CN112390842A

CN112390842A - 一种麦角固醇的制备方法

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Publication number: CN112390842A
Application number: CN202011513341.0A
Authority: CN
Inventors: 李明媛; 李媛; 李萌; 贾琳
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2020-12-21
Filing date: 2020-12-21
Publication date: 2021-02-23
Anticipated expiration: 2040-12-21
Also published as: CN112390842B

Abstract

本发明提供了一种麦角固醇的制备方法，先将菌种超声处理，皂化，柱层析纯化，再经过两次重结晶得到麦角固醇产品。麦角固醇的提取率可达1.63%，纯度高于99%，含量高于95%。本发明结合了超声破壁和皂化提取的优势，并创新得将两个操作分步进行，大大提高提取率。除此之外，经试验发现纯化过程中，柱层析结束后进行两次重结晶，产品纯度最高，显著优于一次或三次重结晶。整个麦角固醇的制备方法，所使用的溶剂大都能够循环套用，生产条件温和，工厂易实现批量化生产，成本低，效率高，产品优质。

Description

一种麦角固醇的制备方法

技术领域

本发明涉及一种麦角固醇的制备方法，属于生物医药技术领域。

背景技术

麦角固醇又称麦角甾醇，是许多微生物细胞膜的重要成分，在确保细胞活力、细胞膜的流动性以及细胞膜的完整性等方面具有重要作用，为白色针状或片状结晶，不溶于水，易溶于乙酸乙酯、苯、乙醚、石油醚等有机溶剂，化学结构如图1所示。

麦角固醇是一种重要的医药化工原料，可生产“可的松”、“黄体酮”“氢化可的松”“维生素D2”等医药，“可的松”是肾上腺皮质激素，用于治疗肾上腺皮质功能减退症、炎症和过敏性等疾病；“黄体酮”又称孕酮激素、黄体激素，用于保护女性的子宫内膜；“氢化可的松”为糖皮质激素，抗炎作用为“可的松”的1.25倍，也具有抗毒、抗休克以及免疫抑制作用；维生素D2又称麦角钙化醇，用于促进人体对钙元素和磷元素的吸收以及防止佝偻病、软骨病和手足抽搐等异常疾病的发生。

麦角固醇的提取的技术脉络大致可分为，周礼红等（专利，公开号：CN105884850A）采用有机溶剂浸提法提取麦角固醇，耗时长且麦角固醇损失较多。曹乐吟等（专利，公开号：CN109280070A）、胡晓进等（专利，公开号：CN110669092A）以及韩庆雪等（麦角固醇工业化提取工艺研究.《河北化工》，2007(02):42-43.）采用皂化方法进行提取，其中胡晓进等（专利，公开号：CN110669092A）的取得的效果为：取0.0098g麦角甾醇对照品配成25mL溶液，麦角甾醇样品2.8mg配成10mL溶液，两者经HPLC法分析，在同一流动相下，外标法测定其中含有2.1356mg麦角甾醇，且纯度低于95%。

胡代花等（正交试验优化香菇粉中麦角甾醇和VD_2超声波微波协同提取工艺.《食品工业科技》，2020,41(19):186-197）采用超声方法进行提取，但是仅超声无法将细胞膜中酯化的麦角固醇完全提取出来，提取率仅为0.36%。

杨雪莲等（专利，公开号：CN106397524A）、徐明芳等（专利，公开号：CN108828096A）、郭育涛（黑曲霉固体发酵生产麦角固醇的研究，《中国科技信息》,2008（09）：35-37.）采用超声皂化，同时进行，提取亦不够充分，且均得到的是提取样的粗品，未进行纯化操作。

韩庆雪（麦角固醇提取工艺的中试放大研究，硕士学位论文，2007）在工艺研究中优选皂化、萃取、结晶纯化三步制备麦角固醇，其中以乙酯和水为溶剂进行重结晶，其公开了结晶条件是得到高纯度麦角固醇的关健，本文在原有结晶条件的基础上改进了结晶工艺。通过控制结晶初始浓度(0.3%)、降温速度(10℃/h)、养晶过程，得到较好的麦角固醇粗品，经乙酯和水进行重结晶。采用新的结晶工艺，成品含量最高达99%，总收率为0.41%。

在针对麦角固醇的提取研究中，如何将提取率、提取纯度及含量兼顾是所要解决的根本问题。纯度指液相色谱检测中，除去溶剂峰后，药物峰占所有峰的比例；含量指以麦角固醇标准品作为外标，计算麦角固醇的产品浓度，乘以产品配置过程中的稀释浓度，再除以产品的称量量，所得百分比即得产品含量。

发明内容

现有麦角固醇的制备方法大都提取率较低，而纯度都不高，产品质量较差，且成本高不易于工厂批量生产。与现有技术相比，本发明涉及的麦角固醇的制备方法具有以下优点：首先，创新的结合了超声破壁和皂化联用提取的优势，利用其协同效应，进行分步操作，将细胞中的麦角固醇尽数提出，提取率大大提高，就普通酵母菌来说，可达1.63%；其次，本发明首次采取柱层析法与两次重结晶联合纯化的方法，制得纯度高于99%，含量高于95%的麦角固醇产品；除此之外，本领域已知，对大部分提取物而言，经过多次结晶可提高纯度，但也会导致提取收率的较大损失，本课题组的研究表明针对麦角固醇的提取，经过两次重结晶对于产品收率影响较小，而纯度却显著高于一次重结晶。当选择三次重结晶时不仅大大影响收率，提取纯度反而会下降。即工艺创新在于，需进行且仅可进行两次重结晶；最后，整个制备工艺中涉及到的有机溶剂均可回收利用，生产条件温和，这对于将实验室制备工艺转化到工厂实现放大是极其重要的，是讨论有益的技术效果的前提。

本发明涉及一种麦角固醇的制备方法，其特征在于：

包括将菌种超声处理，皂化，柱层析纯化，两次重结晶的步骤。

一种麦角固醇的制备方法，其特征在于：包括下述步骤：

步骤1，将菌种进行超声处理，离心，取上清液浓缩，得麦角固醇粗品A；

步骤2，将步骤1离心所得沉淀进行皂化反应；

步骤3，皂化反应结束后，萃取，得麦角固醇粗品B；

步骤4，将麦角固醇粗品A、B合并，得麦角固醇粗品C；

步骤5，取麦角固醇粗品C，采用柱层析纯化，得麦角固醇粗品D；

步骤6，将麦角固醇粗品D进行第一次重结晶，得麦角固醇粗品E；

步骤7，将上述麦角固醇粗E进行第二次重结晶，得麦角固醇产品。

一种麦角固醇的制备方法，其特征在于：包括下述步骤：

步骤1，将酵母溶于醇中，超声，离心，将离心所得上清液浓缩，得麦角固醇粗品A；

步骤2，将步骤1离心所得沉淀，采用醇-碱混合液进行皂化反应；

步骤3，皂化反应结束后冷却，加入乙酸乙酯，静置，取上清液，清洗，干燥，过滤，浓缩，得麦角固醇粗品B；

步骤4，将麦角固醇粗品A、B合并，得麦角固醇粗品C；

步骤5，取麦角固醇粗品C，柱层析法纯化，减压浓缩，得麦角固醇粗品D；

步骤6，将麦角固醇粗品D溶于正己烷-乙酸乙酯混合溶剂或者乙醇或者二氯甲烷中，经第一次重结晶，得麦角固醇粗品E；

步骤7，将上述麦角固醇粗E溶于正己烷-乙酸乙酯混合溶剂或者乙醇或者二氯甲烷中，经第二次重结晶，得麦角固醇产品。

优选的，在所述步骤2中，醇碱体积比为1:1-1:10，物料皂化剂（m:V）比为1:1-1:20。

优选的，在所述步骤5中，硅胶和样品的填柱比例为1:1-20:1。

优选的，在所述步骤6和7中，正己烷-乙酸乙酯的混合溶剂或者乙醇或者二氯甲烷，且正己烷-乙酸乙酯=(10-0.1):1，溶剂量为样品的1-30倍。

一种麦角固醇，其特征在于：包括下述制备步骤：包括将菌种超声处理，皂化，柱层析纯化，两次重结晶。

优选的，包括下述制备步骤：

步骤2，将步骤1离心所得沉淀进行皂化反应；

步骤3，皂化反应结束后，萃取，得麦角固醇粗品B；

步骤4，将麦角固醇粗品A、B合并，得麦角固醇粗品C；

优选的，包括下述制备步骤：

步骤1，将酵母溶于醇中，超声，离心，将离心所得上清液浓缩，得粗品A；

步骤4，将麦角固醇粗品A、B合并，得麦角固醇粗品C；

所述麦角固醇在制备药品、保健品或化妆品中的应用。

本发明克服了现有技术中的不足，提供了一种麦角固醇的制备方法，本方法创新的结合了超声破壁和皂化提取的优势，优化了麦角固醇的纯化方法，提高了生产经济性，生产条件温和，工厂易实现批量化生产。本发明的目的通过下述技术方案予以实现。

优选的，一种麦角固醇的制备方法，按照下述步骤进行

步骤1，超声破壁：将酵母溶于乙醇中，置于超声细胞粉碎机（参数：40%、2s/2s、10min），离心，上清液浓缩得麦角固醇粗品A，沉淀经皂化处理。

步骤2，皂化提取：将沉淀置于茄形瓶中，采用醇碱体积比为1:2，物料皂化剂（m:V）比为1:10，30% NaOH、70%乙醇、2.5 h的皂化时间、85 ^oC的皂化温度。

步骤3，皂化反应结束，待冷却至20-30 ^oC，第一次加入300 mL乙酸乙酯，充分摇晃混匀，静置分液取上清液，第二次加200 mL乙酸乙酯于下层液体中，充分摇晃混匀，静置分液取上清液，第三次加200 mL乙酸乙酯于下层液体中，将三次上清液合并，加入50-100 mL饱和食盐水，分液得上清液，再加入5-10 g无水硫酸钠干燥过滤得液体，于30-40 ^oC旋蒸水浴中减压浓缩可得麦角固醇粗品B。

步骤4，柱层析法纯化：将麦角固醇粗品A和B合并得麦角固醇C，并加入1-2倍质量的硅胶（200-300目）干法拌样。采用柱层析柱，加入约1/3体积的正己烷，打开柱层析柱下面的活塞，保证体系中不会产生气泡。再向其中加入硅胶，随着沉降，会有一些硅胶粘在层析柱壁上，用正己烷将其冲入柱内。沉降完成，加入更多的正己烷，用双联球将其加压，直至流速恒定。此时，将拌好的样上样，加入一些正己烷，让其润湿，在加入一些无水硫酸钠，保证大量的洗脱剂不会冲坏硅胶表面。硅胶和样品的填柱比例为10:1，洗脱剂正己烷：乙酸乙酯=100: 1，试管收集，流速10 ml/min，TLC(薄层色谱法)检测，收集Rf＝0.50（正己烷：乙酸乙酯=5: 1）的组分合并，合并液减压浓缩可得麦角固醇D，纯度为50%-60%。

步骤5，一次重结晶：将麦角固醇D溶于5-7倍体积的正己烷：乙酸乙酯=1:1的溶剂中，加热至60-65 ^oC使其完全溶解，溶液呈澄清状态，再将其冷却至20-30 ^oC，静置5 hrs。最后，过滤，得白色粉末状固体，纯度为75%-88%的麦角固醇E。

步骤6，将麦角固醇E溶于5-20倍体积的正己烷：乙酸乙酯=1:1的溶剂中，加热至60-65 ^oC使其完全溶解，溶液呈澄清状态，再将其冷却至20-30 ^oC,静置5 hrs。过滤取滤饼，得白色针状晶体即麦角固醇产品，纯度高于99%。

在所述步骤1中采用超声破壁的方法破壁，溶剂采用乙醇。

在所述步骤2中，醇碱体积比为1:2，物料皂化剂（m:V）比为1:10，30% NaOH、70%乙醇、2.5 h的皂化时间、85 ^oC的皂化温度。

在所述步骤3中，萃取剂采用乙酸乙酯。

在所述步骤4中，硅胶和样品的填柱比例为10:1，柱层析纯化的洗脱剂的比例正己烷：乙酸乙酯=100:1。

在所述步骤5、6中，采用重结晶的方法纯化麦角固醇，且溶剂正己烷：乙酸乙酯=1:1，在重结晶的过程中，需升温至60-65 ^oC使其完全溶解，在降温至20-30 ^oC静置。

附图说明

图1是麦角固醇化学结构；

图2是本发明的提取和纯化方法流程图；

图3 实施例 1（A）、对比例 1（B）柱层析后的粗品的高效液相色谱图；

图4 对比例 3 重结晶前的麦角固醇的高效液相色谱图；

图5 100 μg/ml 麦角固醇溶液全波长扫描紫外吸收图谱；

图6 实施例 4 柱层析纯化后的麦角固醇的高效液相色谱图；

图7 麦角固醇（A）、待测麦角固醇（B）柱层析后的粗品的高效液相色谱图；

图8 麦角固醇标准品（A）、重结晶后的麦角固醇产品（B）高效液相色谱；

图9 麦角固醇核磁共振氢谱。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。

实施例1：

一、超声破壁：称取4.50 g酵母粉溶于20 mL乙醇中，置于超声细胞粉碎机（参数：40%、2s/2s、10 min），离心（9000 r, 10 min），取上清液，重复两次操作，将上清液合并浓缩得麦角固醇A，沉淀经皂化处理。

二、皂化提取：将上述沉淀置于250 mL茄形瓶中，向其中加入22.5mL 70%乙醇，随后加入45 ml 30%NaOH，将其置于85 ^oC油浴中，反应2.5 hrs。

三、萃取浓缩：待反应结束，冷却至20-30 ^oC，再加入100 mL乙酸乙酯，充分混匀，静置，取上层；再向下层液体中加入100 ml乙酸乙酯，充分混匀，静置，取上层；再向下层液体中加入100 ml乙酸乙酯，充分混匀，静置，取上层，将3次萃取分液得到的上清液合并，加入50 mL饱和食盐水，充分混匀，静置，取上层，上层液体中加入5 g无水硫酸钠干燥，过滤，取液体，减压浓缩得麦角固醇B。

四、柱层析法纯化：麦角固醇粗品A和麦角固醇B合并得麦角固醇C，并加入粗品1倍质量的硅胶干法拌样。采用柱层析柱，加入约1/3体积的正己烷，打开柱层析柱下面的活塞，保证体系中不会产生气泡。再向其中加入硅胶，随着沉降，会有一些硅胶粘在层析柱壁上，用正己烷将其冲入柱内。沉降完成，加入更多的正己烷，用双联球将其加压，直至流速恒定。此时，将拌好的样上样，加入一些正己烷，让其润湿，在加入一些无水硫酸钠，保证大量的洗脱剂不会冲坏硅胶表面。填柱比例=10:1，洗脱剂正己烷：乙酸乙酯=100: 1，试管收集，流速10 ml/min，每管收集50 ml，TLC( 薄层色谱法)检测，收集Rf＝ 0.50（正己烷：乙酸乙酯=5:1）的组分合并，合并液减压浓缩可得麦角固醇D，纯度为54%。

五、一次重结晶：麦角固醇D溶于5-7倍体积的正己烷：乙酸乙酯=1:1的溶剂中，加热至60-65 ^oC使其完全溶解，溶液呈澄清状态，再将其冷却至20-30 ^oC，静置5 hrs。最后，过滤，得白色粉末状固体，纯度为81%的麦角固醇E。

六、二次重结晶：麦角固醇E溶于5-20倍体积的正己烷：乙酸乙酯=1:1的溶剂中，加热至60-65 ^oC使其完全溶解，溶液呈澄清状态，再将其冷却至20-30 ^oC，静置5 hrs。过滤取滤饼，得白色针状晶体即麦角固醇产品，纯度为99%。

对比例1：

将步骤一、二中超声联合皂化提取的方法，更改为超声提取或者皂化提取方法或超声皂化同时进行，并比较不同提取步骤的提取效率。

步骤三与上述实施例1一致。

步骤四：取超声、皂化、超声皂化（同时）及超声皂化（分步）操作后，提取浓缩得到的麦角固醇粗品，分别取10 mg溶于10 mL甲醇中，高效液相色谱测其含量，可得提取率，见表1。其中，超声皂化（同时）操作是指称取4.50 g酵母粉溶于20 mL乙醇中，同时加入22.5mL70%乙醇，随后加入45 ml 30%NaOH，2.5 h的皂化时间、85 ^oC的皂化温度，期间，将茄形瓶取下，置于超声细胞粉碎机（参数：40%、2s/2s、10 min）超声破碎；皂化反应结束后，离心（9000r, 10 min），取上清液，浓缩得麦角固醇A。

表1 超声、皂化、超声联合皂化提取表

由表1可知，将超声破壁的物理方式和皂化提取的化学方式联用，分步进行时提取效率为1.63%，明显高于超声提取或者皂化提取单独使用的效果，也优于超声皂化同时进行的效果。

对比例2：

步骤一至三同实施例1。

步骤四：麦角固醇粗品A和B合并可得麦角固醇C，并加入1-2倍质量的硅胶干法拌样。采用柱层析柱，加入约1/3体积的正己烷，打开柱层析柱下面的活塞，保证体系中不会产生气泡。再向其中加入硅胶，随着沉降，会有一些硅胶粘在层析柱壁上，用正己烷将其冲入柱内。沉降完成，加入更多的正己烷，用双联球将其加压，直至流速恒定。此时，将拌好的样上样，加入一些正己烷，让其润湿，在加入一些无水硫酸钠，保证大量的洗脱剂不会冲坏硅胶表面。填柱比例为10:1，洗脱剂正己烷：乙酸乙酯=10: 1，试管收集，流速 10 ml/min，每管收集50 ml，TLC(薄层色谱法)检测，收集Rf＝0.50（正己烷：乙酸乙酯=5:1）的组分合并，合并液减压浓缩可得麦角固醇粗品D1，纯度仅为10%-20%。

将实施例1中和对比例2中的得到的柱层析后的粗品D和D1，各取适量溶于甲醇中进样分析。色谱条件（ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇：100%；流速：1ml/min；柱温：30 ℃；检测波长：220 nm；进样量：20 μl）高效液相色谱图对比如图3所示。

由图3可知，对比实施例1（图3A）和对比例2（图3 B），可知对比例2中存在很多杂质，但通过薄层色谱板检测只含有Rf=0.50的主点，其余杂质无明显特征（254 nm,高锰酸钾、磷钼酸、碘均不显示）。且后续再进行重结晶纯化也无法得到纯度达99%的麦角固醇。

对比例3

一、超声破壁：称取4.50 g酵母粉溶于20 mL乙醇中，置于超声细胞粉碎机（参数：40%、2s/2s、10 min），离心（9000 r, 10 min），取上清液，重复两次操作，将上清液合并浓缩得粗品A，沉淀经皂化处理。

三、萃取浓缩：待反应结束，冷却至20-30 ^oC，再加入100 mL乙酸乙酯，充分混匀，静置，取上层；再向下层液体中加入100 ml乙酸乙酯，充分混匀，静置，取上层；再向下层液体中加入100 ml乙酸乙酯，充分混匀，静置，取上层，将3次萃取分液得到的上清液合并，加入50 mL饱和食盐水，充分混匀，静置，取上层，上层液体中加入5 g无水硫酸钠干燥，过滤，取液体，减压浓缩得麦角固醇粗品B。

四、柱层析法纯化：麦角固醇粗品A和B合并得麦角固醇C，并加入粗品1倍质量的硅胶干法拌样。采用柱层析柱，加入约1/3体积的正己烷，打开柱层析柱下面的活塞，保证体系中不会产生气泡。再向其中加入硅胶，随着沉降，会有一些硅胶粘在层析柱壁上，用正己烷将其冲入柱内。沉降完成，加入更多的正己烷，用双联球将其加压，直至流速恒定。此时，将拌好的样上样，加入一些正己烷，让其润湿，在加入一些无水硫酸钠，保证大量的洗脱剂不会冲坏硅胶表面。填柱比例=10:1，洗脱剂正己烷：乙酸乙酯=100: 1，试管收集，流速 10ml/min，每管收集50 ml，TLC( 薄层色谱法)检测，收集Rf＝ 0.50（正己烷：乙酸乙酯=5:1）的组分合并，合并液减压浓缩可得化合物粗品D，纯度为54%的麦角固醇。

五、重结晶纯化：将重结晶的溶剂更改为：甲醇、正己烷、乙酸乙酯、异丙醇+水、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、乙醇、异丙醇、正己烷：乙醇=1：1、正己烷：乙醇=2：1、正己烷：乙醇=3：1、正己烷：乙酸乙酯=1：1、正己烷：乙酸乙酯=2：1、正己烷：乙酸乙酯=3：1，对比效果，对麦角固醇D（纯度为50%-55%，见图4）进行重结晶，将麦角固醇样品溶于5-7倍的溶剂中，加热至60-65^oC使其完全溶解，再将其于20-30^oC静置，进行两次重结晶，最终结果如表2：

表2 不同的溶剂重结晶的效果

由表2可知，本发明中重结晶的溶剂使用正己烷：乙酸乙酯=(1-3):1，纯度较高，相对于其它溶剂具有明显的纯度优势。

对比例4

将重结晶温度更改为4 ^oC、55 ^oC,采用正己烷：乙酸乙酯=1:1作为重结晶溶剂，与实施例1对比效果，结果如表3

表3 不同重结晶温度对比

由表3可知，本发明中重结晶温度采用20-30 ^oC最后纯度为99.46%，相对于4 ^oC、55 ^oC具有显著优势。

对比例5

将重结晶的次数改为1次、3次、4次，与实施例1中重结晶2次对比效果，对麦角固醇D进行重结晶，将麦角固醇样品溶于5-7倍的正己烷：乙酸乙酯=1：1的溶剂中，加热至60-65^oC使其完全溶解，再将其于20-30^oC静置，重结晶，结果如表4。

表4 重结晶次数的影响

由表4可知，当重结晶两次时，可使麦角固醇的纯度高于99%，收率没有显著减小，而重结晶次数再增加纯度降低，且收率急剧减小。

实施例2

采用醇碱体积比为1:2，物料皂化剂（m:V）比为1:10，设计皂化条件的影响因素为NaOH溶液的质量分数（A）、乙醇的体积分数（B）、皂化时间（C）、皂化温度（D），实验结果见表5。

表5 皂化条件的实验安排以及结果

注：A：NaOH溶液的质量分数；B：乙醇溶液的体积分数；C：皂化时间；D：皂化温度

由皂化条件的实验结果可知，RA<RB<Rc<RD，所以可以看出皂化温度对麦角固醇含量的影响最大，其次是皂化时间、乙醇的体积分数、NaOH的质量分数；同时可以看出，实验的最佳皂化条件的方案是A3B1C2D2即30% NaOH、70%乙醇、2.5 h的皂化时间、85 ^oC的皂化温度，可使麦角固醇的提取率最高。

实施例3

麦角固醇检测波长的确定

精密称量10 mg麦角固醇标准品于10 mL容量瓶中，加3 mL甲醇使其完全溶解，再加甲醇至刻度线并充分摇匀，使其成为1 mg/mL的储备液。再精密移取1 mL储备液于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度线并摇匀，即得100 ug/mL的样品溶液。取适量样品溶液和空白甲醇分别于石英比色皿中，采用紫外分光光度计对其全波长扫描。

紫外全波长扫描结果（见图5），在270.97 nm、281.38 nm、293.08 nm出现最大吸收峰，本文选取吸收波长为281 nm。

实施例4

四、柱层析法纯化：麦角固醇粗品A和B合并得麦角固醇C，并加入粗品1倍质量的硅胶干法拌样。采用柱层析柱，加入约1/3体积的正己烷，打开柱层析柱下面的活塞，保证体系中不会产生气泡。再向其中加入硅胶，随着沉降，会有一些硅胶粘在层析柱壁上，用正己烷将其冲入柱内。沉降完成，加入更多的正己烷，用双联球将其加压，直至流速恒定。此时，将拌好的样上样，加入一些正己烷，让其润湿，在加入一些无水硫酸钠，保证大量的洗脱剂不会冲坏硅胶表面。填柱比例=10:1，洗脱剂正己烷：乙酸乙酯=100: 1，试管收集，流速10 ml/min，每管收集50 ml，共有223管，分别编码1，2，3，4........223，从223管2.24%依次取2.24%、4.48%、8.97%、13.5%、17.9%、22.4%、26.9%、31.4%、35.9%、40.4%、44.8%、49.3%、53.8%、58.3%、62.8%、67.3%、71.7%、76.2%、80.7%、85.2%、89.7%、94.2%、98.7%、100%合并减压浓缩，于色谱条件为：色谱柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇：100%；流速：1 ml/min；柱温：30 ℃；检测波长：220 nm；进样量：20 μL，分别进样分析，结果见表6。分别收集馏分为了控制220 nm出峰时间为18.044 min（16.390 min为麦角固醇）的杂质比例，如图6。

表6 不同比例的馏分含杂质（出峰时间为18.044 min）比例

结果说明在柱层析过程中自麦角固醇馏出至结束，可收集前31.40%的馏分，以控制杂质含量。

实施例5

测待测麦角固醇相对于麦角固醇标样的含量

分别称取麦角固醇标样10.3 mg，待测麦角固醇11.0 mg，分别溶于10 mL的容量瓶中，于色谱条件为：色谱柱：ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇：100%；流速：1 ml/min；柱温：30 ℃；检测波长：281 nm；进样量：20 μL，分别进样分析。高效液相谱图如图7（A:麦角固醇标样，B:待测麦角固醇）

待测麦角固醇峰面积：30920.2

麦角固醇标样峰面积：30162.5

实施例6

对最后重结晶得到的麦角固醇，采用高效液相色谱以及核磁共振氢谱进行定性和定量分析。高效液相色谱结果如图8。

由图8可知，麦角固醇标准品的保留时间是13.565 min，峰面积为19292.3，纯度大于99%；而重结晶的麦角固醇产品的保留时间是13.117 min，峰面积为 20703.0，纯度大于99%。对比两图可知，两者在色谱条件相同的情况下检测，其峰保留时间一致（测试时间不同，流动相配置的不同会存在时间差）

其理化性质及核磁共振氢谱（见图9）数据如下：

白色粉末，可溶于二甲基亚砜、甲醇、乙酸乙酯等有机溶剂，不溶于水。

1H NMR(CDCl3, 400 MHz),δ: 5.58-5.56 (m, 1H); 5.39-5.38 (m, 1H); 5.22-5.18(m, 2H); 3.67-3.60 (m, 1H); 2.49-2.44 (m, 1H); 2.28 (t, 1H, J = 12 Hz);1.91-1.90 (m, 3H); 1.88-1.87 (m, 3H); 1.55-1.25 (m, 16H); 1.04-1.01 (m, 2H);0.95-0.91 (m, 5H); 0.85-0.80 (m, 5H); 0.63 (s, 2H)通过查阅文献，其核磁数据与专利（UN106032547A)中的5,8-(14),22-三烯-7-酮,3-羟基,(3β,22E)麦角固醇对比基本一致，故化合物鉴定为5,8-(14),22-三烯-7-酮,3-羟基,(3β,22E)麦角固醇。

Claims

1.一种麦角固醇的制备方法，其特征在于：包括将菌种超声处理，皂化，柱层析纯化，两次重结晶的步骤。

2.一种如权利要求1所述麦角固醇的制备方法，其特征在于：包括下述步骤：

步骤2，将步骤1离心所得沉淀进行皂化反应；

步骤3，皂化反应结束后，萃取，得麦角固醇粗品B；

步骤4，将麦角固醇粗品A、B合并，得麦角固醇粗品C；

3.一种如权利要求1所述麦角固醇的制备方法，其特征在于：包括下述步骤：

步骤4，将麦角固醇粗品A、B合并，得麦角固醇粗品C；

4.一种如权利要求1至3任意一项所述麦角固醇的制备方法，其特征在于：在所述步骤2中，醇碱体积比为1:1-1:10，物料皂化剂（m:V）比为1:1-1:20。

5.一种如权利要求1至3任意一项所述麦角固醇的制备方法，其特征在于：在所述步骤5中，硅胶和样品的填柱比例为1:1-20:1。

6.一种如权利要求1至3任意一项所述麦角固醇的制备方法，其特征在于：在所述步骤6和7中，溶剂量为样品的1-30倍，溶剂为正己烷-乙酸乙酯=(10-0.1):1的混合溶剂或者乙醇或者二氯甲烷。

7.一种麦角固醇，其特征在于：包括下述制备步骤：包括将菌种超声处理，皂化，柱层析纯化，两次重结晶。

8.一种如权利要求7所述的麦角固醇，其特征在于：包括下述制备步骤：

步骤2，将步骤1离心所得沉淀进行皂化反应；

步骤3，皂化反应结束后，萃取，得麦角固醇粗品B；

步骤4，将麦角固醇粗品A、B合并，得麦角固醇粗品C；

9.一种如权利要求7所述的麦角固醇，其特征在于：包括下述制备步骤：

步骤4，将麦角固醇粗品A、B合并，得麦角固醇粗品C；

10.一种如权利要求7至9任意一项所述的麦角固醇在制备药品、保健品或化妆品中的应用。