CN112385654B - 一种抗紫外昆虫病毒包涵体颗粒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗紫外昆虫病毒包涵体颗粒及其制备方法，涉及农业害虫的生物防治技术领域。所述病毒包涵体颗粒包括含昆虫病毒包涵体的核以及纳米二氧化硅外壳；所述病毒包涵体颗粒的制备方法为将昆虫病毒包涵体与纳米二氧化硅通过电荷吸引得到包涵体颗粒，所述昆虫病毒包涵体与纳米二氧化硅带异种电荷。本发明方法制备得到的昆虫病毒包涵体颗粒是以具有杀虫作用的昆虫病毒包涵体为核、具有紫外保护效果的纳米二氧化硅为壳组成的核壳复合物，提高了昆虫病毒包涵体的抗紫外能力，解决了目前昆虫病毒包涵体在野外太阳光中的紫外线作用下易失活的问题，扩大了昆虫病毒包涵体的适用范围。
Description
【技术领域】
本发明涉及农业害虫的生物防治技术领域，具体涉及一种抗紫外昆虫病毒包涵体颗粒及其制备方法。
【背景技术】
杀虫昆虫病毒主要包括杆状病毒和质型多角体病毒，杆状病毒又分为核型多角体病毒和颗粒体病毒，是专一性感染昆虫和其他节肢动物的病毒，它们在感染后期会产生包埋有病毒粒子的光学显微镜下可见的包涵体，负责昆虫病毒在宿主昆虫个体之间的传播。由于高度的专一性和杀虫活性，很多昆虫病毒已作为杀虫剂，成功应用到农业害虫的防治。
与传统化学杀虫剂相比，昆虫病毒杀虫剂具有环境友好、不易产生抗药性的优点，但在田间太阳光中的紫外线照射下易失活的缺点限制了其大规模的应用。太阳光中的紫外线主要是中波紫外线UVB(280～315nm)和长波紫外线UVA(315～400nm)，会在DNA链中诱导产生嘧啶二聚体阻断DNA的复制和转录，还会诱导产生活性氧，间接对病毒核酸进行破坏，以及导致病毒蛋白降解。
目前已有一些提高昆虫病毒包涵体抗紫外能力的报道，如CN1387764A介绍了一种通过添加芳香族氨基酸和精制荧光增白剂来提高昆虫病毒包涵体抗紫外能力的方法；CN1923007A介绍了一种通过添加无机纳米材料来提高昆虫病毒包涵体抗紫外能力的方法。这些方法都是通过将紫外保护剂直接与昆虫病毒包涵体混合，以阻止紫外线到达昆虫病毒包涵体表面；混有紫外保护剂的昆虫病毒包涵体喷洒到叶片表面时，其中的紫外保护剂在液滴中能够对昆虫病毒包涵体提供一定的紫外保护，但当水分挥发后，大多数病毒包涵体又重新暴露到外面，失活时间并未得到延长。
Li et al.(2015)通过截短的多角体膜蛋白PEP将纳米ZnO结合肽展示在苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的包涵体表面，使纳米氧化锌特异性包被到苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的包涵体表面，有效地提高了苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒包涵体的抗紫外能力，但该方法利用重组多角体病毒融合纳米ZnO结合肽，制备周期长，成本高，不利于病毒杀虫剂的推广。
因此，有必要针对病毒包涵体抗紫外能力做进一步研究，开发一种病毒包涵体全新结构复合物，在满足抗紫外能力的同时，保留其良好的杀虫活性，扩大昆虫病毒包涵体的适用范围。
【发明内容】
本发明目的在于克服现有技术的不足而提供一种抗紫外昆虫病毒包涵体颗粒及其制备方法，解决目前昆虫病毒包涵体在野外太阳光的紫外线作用下杀虫性能易失活的问题。
为实现上述目的，本发明提供一种抗紫外昆虫病毒包涵体颗粒的制备方法，将昆虫病毒包涵体与纳米二氧化硅通过电荷吸引得到包涵体颗粒，所述昆虫病毒包涵体与纳米二氧化硅带异种电荷。
进一步地，所述制备方法为，在分散体系中加入纳米二氧化硅和昆虫病毒包涵体，所述纳米二氧化硅经修饰，并在分散体系中带正电；所述昆虫病毒包涵体在分散体系中带负电。
进一步地，所述纳米二氧化硅经氨基化修饰。
进一步地，所述分散体系pH为4-8；所述分散体系为水或缓冲溶液。
进一步地，所述纳米二氧化硅粒径为20-60nm，优选45nm。
进一步地，所述纳米二氧化硅的制备方法包括如下步骤：
1)将无水乙醇，25-28wt％氨水和去离子水混匀，40℃摇床150rpm恒温30min；
2)加入正硅酸乙酯，混匀，40℃摇床150rpm继续反应12h；
3)14000rpm离心10min，收集SiO2纳米粒子，用无水乙醇和去离子水分别洗涤离心；
4)重悬在去离子水中，4℃保存备用。
进一步地，所述昆虫病毒包涵体为杆状病毒包涵体、质型多角体病毒包涵体中的一种。
进一步地，上述方法制备得到所述病毒包涵体颗粒后，离心，回收上清液中过量的纳米二氧化硅继续用于制备包涵体颗粒。
本发明另一个目的是提供一种通过上述制备方法获得的昆虫病毒包涵体颗粒，所述包涵体颗粒为核壳复合物，包括以昆虫病毒包涵体作为核，以及包被所述核的纳米二氧化硅外壳。
本发明的制备原理为：
1)具有杀虫活性的昆虫病毒包涵体在pH 4～8的水或缓冲液中，活性无明显变化，其等电点(蛋白电荷为零，在电场中不发生移动，此溶液的pH)在3～4之间，当pH值大于包涵体的等电点时，包涵体表面带负电；而具有紫外保护效果的氨基化修饰的纳米二氧化硅在酸性、中性和弱碱性条件下均是带正电的；
2)带异号电荷的胶体间会相互吸引达到电中和而凝聚，大胶粒会吸附带异号电荷的小胶粒而发生凝聚，当加入过量的带异号电荷的小胶粒时，胶核的强烈吸附作用会使胶体重新带电(电荷异号)，而出现再稳现象；
3)在pH 4～8的水或缓冲液中，过量的粒径较小的带正电的氨基化修饰的纳米二氧化硅与粒径较大的带负电的昆虫病毒包涵体混合时，会通过凝聚和再稳的过程包被到昆虫病毒包涵体上，使昆虫病毒包涵体表面带正电，稳定地分散在溶液中；
4)经洗涤后，核壳复合物上的纳米粒子依旧稳定包被在病毒包涵体上，因此在喷雾干燥后，纳米粒子依旧能够保护病毒包涵体，从而提高了包涵体的抗紫外能力。
本发明的有益效果为：
1.通过本方法制备的纳米二氧化硅包被的抗紫外昆虫病毒包涵体颗粒，既保持了昆虫病毒包涵体颗粒本身良好的杀虫活性，同时也提高了昆虫病毒包涵体颗粒的抗紫外能力；
2.本发明方法适用于对各种昆虫病毒包涵体的紫外保护，减少了对保护材料的使用量，无需特殊设备，工艺简单，成本低廉，反应条件温和，有利于工业大规模生产。
【附图说明】
图1为不同氨水浓度下合成的纳米二氧化硅粒子的透射电镜图；
图2为氨基化修饰前(A)和修饰后(B)二氧化硅粒子的扫描电镜图；
图3是使用的纳米二氧化硅氨基化修饰前(A)和修饰后(B)的Zeta电位图；
图4是棉铃虫核型多角体病毒包涵体颗粒的扫描电镜图(a)，和经过3次离心洗涤后的扫描电镜图(b)；
图5是马尾松毛虫质型多角体病毒包涵体颗粒的扫描电镜图(a)，和经过3次离心洗涤后的扫描电镜图(b)；
图6是棉铃虫核型多角体病毒和经氨基化修饰后的纳米二氧化硅包被的棉铃虫核型多角体病毒包涵体颗粒的抗紫外能力对比曲线。
图7是马尾松毛虫质型多角体病毒和经氨基化修饰后的纳米二氧化硅包被的马尾松毛虫质型多角体病毒包涵体颗粒的抗紫外能力对比曲线。
图8为纳米二氧化硅包被的棉铃虫核型多角体病毒包涵体颗粒与该病毒杀虫剂悬浮颗粒的抗紫外能力对比曲线。
图9为纳米二氧化硅包被的马尾松毛虫质型多角体病毒包涵体颗粒与该病毒杀虫剂悬浮颗粒的抗紫外能力对比曲线。
【具体实施方式】
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰明白，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并不是为了限定本发明。
实施例1纳米二氧化硅粒子的合成
SiO2纳米粒子的合成的具体过程如下：
1)在通风橱中，在100mL三角瓶中依次加入50mL无水乙醇，1.5mL、1.7mL或者2mL氨水(25-28wt％)和1mL去离子水，混匀，40℃摇床150rpm恒温30min；
2)再迅速加入1.5mL正硅酸乙酯(TEOS)，混匀，40℃摇床150rpm继续反应12h；
3)14000rpm离心10min，收集制备的SiO2纳米粒子；用无水乙醇和去离子水分别洗涤离心3次，以除去未反应的试剂和过量的氨水；
4)重悬在去离子水中，4℃保存备用；
附图1为本发明实施例1不同氨水浓度下合成的纳米二氧化硅粒子的透射电镜图。S1、S2、S3分别为不同氨水浓度(25wt％、26wt％、28wt％)下合成的SiO2纳米粒子，为球形纳米粒子，S1、S2、S3粒径依次为24.2±4.4nm，43.6±6.9nm和53.9±6.7nm。
实施例2纳米二氧化硅的氨基化修饰
利用带氨基的硅烷偶联剂3-[2-(2-氨基乙基氨基)乙基氨基]丙基-三甲氧基硅烷(DETA)对合成的SiO2纳米粒子进行氨基化修饰。具体过程如下：
1)取一支2mL EP管，称重m1，加入1mL SiO2纳米粒子分散液，13300rpm离心5min，弃上清，称重m2，管中SiO2纳米粒子的质量为m＝m2-m1；
2)加一定体积的去离子水将SiO2纳米粒子超声重悬，制成10mg/mL的SiO2纳米粒子分散液；
3)取1mL分散液，依次加入20μL冰醋酸、20μL DETA，超声混匀，翻转摇床室温孵育4h；
4)13300rpm离心5min收集SiO2-NH2纳米粒子；
5)10mM MES缓冲液(pH 5.5)洗涤2次；
6)重悬在一定体积的10mM MES缓冲液(pH5.5)中，4℃保存备用。
7)取1mL分散在去离子水中的1mg/mL纳米粒子分散液，加入纳米粒度电位仪比色皿中；
8)同时盖上样品池两侧盖子，使液面一致；
9)将样品池放入纳米粒度电位仪中，检测纳米粒子表面的Zeta电位；
图2为氨基化修饰前(A)和修饰后(B)二氧化硅粒子的扫描电镜图；图3是使用的纳米二氧化硅氨基化修饰前(A)和修饰后(B)的Zeta电位图，不难看出，纳米二氧化硅粒子经氨基化修饰后电位为正。
实施例3抗紫外棉铃虫核型多角体病毒包涵体颗粒的制备
纳米二氧化硅包被的抗紫外核型多角体病毒包涵体颗粒的制备方法包括如下步骤：
1)取1mg粒径43.6±6.9nm的氨基化修饰的纳米二氧化硅，分散在0.75mL 0.1MMES缓冲液(pH可以根据实际情况调节，控制在4-8，本实施例pH为4.5)中；加入0.25mL 2×108OBs/mL的棉铃虫核型多角体病毒(Helicoverpa armigera nucleopolyhedrovirus)悬液(分散在去离子水中)，室温翻转摇床孵育2h；
2)3000rpm离心5min，收集制备的纳米二氧化硅包被的昆虫病毒包涵体；
3)重悬在去离子水中，4℃保存备用；
4)13300rpm离心5min，回收上清液中过量氨基化修饰的纳米二氧化硅，继续用于对昆虫病毒包涵体的包被。
图4是本发明实施例3纳米二氧化硅包被的棉铃虫核型多角体病毒的扫描电镜图(a)，和经过3次离心洗涤后的扫描电镜图(b)。从电镜图中不难看出，棉铃虫核型多角体病毒包涵体表面被纳米二氧化硅吸附成功，并且稳定分布。
实施例4抗紫外马尾松毛虫质型多角体病毒包涵体颗粒的制备
纳米二氧化硅包被的抗紫外质型多角体病毒包涵体颗粒的制备方法包括如下步骤：
1)取1mg粒径43.6±6.9nm的氨基化修饰的纳米二氧化硅，分散在0.75mL0.1M MES缓冲液(pH可以根据实际情况调节，控制在4-8，本实施例pH为4.5)中；加入0.25mL，2×108OBs/mL的马尾松毛虫质型多角体病毒(Dendrolimus punctatus cypovirus)悬液(分散在去离子水中)，室温翻转摇床孵育2h；
2)3000rpm离心5min，收集制备的纳米二氧化硅包被的昆虫病毒包涵体；
3)重悬在去离子水中，4℃保存备用；
4)13300rpm离心5min，回收上清液中过量氨基化修饰的纳米二氧化硅，继续用于对昆虫病毒包涵体的包被。
图5纳米二氧化硅包被的马尾松毛虫质型多角体的扫描电镜图(a)，和经过3次离心洗涤后的扫描电镜图(b)。从电镜图中不难看出，马尾松毛虫质型多角体病毒包涵体表面被纳米二氧化硅吸附成功，并且稳定分布。
实验例1棉铃虫核型多角体病毒抗紫外能力的测定
1)在实验室中，棉铃虫核型多角体病毒稀释为1×106,3×105,1×105,3×104和1×104OBs/mL 5个浓度，喷洒至盆栽中的小白菜叶片上，建立已知病毒浓度与棉铃虫幼虫死亡率(Probit转换)之间的回归方程；
2)将棉铃虫核型多角体病毒包涵体和实施例3得到的包涵体颗粒0.5％(v/v)Tween 20稀释至3×106OBs/mL后，每隔一天均匀喷洒至圆盆中的小白菜叶片上，实验在武汉病毒研究所(30°44′N,114°26'E)进行，在早上7：00至8：00之间喷洒，喷洒量约为0.06L/m2。
3)喷洒后第1、3、5、7天收集叶片样品，并用15mm的打孔器打孔。叶片放入每个孔中含有0.5mL 1％琼脂的12孔板中，将两头二龄的甜菜夜蛾幼虫置于每个叶片孔上，在温度设为28±1℃的培养箱中饲喂24h后转入带有新鲜人工饲料的24孔养虫板中继续培养。每天检查幼虫死亡数直到所有的幼虫全部化蛹或死亡，每个处理选用48头幼虫并重复三次。
4)根据步骤(1)建立的已知病毒浓度与棉铃虫幼虫死亡率Probit值之间的回归方程，计算阳光下暴露1、3、5、7天后叶片上残留的病毒数量。
图6是棉铃虫核型多角体病毒包涵体和纳米二氧化硅包被的棉铃虫核型多角体病毒包涵体颗粒在暴露于阳光下第1天、第3天、第5天和第7天后的病毒活性残留率。可以看出，没有包被的棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV)的半数存活时间约0.5天，而包被SiO2的棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV@SiO2-NH2)的半数存活时间超过3天，说明本方法制备的纳米二氧化硅包被的昆虫病毒包涵体具有较好的抗紫外能力。
实验例2马尾松毛虫质型多角体病毒抗紫外能力的测定
按照实验例1相同的方法，对马尾松毛虫质型多角体病毒包涵体和实施例4得到的病毒包涵体颗粒在暴露于阳光下第1天、第3天、第5天和第7天后，检测病毒活性残留率。如图7所示，可以看出，没有包被的马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV)的半数存活时间约0.5天，而包被SiO2的马尾松毛虫质型多角体病毒(DpCPV@SiO2-NH2)的半数存活时间超过3天，说明本方法制备的纳米二氧化硅包被的昆虫病毒包涵体具有较好的抗紫外能力。
实验例3纳米二氧化硅粒径对病毒包涵体抗紫外能力的影响
按照实施例1的方法制备纳米二氧化硅粒子，控制氨水的浓度，获取不同的粒径，得到粒径范围在15-65nm(粒径平均值)的粒子，通过实施例2的方法进行氨基修饰。
以棉铃虫核型多角体病毒包涵体为例，按实施例3的制备方法及步骤，针对不同粒径的纳米二氧化硅粒子制备抗紫外棉铃虫核型多角体病毒包涵体颗粒，对得到的病毒包涵体颗粒进行抗紫外能力测定(方法同实验例1)，以半数存活时间(按小时换算，精确到一位数)为参考性能指标，对不同粒径下纳米二氧化硅粒子的抗紫外能力进行分析，如表1所示。
表1：
不难看出，不同粒径的纳米二氧化硅粒子制备得到的包涵体颗粒活性有一定的差异，其中当粒径为45nm左右时，病毒的半数存活时间为4天，粒径范围在20-60nm时，病毒的半数存活时间大于2天，仍能体现出较好的抗紫外性能，当粒径大于60nm或小于20nm时，抗紫外能力较弱，因此选择平均粒径在20-60nm的范围可满足病毒包涵体颗粒具有较好的抗紫外性能。
对比例1
将本发明实施例1制备得到的粒径为43.6±6.9nm纳米二氧化硅，按照专利公开文件CN1387764A中的方法制备得到棉铃虫核型多角体病毒杀虫剂悬浮颗粒。将本发明实施例3制备得到的棉铃虫核型多角体病毒包涵体颗粒与该对比例进行稳定性对比试验(方法同实验例1)，对比半数存活时间(按小时换算，精确到一位数)。发现采用CN1387764A制备得到的、未经氨基化修饰纳米二氧化硅包被的病毒杀虫剂悬浮颗粒(HearNPV-SiO2)的半数存活时间约1.1天(图8)，显然相比包被SiO2的棉铃虫核型多角体病毒(HearNPV@SiO2-NH2)(半数存活时间将近4天)稳定性弱一些。
对比例2
将本发明实施例1制备得到的粒径为43.6±6.9nm纳米二氧化硅，按照专利公开文件CN1387764A中的方法制备得到马尾松毛虫质型多角体病毒杀虫剂悬浮颗粒。将本发明实施例3制备得到的马尾松毛虫质型多角体病毒包涵体颗粒与该对比例进行稳定性对比试验，对比半数存活时间(按小时换算，精确到一位数)。发现采用CN1387764A制备得到的、未经氨基化修饰纳米二氧化硅包被的病毒杀虫剂悬浮颗粒(DpCPV-SiO2)的半数存活时间约1.2天(图9)，显然相比包被SiO2的棉铃虫核型多角体病毒(DpCPV@SiO2-NH2)(半数存活时间接近4天)稳定性弱一些。
对比例3
按照本发明实施例3的方法将棉铃虫核型多角体病毒包涵体与氨基化修饰后的纳米二氧化硅粒子在分散体系中孵育，不同的是分散体系中的pH为3.8，室温翻转摇床孵育2h，3000rpm离心5min，收集颗粒。按照实验例1的方法，获得半数存活时间(按小时换算，精确到一位数)为0.5天。
对比例4
按照本发明实施例3的方法将马尾松毛虫质型多角体病毒包涵体与氨基化修饰后的纳米二氧化硅粒子在分散体系中孵育，不同的是分散体系中的pH为8.3，室温翻转摇床孵育2h，3000rpm离心5min，收集颗粒。按照实验例1的方法，获得半数存活时间(按小时换算，精确到一位数)为0.5天。
根据以上实施例及实验例可以得知，被氨基修饰的纳米二氧化硅包被的棉铃虫核型多角体病毒以及马尾松毛虫质型多角体病毒，既保持了昆虫病毒包涵体颗粒本身良好的杀虫活性，同时也提高了昆虫病毒包涵体颗粒的抗紫外能力；在pH为4-8的条件下，经氨基修饰后纳米二氧化硅与病毒包涵体电荷吸附后形成包被复合物，相比于传统的二氧化硅悬浮液中病毒与二氧化硅分子间结合力更稳定，可以将抗紫外性能推广至质型多角体病毒、核型多角体病毒以及颗粒体病毒等昆虫病毒包涵体的改善。本发明提供的病毒包涵体颗粒在取得相同抗紫外效果的情况下相对减少了对保护材料的使用量，制备工艺简单，成本低廉，反应条件温和，有利于工业大规模生产。
上述参照具体实施方式对病毒包涵体颗粒及其制备方法进行了详细的描述，但实施实例的描述是说明性而并非限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明技术的实质和范围下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
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Claims (6)
1.一种抗紫外昆虫病毒包涵体颗粒的制备方法，其特征在于，在分散体系下，将昆虫病毒包涵体与纳米二氧化硅通过电荷吸引得到包涵体颗粒，纳米二氧化硅带正电，昆虫病毒包涵体带负电；所述分散体系pH为4-8；所述纳米二氧化硅经氨基修饰，粒径为20-60 nm；所述昆虫病毒包涵体为杆状病毒包涵体、质型多角体病毒包涵体中的一种。
2.根据权利要求1所述的病毒包涵体颗粒的制备方法，其特征在于，所述分散体系为水或缓冲溶液。
3.根据权利要求1所述的病毒包涵体颗粒的制备方法，其特征在于，所述纳米二氧化硅粒径为45 nm。
4.根据权利要求1所述的病毒包涵体颗粒的制备方法，其特征在于，所述纳米二氧化硅的制备方法包括如下步骤：
1）将无水乙醇，25-28 wt%氨水和去离子水混匀，40℃摇床150 rpm恒温30 min；
2）加入正硅酸乙酯，混匀，40℃摇床150 rpm继续反应12 h；
3）14000 rpm离心10 min，收集SiO2纳米粒子，用无水乙醇和去离子水分别洗涤离心；
4）重悬在去离子水中，4℃保存备用。
5.根据权利要求1所述的病毒包涵体颗粒的制备方法，其特征在于，制备得到所述病毒包涵体颗粒后，离心，回收上清液中过量的纳米二氧化硅继续用于制备包涵体颗粒。
6.一种如权利要求1-5任意一项所述的制备方法得到昆虫病毒包涵体颗粒，其特征在于，所述包涵体颗粒为核壳复合物，包括以昆虫病毒包涵体作为核，以及包被所述核的纳米二氧化硅外壳。
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Legal Events
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Effective date of registration: 20221129 Address after: 237,010 Intersection of Zhifengshan Road and Xingyu Road, High tech Zone, Yu'an District, Lu'an City, Anhui Province Patentee after: Anhui Insect Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 430000, No.44, Xiaohongshan Middle District, guoguohu street, Wuchang District, Wuhan City, Hubei Province Patentee before: Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences |
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Denomination of invention: An anti UV insect virus inclusion body particle and its preparation method Effective date of registration: 20231208 Granted publication date: 20210928 Pledgee: Jiujiang Bank Co.,Ltd. Hefei Linquan East Road Branch Pledgor: Anhui Insect Biotechnology Co.,Ltd. Registration number: Y2023980070278 |