平克隆抗体。

9.一种氨氯地平胶体金快速检测卡，其特征在于，包括底板和依次排列在底板上上的样品垫、结合垫、纤维素膜和吸水垫，所述结合垫内吸附有胶体金标记的权利要求6所述氨氯地平多克隆抗体，所述纤维素膜上印有隐形检测线和隐形质控线，所述隐形检测线采用包被抗原溶液印制，所述隐形质控线采用羊抗兔抗体印制；所述包被抗原为权利要求3～5任一所述氨氯地平完全抗原。

10.权利要求8所述酶联免疫试剂盒或权利要求9所述胶体金快速检测卡在保健食品中氨氯地平的免疫快速检测中的应用。

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