CN112384236A - 用于治疗微血管血栓形成的靶向溶栓 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了融合蛋白，用于以纤维蛋白非依赖性方式将纤溶酶原激活物靶向递送到血小板‑VWF复合物，或替代性地递送到其定位的位点。本发明的融合蛋白在用于预防或治疗与此类血小板‑VWF复合物相关的疾病或状况的方法中，所述血小板‑VWF复合物可能导致在例如血栓性血小板减少性紫癜的疾病中的微血管血栓形成。用于掺入融合蛋白中的优选靶向剂是例如针对VWF或血小板的纳米抗体。用于融合蛋白的优选纤溶酶原激活物包括uPA或tPA的蛋白酶结构域。本发明还涉及编码本发明融合蛋白的核酸分子，例如基因治疗载体，并涉及包含本发明融合蛋白或此类基因治疗载体的药物组合物。

Description

用于治疗微血管血栓形成的靶向溶栓
发明领域
本发明涉及医学和药学领域，尤其涉及用于预防或治疗与微血管血栓形成相关的疾病或状况(例如血栓性血小板减少性紫癜)的生物制药领域。更具体地，本发明涉及包含靶向剂和纤溶酶原激活物的融合蛋白，其中靶向剂将纤溶酶原激活物靶向VWF、血小板和激活的血管内皮中的至少一种，目的是以纤维蛋白非依赖性方式酶促降解血管阻塞。本发明还涉及编码此类融合蛋白的基因治疗载体。
背景技术
微血管血栓形成(MVT)的特征在于微血管血小板聚集体的形成。它们最少由血小板和VWF组成。这在血栓性血小板减少性紫癜(TTP)中变得很清楚，其中富含血小板和VWF但缺乏纤维蛋白的微血栓阻塞了微血管，造成危及生命的后果。因此，大血管血栓形成中看到的纤维蛋白本身并不是这些微血管阻塞所需的。MVT是几种疾病状态之间的共同特征，包含血栓性血小板减少性紫癜、溶血性尿毒症综合征、抗磷脂抗体综合征和补体介导的血栓性微血管病(George等，2014，N Engl J Med.371(7):654-66)。在MVT的严重情况下，会发生多器官衰竭，并带来致命后果。即使在不太严重的情况下，也可能形成器官损伤并降低生活质量和减少患者的预期寿命。最近的研究表明，在较普遍的心血管疾病人群的患者中，微血管疾病是心血管疾病/事件的基础，并且在放射学检查中并未显示明显的大血管阻塞迹象。最终认为这会导致心力衰竭，尤其是在女性中。
当血小板与von Willebrand因子(VWF)的超大型多聚体形成复合物时，患有TTP的患者会经历微血管血栓形成发作。这是ADAMTS13(具有I型血小板反应蛋白基序的解聚素和金属蛋白酶，成员13)酶的活性严重降低的结果。ADAMTS13通常通过酶促降低其多聚体大小来调节VWF的促凝性。迄今为止，VWF需要从其球状形式展开为展开的构象，从而暴露其A2结构域用于蛋白质水解。大多数TTP患者患有针对ADAMTS13的中和性自身抗体。对于小亚组，已经描述了ADAMTS13中的突变导致缺乏(Upshaw-Shulman综合征)。
当前TTP疗法涉及广泛的血浆置换以耗尽抑制性抗体并同时恢复ADAMTS13活性。然而，持续的自身抗体阻碍了微血栓的消除。这使得治疗既费时又非常昂贵(Fijnheer等，Ned Tijdsch Hematol，2016；13(1)：18-24)。
除ADAMTS13外，VWF还可以被纤溶酶裂解(Berkowitz等，J Clin Invest 1987Feb；79(2)：524-31)。我们先前发现全身性纤溶酶原激活(具有链激酶)在TTP小鼠模型中具有治疗作用，表明纤溶酶可以作为ADAMTS13的功能替代物(Tersteeg等，2014，Circulation，129(12)：1320-31)。尽管纤溶酶(原)能够直接结合未折叠的VWF，但是天然纤溶酶原激活物(例如组织纤溶酶原激活物(tPA)和尿激酶纤溶酶原激活物(uPA))却不能。tPA和uPA的天然靶分别是纤维蛋白和内皮细胞受体uPAR。此外，TTP中的微血栓是纤维蛋白贫乏的，尚不确定纤维蛋白是否是其他类型MVT的先决条件。这使得通常在大血管疾病的治疗中用作溶栓剂的这些分子(即tPA、uPA)在治疗MVT方面无效。而且，出于安全原因(即低血小板计数)，期望避免全身性纤溶酶原激活。
本发明的目的是提供用于治疗MVT和相关状况的手段和方法。因此，本发明提供了融合蛋白，用于以纤维蛋白非依赖性方式将纤溶酶原激活物靶向递送到血小板-VWF复合物，或替代地靶向递送到其定位的位点。本发明还提供了可通过将纤溶酶原激活局部递送/刺激至微血管闭塞位点来预防或治疗的状况的治疗方法。
发明内容
在第一方面，本发明涉及一种融合蛋白，其包含纤溶酶原激活物和用于将纤溶酶原激活物靶向血栓位点的靶向剂，该血栓包含VWF和血小板中的至少一种。优选地，本发明的融合蛋白中的靶向剂特异性结合VWF、血小板和激活或损伤的血管内皮中的至少一种。进一步优选的是，本发明融合蛋白中的靶向剂不是仅特异性结合在血小板上的激活形式的GPIIb/IIIa受体的靶向剂。更优选地，本发明融合蛋白中的靶向剂是以下一或多种：a)至少结合未折叠的VWF的靶向剂，其中，优选地，相对于球状VWF，该靶向剂优先地结合未折叠的VWF；b)结合VWF的D3结构域的靶向剂；c)结合在血小板上的GP1B受体的靶向剂；d)结合血小板上的整联蛋白αIIb/βIII的靶向剂；e)结合优先由激活的内皮表达的受体的靶向剂，其中该受体优选地选自：E-选择蛋白、P-选择蛋白、uPAR、c1q受体、激肽B1受体、纤溶酶原受体KT(PLGR-KT)、内皮蛋白C受体、血栓调节蛋白、n-钙粘蛋白、ICAM-1和VCAM-1；以及f)结合用于激活或损伤的内皮的膜标记物的靶向剂，其中该膜标记物是阴离子磷脂、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺中的一或多种。在一个实施方案中，优选地，本发明的融合蛋白包含多于一种的靶向剂。
根据本发明的融合蛋白优选是其中靶向剂包括以下至少一种的融合蛋白：a)特异性结合VWF、血小板和激活的血管内皮中的至少一种的抗体可变结构域；以及b)来自天然结合VWF、血小板和激活或损伤的血管内皮的蛋白的结合结构域，该结合结构域特异性结合VWF、血小板和激活或损伤的血管内皮中的至少一种。因此，在根据本发明的融合蛋白中，抗体可变结构域优选是VHH，更优选为人源化VHH。或者，在根据本发明的融合蛋白中，来自天然结合VWF、血小板和激活或损伤的血管内皮的蛋白的结合结构域优选包含选自以下的结合结构域：i)来自VWF的血小板GP1B受体结合A1结构域；ii)VWF结合结构域，其来自ADAMTS13、因子XII、因子H(补体调节剂)、纤溶酶原和因子VIII中的一种；以及iii)膜结合结构域，其选自维生素K依赖性羧化/γ-羧基谷氨酸(GLA)结构域、来自因子V的C结构域和来自因子VIII的C结构域。
在如上定义的本发明的融合蛋白中，纤溶酶原激活物优选包含组织纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)、纤溶酶原、链激酶或葡激酶的蛋白酶结构域。优选的是，在本发明的融合蛋白中，纤溶酶原激活物还包含连接肽的至少含半胱氨酸的部分，该连接肽天然地存在于纤溶酶原激活物中，在其蛋白酶结构域上游紧邻其蛋白酶结构域。任选地，本发明的融合蛋白包含连接靶向剂和纤溶酶原激活物的接头氨基酸序列。
因此，根据本发明的融合蛋白以N端至C端的顺序优选包含：a)一或多个如上定义的靶向剂，其中任选靶向剂通过接头氨基酸序列连接；b)任选地包含接头氨基酸序列；以及c)如上定义的纤溶酶原激活物或纤溶酶原来源的蛋白酶结构域。
在第二方面，本发明涉及一种核酸分子，其包含核苷酸序列，该核苷酸序列编码如上文所定义的本发明的融合蛋白。优选地，编码融合蛋白的核苷酸序列还包含编码可操作地连接到融合蛋白的信号肽的核苷酸序列。核酸分子优选还包含有助于融合蛋白表达的调节元件，该调节元件可操作地连接到所述核苷酸序列。
在第三方面，本发明涉及包含根据本发明的核酸分子的基因治疗载体。
在第四方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含根据本发明的融合蛋白或根据本发明的基因治疗载体和药学上可接受的赋形剂。
在第五方面，本发明涉及根据本发明的融合蛋白、根据本发明的基因治疗载体或根据本发明的药物组合物，用于预防或治疗与包含VWF和血小板中的至少一种的血栓相关的疾病或状况，其中优选用于预防或治疗与微血管血栓形成相关的疾病或状况。更优选地，与包含VWF和血小板中的至少一种的(微)血栓相关的疾病或状况选自：获得性或遗传性血栓性血小板减少性紫癜(TTP)，补体介导的血栓性微血管病，溶血性尿毒症综合征，抗磷脂抗体综合征，非闭塞性血栓，闭塞性血栓形成，动脉血栓形成，急性冠状动脉闭塞，外周动脉闭塞性疾病，由冠状动脉旁路搭桥术、冠状动脉瓣膜置换术和冠状动脉介入治疗(如血管成形术、支架术或粥样斑块切除术)引起的再狭窄和失调，血管成形术、粥样斑块切除术或动脉支架置入术后的增生，血管系统内的闭塞综合征或病变动脉缺乏通畅性，短暂性大脑缺血发作，不稳定型或稳定型心绞痛，脑梗死，HELLP综合征，颈动脉内膜切除术，颈动脉狭窄，重症肢体缺血，心源性栓塞，外周血管疾病，再狭窄，镰状细胞病和心肌梗塞。
在第六方面，本发明涉及一种用于治疗或降低与包含VWF和血小板中的至少一种的血栓相关的疾病或状况的风险的方法，其中所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的根据本发明的融合蛋白、根据本发明的基因治疗载体或根据本发明的药物组合物的步骤，并且其中优选向患有与微血管血栓形成相关的疾病或状况的受试者施用。更优选地，与包含VWF和血小板中的至少一种的(微)血栓相关的疾病或状况选自：获得性或遗传性血栓性血小板减少性紫癜(TTP)，补体介导的血栓性微血管病，溶血性尿毒症综合征，抗磷脂抗体综合征，非闭塞性血栓，闭塞性血栓形成，动脉血栓形成，急性冠状动脉闭塞，外周动脉闭塞性疾病，由冠状动脉旁路搭桥术、冠状动脉瓣膜置换术和冠状动脉介入治疗(如血管成形术、支架术或粥样斑块切除术)引起的再狭窄和失调，血管成形术、粥样斑块切除术或动脉支架置入术后的增生，血管系统内闭塞综合征或病变动脉缺乏通畅性，短暂性大脑缺血发作，不稳定型或稳定型心绞痛，脑梗死，HELLP综合征，颈动脉内膜切除术，颈动脉狭窄，重症肢体缺血，心源性栓塞，外周血管疾病，再狭窄和心肌梗塞。
具体实施方式
定义
术语“同源性”、“序列相同性”等在本文可互换使用。序列相同性在本文中定义为通过比较序列确定的两或更多个氨基酸(多肽或蛋白质)序列或两或更多个核酸(多核苷酸)序列之间的关系。在本领域中，“相同性”还意指氨基酸序列或核酸序列之间视情况而定的序列相关性程度，这由成串此类序列之间的匹配确定。通过将一个多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代物与第二个多肽的序列进行比较来确定两个氨基酸序列之间的“相似性”。可以通过已知方法容易地计算“相同性”和“相似性”。
取决于两个序列的长度，可以使用全局或局部比对算法通过两个肽序列或两个核苷酸序列的比对来确定“序列相同性”和“序列相似性”。优选使用全局比对算法(例如Needleman Wunsch)对相似长度的序列进行比对，所述全局比对算法在整个长度上最佳比对序列，而优选使用局部比对算法(例如Smith Waterman)对基本上不同长度的序列进行比对。当序列(例如通过使用默认参数的程序GAP或BESTFIT进行最佳比对时)共享至少序列相同性的某个最小百分比(定义如下)时，序列则可以被称为“基本相同”或“实质上相似”。GAP使用Needleman and Wunsch全局比对算法在其整个长度(全长)上比对两个序列，最大化匹配数并最小化缺口数。当两个序列具有相似长度时，全局比对适合用于确定序列相同性。通常，使用GAP默认参数，缺口产生罚分＝50(核苷酸)/8(蛋白质)，缺口延伸罚分＝3(核苷酸)/2(蛋白质)。对于核苷酸，使用的默认打分矩阵是nwsgapdna，对于蛋白质，默认打分矩阵是Blosum62(Henikoff&Henikoff，1992，PNAS 89，915-919)。序列比对和序列相同性百分比的得分可以使用计算机程序(例如GCG Wisconsin Package版本10.3，其可得自AccelrysInc.,9685Scranton Road,San Diego,CA92121-3752 USA或使用开源软件例如程序“needle”(使用全局Needleman Wunsch算法)或EmbossWIN 2.10.0版中的程序“water”(使用局部Smith Waterman算法)，使用与上述GAP相同的参数或使用默认设置(两者均用于“needle”和“water”并且对于蛋白质和DNA比对，默认Gap开放罚分均是10.0并且默认缺口延伸罚分是0.5；对于蛋白质，默认打分矩阵为Blossum62并且对于DNA，默认打分矩阵为DNAFull)来确定。当序列具有实质上不同的总长度时，优选局部比对，例如使用SmithWaterman算法的那些。
可替代地，可以通过使用诸如FASTA、BLAST等的算法对公共数据库进行搜索来确定相似性或相同性百分比。因此，本发明的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列”，以对公共数据库执行搜索，以例如鉴别其他家族成员或相关序列。可以使用Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的BLASTn和BLASTx程序(2.0版)执行此类搜索。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST程序(得分＝100，字长＝12)进行，以获得与本发明的氧化还原酶核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用BLASTx程序(得分＝50，字长＝3)进行，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，Gapped BLAST可以如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-34023877所述使用。当使用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序(例如BLASTx和BLASTn)的默认参数。参见美国国家生物技术信息中心的主页http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。
任选地，在测定氨基酸相似性程度时，本领域技术人员还可以考虑所谓的“保守”氨基酸取代，这对技术人员而言是明显的。保守氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的互换性。下表列出了用于保守取代的氨基酸残基类别实例。
Figure BDA0002799342120000041
Figure BDA0002799342120000051
可选的保守氨基酸残基取代类。
1 A S T
2 D E
3 N Q
4 R K
5 I L M
6 F Y W
氨基酸残基的替代物理和功能性分类。
Figure BDA0002799342120000052
编码本发明融合蛋白的核苷酸序列还可以通过它们在中等或优选在严格杂交条件下与本文所例示的编码融合蛋白的核苷酸序列杂交的能力来定义。严格杂交条件在本文中定义为如下条件：允许至少约25个核苷酸，优选约50个核苷酸、75或100个核苷酸和最优选约200个或更多个核苷酸的核酸序列在约65℃的温度在含约1M盐、优选6x SSC的溶液或具有同等离子强度的任何其他溶液中杂交并在65℃在含约0.1M盐或更少盐、优选0.2x SSC的溶液中或在具有同等离子强度的其他溶液中洗涤。优选地，杂交过夜进行，即至少10小时，并且优选在至少两次更换洗涤溶液的情况下进行至少一小时的洗涤。这些条件通常将允许具有约90％或更高序列相同性的序列的特异性杂交。
中等条件在本文中定义为以下条件：允许至少50个核苷酸，优选约200个或更多个核苷酸的核酸序列在约45℃的温度在包含约1M盐、优选6x SSC的溶液中或在具有同等离子强度的任何其他溶液中杂交，并在室温在包含约1M盐、优选6x SSC的溶液中或具有同等离子强度的任何其他溶液中洗涤。优选地，杂交过夜进行，即至少10小时，并且优选地在至少两次更换洗涤溶液的情况下进行至少一小时的洗涤。这些条件通常将允许具有最多50％序列相同性的序列的特异性杂交。本领域技术人员将能够修改这些杂交条件以特异性鉴别相同性在50％至90％之间变化的序列。
在本文中，“核酸构建体”或“核酸载体”应理解为是指由于使用重组DNA技术而产生的人造核酸分子。因此，术语“核酸构建体”不包含天然存在的核酸分子，虽然核酸构建体可以包含天然存在的核酸分子(的一部分)。术语“表达载体”或“表达构建体”是指能够在与这种表达载体或构建体相容的宿主细胞或宿主生物体中实现核苷酸序列或基因表达的核酸分子。这些表达载体通常包含调控序列元件，该调控序列元件与待表达的核苷酸序列可操作地连接以实现其表达。此类调控元件通常至少包括合适的转录调控序列和任选包括3'转录终止信号。也可能存在实现表达所需的或有帮助的其他元件，例如表达增强子元件。表达载体被引入合适的宿主细胞中并能够在宿主细胞的体外细胞培养物中实现编码序列的表达。表达载体将适于在本发明的宿主细胞或生物体中复制，而表达构建体通常将整合在宿主细胞基因组中以使其得以维持。将核酸引入细胞的技术在本领域中是熟知的并且可以根据具体情况采用任何合适的技术。对于真核细胞，合适的技术可以包括磷酸钙转染、DEAE-右旋糖酐、电穿孔、脂质体介导的转染和使用逆转录病毒或其他病毒(例如腺病毒、AAV、慢病毒或牛痘)的转导。对于微生物，例如细菌、细胞，合适的技术可包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的转染。所引入的核酸可以在细胞内的染色体外载体上，或者该核酸可以整合到宿主细胞的基因组中。根据标准技术，可以通过在核酸或载体内包含促进与基因组重组的序列来促进整合。引入之后可以是核酸的表达以产生编码的融合蛋白。在一些实施方案中，可以在核酸表达的条件下体外培养宿主细胞(其可以包括实际转化的细胞，尽管该细胞更可能是转化的细胞的后代)，使得产生编码的融合蛋白多肽，当使用诱导型启动子时，表达可能需要激活诱导型启动子。
如本文所用，术语“启动子”或“转录调节序列”是指核酸片段，其起到控制一或多个编码序列转录的作用且位于相对于编码序列的转录起始位点的转录方向的上游，并通过DNA依赖性RNA聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其他DNA序列(包括但不限于转录因子结合位点、阻遏物和激活蛋白结合位点以及直接或间接起作用以调节来自启动子的转录量的本领域技术人员已知的任何其他核苷酸序列)的存在进行结构鉴定。“组成型”启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数组织中有活性的启动子。“诱导型”启动子是受到生理或发育调节例如通过使用化学诱导剂调节的启动子。
术语“可选择标记”是本领域技术人员熟悉的术语，在本文中用于描述任何遗传实体，当表达时，其可用于选择含有所述可选择标记的一或多个细胞。术语“报道子”可以与标记互换使用，虽然它主要用于指可见标记，例如绿色荧光蛋白(GFP)。可选择标记可以是显性或隐性或双向的。
如本文所用，术语“可操作地连接”是指功能关系中的多核苷酸元件的连接。当核酸与另一核酸序列处于功能关系时，该核酸是“可操作连接的”。例如，转录调节序列如果影响编码序列的转录，则其与编码序列可操作地连接。可操作地连接是指被连接的DNA序列通常是连续的，并且在需要连接两个蛋白质编码区域时，是连续的并且在读框中。
术语“蛋白质”或“多肽”可互换使用，指由氨基酸链组成的分子，而不涉及特定的作用方式、大小、3维结构或起源。
术语“信号肽”(有时称为信号序列)是存在于大多数新合成蛋白质N末端的短肽(通常长16至30个氨基酸)，这些新合成蛋白质注定要朝向分泌途径。在信号肽的末端，通常有一段氨基酸，其被信号肽酶识别并在易位过程中或完成易位过程(从细胞溶质进入分泌途径，即ER)之后被裂解以生成游离信号肽和成熟蛋白。信号肽极不均一，许多原核信号肽和真核信号肽即使在不同物种之间也可以在功能上互换，但是蛋白质分泌的效率可能取决于信号肽。合适的信号肽在本领域中通常已知，例如
Figure BDA0002799342120000071
等(2004J.Mol.Biol.338：1027-1036)和von Heijne(1985，J Mol Biol.184(1):99–105)。
术语“基因”是指包含区域(转录区域)的DNA片段，该DNA片段被转录成细胞中的RNA分子(例如mRNA)，可操作地连接到合适的调控区域(例如启动子)。基因通常会包含几个可操作连接的片段，例如启动子、5'前导序列、编码区和包含聚腺苷酸化位点的3'非翻译序列(3'末端)。“基因的表达”是指这样的过程，其中将与适当调节区特别是启动子可操作地连接的DNA区域转录成具有生物学活性的RNA，即RNA能够被翻译成生物学活性蛋白或肽。
当用于表示给定(重组)核酸或多肽分子与给定宿主生物体或宿主细胞之间的关系时，术语“同源”应理解为是指核酸或多肽分子实际上是由宿主细胞或相同物种的生物体优选相同品种或株系的生物体产生。如果与宿主细胞同源，则编码多肽的核酸序列通常(但不一定)可操作地连接到不在其自然环境中的另一个(异源)启动子序列以及(如适用)另一个(异源)分泌信号序列和/或终止子序列。应当理解，调控序列、信号序列、终止子序列等也可以与宿主细胞同源。当用于表示两个核酸序列的相关性时，术语“同源”是指一个单链核酸序列可以与互补的单链核酸序列杂交。杂交程度可取决于许多因素，包括序列之间的相同性量和杂交条件例如温度和盐浓度，如后所述。
当关于核酸(DNA或RNA)或蛋白质使用时，术语“异源”是指核酸或蛋白质，其并非天然存在作为其存在于其中的生物体、细胞、基因组或DNA序列或RNA序列的部分，或在与其天然中发现的不同细胞或基因组或DNA序列或RNA序列中的一或多个位置发现。异源核酸或蛋白质对于引入它的细胞不是内源的，而是已经从另一细胞获得或合成地或重组地产生的。通常，尽管不是必须的，此类核酸编码通常不是由其中转录或表达DNA的细胞生成的蛋白质。类似地，外源RNA编码通常不在外源RNA存在的细胞中表达的蛋白质。异源核酸和蛋白质也可以称为外源核酸或蛋白质。术语异源核酸或蛋白质在此涵盖本领域技术人员会认识到对其表达的细胞而言是异源或外源的任何核酸或蛋白质。术语异源也适用于核酸序列或氨基酸序列的非天然组合，即其中至少两个组合序列彼此是外源的组合。
除非另有说明，否则术语“免疫球蛋白”和“抗体”无论在本文中用于指重链抗体还是指常规的4-链抗体，均用作通用术语，包括全尺寸抗体和其单个链两者以及其所有部分、结构域或片段(分别包括但不限于抗原结合结构域或片段，例如VHH结构域或VH/VL结构域)。另外，如本文所用，术语“序列”(例如“免疫球蛋白序列”、“抗体序列”、“可变结构域序列”、“VHH序列”或“蛋白质序列”等术语)通常应理解为包括相关氨基酸序列以及编码其的核酸序列或核苷酸序列，除非上下文需要更具体的解释。
抗体的“可变区域”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变结构域可以被称为“VH”，或者在重链抗体(例如仅由重链组成的骆驼抗体)的情况下被称为“VHH”。轻链的可变结构域可以被称为“VL”。这些结构域通常是抗体变化最大的部分并包含抗原结合位点。术语“可变”是指可变结构域的某些区段在抗体之间的序列差异很大。V结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。但是，变异性并非平均分布在可变结构域的平均110个氨基酸范围内。相反，V区由约15-30个氨基酸的由被称为“高变区”(HVR)或互补决定区(CDR)的极端变异性的较短区域(每个约9-12个氨基酸长)隔开的称为构架区(FR)的相对不变片段组成。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，该四个FR主要采用β-片构型，并通过三个高变区连接，这三个高变区形成连接β-片结构并在某些情况下形成β-片结构一部分的环。每条链中的高变区通过FR紧密结合在一起，并且与另一条链中的高变区一起有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。
术语“VHH”、“VHH结构域”和“纳米抗体(nanobody)”在本文中可互换，在本文中用于指重链抗体即例如来自骆驼的已知仅由重链组成且不含轻链的抗体的可变结构域。然而，可以认为VHH的氨基酸序列和结构不限于此，即由在本领域中和在下文中分别称为“构架区1”或“FR1”、“构架区2”或“FR2”、“构架区3”或“FR3”和“构架区4”或“FR4”的四个构架区或“FR”组成，这些构架区被在本领域中分别称为“互补决定区1”或“CDR1”、“互补决定区2”或“CDR2”和“互补决定区3”或“CDR3”的三个互补决定区或“CDR”间断。VHH中氨基酸残基的总数可以在110-120的范围内，优选为112-115，最优选为113。然而，应注意，VHH的部分、片段或类似物(如下文进一步描述)对其长度和/或大小没有特别限制，只要此类部分、片段或类似物满足本文概述的其他功能要求并也优选地适合于本文所述的目的即可。
VHH(或常规可变结构域)的氨基酸残基根据Kabat等(Sequences of Proteins ofImmunological Interest，US Public Health Services,NIH Bethesda,MD.PublicationNo.91)给出的VH结构域的通用编号进行编号，如用于来自骆驼的VHH结构域，其由Riechmann and Muyldermans(1999，J.Immunol.Methods；231：25-38；例如参见所述文献图2)提出。根据该编号，VHH的FR1包含1-30位的氨基酸残基，VHH的CDR1包含31-36位的氨基酸残基，VHH的FR2包含36-49位的氨基酸，VHH的CDR2包含50-65位的氨基酸残基，VHH的FR3包含66-94位的氨基酸残基，VHH的CDR3包含95-102位的氨基酸残基，以及VHH的FR4包含103-113位的氨基酸残基。为此，应注意，如本领域所公知的，对于VH结构域和对于VHH结构域，每个CDR中的氨基酸残基总数可以变化并且可能不对应于Kabat编号所示的氨基酸残基总数(也就是说，根据Kabat编号的一或多个位置可能不在实际序列中被占据，或者实际序列可能包含比Kabat编号所允许的数目更多的氨基酸残基)。这意味着，通常，根据Kabat的编号可能对应于或可能不对应于实际序列中氨基酸残基的实际编号。但是，通常地可以说，根据Kabat编号，不管CDR中的氨基酸残基数量如何，根据Kabat编号的位置1均对应于FR1的起始且反之亦然，根据Kabat编号的位置36对应于FR2的起始且反之亦然，根据Kabat编号的位置66对应于FR3的起始且反之亦然，以及根据Kabat编号的位置103对应于FR4的起始。
对VH结构域的氨基酸残基进行编号的替代方法(该方法也可以以类似方式应用于骆驼科动物的VHH结构域)是Chothia等人(1989，Nature 342，877-883)描述的方法，即所谓的“AbM定义”和所谓的“接触定义”。但是，在本说明书、权利要求书和附图中，除非另有说明，否则将遵循由Riechmann和Muyldermans应用于VHH结构域的根据Kabat的编号。
对于重链抗体及其可变VHH结构域的一般描述，尤其参考被作为一般背景技术提及的以下参考文献：WO 94/04678、WO 95/04079、WO 96/34103、WO 94/25591、WO99/37681、WO 00/40968、WO 00/43507、WO 00/65057、WO 01/40310、WO 01/44301、EP 1134231、WO 02/48193、WO 97/49805、WO 01/21817；WO 03/035694、WO 03/054016、WO 03/055527WO 03/050531、WO 01/90190、WO 03/025020；WO 04/041867、WO04/041862、WO 04/041865、WO 04/041863和WO 04/062551和Hassanzadeh-Ghassabeh等人(2013，Nanomedicine，8(6)：1013-1026)。对于针对Von Willebrand因子或血小板受体GPIb的单域VHH抗体的更具体描述，请参考WO 2004/062551和WO 2006/122825。
通常，应注意，本文所用的最广义上的术语“VHH”(或纳米抗体)不限于特定生物来源或特定制备方法。例如，本发明中使用的VHH可以通过以下获得：(1)分离天然存在的重链抗体的VHH结构域；(2)表达编码天然存在的VHH结构域的核苷酸序列；(3)“人源化”天然存在的VHH结构域的(如下所述)或表达编码这种人源化VHH结构域的核酸；(4)“骆驼化”来自任何动物物种特别是哺乳动物物种(例如来自人类)的天然存在的VH结构域，或表达编码这种骆驼化VH结构域的核酸；(5)采用制备蛋白质、多肽或其他氨基酸序列的合成或半合成技术；(6)使用核酸合成技术制备编码VHH的核酸，然后表达由此获得的核酸；和/或(7)上述的任意组合。用于执行前述的合适方法和技术是现有技术，因此是技术人员已知的。
用于本发明的一类特别优选的VHH包含具有如下氨基酸序列的VHH，该氨基酸序列对应于天然存在的VHH结构域的氨基酸序列但已被“人源化”，即所述天然存在的VHH序列的氨基酸序列中的一或多个氨基酸残基被在人类的常规4-链抗体在VH结构域中相应位置处出现的一或多个氨基酸残基置换。这可以以本身已知的方式进行，这对于本领域技术人员而言是清楚的，例如基于人源化的现有技术，例如Jones等人(Nature 321：522-525，1986)；Riechmann等人(Nature 332:323-329，1988)；Presta(Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596，1992)，Vaswani and Hamilton(Ann.Allergy,Asthma and Immunol.,1：105-1151998)；Harris(Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038,1995)；Hurle and Gross(Curr.Op.Biotech.5：428-433，1994)以及与VHH人源化相关的特定现有技术，例如Vincke等人(2009，J.Biol.Chem.284：3273-3284)。再者，应当注意，本发明的此类人源化VHH可以以本身已知的任何合适方式获得，因此不严格限制于使用包含天然存在的VHH结构域作为起始原料的多肽获得的多肽。
“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低其结合的抗原的生物学活性的抗体。优选阻断抗体或拮抗剂抗体基本或完全抑制抗原的生物学活性。如本文所用的“激动剂抗体”是模拟感兴趣多肽的至少一种功能活性的抗体。
“结合亲和力”通常是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如抗原或靶)之间的非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指固有结合亲和力，其反映结合对的成员(例如抗体和抗原/靶)之间的1：1相互作用。分子X与其配偶体Y的亲和力通常可以用解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知常规方法测量，包括本文所述的方法。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原/靶并倾向于易于解离，而高亲和力抗体通常较快地结合抗原并倾向于保持结合时间更长。测量结合亲和力的多种方法是本领域已知的，任何一种此类方法均可用于本发明的目的。具体示例性实施方案在下文描述。
“Kd”或“Kd值”可通过使用如本文实施例中所述的ELISA或通过使用BIAcore TM-2000或BIAcore TM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25℃用固定的抗原CM5芯片以～10-50个反应单位(RU)来使用表面等离子体共振测定。简要地说，根据供应商的说明，用N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)活化羧甲基葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。将抗原用10mM乙酸钠(pH 4.8)稀释至5μg/ml(～0.2μM)，然后以5μl/min的流速注入，以实现约10个反应单位(RU)的偶联蛋白。注射抗原后，注射1M乙醇胺以阻断未反应的基团。为了进行动力学测量，将于含0.05％Tween 20的PBS(PBST)中的抗体或Fab的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)在25℃以约25μl/min的流速注入。通过同时拟合结合和解离传感图，使用简单的一对一Langmuir结合模型(BIAcore评估软件版本3.2)来计算结合速率(kon)和解离速率(koff)。平衡解离常数(Kd)被计算为比率koff/kon。参见例如Chen，Y等人(1999)J Mol Biol 293：865-881。如果通过上述表面等离振子共振测定确定的结合速率(on-rate)超过106M-1S-1，则可以在光谱仪中测量的抗原浓度增加的情况下，通过使用测量荧光发射强度的增加或减少的荧光猝灭技术(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)在25℃于PBS中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)、pH 7.2确定结合速率，所述光谱仪例如配备了停流的分光光度计(Aviv Instruments)或带有搅动红色比色杯的8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)。
也可以使用如上所述BIAcore TM-2000或BIAcore TM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)以与上述相同的表面等离子体共振技术确定根据本发明的“结合速率”或“结合的速率”或“结合速率”或“kon”。
短语“药学上或药理学上可接受的”是指当适当地施用于动物例如人类时不产生或产生可接受的不利、过敏或其他不良反应的分子实体和组合物。根据疾病的严重程度确定某些不良反应是否可接受。根据本公开，本领域技术人员将知道包含至少一种嵌合多肽或另外的活性成分的药物组合物的制备，例如Remington：The Science and Practice ofPharmacy(Ed.Allen，L.V.第22版，2012，www.pharmpress.com)，以引用方式并入本文。此外，对于动物(例如人类)施用，应理解，制剂应符合FDA Office of Biological Standards要求的无菌性、产热原性、一般安全性和纯度标准。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等类似材料及其组合，这对本领域普通技术人员是已知的(例如参见Remington：The Science andPractice of Pharmacy(Ed.Allen，L.V.第22版，2012，www.pharmpress.com)，以引用方式并入本文。除非任何常规载体与活性成分不相容，否则考虑将其用于治疗组合物或药物组合物中。
本文中对公共序列数据库中可访问的核苷酸序列或氨基酸序列的任何引用均指在本文件申请日可获得的序列条目的版本。
具体实施方式
本发明人惊奇地发现将纤溶酶原激活靶向MVT位点是治疗TTP的可行方法。当血小板与超大型VWF形成复合物时，患有TTP的患者会经历MVT发作。我们先前曾报道全身性纤溶酶原激活(使用链激酶)在TTP小鼠模型中具有治疗性，暗示纤溶酶可以作为ADAMTS13的功能替代物(Tersteeg等，2014，同上)。尽管纤溶酶(原)可以直接结合VWF，但是天然纤溶酶原激活物(tPA，uPA)不能。此外，微血栓是纤维蛋白贫乏的，并且出于安全原因，希望避免全身性纤溶酶原激活。为了提高治疗功效和安全性，本发明因此旨在通过纤溶酶刺激血栓形成的多聚体蛋白VWF的切割。更具体地，本发明涉及修饰的纤溶酶原激活物，其已经获得了以纤维蛋白非依赖性方式结合VWF、血小板或激活/损伤的(微)血管内皮细胞以局部诱导纤溶酶活性以清除MVT的能力。本发明还提供了可以通过将纤溶酶原激活局部递送/刺激到MVT位点来预防或治疗状况的治疗方法。
因此，在第一方面，本发明涉及一种融合蛋白，其包含纤溶酶原激活物和用于将纤溶酶原激活物靶向血栓位点的靶向剂，所述血栓包含VWF和血小板中的至少一种。靶向剂将本发明融合蛋白靶向的血栓位点原则上可以是其中存在或正在形成血栓的任何位点，包括大血管和微血管血栓(MVT)的位点以及(尚未)非闭塞大血管或微血管血栓的位点。然而，本发明的融合蛋白也(也)旨在清除MVT位点，所述MVT是纤维蛋白贫乏的，但是确实包含VWF、血小板并且在其中血管内皮可以被激活或损伤。因此，优选地，本发明的融合蛋白中的靶向剂是特异性结合VWF、血小板和激活或损伤的血管内皮中的至少一种的靶向剂。
靶向剂可以是特异性结合VWF、血小板以及激活或损伤的血管内皮中的至少一种的任何配体或结合分子。然而，优选地，靶向剂是蛋白质靶向剂。更优选地，蛋白质靶向剂是融合蛋白的单氨基酸链的一部分，其还包含纤溶酶原激活物。
“结合”感兴趣的靶例如VWF、血小板或激活/损伤的内皮的靶向剂是一种以足够的亲和力结合靶的物质，使得该靶向剂可用作靶向一种结构(例如表达或暴露所述靶的MVT、细胞或组织)的治疗剂，并不会与其他蛋白质或分子发生明显的交叉反应。在此实施方案中，靶向剂与“非靶”分子(例如蛋白质)的结合程度将小于靶向剂与其特定靶分子的结合的约10％，如通过荧光激活细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀(RIA)所测定。关于靶向剂与靶分子的结合，术语“特异性结合”或“特异地性结合”或“结合”于或“特异于”特定靶分子或多肽例如特定多肽靶上的表位，是指与非特异性相互作用可测量地不同的结合。可以例如通过测定与对照分子的结合相比的分子的结合来测量特异性结合，所述对照分子通常是不具有结合活性的具有相似结构的分子。例如，特异性结合可以通过与和靶相似的对照分子(例如过量的未标记靶)的竞争来测定。在这种情况下，如果标记的靶与探针的结合被过量的未标记的靶竞争性地抑制，则表明特异性结合。本文所用的术语“特异性结合”或“特异性地结合”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶上的表位例如由对于靶具有至少约10-4M、或者至少约10-5M、或者至少约10-6M、或者至少约10-7M、或者至少约10-8M、或者至少约10-9M、或者至少约10-10M、或者至少约10-11M、或者至少约10-12M、或者更大的Kd(可以如上所述所测定)的分子表现。在一个实施方案中，术语“特异性结合”是指其中靶向剂结合特定靶分子、多肽或特定多肽上的表位而基本上不结合任何其他分子、多肽或表位的结合。
在本发明的一个实施方案中，融合蛋白中的靶向剂特异性结合Von Willebrand因子(VWF)，优选人VWF。基本人VWF单体是2050个氨基酸的蛋白质。每个单体均包含许多具有特定功能的特定结构域，包括例如：D'/D3结构域，其结合因子VIII；A1结构域，其尤其结合血小板GPIb-受体；A2结构域(其必须部分展开以暴露用于特定ADAMTS13蛋白酶的掩埋切割位点以通过制备小得多的多聚体来灭活VWF)；A3结构域，其结合胶原蛋白；C1结构域，其中RGD基序在激活时结合血小板整合素αIIbβ3；以及“半胱氨酸结”结构域(在蛋白的C末端)。VWF的多聚体可能非常大，大于20,000kDa并可以由超过80个的各250kDa的亚基组成。VWF的主要功能是结合其他蛋白质(尤其是因子VIII)，并且其在血小板与伤口部位的粘附中重要。VWF不是酶，因此没有催化活性。VWF结合许多细胞和分子，包含例如胶原蛋白(例如由于血管受损而暴露在内皮细胞中)和血小板GP1B受体。后一种结合在所有情况下发生，但在高剪切应力下(即狭窄血管中快速血液流动时)最有效。VWF结合其他被例如凝血酶激活(即当凝血被刺激时)的血小板受体。
本发明融合蛋白中的靶向剂可以特异性结合VWF的任何和所有形式、构象、结构域和表位。因此，靶向剂可以特异性结合VWF的未折叠的(激活的)构象和VWF的球状的(循环的未激活的)构象(sVWF)中的至少一种。在一个实施方案中，至少结合未折叠的VWF的靶向剂，其中，优选该靶向剂相对于球状VWF优先结合未折叠的VWF(即对未折叠的VWF具有比对球状VWF更高的亲和力)，更优选地，该靶向剂结合该VWF的未折叠(激活)构象并且不结合循环的未激活的球状形式的VWF。更特别地，本发明融合蛋白中的靶向剂特异性结合VWF A1结构域、激活的VWF的A1结构域、VWF A2结构域、激活的VWF的A2结构域、VWF A3结构域和VWF D3结构域中的至少一个。结合VWF的靶向剂的合适实例是在本文实施例中使用的VHH骆驼科动物抗体片段，如下文进一步详述。
在本发明的另一个实施方案中，融合蛋白中的靶向剂特异性结合血小板(也称为凝血细胞)，优选人血小板。血小板与VWF一起是MVT的主要成分，因此也是本发明融合蛋白中靶向剂的合适靶。本发明融合蛋白中的靶向剂可以特异性结合任何和所有形式的血小板。因此，靶向剂可以特异性结合激活的血小板和未激活的血小板的至少一种。优选地，靶向剂(至少)结合未激活的血小板。与大血管血栓或常规血栓不同，MVT确实必须包含激活的血小板，尤其是未激活的血小板(与VWF一起)在MVT中例如在TTP中引起问题。因此，融合蛋白中的靶向剂优选不是仅特异性结合激活的血小板(而不结合非激活的血小板)的靶向剂。更特别地，靶向剂优选不是仅特异性结合血小板上的激活形式的GPIIb/IIIa受体的靶向剂，例如Schwarz等人描述的单链抗体SCE5(2004，FASEB J.18：1704–1706)。因此，靶向剂优选特异性结合整合素αIIb/βIII的非活性形式。在一个优选的实施方案中，本发明融合蛋白中的靶向剂特异性结合以下至少一种：a)血小板GP1B受体，和b)血小板上的整合素αIIb/βIII。然而，优选特异性结合血小板GP1B受体的靶向剂。结合血小板的合适靶向剂是本领域已知的，例如由Fontayne等人描述的抗GPIbα抗体6B4(2006，Thromb Haemost.96(5)：671-84)或在本文实施例中所使用的VHH抗体片段抗GP1B所示例。
在本发明的另一个实施方案中，融合蛋白中的靶向剂特异性结合激活的、损伤的和/或受应激(distressed)的内皮(在本文中进一步统称为激活的内皮)。激活的内皮优选是激活的血管内皮，更优选是激活的微血管内皮。因此，靶向剂可以特异性结合优先由激活的内皮表达的受体和用于激活的内皮的膜标记物中的至少一种。优选地，优先由激活的内皮表达的受体是选自以下的受体：E-选择蛋白、P-选择蛋白、uPAR、c1q受体、激肽B1受体、纤溶酶原受体KT(PLGR-KT)、内皮蛋白C受体、血栓调节蛋白、n-钙粘蛋白、ICAM-1和VCAM-1。优选地，用于激活的内皮的膜标记物是阴离子磷脂、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺中的一或多种。
在本发明融合蛋白的一个实施方案中，特异性结合上述靶中之一的靶向剂优选包含以下至少一种：a)特异性结合所述靶中一种的抗体可变结构域；和b)来自天然地结合所述靶中一种的蛋白质的结合结构域。
本发明融合蛋白中作为靶向剂存在的优选的抗体可变结构域是如上文所定义的VHH，更优选地，抗体可变结构域是人源化的VHH。
在一个优选的实施方案中，在本发明融合蛋白中作为靶向剂存在的VHH是特异性结合VWF的VHH。结合VWF并且作为靶向剂是本发明融合蛋白一部分的VHH的合适实例是本文实施例中融合蛋白一部分的或US2013/0136736-A1(其通过引用并入本文)中所述的结合VWF的VHH。
结合可溶性球状VWF并且作为靶向剂存在于本发明融合蛋白中的优选VHH是具有SEQ ID NO：7的55-178位氨基酸序列的VHH-sVWF或具有与SEQ ID NO：7的55-178位具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列且对VWF具有小于1nM、0.5nM、0.2nM、0.1nM、0.05nM或0.0306nM的Kd的VHH。
结合VWF的D3结构域并且作为靶向剂存在于本发明融合蛋白中的优选VHH是具有SEQ ID NO：8的55-178位氨基酸序列的VHH-D3或具有与SEQ ID NO：8的55-178位具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列且对VWF具有小于1nM、0.5nM、0.4nM、0.35nM或0.33nM的Kd的VHH。
结合VWF的A1结构域并且作为靶向剂存在于本发明融合蛋白中的优选VHH是具有SEQ ID NO：11的55-179位氨基酸序列的VHH-A12或具有与SEQ ID NO：11的55-179位具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列且对VWF具有小于25nM、20nM、18nM、15nM或13nM的Kd的VHH。结合VWF的A1结构域并且作为靶向剂存在于本发明融合蛋白中的另一优选VHH是具有SEQ ID NO：13的氨基酸序列的VHH或其具有SEQ ID NO：14的氨基酸序列的人源化形式，或具有与SEQ ID NO:13或14具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列并且对VWF具有小于10nM、5nM或2nM的Kd的VHH。
结合血小板GP1B受体并且作为靶向剂存在于本发明融合蛋白中的优选VHH是具有SEQ ID NO：12的55-178位氨基酸序列的VHH-GP1B17，或具有与SEQ ID NO：12的55-178位具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列且对血小板GP1B受体具有小于20nM、15nM、10nM、5nM、2nM、1nM、0.5nM、0.2nM或0.1nM的Kd的VHH。结合血小板GP1B受体并且作为靶向剂存在于本发明融合蛋白中的其他优选VHH具有由选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO：20的55-175位氨基酸序列、SEQ ID NO:21的55-178位氨基酸序列、SEQ ID NO：22的55-172位氨基酸序列、SEQ ID NO：23的55-171位氨基酸序列、SEQ ID NO：24的55-174位氨基酸序列、SEQ ID NO：25的55-176位氨基酸序列、SEQ ID NO：26的55-178位氨基酸序列、SEQ ID NO：27的55-178位氨基酸序列、SEQ IDNO：28的55-178位氨基酸序列、SEQ ID NO：29的55-166位氨基酸序列、SEQ ID NO：30的55-180位氨基酸序列、SEQ ID NO：31的55-176位氨基酸序列、SEQ ID NO：32的55-176位氨基酸序列、SEQ ID NO：33的55-179位氨基酸序列、SEQ ID NO：34的55-179位氨基酸序列、SEQ IDNO：35的55-177位氨基酸序列、SEQ ID NO：36的55-178位氨基酸序列和SEQ ID NO：37的55-181位氨基酸序列，或具有与在该组中的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性且对血小板GP1B受体具有小于20nM、15nM、10nM、5nM、2nM、1nM、0.5nM、0.2nM或0.1nM的Kd的氨基酸序列。
结合VWF的A1结构域的另一优选VHH包含与SEQ ID NO：46具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列。优选地，结合VWF的A1结构域并且包含SEQ ID NO：46的氨基酸序列的VHH作为靶向剂存在于本发明的融合蛋白中，是具有SEQ ID NO：45的氨基酸序列或其具有SEQ ID NO：44的氨基酸序列的人源化形式的VHH，或具有与SEQ ID NO：44或45具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸序列并且对VWF具有小于10nM、5nM或2nM的Kd的VHH。
在本发明融合蛋白的另一个实施方案中，特异性结合VWF、血小板和激活或损伤的血管内皮中的至少一种的靶向剂包含来自天然地结合VWF、血小板和激活或受伤的血管内皮中的至少一种的蛋白质的结合结构域。优选地，结合结构域包含选自以下的结合结构域：i)来自VWF的A1结构域或结合血小板GP1B受体的VWF A1结构域的至少一部分；ii)来自ADAMTS13、因子XII、因子H(补体调节物)、纤溶酶原和因子VIII中一种的VWF结合结构域，结合VWF的这些结构域的至少一部分；和iii)结合激活或损伤的血管内皮的膜的结构域，该结构域选自维生素K依赖性羧化/γ-羧基谷氨酸(GLA)结构域、来自因子V的C结构域和来自因子VIII的C结构域。
在本发明的一个实施方案中，融合蛋白包含多于一种的靶向剂。融合蛋白因此可以包含例如两个、三个、四个、五个、六个或更多个靶向剂。如果融合蛋白中存在多于一种的靶向剂，则融合蛋白中可以存在多于一个拷贝的相同靶向剂。或者，融合蛋白可包含至少两种不同的靶向剂。例如，融合蛋白可包含至少两种不同的靶向剂，该靶向剂(各自)结合VWF的至少两个不同的结构域或血小板上的至少两个不同的受体。或融合蛋白可包含至少两种不同的靶向剂，其中至少一种靶向剂结合VWF而至少一种其他靶向剂结合血小板。在融合蛋白中掺入多于一种的靶向剂的优点是在MVT位点的多价结合的亲合力，即各个靶向剂的各个结合相互作用的多个亲和力的累积强度。当融合蛋白中存在多于一种的靶向剂时，各个靶向剂优选串联排列，并且优选在各个靶向剂之间具有合适的(柔性)间隔序列或接头氨基酸序列。
合适的柔性接头-氨基酸序列是本领域已知的(例如Chen等，2013，Adv DrugDelivRev.65(10)：1357-1369)。当连接的结构域需要一定程度的移动或相互作用时，通常使用柔性接头。它们通常由小的、非极性(例如Gly)或极性(例如Ser或Thr)氨基酸组成。这些氨基酸的小尺寸提供了柔性，并允许连接功能域的迁移。Ser或Thr的掺入可通过与水分子形成氢键来维持接头在水溶液中的稳定性，因此减少了接头与蛋白质部分之间的不利相互作用。优选的柔性接头具有主要由Gly和Ser残基的片段组成的序列(“GS”接头)。优选的(并且广泛使用的)柔性接头的实例具有(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n的序列。通过调节拷贝数“n”，可以优化该GS接头的长度，以实现功能域的适当分离，或维持必要的结构域间相互作用。除GS接头外，还为重组融合蛋白设计了许多其他柔性接头。这些柔性接头还富含小的或极性氨基酸(例如Gly和Ser)，但可以包含其他氨基酸(例如Thr和Ala)以保持柔性，还可以包含极性氨基酸(例如Lys和Glu)以提高溶解度，例如柔性接头KESGSVSSEQLAQFRSLD(SEQID NO：38)和EGKSSGSGSESKST(SEQ ID NO：38)，其已用于构建生物活性scFv。
除了上述一或多种靶向MVT的靶向剂外，本发明的融合蛋白还至少包含纤溶酶原激活物。纤溶酶原激活物是丝氨酸蛋白酶，其通过其酶原形式纤溶酶原的蛋白裂解来催化纤溶酶的激活。虽然纤溶酶是纤维蛋白溶解的重要因子，但在本发明的上下文中，纤溶酶原激活依赖于其对MVT的纤维蛋白非依赖性溶栓活性。因此，根据本发明的融合蛋白包含纤溶酶原激活物，该纤溶酶原激活优选包含组织纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)、纤溶酶原、链激酶或葡激酶的(催化)蛋白酶结构域。tPA、uPA、纤溶酶原、链激酶和葡激酶的催化蛋白酶结构域是本领域熟知的。用于掺入本发明融合蛋白中的优选纤溶酶原激活催化蛋白酶结构域是uPA、优选人uPA的催化蛋白酶结构域，其包含SEQ ID NO：1的16-268位氨基酸序列，或是tPA、优选人tPA的催化蛋白酶结构域，其包含SEQ ID NO：19的15-266位氨基酸序列。
在一个实施方案中，其中用于掺入本发明融合蛋白的催化蛋白酶结构域是uPA、优选人uPA的催化蛋白酶结构域，(人)uPA结构域包含在其序列中使(人)uPA稳定的突变。稳定化突变已在US5,472,692和Sun等(J Biol Chem，1997年9月19日；272(38)：23818–23823)中描述，其全部内容并入本文。在一个优选的实施方案中，催化结构域蛋白酶包含SEQ ID NO：1和/或由SEQ ID NO：1组成，其中位于SEQ ID NO：1的157位的赖氨酸(K)被突变为组氨酸(H)。在一个优选的实施方案中，催化结构域蛋白酶包含SEQ ID NO：2和/或由SEQ ID NO：2组成，其中位于SEQ ID NO：2的158位的赖氨酸(K)被突变为组氨酸(H)。
在一个实施方案中，掺入本发明融合蛋白中的纤溶酶原激活物包含催化蛋白酶结构域的变体，其对纤溶酶原激活物的天然抑制剂(例如纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1))的敏感性降低。此类变体包含例如uPA或tPA蛋白酶结构域的变体，在其exosite环中具有一个或多个修饰，这些修饰涉及与PAI-1的相互作用，例如uPA的蛋白酶结构域中的37环和147环或tPA的蛋白酶结构域中的类似环，例如37环、60环、97环、147环和217环(参见Lin等，JBiol Chem，2011年3月4日；286(9)：7027-7032)。此类修饰的实例是特异于与PAI-1相互作用的exosite的缺失(tPA del 296-302)或特异性介导与PAI-1相互作用的特定氨基酸的置换(tPA Arg->Glu 304或Arg->Ser 304)(Madison等，Nature 1989年6月29日；339(6227)：721-4)。
在优选的实施方案中，掺入本发明融合蛋白中的纤溶酶原激活物还至少包含连接肽的至少含半胱氨酸的部分，该连接肽天然地存在于纤溶酶原激活物中，在其蛋白酶结构域上游紧邻(N-末端)其蛋白酶结构域。连接肽(包括其半胱氨酸)的存在避免了蛋白酶结构域中对应半胱氨酸形成不需要的二硫键。
包含在掺入本发明融合蛋白中的纤溶酶原激活物中的优选连接肽是：a)来自uPA的连接肽，其至少包含SEQ ID NO：16的氨基酸17-27，更优选地，该连接肽至少包含SEQ IDNO：16的氨基酸13-27；b)来自tPA的连接肽，其至少包含SEQ ID NO：17的氨基酸3-14，更优选地，该连接肽至少包含SEQ ID NO：17的氨基酸1-14；或c)来自纤溶酶原的连接肽，其至少包含SEQ ID NO：18的氨基酸5-18，更优选地，该连接肽至少包含SEQ ID NO：18的氨基酸1-18。
在另一个优选的实施方案中，本发明的融合蛋白优选包含一方面位于一或多个靶向剂之间与另一方面位于一或多个靶向剂与纤溶酶原激活物之间的接头氨基酸序列。因此，应理解，如果纤溶酶原激活物包含连接肽，例如如上所述，则该接头氨基酸序列位于纤溶酶原激活物的连接肽的上游。连接靶向剂和纤溶酶原激活物的接头-氨基酸序列优选是如上所述的柔性接头-氨基酸序列。用于连接靶向剂和纤溶酶原激活物的优选接头氨基酸序列具有(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n的序列，其中n为1-4，更优选为2或3，最优选为2。特别优选的接头氨基酸序列具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列。
因此，根据本发明的优选融合蛋白是这样的融合蛋白，其以N端至C端的顺序包含：a)一或多个上文定义的靶向剂，其中，任选地，靶向剂通过如上文定义的接头氨基酸序列连接；b)任选地包含如上文所定义的接头氨基酸序列；和c)上文定义的纤溶酶原激活物。融合蛋白可以还包含其他功能元件，包括例如分离标签(例如His标签或STREP分离标签)或仅被特定蛋白酶识别的裂解位点(例如烟草蚀刻病毒裂解位点)以便能够从融合蛋白切割掉不需要的氨基酸序列(例如分离标签)。图1显示了根据本发明的优选融合蛋白的构型的实例，其中编码融合蛋白的核苷酸序列还编码融合蛋白上游的(Igκ)信号序列，以指导其从产生蛋白质的细胞中分泌。
在第二方面，本发明涉及包含编码如上文所定义的本发明融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子。编码融合蛋白的核苷酸序列还优选包含编码与融合蛋白可操作连接的信号肽的核苷酸序列。指导本发明融合蛋白分泌的优选信号肽是Igκ信号肽，具有SEQ ID NO：3的氨基酸序列。包含编码本发明融合蛋白的核苷酸序列的核酸分子还优选包含有助于融合蛋白在合适宿主细胞中表达的调控元件，该调控元件可操作地连接到核苷酸序列。
在第三方面，本发明涉及包含根据本发明的核酸分子的载体。任选地，根据本发明的载体是基因治疗载体。
优选地，所述基因治疗载体是病毒基因治疗载体，例如选自基于腺病毒、腺相关病毒(AAV)、疱疹病毒、痘病毒、溶瘤病毒载体和逆转录病毒的基因治疗载体的病毒基因治疗载体。优选的病毒基因治疗载体是AAV或慢病毒载体。
在第四方面，本发明涉及包含根据本发明的载体的宿主细胞，该宿主细胞表达根据本发明的融合蛋白。
该细胞优选是分离的细胞或培养的细胞。可以使用的宿主细胞是原核生物、酵母或高等真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性生物体或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌或杆菌。高等真核细胞包括昆虫细胞和已建立的哺乳动物来源细胞系。合适的哺乳动物宿主细胞系的实例包括猴肾细胞的COS-7细胞系(Gluzman等，1981，Cell 23：175)、L细胞、HEK293细胞、C127细胞、3T3细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Hela细胞、BHK细胞系和衍生自非洲绿猴肾细胞系CVI的CVI/EBNA细胞系，如McMahan等，1991，EMBO J.10：2821所述。与细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主一起使用的合适克隆和表达载体如Pouwels等人描述(Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,New York，1985)。
转化的细胞可以在促进该宿主细胞表达根据本发明的融合蛋白的条件下培养。因此，一方面，本发明涉及一种生产根据本发明的融合蛋白的方法，该方法包括以下步骤：在有助于表达根据本发明的融合蛋白的条件下，培养包含至少一种如本文所定义的表达载体的细胞，任选地，回收根据本发明的融合蛋白。
本发明的融合蛋白可以通过常规蛋白质纯化方法回收，包括例如蛋白A-琼脂糖、羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析或亲和色谱，使用例如链霉亲和素/生物素(参见例如Low etal.,2007,J.Chromatography B,848:48-63；Shukla et al.,2007,J.Chromatography B,848:28-39)。
在第五方面，本发明涉及药物组合物，其包含根据本发明的融合蛋白、根据本发明的核酸、根据本发明的载体或基因治疗载体或根据本发明的宿主细胞和药学上可接受的赋形剂和/或由根据本发明的融合蛋白、根据本发明的核酸、根据本发明的载体或基因治疗载体或根据本发明的宿主细胞和药学上可接受的赋形剂组成。
药物组合物还优选包含至少一种药学上可接受的载体。药学上可接受的载体(例如佐剂或运载体)用于将抗体或抗体片段施用于受试者。所述药物组合物可通过将有效量的组合物施用于有需要的受试者而用于下文所述的治疗方法。如本文所用，术语“受试者”是指被分类为哺乳动物的所有动物，包括但不限于灵长类动物和人类。受试者优选是任何年龄或种族的男性或女性人类。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”旨在包含与药物施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等(参见例如“Handbookof Pharmaceutical Excipients”,Rowe et al eds.7th edition,2012,www.pharmpress.com)。这些介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域众所周知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑将其用于组合物中。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并包括：缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵和苄索氯铵；酚醇、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐的抗衡离子，例如钠；金属配合物(例如Zn2+-蛋白质配合物)；和/或非离子表面活性剂，例如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
也可以将补充活性化合物掺入本发明的药物组合物中。因此，在一个特定实施方案中，本发明的药物组合物还可以含有多于一个的活性化合物，该活性化合物对于所治疗的特定适应症是需要的，优选那些具有不会互相不利影响的互补活性的活性化合物。例如，可能需要进一步提供化疗剂、细胞因子、止痛剂、血栓溶解剂或免疫调节剂(例如免疫抑制剂或免疫刺激剂)。此类其他活性剂的有效量尤其取决于药物组合物中存在的本发明抗体的量、疾病或状况的类型或治疗等。
在一个实施方案中，根据本发明的融合蛋白与载体一起制备，所述载体将保护所述化合物免于从体内快速清除，例如控释制剂，包括植入物和微胶囊化递送系统，例如脂质体。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、多正酯类和聚乳酸。这类制剂的制备方法对本领域技术人员而言是明显的。脂质体悬浮液，包括靶向脂质体，也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备，例如如US 4,522,811或WO2010/095940中所述。
根据本发明的融合蛋白的施用途径可以是肠胃外的。本文所用的术语“肠胃外”包括静脉内、动脉内、淋巴管内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或阴道施用。肠胃外施用的静脉内形式是优选的。“全身施用”是指口服、静脉内、腹膜内和肌内施用。当然，治疗或预防作用所需的融合蛋白的量将当然随所选择的融合蛋白、所治疗状况的性质和严重程度以及患者而变化。另外，可以通过脉冲输注例如以递减的融合蛋白剂量来适当地施用融合蛋白。优选地，部分地取决于施用是短暂的还是长期的，通过注射最优选静脉内或皮下注射来给予剂量。
因此，在一个特定实施方案中，本发明的药物组合物可以是适合肠胃外施用的形式，例如适当单位剂型的无菌溶液、悬浮液或冻干产品。适用于可注射用途的药物组合物包括用于无菌水溶液(水溶性时)或分散液和临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉剂。对于静脉内施用，合适的载体包括生理盐水、抑菌水、CremophorEM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物必须是无菌的并且应该是以易于注射的程度存在的流体。它必须在生产和储存条件下稳定，并且必须加以防腐，以防止微生物(如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、药学上可接受的多元醇(如甘油、丙二醇，液态聚乙二醇)及其合适的混合物。可以例如通过使用诸如卵磷脂的包衣，在分散液的情况下通过维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在许多情况下，优选在组合物中含有等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露醇和山梨醇)或氯化钠。
通过在组合物中含有延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长吸收。
无菌注射溶液可通过将所需量的活性化合物(例如融合蛋白)掺入具有并根据需要的上述列举的成分之一或组合的合适溶剂中，然后通过过滤灭菌来制备。通常，通过将活性化合物掺入无菌运载体中来制备分散液，所述无菌运载体包含基本分散介质和所需的上文列举的其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。
在特定实施方案中，所述药物组合物通过静脉内(IV)或皮下(SC)施用。可以使用足够的赋形剂，例如填充剂、缓冲剂或表面活性剂。所提及的制剂将使用本领域众所周知的用于制备肠胃外施用组合物并且在各种来源包括例如“Remington:The Science andPractice of Pharmacy”(Ed.Allen,L.V.22nd edition,2012,www.pharmpress.com)中更详细描述的标准方法制备。
以易于施用和剂量均一性的剂量单位形式来配制药物组合物(即肠胃外组合物)是特别有利的。如本文所用，剂量单位形式是指适合作为用于待治疗的受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有预定量的活性化合物(本发明的抗体)，该活性化合物经计算联合所需的药物载体可产生所需的治疗效果。本发明的剂量单位形式的规范根据并直接取决于活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗效果以及为治疗个体而复合此类活性化合物的本领域固有限制。
通常，为了预防和/或治疗本文所述的疾病和失调并取决于待治疗的具体疾病或状况及其严重程度、待使用的本发明的特异性融合蛋白的效力、具体的施用途径和所使用的特定药物制剂或组合物，本发明的融合蛋白通常将以0.001至1,000mg/kg体重/天的范围施用，优选约0.01至约100mg/kg体重/天，更优选约0.05至10mg/kg体重/天，例如约1微克、10微克、100微克或1000微克/kg体重/天，或者连续地(例如通过输注)，以单次日剂量或者一天多次分剂量。根据本文提到的因素，临床医生通常将能够确定合适的日剂量。还应该清楚的是，在特定情况下，临床医生可以例如根据上述因素和其专业判断选择偏离这些量。
除了向患者施用根据本发明的融合蛋白之外，本申请还考虑通过基因疗法施用融合蛋白。
药物组合物可以与施用说明书一起包括在容器、包装或分配器中。
本发明的融合蛋白和药物组合物可以与其他药物一起使用以提供联合治疗。其他药物可以形成相同组合物的部分，或作为单独的组合物提供，以同时或在不同时间施用。
在第六方面，本发明涉及用于治疗或预防与血栓形成相关的疾病或状况的各自如上文所定义的融合蛋白、基因治疗载体和药物组合物中的至少一种。待预防或治疗的疾病或状况可以是与包含VWF和血小板中的至少一种的血栓相关或涉及包含VWF和血小板中的至少一种的血栓的任何疾病或状况。与包含VWF和血小板中的至少一种的血栓相关的这种疾病或状况可以是涉及大血管血栓和/或微血管血栓(MVT)和/或涉及(目前)非闭塞性大血管血栓或微血管血栓的部位的任何疾病或状况。然而，优选地，待预防或治疗的疾病或状况是至少与微血管血栓形成(MVT)相关的疾病或状况。应理解，在本文中，术语“预防疾病或状况”包括和/或可以等于减少该疾病或状况发生或发展的风险。
在优选的实施方案中，与包含VWF和血小板中的至少一种的血栓相关的疾病或状况是选自由以下的疾病或状况：获得性或遗传性血栓性血小板减少性紫癜(TTP)，补体介导的血栓性微血管病(如George et al.,2014,N Engl J Med.371(7):654-66所述)，溶血性尿毒症综合征，抗磷脂抗体综合征，闭塞性血栓形成，动脉血栓形成，急性冠状动脉闭塞，外周动脉闭塞性疾病，由冠状动脉旁路搭桥术、冠状动脉瓣膜置换术和冠状动脉介入治疗(如血管成形术、支架术或粥样斑块切除术)引起的再狭窄和失调，血管成形术、粥样斑块切除术或动脉支架置入术后增生，血管系统内闭塞综合征或病变动脉缺乏通畅性，短暂性大脑缺血发作，不稳定型或稳定型心绞痛，脑梗死，HELLP综合征(HELLP是溶血、肝酵素升高和血小板计数低)，颈动脉内膜切除术，颈动脉狭窄，重症肢体缺血，心源性栓塞，外周血管疾病，再狭窄，镰状细胞病和心肌梗塞。
根据本发明的方法治疗或预防的与包含VWF和血小板中的至少一种的血栓相关的其他疾病或状况是选自以下的疾病或状况：不稳定型心绞痛，稳定型心绞痛，心绞痛，栓子形成，深静脉血栓形成，溶血性贫血，急性肾衰竭，溶栓并发症，弥散性血管内凝血病(DIC)，血栓形成，冠心病，血栓栓塞性并发症，心肌梗塞，再狭窄和心房颤动导致的心房血栓形成，慢性不稳定型心绞痛，短暂性缺血发作和中风，外周血管疾病，动脉血栓形成，先兆子痫，栓塞，血管成形术后再狭窄和/或血栓形成，血管移植物吻合以及长期暴露于心血管器械。此类状况也可能是溶栓治疗期间和之后、血管成形术之后以及冠状动脉搭桥术后的血栓栓塞和再闭塞所致。
在另一个实施方案中，各自如上文所定义的融合蛋白、基因治疗载体和药物组合物用于治疗或预防个体的斑块或血栓。所述斑块或血栓形成可以是在高剪切的条件下。在血栓形成和再闭塞中，血小板在高剪切速度下可逆的粘附或束缚，随后通过血小板上的胶原受体牢固粘附，导致血小板激活。在高剪切条件下，VWF将血小板束缚在暴露在受损血管壁上的胶原蛋白上尤为重要。本发明的融合蛋白在高剪切条件下表现良好。
在第七方面，本发明涉及用于治疗或降低与包括VWF和血小板中的至少一种的血栓相关的疾病或状况的风险的方法，其中所述方法包括向需要其的受试者施用有效量的上文定义的融合蛋白、上文定义的基因治疗载体或上文定义的药物组合物的步骤，其中优选地所述疾病或状况与微血管血栓形成相关。优选地，在该方法中，与包含VWF和血小板中的至少一种的血栓相关的疾病或状况选自：获得性或遗传性血栓性血小板减少性紫癜(TTP)，补体介导的血栓性微血管病，溶血性尿毒症综合征，抗磷脂抗体综合征，非闭塞性血栓，闭塞性血栓形成，动脉血栓形成，急性冠状动脉闭塞，外周动脉闭塞性疾病，由冠状动脉旁路搭桥术、冠状动脉瓣膜置换术和冠状动脉介入治疗(如血管成形术、支架术或粥样斑块切除术)引起的再狭窄和失调，血管成形术、粥样斑块切除术或动脉支架置入术后的增生，血管系统内的闭塞综合征或病变动脉缺乏通畅性，短暂性大脑缺血发作，不稳定型或稳定型心绞痛，脑梗死，HELLP综合征，颈动脉内膜切除术，颈动脉狭窄，重症肢体缺血，心源性栓塞，外周血管疾病，再狭窄，镰状细胞病和心肌梗塞，或上文定义的其他疾病或状况。
在第八方面，本发明涉及用于治疗或降低微血管血栓、非血纤蛋白依赖性血栓和包括VWF和血小板中的至少一种的血栓中的至少一种的风险的方法。优选地，在该方法中，在选自由以下的疾病或状况中治疗至少一种这些血栓或降低其发生的风险：获得性或遗传性血栓性血小板减少性紫癜(TTP)，补体介导的血栓性微血管病，溶血性尿毒症综合征，抗磷脂抗体综合征，非闭塞性血栓，闭塞性血栓形成，动脉血栓形成，急性冠状动脉闭塞，外周动脉闭塞性疾病，由冠状动脉旁路搭桥术、冠状动脉瓣膜置换术和冠状动脉介入治疗(如血管成形术、支架术或粥样斑块切除术)引起的再狭窄和失调，血管成形术、粥样斑块切除术或动脉支架置入术后的增生，血管系统内闭塞综合征或病变动脉缺乏通畅性，短暂性大脑缺血发作，不稳定型或稳定型心绞痛，脑梗死，HELLP综合征，颈动脉内膜切除术，颈动脉狭窄，重症肢体缺血，心源性栓塞，外周血管疾病，再狭窄，镰状细胞病和心肌梗塞，或上文定义的其他疾病或状况。
在本文件及其权利要求中，动词“包含”及其变化形式以其非限制性意义使用，以表示包括该词之后的条目，但不排除未特别提及的条目。另外，不定冠词“a”或“an”所指的要素不排除存在多于一个的这种要素的可能性，除非上下文明确要求存在一个并仅存在一个这种要素。因此，不定冠词“a”或“an”通常表示“至少一个”。
当与数值(例如约10)关联使用时，单词“约”或“大约”优选地是指该值可以是给定值(为10)或多或少0.1％。
本说明书中引用的所有专利和参考文献参考均通过引用以整体并入本文。
通过以下实施例进一步描述本发明，这些实施例不应解释为限制本发明的范围。
附图说明
图1：VHH-miniUPA(mUPA)构建体：A)mUPA构建体的示意图；B)包含VHH编码序列的mUPA构建体的示意图(VHH-mUPA)。
图2：纯化的VHH-mUPA构建体的Western印迹。
图3：被纤溶酶激活后的VHH-mUPA构建体活性。
图4：通过VHH-mUPA构建体激活的纤溶酶原。
图5：在球状VWF或开放性VWF存在下，通过VHH-mUPA构建体激活的纤溶酶原。A)通过VHH-sVWF的纤溶酶原激活，B)通过VHH-D3的纤溶酶原激活，C)通过VHH-GP1B17的纤溶酶原激活，D)通过VHH-R2的纤溶酶原激活，E)通过VHH-A12的纤溶酶原激活。
图6：构建体VHH-sVWF、VHH-D3、VHH-GP1B17、VHH-R2和VHH-A12在37℃培育5分钟后的纤溶酶底物转化。
图7：VWF-血小板凝集物的微溶栓(即酶促分解)。随时间监测凝集物的裂解：A)VHH-sVWF诱导的微溶栓，B)VHH-D3诱导的微溶栓，C)VHH-R2诱导的微溶栓，D)VHH-GP1B17诱导的微溶栓。
图8：A)确定发生了50％微血栓降解的时间点的分析方法的图形实例。B)构建体VHH-sVWF、VHH-D3、VHH-GP1B17、VHH-R2和VHH-A12的50％微血栓降解。
图9：在流灌注实验中分析的粘附到人血管内皮细胞的VWF-血小板复合物的微溶栓。VWF-血小板复合物以血小板串(strings of platelets)的形式可见并且响应于所示融合蛋白的添加，可见串的数目作为时间的函数进行计数。
图10：VWF-血小板凝集物的微溶栓(即酶促分解)。在光透射聚集计上随时间监测凝集物的裂解。A)在(100μg/mL)纤溶酶原存在下，(154.3nM)卡帕珠单抗(Caplacizumab)或(154.3nM)VHH-D3融合蛋白与UPA诱导的微溶栓。B)在(100μg/mL)纤溶酶原存在下，(154.3nM)卡帕珠单抗或(154.3nM)VHH-GP1B17融合蛋白与UPA诱导的微溶栓。
实施例
实施例1
方法与材料
纳米抗体-mUPA构建
人和小鼠尿激酶(PLAU)两者的cDNA序列均从NCBI数据库获得(分别为NM_002658.4和NM_008873.3)。除去信号肽、EGF样和Kringle结构域的序列以及连接肽的第一部分。向其余的连接肽和S1肽酶结构域(催化结构域)添加在GGGGS接头后的编码烟草蚀刻病毒切割位点的N-末端序列。在连接的GGGGS中，掺入了PstI和BamHI消化位点，而没有干扰氨基酸序列。在5'端添加了EcoRI消化位点，在3'端，在PLAU的STOP密码子后添加了NotI消化位点。该构建体作为定制基因构建体从IDT(Integrated DNA Technologies,Leuven,Belgium)获得。
通过IDT对纳米抗体(也称为VHH)的编码序列进行密码子优化，以在人宿主细胞中表达。在VHH编码序列的N末端侧放置了编码烟草蚀刻病毒切割位点的序列并在C末端侧放置了GGGGS接头(编码PstI和BamHI消化位点)。这些DNA片段作为双链DNA片段(gBLocks)从IDT获得。
定制基因构建体在大肠杆菌TOP10中繁殖并经氨苄西林抗性选择。通过EcoRI和NotI消化获得的质粒DNA。将得到的插入物(886)在琼脂糖凝胶上分开并分离并连接到修饰的pcDNA6表达载体(pSM2)中(De Maat et al,2016J Allergy Clin Immunol Nov；30；138(5):1414-23)。pSM2编码N末端鼠IgK分泌信号和双STREP分离标签，然后将修饰的UPA构建体连接起来。
根据制造商说明书将gBlocks连接到pJET1.2克隆载体中(CloneJET PCR CloningKit；Thermo Fisher)。该构建体在大肠杆菌TOP10中繁殖并通过氨苄西林抗性选择。通过EcoRI和BamHI消化获得的质粒DNA。将得到的插入物在琼脂糖凝胶上分开并分离并连接到含有miniUPA构建体的pSM2载体中。图1中示意性地描绘了基因构建体。
表1列出了所制备的纳米抗体-mUPA融合蛋白构建体，包括其纳米抗体的靶及其名称。
表1。纳米抗体-mUPA融合蛋白构建体的描述
Figure BDA0002799342120000221
纳米抗体-mUPA生产
按照制造商(ThermoFisher)的说明，使用239Fectin将纳米抗体/mUPA-pSM2构建体转染到HEK293 FreeStyleTM细胞中。1天后，将细胞扩展至20mL。后2天，将细胞置于杀稻瘟素选择(5μg/mL)下。根据生产商说明书进一步培养转染的细胞，直到将构建体稳定整合到HEK基因组中。扩增细胞(至1.1×106细胞/mL)并在产生蛋白质7天后，将细胞以2000xg旋转5分钟。此后，收集上清液并加入苯扎明(0.174mg/mL)，之后将上清液储存在-20℃直至进一步使用。
纳米抗体-mUPA纯化
使用10kDA截止膜(GE healthcare)在Quixstand上将收集的上清液(400mL)浓缩至150mL。此后，将浓缩物对2L 1x含有苯甲脒的STREP缓冲液(100mM Tris，150mM NaCl，0.174mg/mL的苯甲脒，pH 8.0)透析。使浓缩物流过含有8mL Strep-Tactin超流珠(IBA)的柱。用20mL 1xSTREP缓冲液洗涤该柱后，蛋白质通过d-脱硫生物素(2.5mM；Sigma Aldrich)在1xSTREP缓冲液中洗脱。将纯化的蛋白质对2L乙酸钠(4mM乙酸钠，150mM NaCl，pH 5.4)透析并在-80℃保存。
结果
在western印迹上纯化的纳米抗体-mUPA构建体
将纳米抗体-mUPA构建体在样品缓冲液(25mM DTT)中稀释至100μg/mL的浓度。将10μL样品上样至MES缓冲液中的4-12％梯度Bis-Tris凝胶中。样品分离在165伏进行50分钟。将凝胶在印迹缓冲液中于125伏转移到Immobilon-FL膜上1小时。用0.5x Odyssey封闭缓冲液封闭膜，然后用兔多克隆抗人UPA抗体组合IR800标记的山羊抗兔抗体检测构建体。根据制造商说明书，通过近红外奥德赛扫描仪(Licor)分析结果。图2显示除了A11-mUPA以外的所有融合蛋白均以几乎相等的水平表达。
纳米抗体-mUPA构建体的尿激酶活性
纳米抗体-mUPA构建体应该没有显示自发的(即非诱导的)活性，但是应该可以通过纤溶酶的分子切割而被激活。
为了验证没有纳米抗体-mUPA构建体显示出任何自发活性，将构建体(1μg/mL)在0.5mM尿激酶底物(I1140；Bachem)存在下保温。根据制造商说明书在37℃测量底物转化。没有融合蛋白显示出对尿激酶底物的任何可检测到的自发活性(数据未显示)。
为了测试纳米抗体-mUPA构建体是否可被纤溶酶激活，在37℃通过链激酶将纤溶酶原预激活15分钟(以下称为纤溶酶)。将纳米抗体-mUPA融合构建体(终浓度1μg/mL)在0.2％BSA-HBS中稀释并与纤溶酶(终浓度1μg/mL)保温12分钟。随后，加入尿激酶底物(0.5mM I1140，Bachem)并根据制造商说明书在37℃测量其转化。图3显示融合蛋白通常是可激活的。
纤溶酶原激活
尿激酶激活纤溶酶原的基础取决于尿激酶和纤溶酶原之间的相互切割。为了测试通过纳米抗体-mUPA构建体的纤溶酶原激活，将构建体(1μg/mL)在100μg/mL纤溶酶原和0.2mM纤溶酶底物(I1390；Bachem)存在下在0.2％BSA-HBS中保温。根据制造商说明书在37℃测量底物转化。图4显示所有构建体均显示出可比的酶活性的发展。
通过ELISA测定的抗VWF构建体与VWF的结合
将nunc maxisorp板(Thermo)用1μg/mL VWF在PBS中包被过夜。第二天，将该板用1％BSA-PBS封闭。将抗VWF纳米抗体-mUPA融合构建体以各种浓度在1％BSA-PBS中稀释，然后将50uL加入每个孔中并保温1小时。此后，用PBS-Tween 20(PBST；0.05％v/v)洗涤板。通过兔抗UPA多克隆抗体组合山羊抗兔HRP二抗(Abcam)检测结合的构建体。用PBST冲洗孔，然后在室温加入100μl TMB。将底物显色5分钟，然后加入50μl H2SO4(0.3M)。在450nm处通过吸收分析结果。通过Graphpad Prism 7.02分析结果，并通过非线性回归曲线拟合来测定Kd(nM)。结合亲和力在表2中列出。
表2。通过ELISA测定的抗VWF纳米抗体-mUPA融合构建体与VWF的结合亲和力。
构建体 K<sub>d</sub>(nM) 标准偏差
sVWF-mUPA 0.03055 0.02491
D3-mUPA 0.3279 0.2005
A12-mUPA 12.84 6.571
R2-mUPA 1039010 1798731
在球状或开放性VWF存在下的纤溶酶原激活
VWF是微血栓形成的支架。它也具有依赖于蛋白质构象的纤溶酶(原)结合特性(Tersteeg等，2014，同上)。VWF在剪切应力下(以及在固定在微量滴定板上的过程中-参见先前实验)展开。这可以通过与小分子利托菌素保温来模拟。我们询问由我们的靶向融合蛋白激活纤溶酶原是否受VWF构象影响。将纳米抗体融合构建体(0.25μg/mL)和VWF(5μg/mL)在0.2％BSA-HBS中稀释。此后，在37℃培育5分钟时添加利托菌素(0.6mg/mL)或缓冲液以分别打开VWF或使其保持球状。此后，添加纤溶酶原(100μg/mL)，然后加入纤溶酶底物(I1390，Bachem；0.2mM)。根据制造商说明书在37℃测量底物转化。为了比较，对于不同的构建体显示了5分钟后转化的底物。在下面的条形图中。数据在Graphpad Prism 7.02中处理并通过单向方差分析。*P<0.05.图5和6显示，与封闭的VWF相比，开放的VWF(在利托菌素存在下)显著缩短了纤溶酶活性发展的时间。
VWF-血小板凝集物的微溶栓。
根据较早描述的方法(Tersteeg等，2014，同上)从柠檬酸化全血中分离血小板。将分离的血小板(200.000/mL)与VWF(5μg/mL)、纤溶酶原(100μg/mL)和聚集抑制剂RGDW(200μM)和伊洛前列素(0.4μg/mL)在37℃在光透射凝集计中保温15分钟。通过加入利托菌素(0.6mg/mL)诱导凝集。此后6分钟，添加纳米抗体-mUPA构建体(1μg/mL)并随时间监测凝集物的裂解(图7)。对于所有样品，确定发生了50％微血栓降解的时间点(分析方法的图形实例如图8A所示)。在Graphpad Prism 7.02中处理结果并通过单向方差分析(*P<0.05)进行分析，如图8B所示。显然，至少通过融合蛋白sVWF-mUPA、D3-mUPA和GP1B17-mUPA靶向纤溶酶原激活可加速微溶栓。
实施例2：流灌注中内皮细胞上VWF-血小板的微溶栓
材料和方法
盖玻片上人血管内皮细胞(Huvecs)培养
将储存在液氮中的Huvecs(0代)在37℃融化并添加到1:10培养基(EBM-2Lonza或Promocel，补充了人脐静脉内皮细胞生长因子EGM2)中并100g旋转5分钟。丢弃上清液，将细胞吸收在5mL培养基中并在37℃在5％CO2的T25烧瓶中培养。第二天，将细胞传代至3xT75烧瓶。在第6天，将细胞在HT缓冲液pH 7.4(HEPES Tyrode缓冲液：10mM HEPES，0.5mM Na2HPO4，145mM NaCl，5mM KCl，1mM MgSO4)中以1：6传代至用1.25％戊二醛预处理的盖玻片。
为了用戊二醛包被盖玻片，盖玻片用去离子水和乙醇冲洗。然后将盖玻片在HCL37％：甲醇(1：1)中保温30分钟，然后用去离子水冲洗5分钟。接下来将盖玻片在氨丙基三乙氧基硅烷：乙醇(1：100)中保温30秒，然后用去离子水和乙醇冲洗。然后将盖玻片干燥并与戊二醛20％：HT缓冲液pH 7.4(1:20)一起保温1小时，然后用去离子水冲洗并将盖玻片储存在乙醇中直至使用。
在使用前，将人脐静脉内皮细胞在盖玻片上培养大约10-15天。
热灭活血浆制备
通过混合两袋血浆(来自octapharma的Ominplasma，两种血型AB批号：C442A9521，袋：X000214223782；X000214223577)来制备热灭活血浆。将200mL这种混合物分装在10个离心管中(各50mL、20mL)并在设定为恰好56℃的水浴中保温30分钟(20mL完全浸没)，然后在中途(15分钟)将离心管混合。保温30分钟后，将离心管盖在冰上并保持在冰上直至离心(注意：将管从冰上移开离心时，该管仍然相当温热)。将管以15000g离心5分钟(不冷却)。合并上清液并保持在冰上直至在1mL试样中等分。
流动室设置
在放置盖玻片之前，将层流灌注室充满预热培养基以从管道中清除所有空气。将入口管切成与90.6μL体积相对应的长度，以便在灌注过程中，进入入口的流体恰好在1分钟后到达灌注室。所使用的注射器直径为16mm(仅适用于Braun 12ml注射器)并且注射器泵设置为每分钟90.6μL，因为这(使用3mm软管)导致300s-1的剪切速率。将人脐静脉内皮细胞盖玻片放在培养基上，在将其真空度设置为10bar下连接，然后将灌注室放置在带有加热模块的倒置显微镜下(Zeiss observer Z.1，Carl Zeiss)，加热模块将灌注室保持在37℃。通过灌注培养基清除所有残留的气泡。
在热灭活血浆中洗涤的血小板
将来自健康自愿志愿者的血液收集到0.1体积3.2％10.9mM柠檬酸三钠中。通过离心(在室温160g 15分钟)获得富血小板血浆(PRP)。将补充有10％(v/v)枸橼酸葡萄糖、85mM柠檬酸三钠、71mM柠檬酸、111mM D-葡萄糖的PRP离心(室温400g 15分钟)并将血小板重悬于HEPES台氏液缓冲液pH 6.5中，该台氏液缓冲液包含0.145M NaCl、5mM KCl、0.5mMNa2HPO4、1mM MgSO4、10mM HEPES和5.5mM D-葡萄糖。在另一个离心步骤(室温400g 15分钟)之前，将10μg/mL PGI2添加到血小板悬液中并将血小板重悬于热灭活血浆中并将血小板计数调整为200G/L的最终计数。
灌注实验设置
将包含200G/L血小板的热灭活血浆(在37℃水浴中预热)分成2mL eppendorf杯(40分钟实验→需要2x 2mL等)。在所有eppendorf杯开始之前，首先添加伊洛前列素(添加8μL(250倍稀释)的0.1mg/mL储液，终浓度0.4μg/mL，Bayer Schering Pharma AG)，然后添加组胺(培养基中的4μL(500倍稀释)的500μM储液，终浓度100μM)。加入伊洛前列素和组胺后立即开始灌流，将进口管从包括培养基的2mL eppendorf杯转移到包含带有血小板的热灭活血浆的eppendorf杯，通过挤压该管以确保不引入空气。当第一个血小板进入流动室(可见变化)后大约1分钟，从frame 1开始实验。7分钟后，通过将所需体积直接吸取到eppendorf杯中并用塑料移液管将其混合，将构建体添加到剩余溶液中(2000-634.2＝1365.8μL，因为此时使用7*90.6＝634μL)，终浓度是10μg/mL。此时，还将构建体添加到其他Eppendorf杯中以确保与血浆的预保温时间保持相等。在灌注过程中，需要通过用塑料移液管逐滴小心地添加血浆来重新装满2mL Eppendorf杯。该重新填充在frame 150、250等处完成，使得可以将由于重新填充而引起的潜在干扰与相应的frame/时间点匹配。在实验过程中，每5秒拍摄一张DIC图像，并在实验结束时对灌注腔中的其他区域制作5张屏幕截图并计数以“血小板串”形式可见的血小板-VWF复合物的数量。
结果
结果显示在图9中，其显示与对照融合蛋白R2-mUPA相比，至少融合蛋白GP1B17-mUPA、sVWF-mUPA和D3-mUPA的靶向纤溶酶原激活加速结合至人脐静脉内皮细胞的血小板-VWF复合物的溶栓。特别地，融合蛋白GP1B17-mUPA快速清除血小板-VWF复合物，这表明特别地，血小板靶向有效清除微血栓中的血小板-VWF复合物。
实施例3：
方法和材料
卡帕珠单抗的生产
克隆
卡帕珠单抗(Cablivi VHH的二价变体)在大肠杆菌中产生并通过HIS-tag亲和色谱纯化。卡帕珠单抗蛋白序列来自其EMA评估报告(EMA/490172/2018；Procedure No：EMEA/H/C/004426/0000)并通过集成DNA技术(IDT)密码子优化工具进行了密码子优化以用于大肠杆菌表达。将N-末端BamHI消化位点和C-末端NotI消化位点加入到构建体中并作为双链DNA片段定购自IDT(SEQ ID NO：40)。
将DNA片段在5mM Tris缓冲液(pH＝8.5)中溶解并在50℃加热20分钟。此后，将DNA片段根据制造商说明书连接到pJET1.2载体中(CloneJET PCR Cloning Kit；ThermoFisher)。根据制造商说明书，通过热休克将连接的产物转化化学感受态大肠杆菌TOP10(Thermo Fisher)。转化的细菌在10mL 2xYT培养基(含100μg/mL氨苄西林)中培养并在37℃生长过夜。根据生产商说明书，通过质粒分离试剂盒(M&N)分离质粒DNA。插入物通过BamHI-HF和NotI-HF(NEB)在Cutsmart缓冲液中消化并在0.7％(w/v)琼脂糖凝胶(1xTBE缓冲液；1：1000gel red)上在130V分离1小时。从凝胶上切下插入物并根据制造商说明书通过PCR&Gel纯化试剂盒(M&N)进行纯化。
将纯化的插入物连接到pTH4.0载体中。pTH4.0载体是编码N末端PelB信号肽、用于纯化目的的His6标签和在BamHI消化位点之后的编码烟草蚀刻病毒(TEV)蛋白酶的切割位点的序列的修饰的pET32a(+)载体。C末端NotI消化后，放置myc标签用于检测目的，然后放置终止密码子(表1)。通过BamHI-HF和NotI-HF消化pTH4.0载体，随后如对片段所述进行纯化。根据制造商说明书，通过T4连接酶在1xT4连接缓冲液中以3：1比例将片段连接到消化的pTH4.0载体中。如前所述，将连接混合物转化TOP10细菌，并将转化的细菌在YT-琼脂板(100μg/mL氨苄西林，2％(w/v)葡萄糖)上在37℃生长过夜。挑取菌落，并使其在10mL 2xYT培养基(包含100μg/mL氨苄西林，2％(w/v)葡萄糖)中生长。如前所述分离质粒DNA。通过Macrogen(SEQ ID NO：41)经由桑格测序证实了DNA序列。
生产
根据生产商说明书，将pTH4.0质粒DNA中的卡帕珠单抗转化化学感受态BL21pLysS大肠杆菌(Thermo)。将转化的细菌在10mL 2xYT培养基(包含100μg/mL氨苄西林、34μg/mL氯霉素和2％(w/v)葡萄糖)中在37℃培养过夜。将过夜的细菌在2xYT培养基(包含100μg/mL氨苄西林、34μg/mL氯霉素和2％(w/v)葡萄糖)中以1:10稀释并在37℃生长3小时。此后，将培养物在2xYT培养基(包含100μg/mL氨苄西林，34μg/mL氯霉素)中以1：100稀释并在37℃生长约3小时。当细菌达到OD600nm＝0.6时，通过添加异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(终浓度0.1mM)诱导蛋白质产生。在24℃过夜生产蛋白质。将细菌以5000xg沉淀15分钟，然后去除上清液。将400毫升培养物中的细菌沉淀重悬于25ml dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(PBS；137mMNaCl，2.7mM KCl，1.5mM KH2PO4，8.2mM Na2HPO4，pH＝7.4)并在-20℃冷冻。
纯化
将冷冻细菌在37℃解冻并通过离心在10000xg沉淀15分钟。将上清液转移至新管中。5mL钴-琼脂糖珠(TALON Superflow，G&E Heatlhcare；50％溶液；)根据制造商说明书用PBS洗涤，添加至上清液中并在室温在辊台上保温2小时。通过离心将TALON以1000xg沉淀5分钟。去除上清液并将沉淀溶解在20mL的PBS中。将TALON洗涤总共重复3次。在最后一步之后，将TALON溶解在8mL的PBS中并加载到PD-10柱中。用过量的PBS冲洗该柱。用咪唑(在PBS中150mM)洗脱该柱并收集0.5mL级分。包含蛋白质的级分被合并并通过3.500MWCO透析膜(3RC管；Spectra/Por.)将其对HEPES缓冲盐水(HBS：10mM HEPES，150mM NaCl，pH＝7.4)透析过夜。通过在DeNovix分光光度计(DS-11)上在280nm处的吸收来测定蛋白质浓度，然后针对其消光系数(通过ProtParam计算)校正浓度。通过用Coomassie Page Blue染色的SDS-PAGE评估纯度。
VWF-血小板凝集物的微溶栓
根据较早描述的方法(Tersteeg等，2014，同上)从柠檬酸化全血中分离血小板。将分离的血小板(200000/μL)与VWF(5μg/mL)、血浆纯化的纤溶酶原(100μg/mL)和聚集抑制剂RGDW(200μM)和伊洛前列素(0.4μg/mL)在光透射凝集计中在37℃保温15分钟。通过加入利托菌素(0.6mg/mL)诱导凝集。此后6分钟，加入纳米抗体-mUPA构建体或卡帕珠单抗并随时间监测凝集物的裂解。对于所有样品，确定发生了50％微血栓降解的时间点(图8A中显示了分析方法的图形实例)。结果在Graphpad Prism7.02中处理并通过单向方差分析(*P<0.05)进行分析，如图10所示。
结果
结果显示在图10中，其中可以清楚地看到，与由卡帕珠单抗诱导的微溶栓相比，至少融合蛋白D3-mUPA和GP1B17-mUPA对纤溶酶原激活的靶向加速了微溶栓。
表3：序列描述
Figure BDA0002799342120000271
Figure BDA0002799342120000281
Figure BDA0002799342120000291
Figure BDA0002799342120000301
Figure BDA0002799342120000311
Figure BDA0002799342120000321
Figure BDA0002799342120000331
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<160> 46
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hmUPA
<400> 1
Leu Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg Phe Lys Ile
1 5 10 15
Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe Ala Ala
20 25 30
Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val Cys Gly Gly
35 40 45
Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His Cys Phe Ile
50 55 60
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65 70 75 80
Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val Glu Asn Leu
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225 230 235 240
Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu Pro Trp Ile
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<213> 人工序列
<220>
<223> mmUPA
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1 5 10 15
Val Gly Gly Glu Phe Thr Glu Val Glu Asn Gln Pro Trp Phe Ala Ala
20 25 30
Ile Tyr Gln Lys Asn Lys Gly Gly Ser Pro Pro Ser Phe Lys Cys Gly
35 40 45
Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ala Ser Ala Ala His Cys Phe
50 55 60
Ile Gln Leu Pro Lys Lys Glu Asn Tyr Val Val Tyr Leu Gly Gln Ser
65 70 75 80
Lys Glu Ser Ser Tyr Asn Pro Gly Glu Met Lys Phe Glu Val Glu Gln
85 90 95
Leu Ile Leu His Glu Tyr Tyr Arg Glu Asp Ser Leu Ala Tyr His Asn
100 105 110
Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Thr Ser Thr Gly Gln Cys Ala Gln
115 120 125
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130 135 140
Ala Pro Phe Gly Ser Asp Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu Ser
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Glu Ser Asp Tyr Leu Tyr Pro Lys Asn Leu Lys Met Ser Val Val Lys
165 170 175
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Ile Asn Tyr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Glu Trp Lys Thr Asp
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Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile Cys Asn Ile Glu Gly
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<213> 人工序列
<220>
<223> 分泌信号肽
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<213> 人工序列
<220>
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<223> 接头
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<213> 人工序列
<220>
<223> sVWF-hmUPA
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Lys Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe
210 215 220
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> D3-hmUPA
<400> 8
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Gly Ser Thr Gly Asp Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
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Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Tyr Thr Ile Ala Val Val Thr
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Ala Met Arg Glu Tyr Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
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Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His Cys
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Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val Glu
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Asn Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His His
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Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala
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Gln Pro Ser Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn
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Asp Pro Gln Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu
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Asn Ser Thr Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val Val
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385 390 395 400
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405 410 415
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420 425 430
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<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2-hmUPA
<400> 9
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1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
20 25 30
Lys Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Glu Phe Glu
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Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Ala Thr Ser Gly His Gly His Tyr Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln
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Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly
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Lys Glu Thr Trp Tyr Lys Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
115 120 125
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Asp Asp Ile Ser Leu Pro Val Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
165 170 175
Gln Val Thr Val Ser Ser Ser Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
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Gly Gly Ser Ala Ala Ala Leu Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu
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Gln Pro Trp Phe Ala Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val
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245 250 255
Ala Thr His Cys Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val
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Tyr Leu Gly Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys
275 280 285
Phe Glu Val Glu Asn Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr
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Leu Ala His His Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu
305 310 315 320
Gly Arg Cys Ala Gln Pro Ser Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro
325 330 335
Ser Met Tyr Asn Asp Pro Gln Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly
340 345 350
Phe Gly Lys Glu Asn Ser Thr Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys
355 360 365
Met Thr Val Val Lys Leu Ile Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His
370 375 380
Tyr Tyr Gly Ser Glu Val Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro
385 390 395 400
Gln Trp Lys Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val
405 410 415
Cys Ser Leu Gln Gly Arg Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly
420 425 430
Arg Gly Cys Ala Leu Lys Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser
435 440 445
His Phe Leu Pro Trp Ile Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu
450 455 460
Ala Leu
465
<210> 10
<211> 464
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A11-hmUPA
<400> 10
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
20 25 30
Lys Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Glu Phe Glu
35 40 45
Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Ala Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg
50 55 60
Leu Val Lys Ala Gly Ala Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
65 70 75 80
Arg Thr Phe Ser Ser Leu Pro Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly
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Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Phe Ile Gly Ser Asp Ser Ser Thr Leu
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115 120 125
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Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Ser Ser Ala Phe Ser Ser Gly Ile
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Tyr Tyr Arg Glu Gly Ser Tyr Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
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Gly Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu
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Cys Ala Gln Pro Ser Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met
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340 345 350
Lys Glu Asn Ser Thr Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr
355 360 365
Val Val Lys Leu Ile Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr
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Gly Ser Glu Val Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp
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Lys Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser
405 410 415
Leu Gln Gly Arg Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly
420 425 430
Cys Ala Leu Lys Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe
435 440 445
Leu Pro Trp Ile Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu
450 455 460
<210> 11
<211> 463
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> A12-hmUPA
<400> 11
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
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Lys Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Glu Phe Glu
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65 70 75 80
Arg Thr Phe Ser Thr Tyr Ala Leu Gly Trp Phe Arg Gln Val Pro Gly
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Lys Gly Arg Glu Phe Ile Ala Val Ile Tyr Trp Arg Asp Gly Ser Ser
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Leu Tyr Ser Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Asp Asn
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130 135 140
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Tyr Ser Ser Arg Gly Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
165 170 175
Val Ser Ser Ser Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Ala Ala Ala Leu Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg
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Phe Lys Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp
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Phe Ala Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val
225 230 235 240
Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His
245 250 255
Cys Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly
260 265 270
Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val
275 280 285
Glu Asn Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His
290 295 300
His Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys
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Ala Gln Pro Ser Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr
325 330 335
Asn Asp Pro Gln Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys
340 345 350
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405 410 415
Gln Gly Arg Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys
420 425 430
Ala Leu Lys Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu
435 440 445
Pro Trp Ile Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu
450 455 460
<210> 12
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GP1B-17 hmUPA
<400> 12
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Gly Ser Thr Gly Asp Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
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Lys Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Glu Phe Glu
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Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
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Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp
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Ile Phe Ser Ile Asn Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys
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Gln Arg Glu Leu Val Ala Ser Ile Thr Arg Gly Gly Asp Pro Trp Tyr
100 105 110
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Gly Ala Lys
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Asn Ala Arg Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu
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165 170 175
Ser Ser Ser Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
180 185 190
Ala Ala Leu Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg Phe
195 200 205
Lys Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe
210 215 220
Ala Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val Cys
225 230 235 240
Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His Cys
245 250 255
Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly Arg
260 265 270
Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val Glu
275 280 285
Asn Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His His
290 295 300
Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala
305 310 315 320
Gln Pro Ser Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn
325 330 335
Asp Pro Gln Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu
340 345 350
Asn Ser Thr Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val Val
355 360 365
Lys Leu Ile Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly Ser
370 375 380
Glu Val Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys Thr
385 390 395 400
Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu Gln
405 410 415
Gly Arg Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala
420 425 430
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435 440 445
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 12A5
<400> 13
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<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 12A5H1
<400> 14
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 15
<211> 467
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> R2-mmUPA
<400> 15
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
20 25 30
Lys Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Glu Phe Glu
35 40 45
Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly
50 55 60
Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
65 70 75 80
Arg Ala Thr Ser Gly His Gly His Tyr Gly Met Gly Trp Phe Arg Gln
85 90 95
Val Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Arg Trp Ser Gly
100 105 110
Lys Glu Thr Trp Tyr Lys Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser
115 120 125
Arg Asp Asn Ala Lys Thr Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys
130 135 140
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Pro Val Arg Val
145 150 155 160
Asp Asp Ile Ser Leu Pro Val Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
165 170 175
Gln Val Thr Val Ser Ser Ser Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Ser Ala Ala Ala Gln Gly Phe Gln Cys Gly Gln Lys Ala Leu
195 200 205
Arg Pro Arg Phe Lys Ile Val Gly Gly Glu Phe Thr Glu Val Glu Asn
210 215 220
Gln Pro Trp Phe Ala Ala Ile Tyr Gln Lys Asn Lys Gly Gly Ser Pro
225 230 235 240
Pro Ser Phe Lys Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ala
245 250 255
Ser Ala Ala His Cys Phe Ile Gln Leu Pro Lys Lys Glu Asn Tyr Val
260 265 270
Val Tyr Leu Gly Gln Ser Lys Glu Ser Ser Tyr Asn Pro Gly Glu Met
275 280 285
Lys Phe Glu Val Glu Gln Leu Ile Leu His Glu Tyr Tyr Arg Glu Asp
290 295 300
Ser Leu Ala Tyr His Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Thr Ser
305 310 315 320
Thr Gly Gln Cys Ala Gln Pro Ser Arg Ser Ile Gln Thr Ile Cys Leu
325 330 335
Pro Pro Arg Phe Thr Asp Ala Pro Phe Gly Ser Asp Cys Glu Ile Thr
340 345 350
Gly Phe Gly Lys Glu Ser Glu Ser Asp Tyr Leu Tyr Pro Lys Asn Leu
355 360 365
Lys Met Ser Val Val Lys Leu Val Ser His Glu Gln Cys Met Gln Pro
370 375 380
His Tyr Tyr Gly Ser Glu Ile Asn Tyr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp
385 390 395 400
Pro Glu Trp Lys Thr Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu
405 410 415
Ile Cys Asn Ile Glu Gly Arg Pro Thr Leu Ser Gly Ile Val Ser Trp
420 425 430
Gly Arg Gly Cys Ala Glu Lys Asn Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val
435 440 445
Ser His Phe Leu Asp Trp Ile Gln Ser His Ile Gly Glu Glu Lys Gly
450 455 460
Leu Ala Phe
465
<210> 16
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人uPA连接肽
<400> 16
Ala Asp Gly Lys Lys Pro Ser Ser Pro Pro Glu Glu Leu Lys Phe Gln
1 5 10 15
Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg Phe Lys
20 25
<210> 17
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人tPA连接肽
<400> 17
Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg
1 5 10
<210> 18
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人纤溶酶原连接肽
<400> 18
Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys Cys Pro
1 5 10 15
Gly Arg
<210> 19
<211> 266
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tPA催化结构域
<400> 19
Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gln Tyr Ser Gln Pro Gln Phe Arg Ile Lys
1 5 10 15
Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile
20 25 30
Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly
35 40 45
Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gln
50 55 60
Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu Gln Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr
85 90 95
Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala
100 105 110
Leu Leu Gln Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gln Glu Ser Ser
115 120 125
Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gln Leu Pro Asp
130 135 140
Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser
145 150 155 160
Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro
165 170 175
Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gln His Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp
180 185 190
Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gln Ala Asn
195 200 205
Leu His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Leu
210 215 220
Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly
225 230 235 240
Cys Gly Gln Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr
245 250 255
Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro
260 265
<210> 20
<211> 459
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPB1-1 - hmUPA
<400> 20
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
20 25 30
Lys Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Glu Phe Glu
35 40 45
Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
50 55 60
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
65 70 75 80
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
85 90 95
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ala Ile Asn Thr Gly Gly Gly Ser Thr
100 105 110
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
115 120 125
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp
130 135 140
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asp Leu Pro Asn Ser Asp Ser Leu
145 150 155 160
Gly Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ser
165 170 175
Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Leu
180 185 190
Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg Phe Lys Ile Ile
195 200 205
Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe Ala Ala Ile
210 215 220
Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val Cys Gly Gly Ser
225 230 235 240
Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His Cys Phe Ile Asp
245 250 255
Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly Arg Ser Arg Leu
260 265 270
Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val Glu Asn Leu Ile
275 280 285
Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His His Asn Asp Ile
290 295 300
Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala Gln Pro Ser
305 310 315 320
Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn Asp Pro Gln
325 330 335
Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu Asn Ser Thr
340 345 350
Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val Val Lys Leu Ile
355 360 365
Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly Ser Glu Val Thr
370 375 380
Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys Thr Asp Ser Cys
385 390 395 400
Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu Gln Gly Arg Met
405 410 415
Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala Leu Lys Asp
420 425 430
Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu Pro Trp Ile Arg
435 440 445
Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu
450 455
<210> 21
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPB1-2-hmUPA
<400> 21
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
20 25 30
Lys Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Glu Phe Glu
35 40 45
Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
50 55 60
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Thr Cys Val Gly Ser Asp
65 70 75 80
Arg Thr Phe Ser Asn Tyr Ser Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly
85 90 95
Lys Glu Arg Gln Phe Val Ser Thr Ile Ser Arg His Gly Thr Ser Thr
100 105 110
Ala Tyr Ala Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
115 120 125
Ala Glu Asn Ile Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp
130 135 140
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Pro His Thr Gln His Tyr Val
145 150 155 160
Arg Val Glu Ser Tyr Gly Val Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
165 170 175
Ser Ser Ser Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
180 185 190
Ala Ala Leu Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg Phe
195 200 205
Lys Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe
210 215 220
Ala Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val Cys
225 230 235 240
Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His Cys
245 250 255
Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly Arg
260 265 270
Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val Glu
275 280 285
Asn Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His His
290 295 300
Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala
305 310 315 320
Gln Pro Ser Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn
325 330 335
Asp Pro Gln Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu
340 345 350
Asn Ser Thr Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val Val
355 360 365
Lys Leu Ile Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly Ser
370 375 380
Glu Val Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys Thr
385 390 395 400
Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu Gln
405 410 415
Gly Arg Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala
420 425 430
Leu Lys Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu Pro
435 440 445
Trp Ile Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu
450 455 460
<210> 22
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPB1-3- hmUPA
<400> 22
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
20 25 30
Lys Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Glu Phe Glu
35 40 45
Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
50 55 60
Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
65 70 75 80
Ser Ile Asn Ser Ile Arg Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Pro Pro Gly
85 90 95
Lys Gln Arg Glu Leu Val Ala Thr Ile Thr Arg Asp Gly Arg Thr Asn
100 105 110
Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly Gln Phe Thr Ile Ser Ile Asp Asn Ala
115 120 125
Arg Asn Thr Val Ser Leu Gln Arg Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr
130 135 140
Ala Val Tyr Tyr Cys Val Ala Asp Trp Gly Glu Gly Tyr Leu Thr Arg
145 150 155 160
Val Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ser Ala Ala Gly
165 170 175
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Leu Lys Phe Gln
180 185 190
Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg Phe Lys Ile Ile Gly Gly Glu
195 200 205
Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe Ala Ala Ile Tyr Arg Arg
210 215 220
His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser
225 230 235 240
Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His Cys Phe Ile Asp Tyr Pro Lys
245 250 255
Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn
260 265 270
Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val Glu Asn Leu Ile Leu His Lys
275 280 285
Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His His Asn Asp Ile Ala Leu Leu
290 295 300
Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala Gln Pro Ser Arg Thr Ile
305 310 315 320
Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn Asp Pro Gln Phe Gly Thr
325 330 335
Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu Asn Ser Thr Asp Tyr Leu
340 345 350
Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val Val Lys Leu Ile Ser His Arg
355 360 365
Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly Ser Glu Val Thr Thr Lys Met
370 375 380
Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp
385 390 395 400
Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu Gln Gly Arg Met Thr Leu Thr
405 410 415
Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala Leu Lys Asp Lys Pro Gly
420 425 430
Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu Pro Trp Ile Arg Ser His Thr
435 440 445
Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu
450 455
<210> 23
<211> 455
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPB1-4 hmUPA
<400> 23
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
20 25 30
Lys Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Glu Phe Glu
35 40 45
Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
50 55 60
Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu
65 70 75 80
Thr Phe Ser Ile Arg Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys
85 90 95
Gln Arg Glu Leu Val Ala Tyr Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr
100 105 110
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Asp Arg
115 120 125
Asn Thr Val Ser Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala
130 135 140
Val Tyr Tyr Cys Tyr Gln Ala Pro Arg Ser Gly Tyr Asp Pro Val Tyr
145 150 155 160
Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ser Ala Ala Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Leu Lys Phe Gln Cys
180 185 190
Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg Phe Lys Ile Ile Gly Gly Glu Phe
195 200 205
Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe Ala Ala Ile Tyr Arg Arg His
210 215 220
Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro
225 230 235 240
Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His Cys Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys
245 250 255
Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr
260 265 270
Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val Glu Asn Leu Ile Leu His Lys Asp
275 280 285
Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His His Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys
290 295 300
Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala Gln Pro Ser Arg Thr Ile Gln
305 310 315 320
Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn Asp Pro Gln Phe Gly Thr Ser
325 330 335
Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu Asn Ser Thr Asp Tyr Leu Tyr
340 345 350
Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val Val Lys Leu Ile Ser His Arg Glu
355 360 365
Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly Ser Glu Val Thr Thr Lys Met Leu
370 375 380
Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser
385 390 395 400
Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu Gln Gly Arg Met Thr Leu Thr Gly
405 410 415
Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala Leu Lys Asp Lys Pro Gly Val
420 425 430
Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu Pro Trp Ile Arg Ser His Thr Lys
435 440 445
Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu
450 455
<210> 24
<211> 458
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPB1-5 hmUPA
<400> 24
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
20 25 30
Lys Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Glu Phe Glu
35 40 45
Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
50 55 60
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Glu
65 70 75 80
Phe Thr Phe Ser Lys His Trp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
85 90 95
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Gly Ile Asn Leu Gly Gly Asp Ser Thr
100 105 110
Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
115 120 125
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Lys Ser Glu Asp
130 135 140
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gly Ala Ser Ser Trp Phe Gly Asp
145 150 155 160
Phe Gly Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Ser Ala
165 170 175
Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Leu Lys
180 185 190
Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg Phe Lys Ile Ile Gly
195 200 205
Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe Ala Ala Ile Tyr
210 215 220
Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val Cys Gly Gly Ser Leu
225 230 235 240
Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His Cys Phe Ile Asp Tyr
245 250 255
Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly Arg Ser Arg Leu Asn
260 265 270
Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val Glu Asn Leu Ile Leu
275 280 285
His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His His Asn Asp Ile Ala
290 295 300
Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala Gln Pro Ser Arg
305 310 315 320
Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn Asp Pro Gln Phe
325 330 335
Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu Asn Ser Thr Asp
340 345 350
Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val Val Lys Leu Ile Ser
355 360 365
His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly Ser Glu Val Thr Thr
370 375 380
Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys Thr Asp Ser Cys Gln
385 390 395 400
Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu Gln Gly Arg Met Thr
405 410 415
Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala Leu Lys Asp Lys
420 425 430
Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu Pro Trp Ile Arg Ser
435 440 445
His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu
450 455
<210> 25
<211> 460
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPB1-6 hmUPA
<400> 25
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
20 25 30
Lys Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Glu Phe Glu
35 40 45
Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
50 55 60
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
65 70 75 80
Phe Thr Phe Ser Asn Phe Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
85 90 95
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Phe Ile Asn Arg Gly Gly Gly Ser Thr
100 105 110
Gly Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
115 120 125
Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp
130 135 140
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Phe Ser Arg Ser Val Pro Pro Tyr
145 150 155 160
Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Lys Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
165 170 175
Ser Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala
180 185 190
Leu Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg Phe Lys Ile
195 200 205
Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe Ala Ala
210 215 220
Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val Cys Gly Gly
225 230 235 240
Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His Cys Phe Ile
245 250 255
Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly Arg Ser Arg
260 265 270
Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val Glu Asn Leu
275 280 285
Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His His Asn Asp
290 295 300
Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala Gln Pro
305 310 315 320
Ser Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn Asp Pro
325 330 335
Gln Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu Asn Ser
340 345 350
Thr Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val Val Lys Leu
355 360 365
Ile Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly Ser Glu Val
370 375 380
Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys Thr Asp Ser
385 390 395 400
Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu Gln Gly Arg
405 410 415
Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala Leu Lys
420 425 430
Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu Pro Trp Ile
435 440 445
Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu
450 455 460
<210> 26
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPB1 - 7 hmUPA
<400> 26
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
20 25 30
Lys Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Glu Phe Glu
35 40 45
Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
50 55 60
Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
65 70 75 80
Arg Val Asp Ser Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg
85 90 95
Glu Phe Val Ala Thr Ile Thr Trp Ser Asp Ser Lys Ile Tyr Tyr Ala
100 105 110
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Gly Glu Arg Ala Lys Asn
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Thr Met Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val
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Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala His Arg Pro Tyr Arg Ser Gly Tyr Tyr Tyr
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Met Gln Ser Arg Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
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Ser Ser Ser Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
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Ala Ala Leu Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg Phe
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Lys Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe
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Ala Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val Cys
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Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His Cys
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Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly Arg
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Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala
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Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala
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<223> GPB1- 15 hmUPA
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180 185 190
Ala Ala Ala Leu Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg
195 200 205
Phe Lys Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp
210 215 220
Phe Ala Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val
225 230 235 240
Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His
245 250 255
Cys Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly
260 265 270
Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val
275 280 285
Glu Asn Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His
290 295 300
His Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys
305 310 315 320
Ala Gln Pro Ser Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr
325 330 335
Asn Asp Pro Gln Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys
340 345 350
Glu Asn Ser Thr Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val
355 360 365
Val Lys Leu Ile Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly
370 375 380
Ser Glu Val Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys
385 390 395 400
Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu
405 410 415
Gln Gly Arg Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys
420 425 430
Ala Leu Lys Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu
435 440 445
Pro Trp Ile Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu
450 455 460
<210> 35
<211> 461
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPB1- 16 hmUPA
<400> 35
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
20 25 30
Lys Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Glu Phe Glu
35 40 45
Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
50 55 60
Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg
65 70 75 80
Arg Thr Phe Ser Asn Tyr Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly
85 90 95
Lys Glu Arg Glu Ser Val Thr Ala Ile Gly Arg Ser Gly Thr Ile Leu
100 105 110
Tyr Ala Asp Ser Met Lys Gly Arg Ile Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
115 120 125
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Pro Asp Asp Thr
130 135 140
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Ser Met Gln Gln Phe Trp
145 150 155 160
Arg Met Glu Tyr Asp Tyr Glu Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser
165 170 175
Ser Ser Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala
180 185 190
Ala Leu Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg Phe Lys
195 200 205
Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe Ala
210 215 220
Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val Cys Gly
225 230 235 240
Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His Cys Phe
245 250 255
Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly Arg Ser
260 265 270
Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val Glu Asn
275 280 285
Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His His Asn
290 295 300
Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala Gln
305 310 315 320
Pro Ser Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn Asp
325 330 335
Pro Gln Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu Asn
340 345 350
Ser Thr Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val Val Lys
355 360 365
Leu Ile Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly Ser Glu
370 375 380
Val Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys Thr Asp
385 390 395 400
Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu Gln Gly
405 410 415
Arg Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala Leu
420 425 430
Lys Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu Pro Trp
435 440 445
Ile Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu
450 455 460
<210> 36
<211> 462
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPB1- 19 hmUPA
<400> 36
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
20 25 30
Lys Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Glu Phe Glu
35 40 45
Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
50 55 60
Leu Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
65 70 75 80
Arg Thr Phe Gly Ser Tyr Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly
85 90 95
Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Ile Gly Arg Ser Gly Thr Thr Tyr
100 105 110
Tyr Leu Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
115 120 125
Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr
130 135 140
Ala Val Tyr Tyr Cys Gly Ala Ser Leu Lys Gly Thr Val Leu Gly Ile
145 150 155 160
Ala Arg Tyr Glu Tyr Asp Val Arg Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val
165 170 175
Ser Ser Ser Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala
180 185 190
Ala Ala Leu Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg Phe
195 200 205
Lys Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe
210 215 220
Ala Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val Cys
225 230 235 240
Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His Cys
245 250 255
Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly Arg
260 265 270
Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val Glu
275 280 285
Asn Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His His
290 295 300
Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala
305 310 315 320
Gln Pro Ser Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn
325 330 335
Asp Pro Gln Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu
340 345 350
Asn Ser Thr Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val Val
355 360 365
Lys Leu Ile Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly Ser
370 375 380
Glu Val Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys Thr
385 390 395 400
Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu Gln
405 410 415
Gly Arg Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala
420 425 430
Leu Lys Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu Pro
435 440 445
Trp Ile Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu
450 455 460
<210> 37
<211> 465
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GPB1- 20 hmUPA
<400> 37
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
20 25 30
Lys Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Glu Phe Glu
35 40 45
Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Val Gln Ala Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
65 70 75 80
Arg Thr Leu Ser Ser Leu Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly
85 90 95
Lys Glu Arg Glu Phe Val Ala Ala Asp Arg Arg Asn Gly Gly Tyr Thr
100 105 110
Val Val Ala Asp Tyr Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Phe
115 120 125
Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Ser Asp Arg Thr
145 150 155 160
Met Ser Leu Arg Ser Thr Asp Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln
165 170 175
Val Thr Val Ser Ser Ser Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
180 185 190
Gly Ser Ala Ala Ala Leu Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg
195 200 205
Pro Arg Phe Lys Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln
210 215 220
Pro Trp Phe Ala Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr
225 230 235 240
Tyr Val Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala
245 250 255
Thr His Cys Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr
260 265 270
Leu Gly Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe
275 280 285
Glu Val Glu Asn Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu
290 295 300
Ala His His Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly
305 310 315 320
Arg Cys Ala Gln Pro Ser Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser
325 330 335
Met Tyr Asn Asp Pro Gln Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe
340 345 350
Gly Lys Glu Asn Ser Thr Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met
355 360 365
Thr Val Val Lys Leu Ile Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr
370 375 380
Tyr Gly Ser Glu Val Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln
385 390 395 400
Trp Lys Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys
405 410 415
Ser Leu Gln Gly Arg Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg
420 425 430
Gly Cys Ala Leu Lys Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His
435 440 445
Phe Leu Pro Trp Ile Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala
450 455 460
Leu
465
<210> 38
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 38
Lys Glu Ser Gly Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu Ala Gln Phe Arg Ser
1 5 10 15
Leu Asp
<210> 39
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 柔性接头
<400> 39
Glu Gly Lys Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu Ser Lys Ser Thr
1 5 10
<210> 40
<211> 791
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dsDNA
<400> 40
ggatccgaag tccagcttgt agaatcagga ggaggccttg tccagccagg tggtagcctt 60
cgtctgtcgt gtgctgcttc gggccgcaca ttttcgtata accctatggg ttggtttcgc 120
caagcacccg gcaagggacg cgagttggtg gccgcgatta gtcgtacggg tggttccacc 180
tactacccgg attcagtgga aggacgcttt acgattagcc gtgataacgc gaagcgtatg 240
gtctacttac agatgaatag cttgcgcgcg gaagacaccg cggtatacta ttgtgctgca 300
gcaggagtcc gtgctgagga tggacgcgtc cgcacgttac ctagtgagta tacattctgg 360
ggccagggca cccaagttac cgtatccagt gcagcagcgg aagtacaact ggtcgaatct 420
ggaggaggac ttgtacaacc agggggttcc ttacgtttgt catgtgcggc aagtgggcgc 480
acatttagtt acaaccctat gggctggttc cgtcaagccc cgggaaaagg gcgcgaactt 540
gtagccgcca tttcgcgtac agggggaagt acctattacc cggactcagt agagggacgc 600
ttcacgattt ctcgtgacaa cgcaaagcgc atggtttatc tgcaaatgaa tagtttacgc 660
gccgaagata cagcagttta ctattgcgcc gcagctggag tccgcgccga agacggccgt 720
gtacgcacct tgccttctga atacactttt tggggtcaag gaacacaggt gaccgtgtca 780
tctgcggccg c 791
<210> 41
<211> 320
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> pTH4.0蛋白序列中的卡帕珠单抗
<400> 41
Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala
1 5 10 15
Ala Gln Pro Ala Met Ala Gln Ser Gly His His His His His His His
20 25 30
His Asp Tyr Asp Ile Pro Ser Ser Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser
35 40 45
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
50 55 60
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn
65 70 75 80
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
85 90 95
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
100 105 110
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
115 120 125
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
130 135 140
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro
145 150 155 160
Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
165 170 175
Ala Ala Ala Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
180 185 190
Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe
195 200 205
Ser Tyr Asn Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg
210 215 220
Glu Leu Val Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro
225 230 235 240
Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg
245 250 255
Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val
260 265 270
Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg
275 280 285
Thr Leu Pro Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr
290 295 300
Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
305 310 315 320
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 42
taatacgact cactataggg 20
<210> 43
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物Rv
<400> 43
gctagttatt gctcagcgg 19
<210> 44
<211> 466
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Cablivi-hmUPA
<400> 44
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
20 25 30
Lys Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Glu Phe Glu
35 40 45
Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
50 55 60
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
65 70 75 80
Arg Thr Phe Ser Tyr Asn Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly
85 90 95
Lys Gly Arg Glu Leu Val Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr
100 105 110
Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
115 120 125
Ala Lys Arg Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
130 135 140
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly
145 150 155 160
Arg Val Arg Thr Leu Pro Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr
165 170 175
Gln Val Thr Val Ser Ser Ser Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Ser Ala Ala Ala Leu Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu
195 200 205
Arg Pro Arg Phe Lys Ile Ile Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn
210 215 220
Gln Pro Trp Phe Ala Ala Ile Tyr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val
225 230 235 240
Thr Tyr Val Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser
245 250 255
Ala Thr His Cys Phe Ile Asp Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val
260 265 270
Tyr Leu Gly Arg Ser Arg Leu Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys
275 280 285
Phe Glu Val Glu Asn Leu Ile Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr
290 295 300
Leu Ala His His Asn Asp Ile Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu
305 310 315 320
Gly Arg Cys Ala Gln Pro Ser Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro
325 330 335
Ser Met Tyr Asn Asp Pro Gln Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly
340 345 350
Phe Gly Lys Glu Asn Ser Thr Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys
355 360 365
Met Thr Val Val Lys Leu Ile Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His
370 375 380
Tyr Tyr Gly Ser Glu Val Thr Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro
385 390 395 400
Gln Trp Lys Thr Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val
405 410 415
Cys Ser Leu Gln Gly Arg Met Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly
420 425 430
Arg Gly Cys Ala Leu Lys Asp Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser
435 440 445
His Phe Leu Pro Trp Ile Arg Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu
450 455 460
Ala Leu
465
<210> 45
<211> 297
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Cablivi-mmUPA
<400> 45
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu
20 25 30
Lys Gly Ser Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Glu Phe Glu
35 40 45
Asn Leu Tyr Phe Gln Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly
50 55 60
Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly
65 70 75 80
Arg Thr Phe Ser Tyr Asn Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly
85 90 95
Lys Gly Arg Glu Leu Val Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr
100 105 110
Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn
115 120 125
Ala Lys Arg Met Val Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp
130 135 140
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly
145 150 155 160
Arg Val Arg Thr Leu Pro Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr
165 170 175
Gln Val Thr Val Ser Ser Ser Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Ser Ala Ala Ala Gln Gly Phe Gln Cys Gly Gln Lys Ala Leu
195 200 205
Arg Pro Arg Phe Lys Ile Val Gly Gly Glu Phe Thr Glu Val Glu Asn
210 215 220
Gln Pro Trp Phe Ala Ala Ile Tyr Gln Lys Asn Lys Gly Gly Ser Pro
225 230 235 240
Pro Ser Phe Lys Cys Gly Gly Ser Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ala
245 250 255
Ser Ala Ala His Cys Phe Ile Gln Leu Pro Lys Lys Glu Asn Tyr Val
260 265 270
Val Tyr Leu Gly Gln Ser Lys Glu Ser Ser Tyr Asn Pro Gly Glu Met
275 280 285
Lys Phe Glu Val Glu Gln Leu Ile Leu
290 295
<210> 46
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Cablivi VHH
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Tyr Asn
20 25 30
Pro Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Arg Thr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Arg Met Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Gly Val Arg Ala Glu Asp Gly Arg Val Arg Thr Leu Pro
100 105 110
Ser Glu Tyr Thr Phe Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125

Claims (20)

1.一种融合蛋白，其包含纤溶酶原激活物和用于将所述纤溶酶原激活物靶向到包含VWF和血小板中的至少一种的血栓的位点的靶向剂，其中所述靶向剂不是仅特异性结合血小板上激活形式的GPIIb/IIIa受体的靶向剂，所述融合蛋白用于预防或治疗微血管血栓形成的用途。
2.权利要求1的用于所述用途的融合蛋白，其中所述靶向剂特异性结合VWF、血小板以及激活或损伤的血管内皮中的至少一种。
3.权利要求1或2的用于所述用途的融合蛋白，其中所述靶向剂是以下靶向剂中的一或多种：
a)至少结合未折叠的VWF的靶向剂，其中优选地，相比于球状VWF，所述靶向剂优先结合未折叠的VWF；
b)结合VWF的D3结构域的靶向剂；
c)结合血小板上GP1B受体的靶向剂；
d)结合血小板上整联蛋白αIIb/βIII的靶向剂；
e)结合优先由激活的内皮表达的受体的靶向剂，其中所述受体优选选自：E-选择蛋白、P-选择蛋白、uPAR、c1q受体、激肽B1受体、纤溶酶原受体KT(PLGR-KT)、内皮蛋白C受体、血栓调节蛋白、n-钙粘蛋白、ICAM-1和VCAM-1；和，
f)结合激活或损伤的内皮的膜标记物的靶向剂，其中所述膜标记物是阴离子磷脂、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺中的一或多种。
4.前述权利要求任一项的用于所述用途的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含多于一种靶向剂。
5.前述权利要求任一项的用于所述用途的融合蛋白，其中所述靶向剂包括以下中的至少一种：
a)特异性结合VWF、血小板和激活的血管内皮中的至少一种的抗体可变结构域；和，
b)来自天然结合VWF、血小板和激活或损伤的血管内皮的蛋白质的结合结构域，所述结合结构域特异性结合VWF、血小板和激活或损伤的血管内皮中的至少一种。
6.权利要求5的用于所述用途的融合蛋白，其中所述抗体可变结构域是VHH，优选人源化VHH，或其中所述结合结构域包含选自以下的结合结构域：
i)来自VWF的血小板GP1B受体结合A1结构域；
ii)VWF结合结构域，其来自ADAMTS13、因子XII、因子H(补体调节物)、纤溶酶原和因子VIII中的一种；和，
iii)膜结合结构域，其选自维生素K依赖性羧化/γ-羧基谷氨酸(GLA)结构域、来自因子V的C结构域和来自因子VIII的C结构域。
7.前述权利要求任一项的用于所述用途的融合蛋白，其中所述纤溶酶原激活物包含组织纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)、纤溶酶原、链激酶或葡激酶的蛋白酶结构域，
其中优选地，所述纤溶酶原激活物还包含连接肽的至少含半胱氨酸的部分，所述连接肽天然地存在于纤溶酶原激活物中，在其蛋白酶结构域上游紧邻其蛋白酶结构域，
其中所述融合蛋白任选地包含连接所述靶向剂和所述纤溶酶原激活物的接头氨基酸序列。
8.权利要求7的用于所述用途的融合蛋白，其中所述融合蛋白按N至C末端顺序包含：
a)一或多种根据权利要求1-6中任一项所定义的靶向剂，其中，任选地，所述靶向剂通过接头氨基酸序列连接；
b)任选存在的接头氨基酸序列；和，
c)权利要求7所定义的纤溶酶原激活物或纤溶酶原来源的蛋白酶结构域。
9.前述权利要求任一项的用于所述用途的融合蛋白，其中在选自以下的疾病或状况中预防或治疗所述微血管血栓形成：获得性或遗传性血栓性血小板减少性紫癜(TTP)，补体介导的血栓性微血管病，溶血性尿毒症综合征，抗磷脂抗体综合征，非闭塞性血栓，闭塞性血栓形成，动脉血栓形成，急性冠状动脉闭塞，外周动脉闭塞性疾病，由冠状动脉旁路搭桥术、冠状动脉瓣膜置换术和冠状动脉介入治疗(如血管成形术、支架术或粥样斑块切除术)引起的再狭窄和失调，血管成形术、粥样斑块切除术或动脉支架置入术后的增生，血管系统内闭塞综合征或病变动脉缺乏通畅性，短暂性大脑缺血发作，不稳定型或稳定型心绞痛，脑梗死，HELLP综合征，颈动脉内膜切除术，颈动脉狭窄，重症肢体缺血，心源性栓塞，外周血管疾病，再狭窄，镰状细胞病和心肌梗塞。
10.一种用于治疗微血管血栓形成或降低其风险的方法，其中所述方法包括向需要其的受试者施用有效量的根据权利要求1-8任一项的融合蛋白的步骤。
11.权利要求10的方法，其中在选自以下的疾病或状况中治疗所述微血管血栓形成或降低其发生的风险：获得性或遗传性血栓性血小板减少性紫癜(TTP)，补体介导的血栓性微血管病，溶血性尿毒症综合征，抗磷脂抗体综合征，非闭塞性血栓，闭塞性血栓形成，动脉血栓形成，急性冠状动脉闭塞，外周动脉闭塞性疾病，由冠状动脉旁路搭桥术、冠状动脉瓣膜置换术和冠状动脉介入治疗(如血管成形术、支架术或粥样斑块切除术)引起的再狭窄和失调，血管成形术、粥样斑块切除术或动脉支架置入术后的增生，血管系统内闭塞综合征或病变动脉缺乏通畅性，短暂性大脑缺血发作，不稳定型或稳定型心绞痛，脑梗死，HELLP综合征，颈动脉内膜切除术，颈动脉狭窄，重症肢体缺血，心源性栓塞，外周血管疾病，再狭窄，镰状细胞病和心肌梗塞。
12.一种融合蛋白，其包含纤溶酶原激活物和用于将所述纤溶酶原激活物靶向到包含VWF和血小板中的至少一种的血栓的位点的靶向剂，其中所述靶向剂是以下靶向剂中的一或多种：
a)至少结合未折叠的VWF的靶向剂，其中优选地，相比于球状VWF，所述靶向剂优先结合未折叠的VWF；
b)结合VWF的D3结构域的靶向剂；
c)结合在血小板上的整联蛋白αIIb/βIII的靶向剂；
d)结合优先由激活的内皮表达的受体的靶向剂，其中所述受体优选选自：E-选择蛋白、P-选择蛋白、uPAR、c1q受体、激肽B1受体、纤溶酶原受体KT(PLGR-KT)、内皮蛋白C受体、血栓调节蛋白、n-钙粘蛋白、ICAM-1和VCAM-1；和，
e)结合激活或损伤的内皮的膜标记物的靶向剂，其中所述膜标记物是阴离子磷脂、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺中的一或多种。
13.权利要求12的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含多于一种靶向剂。
14.权利要求12或13的融合蛋白，其中所述靶向剂包括以下至少一种：
a)特异性结合VWF、血小板和激活的血管内皮中的至少一种的抗体可变结构域；和，
b)来自天然结合VWF、血小板和激活或损伤的血管内皮的蛋白质的结合结构域，所述结合结构域特异性结合VWF、血小板和激活或损伤的血管内皮中的至少一种。
15.权利要求14的融合蛋白，其中所述抗体可变结构域是VHH，优选人源化VHH，或其中所述结合结构域包含选自以下的结合结构域：
i)VWF结合结构域，其来自ADAMTS13、因子XII、因子H(补体调节物)、纤溶酶原和因子VIII中的一种；和，
ii)膜结合结构域，其选自维生素K依赖性羧化/γ-羧基谷氨酸(GLA)结构域、来自因子V的C结构域和来自因子VIII的C结构域。
16.权利要求12-15任一项的融合蛋白，其中所述纤溶酶原激活物包含组织纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)、纤溶酶原、链激酶或葡激酶的蛋白酶结构域，
其中优选地，所述纤溶酶原激活物还包含连接肽的至少含半胱氨酸的部分，所述连接肽天然存在于纤溶酶原激活物中，在其蛋白酶结构域上游紧邻其蛋白酶结构域，
以及其中所述融合蛋白任选地包含连接所述靶向剂和所述纤溶酶原激活物的接头氨基酸序列。
17.权利要求16的融合蛋白，其中所述融合蛋白按N至C末端顺序包含：
a)权利要求12-14任一项所定义的一或多种靶向剂，其中，任选地，所述靶向剂通过接头氨基酸序列连接；
b)任选存在的接头氨基酸序列；和，
c)权利要求16所定义的纤溶酶原激活物或纤溶酶原来源的蛋白酶结构域。
18.一种核酸分子，其包含编码权利要求12-17任一项所定义的融合蛋白的核苷酸序列，其中编码所述融合蛋白的所述核苷酸序列优选还包含编码可操作地连接所述融合蛋白的信号肽的核苷酸序列，且其中核酸分子优选还包含有助于所述融合蛋白表达的调控元件，所述调控元件可操作地连接到所述核苷酸序列。
19.一种基因治疗载体，其包含权利要求18的核酸分子。
20.一种药物组合物，其包含权利要求12-18任一项的融合蛋白或权利要求19的基因治疗载体和药学上可接受的赋形剂。
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