CN112394175A - IgG3检测试剂在制备结直肠癌诊断剂方面的应用 - Google Patents
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Abstract
IgG3检测试剂在制备结直肠癌诊断剂方面的应用。本发明属于生物医药领域,涉及免疫球蛋白亚型中的IgG3的检测试剂在制备结直肠癌诊断或预后试剂/试剂盒中的应用。本发明研究发现,免疫球蛋白亚型中的IgG3在结肠直肠癌中高表达,且具有很大的差异性和可信度。将IgG3作为结直肠癌诊断生物标记物,具有特异性强,灵敏度高的优势,有利于提高结肠直肠癌的诊疗水平,有效防治结直肠癌。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,涉及IgG3的检测试剂在制备结肠直肠癌诊断试剂/试剂盒中的应用和一种结肠直肠癌诊断的试剂/试剂盒。
发明背景
结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是最常见的消化道恶性肿瘤,是世界第二大癌症,其高发病率和致死率分别位于第三位和第四位。近年来随着我国人民生活水平的提高、生活方式的改变以及人口老龄化,结直肠癌在我国的发病率呈现逐渐上升的趋势,居我国恶性肿瘤发病率第三位和死亡率第五位,严重威胁着人们的健康和生命。早发现、早诊断、早治疗是治疗结直肠癌的关键。但是结直肠癌初期多数没有明显症状,随病情进展多以“肠炎”就诊,使得大部分结直肠癌患者确诊时已处于肿瘤进展期,失去了最佳的治疗时机,导致其五年生存率不到20%,预后较差。因此,探索结直肠癌早期、快速、大规模的诊断方法,提高诊疗水平,是目前防治结直肠癌亟待解决的问题。
人的血清中含有大量的免疫球蛋白(Immunoglobulin,Ig),免疫球蛋白是一种主要由浆细胞分泌,被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等病原体的大型Y形蛋白质,具有多种免疫球蛋白亚型;更重要的是,免疫球蛋白的不同亚型在机体遭受感染时会出现波动变化;且与其他蛋白分子相比,免疫球蛋白具有更稳定的性质及更长的半衰期,这些特点使得血浆中不同免疫球蛋白亚型表达水平在感染及肿瘤等疾病诊断应用上具有广阔的前景。
IgG是血清中含量最高的免疫球蛋白,占70%-75%,也是最重要的抗感染分子。IgG是高度糖基化的蛋白质,IgG根据其分子主链(γ链)抗原性的差别及二硫键数目和位置的不同,可分为4个亚型,分别是IgG1,IgG2,IgG3和IgG4。各种亚型都有各自特性和不同的功能,IgG作用大多通过IgG亚型来完成。IgG1是IgG中最重要的亚型,具有很强的激活补体和结合吞噬能力。IgG1在血浆中含量最多,也是重组抗体药物应用最多的亚型。IgG2在对多糖抗原的免疫、应答中占优势。IgG3在对蛋白质及多肽类抗原产生的免疫应答中常常表现出比IgG1更高的亲和力。IgG4主要参与过敏反应。
由于IgG的每种亚型都具有不同的功能,在相应疾病发生时,需要对IgG的各亚型进行针对性的分析和研究才能得到相对准确的结果。近年来随着新适应症的拓展、新作用机制抗体药物的发现,IgG2、IgG4亚型的应用逐渐增多。然而关于IgG3与相关疾病的研究还比较有限。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性强、灵敏度高的结肠直肠癌的分子标志物,以及该分子标志物的诊断试剂及其应用。
本发明的上述目的通过以下技术手段实现:
一方面,本发明提供了IgG3的检测试剂在制备结直肠癌诊断试剂或试剂盒中的应用。
本发明发明人收集了健康人血液(优选采用血浆样本)和结直肠癌患者的血浆样本进行检测,通过数据处理分析,得到标准化的不同血浆促/抑炎因子丰度,非显而易见地发现,免疫球蛋白亚型IgG3差异表达,可以作为结直肠癌诊断生物标记物。
上述IgG3的检测试剂为检测IgG3的mRNA的表达量;或者检测IgG3蛋白的表达量,或者检测IgG3蛋白的生物活性中的一种或几种。作为本发明中一种优选的实施方式,所述的IgG3的检测试剂为检测IgG3蛋白的表达量。
作为优选的实施方式IgG3的表达量即表示IgG3在检测样品中的浓度;作为更优选的实施方式,表示IgG3在血浆中的浓度。
作为优选的实施方式,所述的检测试剂选自检测IgG3的抗体、抗体功能性片段或者偶联抗体中的一种或多种。
作为优选的实施方式,所述的偶联抗体选自荧光素偶联抗体或生物酶偶联抗体中的一种或两种。
其中,所述的抗体可能是单克隆抗体,多克隆抗体,多价抗体,多特异性抗体(例如:双特异性抗体),和/或连接在蛋白酶体上的抗体片段。该抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体、CDR移植抗体或人型抗体。抗体片段可以是,例如,Fab,Fab’,F(ab’)2,Fv,Fd,单链Fv(scFv),具二硫键的Fv(sdFv),或VL、VH结构域。抗体可能是一个共轭的形式,例如,结合一个标签、一个可检测标记,或一种细胞毒性剂。
作为优选的实施方式,所述试剂盒为ELISA试剂盒,进一步地,是基于抗人IgG3偶联抗体的ELISA试剂盒,该检测试剂盒用于检测IgG3蛋白的表达量。
作为优选的实施方式,所述的检测试剂的检测方法为ELISA法、蛋白芯片法、液相色谱法、免疫比浊法、流式细胞法中的任意一种或几种;作为优选的实施方式,所述的检测试剂的检测方法为蛋白芯片法、ELISA法或免疫比浊法中的一种或几种。
作为优选的实施方式,所述的检测试剂判断结直肠癌高风险或低风险的IgG3蛋白表达量临界值的取值范围为3404.4pg/ml至4069.7pg/ml。
作为更为优选的实施方式,所述IgG3蛋白表达量临界值取值为3784.20pg/ml;当IgG3蛋白的表达量≤3784.20pg/ml,则结直肠癌低风险;所述的检测试剂的检测结果为:IgG3蛋白的表达量>3784.20pg/ml,则结直肠癌高风险。
作为本发明一种示范性的实施方式,IgG3的表达量的计算方法可以采用标准曲线法。
作为优选的实施方式,检测试剂所检测样品为血液;作为优选的实施方式,检测试剂所检测样品为血浆。
另一方面,本发明还提供了一种结直肠癌诊断的试剂或试剂盒,所述的试剂或试剂盒含有IgG3的检测试剂。IgG3的检测试剂如上所述。
另一方面,本发明还提供了一种结直肠癌诊断的芯片,该芯片包括固相载体以及固定于固相载体上的生物标志物IgG3的探针。作为优选的实施方式,所述的芯片为蛋白芯片。
另一方面,本发明还提供了一种结直肠癌诊断系统,该检测系统含有:
a)检测构件:所述的检测构件用以检测诊断对象的IgG3的表达量;
b)结果判断构件:所述的结果判断构件用于根据检测构件所检测的IgG3的表达量得出结直肠癌的患病的可能性或者风险值;
作为优选的实施方式,所述的检测构件为酶标仪、激光扫描仪、流式细胞仪、液相色谱仪中的一种或几种;作为优选的实施方式,所述的检测构件为酶标仪、激光扫描仪中的一种或两种。
作为优选的实施方式,所述的结果判断构件为软件,其含有输入模块、分析模块和输出模块;输入模块用于输入IgG3的表达量;分析模块用于根据IgG3的表达量,分析出结肠直肠癌患病可能性或者风险值;输出模块用于输出分析模块的分析结果。
其中,所述的系统中,IgG3的表达量为IgG3的mRNA的表达量;或者为IgG3蛋白的表达量。作为优选的实施方式,所述的检测构件检测的是IgG3蛋白的表达量。
作为优选的实施方式,所述的结构判断构件中,判断直肠癌高风险或低风险的IgG3蛋白表达量临界值的取值范围为3404.4pg/ml至4069.7pg/ml。
作为优选的实施方式,所述IgG3蛋白表达量临界值取值为3784.20pg/ml;当IgG3蛋白的表达量≤3784.20pg/ml,则结直肠癌低风险;所述的检测试剂的检测结果为:IgG3蛋白的表达量>3784.20pg/ml,则结直肠癌高风险。
其中,所述的诊断系统的诊断样品为血液;更优选为血浆。
本发明的有益效果:
(1)本发明发现,在众多的免疫球蛋白亚型中,IgG3差异表达,其可作为结肠直肠的生物标志物,且具有良好的特异性、灵敏度。
(2)本发明检测试剂的检测对象为血液,可实现动态、大规模筛查。
(3)和血浆中其他蛋白相比,免疫球蛋白半衰期较长,性质稳定,更适于作为疾病诊断的标志物。
附图说明
图1为差异免疫球蛋白亚型火山图。
图2为51例健康人、99例结直肠癌患者血浆中IgD、IgG3浓度比较。
图3为IgG3、IgD单个指标区分结直肠癌的ROC曲线分析。
图4为免疫球蛋白标准品梯度稀释图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案,具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
实施例1差异免疫球蛋白亚型的表达分析
实验方法:
本发明首先收集中山大学附属第六医院49例健康人及99例结直肠癌患者血浆,通过以下步骤获得筛选出差异免疫球蛋白亚型:
1.通过枸橼酸钠抗凝采血管收取3-5cm健康人或结直肠癌患者全血;
2. 500g转速下离心10分钟,血细胞沉淀后吸取得到血浆上层;
3.收集血浆上层清液再通过2000g转速下离心15min的到去除沉淀后血浆样本;
4.分装冻存于-80℃冰箱;
5.对血浆样本进行瑞博奥蛋白芯片(型号QAH-ISO-1)检测;
(1)玻片芯片的完全干燥
将玻片芯片从盒子中取出来,在室温平衡20-30min后,将包装袋打开,揭开密封条,然后将芯片放在真空干燥器或者室温干燥1-2小时。
(2)标准品的配置
免疫球蛋白亚型标准品梯度稀释见图4。
添加500μL的样品稀释液(sample diluent)到免疫球蛋白亚型标准混合物的小管中,重新溶解标准品。打开小管前,先快速的离心,轻轻的上下吹打溶解粉末,标记这个小管为Std 1。
分别标记6个干净的离心管为Std2、Std3到Std7,添加200μL的样品稀释液到每个小管中。
抽取100μL的Std 1加入到Std2中轻轻混合,然后从Std 2中抽取100μL加入到Std3中,如此梯度稀释至Std7。
抽取100μL的样品稀释液到另一个新的离心管中,标记为CNTRL,作为阴性对照。
注:因为每种免于球蛋白亚型的起始浓度是不同的,所以Std1到Std7的梯度稀释后,每个细胞因子的系列浓度是不同的。
(3)芯片操作流程
(a)每个孔中加100μL的样品稀释液,室温摇床上孵育1h,封闭定量抗体芯片。
(b)抽去每个孔中的缓冲液,添加100μL的标准液和样品到孔中,4℃过夜孵育。(样品1万倍稀释)
(c)使用Thermo Scientific Wellwash Versa芯片洗板机清洗玻片,分为两步,首先用1×洗液I进行清洗,每孔250μL的1×洗液I,清洗10次,每次震荡10s,震荡强度选择高,用去离子水稀释20×洗液I。然后换用1×洗液II通道进行清洗,每孔250μL的1×洗液II,清洗6次,每次震荡10s,震荡强度选择高,用去离子水稀释20×洗液II。
(d)检测抗体混合物的孵育,离心检测抗体混合物小管,然后加入1.4ml的样品稀释液,混合均匀后再次快速离心。添加80μL的检测抗体到每个孔中,RT摇床上孵育2小时。
(e)清洗,同步骤(c)。
(f)Cy3-链霉亲和素的孵育,离心Cy3-链霉亲和素小管,然后加入1.4ml的样品稀释液,混合均匀后再次快速离心。添加80μL的Cy3-链霉亲和素到每个孔中,用铝箔纸包住玻片避光孵育,RT摇床上孵育1个小时。
(g)清洗,同步骤(c)。
(h)荧光检测,采用激光扫描仪例如InnoScan 300扫描信号,采用Cy3或者绿色通道(激发频率=532nm),仪器型号:InnoScan 300Microarray Scanner,厂家:Innopsys,扫描参数:WaveLengh:532nm;Resolution:10μm,采用QAH-ISO-1的数据分析软件来进行数据分析。
6.对检测数据进行标准化处理,对比分析各个免疫球蛋白亚型在三组样本中的表达情况。
分析数据:
1.差异免疫球蛋白火山图分析
差异免疫球蛋白火山图分析的结果见表1和图1。
差异表达蛋白(DEPs)。
为了检测差异表达蛋白,我们对10000倍稀释后样品不同抗体亚型浓度值进行比较,比较后得到两组间每个抗体亚型变化倍数(log2倍数变化)和T检验后P值(-log10P值)。
差异表达蛋白是指P值小于0.05(-log10P value大于1.3),并且变化倍数(log2倍数变化)大于+0.58或小于-0.58的蛋白。
表1差异免疫球蛋白对比结直肠癌对比健康人组
IgD | IgE | IgM | IgG1 | IgG2 | IgG3 | IgG4 | IgA1 | IgA2 | |
log2倍数(结直肠/健康) | 0.716 | -0.367 | 0.030 | 0.155 | 0.098 | 0.600 | 0.573 | 0.010 | -0.534 |
-log10P值 | 1.980 | 2.899 | 0.169 | 0.677 | 0.415 | 2.282 | 1.300 | 0.061 | 1.092 |
由表1和图1说明:和健康人组相比,IgD及IgG3免疫球蛋白亚型在结直肠癌患者组中显著高表达。
2.健康人和结直肠癌患者血浆IgD及IgG3浓度比较
51例健康人,99例结直肠癌患者血浆IgD、IgG3浓度比较(见图2)。
IgD(P=0.011)和IgG3(P=0.0052)在结直肠癌组和健康人之间皆有较大差异。
3.IgD及IgG3单指标ROC曲线分析
1及2结果提示,IgD及IgG3可作为区分结直肠癌的差异指标。为了评估IgD及IgG3区分结直肠癌/健康人的能力,我们对IgD及IgG3分别进行了ROC曲线分析。
如图3所示,和IgD相比(曲线下面积=0.619,P=0.017),IgG3显示出了更好的区分结直肠癌/健康人的能力(曲线下面积=0.644,P=0.004)。
综合以上结果,我们选定IgG3作为区分结直肠癌/健康人的差异指标。
3.IgG3最佳诊断界限值的选取
我们将ROC曲线分析中的诊断界限值进行约登指数(Youden’s index)排序,如表3所示,选取约登指数排前10的界限值进行分析发现:当以IgG3浓度3784.20pg/ml为临界值时,显示出了最高的区分结直肠癌的能力(灵敏度=0.59,特异度=0.71)。
表3 IgG3最佳诊断界限值
由表3和图2的结果,判断结直肠癌高风险或低风险的IgG3蛋白表达量临界值的取值范围为3404.40pg/ml至4069.70pg/ml。
结合图2结果,我们将10000倍稀释后的血浆浓度IgG3=3784.20pg/ml作为临界值,当IgG3蛋白的表达量≤3784.20pg/ml,则结直肠癌低风险;所述的检测试剂的检测结果为:IgG3蛋白的表达量>3784.20pg/ml,则结直肠癌高风险。
本发明发现了IgG3可以作为存在于血浆的标记物,以血液采样的方式即可实现较好的预诊效果,这对减轻待测人群的取样痛苦,以及实现较为普及性的预诊筛查,具有非常重大的意义。
Claims (10)
1.IgG3的检测试剂在制备结直肠癌诊断试剂或试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述IgG3的检测试剂选自检测IgG3的mRNA的表达量,或者检测IgG3蛋白的表达量,或者检测IgG3蛋白的生物活性的试剂中的一种或多种;优选地,所述IgG3的检测试剂选自检测IgG3蛋白的表达量的试剂。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的检测试剂选自检测IgG3的抗体、抗体功能性片段或者偶联抗体中的一种或多种;优选地,所述的偶联抗体选自荧光素偶联抗体或生物酶偶联抗体中的一种或两种。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的试剂盒为ELISA试剂盒。
5.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的检测试剂的检测方法为ELISA法、蛋白芯片法、液相色谱法、免疫比浊法、流式细胞法中的任意一种或几种;优选地,为蛋白芯片法、ELISA法或免疫比浊法中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的检测试剂判断结直肠癌高风险或低风险的IgG3蛋白表达量临界值的取值范围为3404.4pg/ml至4069.7pg/ml;
优选地,所述IgG3蛋白表达量临界值取值为3784.20pg/ml;当IgG3蛋白的表达量≤3784.20pg/ml,则结直肠癌低风险;所述的检测试剂的检测结果为:IgG3蛋白的表达量>3784.20pg/ml,则结直肠癌高风险。
7.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的检测试剂的检测样品为血液;优选为血浆。
8.一种结肠直肠癌诊断的试剂或试剂盒,所述的试剂或试剂盒含有IgG3的检测试剂;
优选地,所述IgG3的检测试剂选自检测IgG3的mRNA的表达量,或者检测IgG3蛋白的表达量,或者检测IgG3蛋白的生物活性的试剂中的一种或多种;
优选地,所述IgG3的检测试剂选自检测IgG3蛋白的表达量的试剂;
优选地,所述的试剂或试剂盒含有检测IgG3的抗体、抗体功能性片段或者偶联抗体;更优选地,所述的偶联抗体选自荧光素偶联抗体或生物酶偶联抗体中的一种或多种;
优选地,所述的试剂盒为ELISA试剂盒;
优选地,所述的检测试剂的检测方法选自ELISA法、蛋白芯片法、液相色谱法、免疫比浊法、流式细胞法中的任意一种或几种;
优选地,所述的检测试剂的检测方法为蛋白芯片法、ELISA法或免疫比浊法中的一种或多种;
优选地,所述的检测试剂判断结直肠癌高风险或低风险的IgG3蛋白表达量临界值的取值范围为3404.4pg/ml至4069.7pg/ml;
优选地,所述IgG3蛋白表达量临界值取值为3784.20pg/ml;当IgG3蛋白的表达量≤3784.20pg/ml,则结直肠癌低风险;所述的检测试剂的检测结果为:IgG3蛋白的表达量>3784.20pg/ml,则结直肠癌高风险;
优选地,所述的检测试剂的检测样品为血液;优选为血浆。
9.一种结肠直肠癌诊断的芯片,特征在于,所述的芯片包括固相载体以及固定于固相载体上的生物标志物IgG3的探针;优选地,所述的芯片为蛋白芯片。
10.一种肠直肠癌诊断系统,其特征在于,所述的检测系统含有:
a)检测构件:所述的检测构件用以检测诊断对象的IgG3的表达量;
b)结果判断构件:所述的结果判断构件用于根据检测构件所检测的IgG3的表达量得出结肠直肠癌的患病的可能性或者风险值;
优选地,所述的检测构件为酶标仪、激光扫描仪、流式细胞仪、液相色谱仪中的一种或几种;更优选地,所述的检测构件为激光扫描仪、酶标仪中的一种或两种;
优选地,所述的结果判断构件含有输入模块、分析模块和输出模块;输入模块用于输入IgG3的表达量;分析模块用于根据IgG3的表达量,分析出结肠直肠癌患病可能性或者风险值;输出模块用于输出分析模块的分析结果;
优选地,所述IgG3的表达量为IgG3的mRNA的表达量;或者IgG3蛋白的表达量;更优选为IgG3蛋白的表达量;
优选地,所述的诊断系统的诊断样品为血液样本;更优选血浆样本;
优选地,所述的结构判断构件中,判断结直肠癌高风险或低风险的IgG3蛋白表达量临界值的取值范围为3404.4pg/ml至4069.7pg/ml;;
更优选地,所述IgG3蛋白表达量临界值取值为3784.20pg/ml;当IgG3蛋白的表达量≤3784.20pg/ml,则结直肠癌低风险;所述的检测试剂的检测结果为:
IgG3蛋白的表达量>3784.20pg/ml,则结直肠癌高风险。
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