CN112402424B - 一种小分子药物及其在治疗间歇性低氧中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种小分子药物及其在治疗间歇性低氧中的用途，涉及医药技术领域。该药物包括GSK2606414和水飞蓟提取物，能够明显改善海马依赖的认知功能降低；对海马突触可塑性的提高具有一定的作用，并且能够使抑制PERK通路的激活。该药物按照每日GSK2606414 45～55mg/kg、水飞蓟提取物32.4～50mg/kg的量施用，每天1次或分为2～4次施用，以摄取12～14d或更久的方式施用。

Description

一种小分子药物及其在治疗间歇性低氧中的用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种小分子药物及其在治疗间歇性低氧中的用途。
背景技术
氧在维持机体能量代谢和稳态平衡中具有至关重要，它是机体正常发育和生长不可缺少的生命要素。人体新陈代谢所需的氧气是由血液循环系统运输到各个组织器官。研究发现，多种器官及组织内氧分压通常低于外界大气压，器官和组织内的这种适度的低氧环境被称为”生理性低氧”。在胚胎形成血管系统等发育过程中，胚胎神经血管区域的氧分压均低于7.6mmHg。因此，生理性低氧对于胚胎发育和维持大脑正常功能具有重要的作用。研究发现：慢性及适度的间歇性低氧暴露可以改变机体对缺氧的耐受能力，从而使机体可以有效的对抗缺氧造成的应激状态。例如，间歇性低氧环境可以激活HIF-1下游的靶基因VEGF，脑缺血后VEGF表达增加，促进微循环的重建，增加缺血组织血流灌注和供氧量，加快脑缺血缺氧的恢复过程。此外，间歇性低氧对神经发生、心肌缺血、免疫系统和呼吸系统损伤等均具有保护作用，目前已成为临床医学、高原医学和航天医学等领域的研究热点之一。
阻塞性睡眠呼吸暂停(OSA)是一种严重的可能危及生命的非常普遍的慢性疾病。由于呼吸道的反复萎陷，气流停止(即呼吸暂停)或减少(即，呼吸不足)反复发作的直接结果便体现为OSA的病症、症状和后果。睡眠过程中空气流通的减少会导致低氧血症的反复发作、动脉CO2增加，以及动脉O2减少。OSA影响至少2％至4％的成年人，并日益为公众认识。已经尝试各种药物制剂用于治疗OSA，但没有一个被认为是足够有效的。Hedner Kraiczi最初声称用乙酰胆碱酯酶抑制剂(CEI)治疗打鼾、睡眠呼吸暂停和其他形式的睡眠呼吸障碍，这基于其对中度至重度OSA患者的临床研究，其中用水杨酸毒扁豆碱以12μg/min/kg的剂量对所述OSA患者进行7小时的连续静脉滴注，此外，他还提供了其他对于治疗特别有用的CEI的列表，其中包括吡啶斯的明(美国专利号6,034,117)。Hedner以0.12μg/min/kg毒扁豆碱或多奈哌齐的剂量向患者持续静脉滴注7小时，并得到了相似的结果。因此，仍然需要一种方便，侵入性较小的和有效的OSA治疗，特别是一种很容易给予的强效治疗剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种小分子药物及其在治疗间歇性低氧中的用途，该药物能够明显改善海马依赖的认知功能降低；对海马突触可塑性的提高具有一定的作用，并且能够使抑制PERK通路的激活。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种PERK抑制剂在治疗间歇性低氧中的用途，上述抑制剂为GSK2606414。抑制剂GSK2606414对阻塞性睡眠呼吸暂停疾病具有良好的治疗效果，在间歇性缺氧动物模型试验模拟过程中，可有效增加探索识别新目标的时间，进而改善神经认知功能障碍；缓解间歇性低氧带来的海马长时程增强值的下降，提升海马突触可塑性；且能够显著降低PERK通路中p-PERK，p-eLf2α和ATF-4的表达量，抑制相应蛋白的表达，从而抑制PERK通路的激活。本发明提供的GSK2606414可用于间歇性低氧引起的疾病治疗，具有较好的治疗效果。
优选地，GSK2606414能够改善神经认知功能障碍。
优选地，GSK2606414能够提高海马突触可塑性。
优选地，GSK2606414能够抑制PERK通路的激活。
本发明的又一目的，在于提供GSK2606414在治疗或预防阻塞性睡眠呼吸暂停中的用途。
一种药物组合物，包括，GSK2606414和水飞蓟提取物。本发明制得的水飞蓟提取物中，有效成分主要为水飞蓟宾和黄酮类化合物。抑制剂GSK2606414和水飞蓟提取物联合用药能够有效提升对阻塞性睡眠呼吸暂停疾病的治疗作用，在间歇性缺氧动物模型试验模拟过程中，显著提升间歇性低氧带来的海马长时程增强值的幅度，有效增强海马突触的可塑性；且能够提升对PERK通路中p-PERK，p-eLf2α和ATF-4表达量的抑制作用，增强相应蛋白表达的抑制效果，有效抑制PERK通路的激活。本发明提供的GSK2606414和水飞蓟提取物的药物组合物可用于间歇性低氧引起的疾病治疗，两种药物呈现协同增强作用。
优选地，水飞蓟提取物中，水飞蓟宾含量36～42mg/g，总黄酮含量57～65mg/g。
优选地，GSK2606414和水飞蓟提取物的质量比为1：0.72～0.91。
优选地，该药物组合物的使用方法为：口服，按照每日GSK2606414 45～55mg/kg、水飞蓟提取物32.4～50mg/kg的量施用，每天1次或分为2～4次。
优选地，药物以摄取12～14d或者更久的方式施用。
优选地，该药物组合物还包括芒柄花苷，与水飞蓟提取物的质量比为1：1.57～1.7。芒柄花苷的存在，可与水飞蓟提取物复配，增强水飞蓟提取物的药效；两者复配后再与GSK2606414 协同作用，提升对间歇性低氧的治疗效果。
本发明的又一目的，在于提供上述药物组合物在治疗间歇性低氧中的用途。
优选地，组合物能够改善神经认知功能障碍。
优选地，组合物可显著抑制PERK通路的激活。
相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：
GSK2606414对阻塞性睡眠呼吸暂停疾病具有良好的治疗效果，在本发明间歇性缺氧动物模型试验模拟过程中，可有效增加探索识别新目标的时间，显著改善神经认知功能障碍；缓解间歇性低氧带来的海马长时程增强值的下降，提高海马突触可塑性；且能够显著降低 PERK通路中p-PERK，p-eLf2α和ATF-4的表达量，抑制相应蛋白的表达，从而抑制PERK通路的激活。GSK2606414与水飞蓟提取物复配使用，起到协同增强作用。芒柄花苷的加入，可与水飞蓟提取物复配，增强水飞蓟提取物的药效，进一步提升对间歇性低氧的治疗效果。本发明提供的GSK2606414及药物组合物可用于间歇性低氧引起的疾病治疗，具有优异的治疗效果。
因此，本发明提供了一种小分子药物及其在治疗间歇性低氧中的用途，该药物能够明显改善海马依赖的认知功能降低；对海马突触可塑性的提高具有一定的作用，并且能够使抑制 PERK通路的激活。
附图说明
图1为本发明实施例1中测试区域示意图；
图2为本发明实施例1中小鼠在不同区域停留时间测试结果图；
图3为本发明实施例1中偏好性测试结果示意图；
图4为本发明实施例1中探索新目标花费时间示意图；
图5为本发明实施例1中LTP幅度测试示意图；
图6为本发明实施例1中LTP幅度值测试结果；
图7为本发明实施例1中p-PERK，p-elf2α和ATF-4表达水平示意图；
图8为本发明实施例1中p-PERK，p-elf2α和ATF-4的表达量；
图9为本发明实施例2中LTP幅度值测试结果；
图10为本发明实施例2中p-PERK，p-elf2α和ATF-4的表达量；
图11为本发明实施例3中LTP幅度值测试结果；
图12为本发明实施例3中p-PERK，p-elf2α和ATF-4的表达量。
具体实施方式
以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：
实施例1：
1.间歇性缺氧动物模型制备
清洁级雄性C57BL/6小鼠，周龄7周，体重为20～22g，由中国香港中文大学动物实验中心提供。本实验采用慢性间歇性低氧(intermittent hypoxia,IH)来模拟阻塞性睡眠呼吸暂停 (Obstructive sLeep apnea，OSA)疾病。把C57雄性老鼠放在特制的低氧舱中(46×20×22cm)，并通过氧气分析器检测容器中的氧气浓度和电脑程序设定来控制氮气和氧气进入量 (OxycycLer modeL A48XOV；Reming Bioinstruments)，使低氧舱中氧气浓度从21％下降到10％，再从10％恢复到21％为一个循环，每个循环的时间为90s，每天持续循环8h，一共2 周。同时，低氧舱内部的远程感应器还能够检测舱内温度，湿度，二氧化碳(CO2)的浓度。舱内的温度保持在22～24℃，并在低氧舱内放置清水，使舱内的湿度保持在40～50％，CO2的浓度低于0.01％。
2.药物配置和分组
将GSK2606414溶解在含有0.5％羟丙基甲基纤维素双蒸水中，配置浓度为5mg/mL。采用随机数字表法将小鼠随机分为4组：对照组(ControL)：灌胃0.5％羟丙基甲基纤维素0.2mL； GSK2606414组(ControL+GSK2606414)：灌胃GSK2606414 0.2mL(50mg/kg/day)；间歇性低氧组(IH)：灌胃0.5％羟丙基甲基纤维素0.2mL IH+GSK2606414组(IH+GSK2606414)：灌胃GSK2606414 0.2mL(50mg/kg/day)。
3.行为学检测
3.1旷场探索实验
(1)IH处理后，将各组小鼠依次放入高为60cm，宽和长分别为70×70cm旷场反应箱，箱四壁和底面涂成黑色。让其自由探索5min；
(2)旷场底面的中心为原点，底面平均分为同心的三部分，通过在线视频跟踪系统记录小鼠在这5min中内在这三部分中各停留的时间，来检测陌生环境中的实验动物自主行为与探究行为，来反映其紧张度。
3.2新物体识别实验
(1)旷场探索实验结束后，在旷场反应箱内的放入两个颜色，形状和材质均相同的物体 (A和B)，两个物体离侧壁的距离也相同。将小鼠背朝两物体放入场地内，并且使得小鼠鼻尖距离两物的长度要一致，使其自由探索5min。记录小鼠在此时间段内与这两个物体接触的情况，包括鼻子或嘴巴触及物体的时间(前爪搭在物体上、鼻子嗅物体、舔物体等均属探究物体)。每只鼠测试完成后，用酒精擦拭物体以消除鼠停留在物体上的气味；
(2)5min结束后，立即将小鼠放回原来饲养的鼠盒内，待小鼠休息2小时以及24小时后再进行测试；
(3)在将小鼠放回旷场反应箱之前，将反应箱其中的一个物体(B)替换成颜色，形状和材质均不相同的物体(C)，记录小鼠在这5min探索时期内与这两个物体接触的情况(A，C)。
3.3实验结果分析
在旷场实验中，各组小鼠在不同区域的停留时间没有明显差异，说明小鼠没有紧张情绪 (图1和图2)。在新物体识别实验训练阶段，不同组的动物对同一物体没有偏好(图3，P<0.001)。训练后2小时的试验阶段，各组小鼠在探索新目标所花费的时间百分比没有明显差异(图4，P>0.05)，而在训练后24小时的试验阶段，IH组小鼠探索新目标所花费的时间百分比明显减少，GSK2606414可以增加探索新目标的时间(图4，P<0.05)，有效改善认知功能障碍。
4.长时程增强(Long term potentiaL，LTP)的测定
(1)IH结束后，小鼠用异氟烷麻醉，断头取脑，固定在切片平台上，放入遇冷后人工脑脊液后，能够振动切片机切成300μm。放入通有95％O2/5％CO2气体的人工脑脊液中，34℃孵育1.5～2h；
(2)多极阵列记录系统(MED64)，采用日本ALpha Med sciences产品。MED64系统包括四个部分：信号放大器，分离器，链接板，多电极阵列探测器。将孵育恢复后的脑片到含有人工脑脊液的多电极阵列探测器(电极间距100μm)，在显微镜的观察下，将海马的CA1 区域移到多电极阵列探测器；
(3)将放置好海马脑片的多电极阵列探测器放置到链接板上，并通有95％O2/5％CO2气体的人工脑脊液在多电极阵列探测器中循环流动；
(4)给予不同的电流刺激后，观察场兴奋性突触后电位(fieLd excitatory postsynaptic potentiaL，fEPSC)的反应。根据I-V曲线，确定电流刺激强度，使得fEPSC大小为最大值 30～40％。刺激长度为1ms，刺激频率为0.0167HZ；
(5)在基线平稳30min后，给予高频刺激(刺激频率100HZ，维持1s)。在高频刺激后，并连续记录场兴奋性突触后电位1h后，将高频刺激后的50min至60min的fEPSC平均值除以高频刺激前基线的fEPSC数值，作为长时程增强结果。
测试结果如图5和图6所示。由图分析可知，对照组的LTP值为157.04±4.3％，而GSK2460414本身对fEPSP的增强没有任何影响。另一方面，14d IH组中fEPSP幅度 (104.61±4.02％，P＜0.05)，而IH+GSK26064组中LTP幅度为156.67±11.42％，与IH组相比有显著性差异(P＜0.05)。结果表明GSK2606414能够提高LTP幅度，IH后14d小鼠海马 LTP下降，GSK2606414可以提高IH模型中LTP幅度，进而提高海马突触可塑性。
5.免疫印迹检测蛋白质表达
5.1细胞可溶性总蛋白的提取
在行为学结束后，将每组中3只小鼠用戊巴比妥钠麻醉后，打开胸腔后，将针头插入左心室，并剪开右心耳。先用生理盐水灌注50mL，断头后分离出海马组织。用RIPA组织细胞快速裂解液提取海马组织总蛋白。
(1)按1mL RIPA加100μL PMSF蛋白酶抑制剂的比例准备RIPA，冰浴；
(2)取液氮冻存组织标本0.1g放入10mL离心管，加入1mL冰浴RIPA，眼科剪剪碎，冰浴20min；
(3)冰浴下内切式匀浆机匀浆；
(4)将样品转移到1.5mL离心管，4℃，12000g×10min；
(5)将上清转移到干净无菌离心管，-20℃保存。
5.2BCA蛋白浓度测定
采用Thermo BCA蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定。
(1)按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50：1)配制适量BCA工作液，充分混匀；
(2)用PBS溶液完全溶解蛋白标准品，取10μL稀释至100μL，使其终浓度为0.5mg/mL；
(3)将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20μL加到96孔板的标准品孔中，PBS溶液补足20μL；
(4)加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加PBS溶液补足到20μL；
(5)每孔各加入200μL BCA工作液，37℃放置30min；
(6)酶标仪在562nm波长下测定吸光度值；
(7)用测得的标准品的吸光度值建立标准曲线(理论上呈一条直线)及方程，根据标准曲线方程计算出样品的蛋白浓度。
5.3半干转法检测相关目的蛋白的表达
(1)聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)垂直平板电泳
①用洗涤剂、蒸馏水和70％乙醇将两块玻璃板、垫条洗净晾干。在制胶架上组装制胶装置，使其完好吻合以防灌胶时渗漏；
②配制12％的分离胶(15mL)，加入新鲜配制的10％硫酸铵100μL和TEMED 20μL，轻轻搅拌混匀，不产生气泡；
③将分离胶用移液管缓慢倒入两玻璃板间。灌至离成胶板顶端大约2cm处,在凝胶溶液之上轻轻注入蒸馏水,维持胶表面平整,避免产生气泡，室温静置45-60分钟,待聚丙烯酰胺聚合后可在水和胶之间看见一条清晰的折光线；
④倒尽顶层蒸馏水。多余的水用滤纸轻轻吸干；
⑤配制4％积层胶液体8mL，灌入到玻璃板夹层中，至离夹层的顶部约5mm高为止，避免产生气泡；
⑥将TefLon梳子插入积层胶液体中。室温静置30～45min待积层胶聚合，小心拔出梳子，并以1×SDS电泳电极缓冲液冲洗加样孔数次；
⑦将卸下玻璃板下方的垫片，重新装入制胶架并置入电泳槽中；内槽、外槽加入1×SDS 电泳电极缓冲液至刚好淹没凝胶的加样孔，而两槽液体不相通；用弯头吸管将加样孔内和玻璃板下面密封条位置的气泡全部排出；
⑧在EP管中，用2×SDS加样缓冲液按1：1稀释待测蛋白样品，于100℃煮沸3～5min后立即置于冰上；
⑨上样：用微量进样器吸取30μg的蛋白样品(10μL)小心加入点样孔中，尽量避免不同点样孔之间的污染，每点完一个样品后要用蒸馏水将微量进样器反复洗涤3次。在样品旁边的点样孔中加入预染好的蛋白质marker，闲置的孔加入等体积的1×SDS样品缓冲液；
⑩4℃冰箱内电泳：首先以恒定电压60V电泳，当待测样品完全进入分离胶后改为电压为100V继续电泳，至溴酚蓝距凝胶底部1cm时停止电泳(共约3～4h)。
(2)转膜
①撤卸玻璃板夹层，去除积层胶，以适量的转移缓冲液平衡凝胶30分钟；
②按胶的大小剪裁六张滤纸和聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)；
③组装转印夹层：负极--海绵--3张滤纸--凝胶--PVDF膜--滤纸--海绵--正极，对齐；
④在组装好的转印夹层放入半干转仪中，将转膜钙合上，并连接好电源，室温条件下18V 电转1小时，将胶上的蛋白电转移至PVDF膜上。
(3)免疫印迹
①封闭：为了降低膜与抗体的非特异性结合，将转移好的PVDF膜放入5％脱脂奶粉封闭液中，室温封闭2h，TBST洗涤；
②孵一抗：用封闭液稀释小鼠抗小鼠CHOP单抗，兔抗大鼠p-PERK多抗，兔抗大鼠p-eLf2α多抗，兔抗大鼠ATF-4多抗，将PVDF膜加入稀释的一抗工作液中，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次×10min；
③孵二抗：将PVDF膜加入封闭液稀释的荧光标记的羊抗小鼠，羊抗兔Ig二抗(1：10000)，室温振摇孵育1h，TBST洗膜3次×10min；
④以β-actin做内对照：将封闭后的PVDF膜加入封闭液稀释后的小鼠抗人β-actin一抗 (1：10000)，4℃孵育过夜。TBST洗膜3次×10min。再加入封闭液稀释的荧光标记的羊抗小鼠Ig二抗(1：10000)，室温振摇孵育1h，TBST洗膜3次×10min。
(4)免疫印迹激光成像系统显示杂交印迹
①TBST洗膜后，将膜的正面朝下，平铺在扫描仪上；
②调整扫描位置的大小，扫描结束后，调整亮度及对比度，导出其图片；
③扫描分析：打开QuaLity One 4.6.2软件，导入图片，使用灰度扫描工具，扫描相应条带的灰度值，存储；用ExceL根据灰度值绘制柱形图进行统计分析。
5.4结果分析
测试结果如图7和图8所示。分析可知，在每天IH处理前，我们对小鼠进行GSK2606414 灌胃(50mg/kg)，结果显示，GSK2606414可显著降低p-PERK，p-elf2α和ATF-4的表达量，从而抑制相应蛋白的表达。该结果表明GSK2606414能够有效抑制PERK通路的激活。
实施例2：
1、水飞蓟提取物的制备：
取水飞蓟种子低温冷冻24h，用多功能豆浆机将其粉碎，过四十目筛，用石油醚(30～60℃) 索式回流脱脂至提取液澄清，干燥，得脱脂种子粉。按料液比为1：15加入乙醇，浸渍6h后，置于超声波清洗器中，温度60℃、超声功率100％条件下超声40min；超声处理后，过滤，减压蒸馏(44℃)，得到黄色粉末状物质。加甲醇溶解、离心、过滤，重复两次，取不溶物真空干燥，得到提取物。经测定，均以mg/g脱脂种子表示，总黄酮含量62.31mg/g，水飞蓟宾含量39.62mg/g。
1.1总黄酮含量的测定：
准确称取0.3g样品溶解在40mL甲醇中，再用同一溶剂稀释到50.0mL，摇匀；用移液管吸取1.0mL该溶液到10mL容量瓶中，另外准备1.0mL的甲醇作空白样。分别向上述样品溶液和空白甲醇中加入2mL新鲜配制的2,4-二硝基苯肼溶液，摇匀后，50～55℃水溶液中加热反应50min；冷却后用氢氧化钾甲醇溶液(10g氢氧化钾溶解在30mL水中，用甲醇稀释至100mL)，稀释到10mL，充分混匀。2min后，将混合溶液移至500mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，充分摇匀，超声10min，过0.45μm滤膜。在490nm波长下(1cm厚测量池)测量提取液的吸光度，用空白溶液作参考，取537为水飞蓟宾2,4-二硝基苯肼衍生物的消光值E (1％，1cm)时，按下列公式计算黄酮类化合物的含量：
总黄酮质量分数C1(％)＝(490nm处吸光度)/样品质量×(10/2)×(500/10)×(1/537) ×100％
总黄酮质量分数C2(mg/g)＝提取物质量/脱脂种子质量×C1×1000
1.2水飞蓟宾含量测定：
采用薄板分离-紫外分光光度法测定。称取提取物样品60.0mg，加入95％乙醇溶解，并于10mL容量瓶中稀释至刻度，用微量注射器准确吸取上述溶液50μL，点于硅胶G板上，随行点水飞蓟宾标准液(7.3mg/5mL 95％乙醇)，用氯仿：甲醇＝5：1(体积比)展开，取出板，用1％三氯化铁乙醇溶液显色，画下与标准品Rf值一致的斑点轮廓，挥干溶剂，刮下斑点，放入具塞三角瓶中，准确加入20mL甲醇，浸渍30min，过滤，用紫外分光光度计于287nm 测定吸收度，计算水飞蓟宾相对含量：
水飞蓟宾质量分数M1(％)＝(C×20×103×10)/(50×103×60)×100％
水飞蓟宾质量分数M2(mg/g)＝提取物质量/脱脂种子质量×M1×1000
式中，C为依据水飞蓟宾标准样品制得的标准曲线，读取287nm处吸光度值对应的溶液浓度值，μg/mL。
2、间歇性缺氧动物模型
2.1模型建立与实施例1相同
2.2药物配置和分组
将GSK2606414溶解在含有0.5％羟丙基甲基纤维素双蒸水中，配置浓度为5mg/ml；将水飞蓟提取物溶解在含有0.5％羟丙基甲基纤维素双蒸水中，配置浓度为5mg/mL。采用随机数字表法将小鼠随机分为7组：对照组(Control)：灌胃0.5％羟丙基甲基纤维素0.2ml；GSK2606414组：灌胃GSK2606414 0.2ml(50mg/kg/day)；水飞蓟提取物组：灌胃水飞蓟提取物0.168mL(42mg/kg/day)；间歇性低氧组(IH)(实验组1)：灌胃0.5％羟丙基甲基纤维素0.2ml；IH+GSK2606414组(实验组2)：灌胃GSK2606414 0.2ml(50mg/kg/day)；IH+水飞蓟提取物组(实验组3)：灌胃水飞蓟提取物0.168mL(42mg/kg/day)；IH+GSK2606414+水飞蓟提取物组(实验组4)：灌胃GSK2606414 0.2ml(50mg/kg/day)、水飞蓟提取物0.168mL (42mg/kg/day)。
2.3配伍计算方法
依据金氏公式计算q值，q＝EA+B/(EA+EB-EA×EB)，用于判断两药物配伍使用后的效果是否优于单独给药。若q<0.55，两药作用为显著拮抗；0.55≤q<0.85，两药作用为拮抗；0.85≤q<1.15，两药作用为单纯相加；1.15≤q<20，两药作用为协同增强；q≥20，两药作用为显著增强。
2.4长时程增强(Long term potential，LTP)的测定与实施例1相同
测试结果如图9所示。从图中看来，水飞蓟提取物组LTP值为151.42±3.78％，相比于对照组，其对fEPSP的增强基本没有影响；实验组3的值为132.43±5.43％，相比实验组1，有一定的提升，但要低于实验组2，表明水飞蓟提取物在一定程度上可以提升fEPSP的幅度。从图中数据计算可得，实验组2、实验组3、实验组4中fEPSP值的提升率分别为49.76％、26.59％、79.36％，依据金氏公式，q＝79.36％/(49.76％+26.59％-49.76％×26.59％)＝1.26，符合 1.15≤q<20。实验组4的值为183.97±4.12％，明显高于实验组1～3，表明水飞蓟提取物和 GSK2606414协同作用，对fEPSP幅度提升效果具有增强作用。差异均有统计学意义(P＜0.05)。
2.5免疫印迹检测蛋白质表达与实施例1相同
测试结果如图10所示。从图中分析可得，相比于对照组，水飞蓟提取物组对p-PERK， p-elf2α和ATF-4含量的影响不大。从图中数据计算可得，实验组2、实验组3、实验组4中 p-PERK表达量的下降率分别为22.5％、12.5％、37.5％，依据金氏公式， q＝37.5％/(22.5％+12.5％-22.5％×12.5％)＝1.17，符合1.15≤q<20；同理，p-elf2α和ATF-4的q 分别为1.22、1.21。同时，实验组3中p-PERK，p-elf2α和ATF-4的含量均低于实验组1，但要高于实验组2，表明水飞蓟提取物对p-PERK，p-elf2α和ATF-4的表达含量具有一定的抑制作用，影响相应蛋白的表达；实验组4的相应值均低于实验组2，表明水飞蓟提取物和 GSK2606414复配使用，可以有效降低p-PERK，p-elf2α和ATF-4的表达含量，对蛋白质表达的抑制作用显著增加，两药作用为协同增强。差异均有统计学意义(P＜0.05)。
实施例3
1、水飞蓟提取物的制备与实施例2相同
2、间歇性缺氧动物模型
2.1模型建立与实施例1相同
2.2药物配置和分组
将GSK2606414溶解在含有0.5％羟丙基甲基纤维素双蒸水中，配置浓度为5mg/ml；将水飞蓟提取物溶解在含有0.5％羟丙基甲基纤维素双蒸水中，配置浓度为5mg/mL；将芒柄花苷溶解在含有0.5％羟丙基甲基纤维素双蒸水中，配置浓度为5mg/mL。采用随机数字表法将小鼠随机分为6组：间歇性低氧组(IH)(实验组1)：灌胃0.5％羟丙基甲基纤维素0.2ml；IH+GSK2606414组(IH+GSK2606414)(实验组2)：灌胃GSK2606414 0.2ml(50mg/kg/day)； IH+水飞蓟提取物组(实验组3)：灌胃水飞蓟提取物0.168mL(42mg/kg/day)； IH+GSK2606414+水飞蓟提取物(实验组4)：灌胃GSK2606414 0.2ml(50mg/kg/day)、水飞蓟提取物0.168mL(42mg/kg/day)；IH+水飞蓟提取物+芒柄花苷组(实验组5)：灌胃水飞蓟提取物0.168mL(42mg/kg/day)、芒柄花苷0.1mL(25mg/kg/day)；IH+GSK2606414+水飞蓟提取物+芒柄花苷组(实验组6)：灌胃GSK2606414 0.2ml(50mg/kg/day)、水飞蓟提取物 0.168mL(42mg/kg/day)、芒柄花苷0.1mL(25mg/kg/day)。
2.3长时程增强(Long term potential，LTP)的测定与实施例1相同
测试结果如图11所示。从图中看来，实验组5的LTP值为151.45±3.41％，相比于实验组3，具有一定的提升，表明芒柄花苷的加入对水飞蓟提取物的作用具有一定的增强效果；实验组6的值为194.31±3.83％，高于实验组4，表明芒柄花苷与水飞蓟提取物复配再和GSK2606414协同作用，进一步提升fEPSP的幅度，芒柄花苷的存在具有复配增强效果。
2.4免疫印迹检测蛋白质表达与实施例1相同
测试结果如图12所示。从图中分析可得，实验组5中p-PERK，p-elf2α和ATF-4的含量均低于实验组3，与实验组2效果相当，表明芒柄花苷的加入对水飞蓟提取物的作用具有增强效果，进一步抑制相应蛋白的表达；实验组6的相应值均低于实验组4，表明芒柄花苷与水飞蓟提取物复配再和GSK2606414协同作用，可进一步降低p-PERK，p-elf2α和ATF-4的表达含量，增强对相应蛋白质表达的抑制作用，芒柄花苷的存在起到复配增强的效果。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (5)

1.一种药物组合物，包括，GSK2606414和水飞蓟提取物；
所述水飞蓟提取物的制备方法，具体为：取水飞蓟种子低温冷冻24h，用多功能豆浆机将其粉碎，过四十目筛，用石油醚（30~60℃）索式回流脱脂至提取液澄清，干燥，得脱脂种子粉；按料液比为1：15加入乙醇，浸渍6h后，置于超声波清洗器中，温度60℃、超声功率100％条件下超声40min；超声处理后，过滤，减压蒸馏（44℃），得到黄色粉末状物质；加甲醇溶解、离心、过滤，重复两次，取不溶物真空干燥，得到提取物。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：所述GSK2606414和水飞蓟提取物的质量比为1：0.72~0.91；所述水飞蓟提取物中，水飞蓟宾含量39.62mg/g，总黄酮含量62.31mg/g。
3.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物还包括芒柄花苷。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：所述组合物能够改善神经认知功能障碍。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于：所述组合物显著抑制PERK通路的激活。
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水飞蓟宾对阿尔茨海默病动物模型的保护作用及机制研究;宋晓宇;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20170815(第8期);E057-53 *

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