CN113521293B - 血栓靶向的血小板递药系统及其应用 - Google Patents

血栓靶向的血小板递药系统及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种血栓靶向的血小板递药系统，包括：血小板、嵌合在血小板膜表面的蛋白以及直接或间接加载在血小板内的抗血小板物质。本发明还涉及血栓靶向的血小板递药系统的制备方法及其应用。

Description

血栓靶向的血小板递药系统及其应用
技术领域
本发明涉及药学及生物学领域，具体涉及一种血栓靶向的血小板递药系统及其应用。
背景技术
缺血性卒中、心肌梗死、肺血栓等血栓性疾病严重危及人类健康和生命，已成为继肿瘤之后又一个高死亡率疾病。溶栓药物经历几十年的发展在特异性、半衰期、溶栓效率等方面都有了明显的提高，然而依然不能避免出血等副作用的发生。因此，需要进行更多的研究来解决溶栓药物所涉及的有效性和潜在不良反应等问题。
基于纳米技术的发展和对血栓病理的深入认知，主动靶向溶栓制剂技术在延长溶栓药物的半衰期、提高溶栓效果、降低出血副作用等方面有了显著的提高。但纳米制剂依然存在一些局限性：外源性短肽分子作为靶向配体可能激活免疫系统、靶向效率不高、临床疗效不理想等。因此，亟需寻找一种更为高效、安全的溶栓药物靶向递送系统。
血小板作为血栓发生发展的主要参与者，能动态感知血管的病理状态，第一时间趋化至血栓部位，其作为溶栓药物载体的优势：1)利用内源性血小板作为递送载体可有效地规避巨噬细胞系统的识别和吞噬；2)利用其天然的血栓部位趋向性将溶栓药物主动递送至血栓部位，提高药物在血栓部位的浓度，减少游离药物血中暴露量。因此，血小板作为溶栓药物递送系统有望实现高效安全抗血栓的治疗目标。
本发明首次提供了一种新型的血栓靶向的血小板递药系统，其包括血小板、嵌合在血小板膜表面的蛋白以及以直接或间接方式加载到血小板内的抗血小板物质。本发明以血小板为药物递送载体，将药物主动靶向递送至血栓部位，提高了药物在病灶部位浓度，增强了血栓治疗效果。本发明方法简便、快捷、通用，为细胞载药提供了一个新的技术平台，具有非常广阔的应用前景。
发明内容
一方面，本发明提供了一种血栓靶向的血小板递药系统，包括：血小板、嵌合在血小板膜表面的蛋白以及直接或间接加载在血小板内的抗血小板物质。
在优选的实施方式中，嵌合在血小板膜表面的蛋白通过脂质复合物偶联而嵌合在血小板膜表面，所述脂质复合物具有下式：
R-聚乙二醇-脂质分子
其中，R为反应基团，选自酸酐、酰氯、醛基、马来酰亚胺或琥珀酰亚胺酯；
其中，脂质分子选自：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、1,2-十六烷基-3-甘油-磷酸乙醇胺或胆固醇；以及
其中，聚乙二醇选自数均分子量为1000-6000道尔顿的聚乙二醇。
在更优选的实施方式中，脂质复合物是DSPE-PEG3400-NHS。
在优选的实施方式中，嵌合在血小板膜表面的蛋白是溶栓酶，所述溶栓酶选自：蚓激酶、尿激酶、链激酶、组织纤溶酶或它们的组合。
在优选的实施方式中，直接或间接加载在血小板内的抗血小板物质选自：精氨酸、阿斯匹林、氯吡格雷、双嘧达莫或它们的组合。
在优选的实施方式中，血小板递药系统中嵌合在血小板膜表面的蛋白的装载量为30-45μg/6×109个血小板。
在优选的实施方式中，血小板递药系统中抗血小板物质的装载量为40-70 μg/6×109个血小板。
在优选的实施方式中，间接加载在血小板内的抗血小板物质是通过封装抗血小板物质的粒径为10-200nm的纳米载体实现的。在优选的实施方式中，所述纳米载体选自：介孔二氧化硅纳米粒、金纳米粒、金纳米棒、磁性纳米粒、脂质体、胶束、纳米粒、纳米囊、树枝状聚合物中的任意一种或几种。
另一方面，本发明还涉及制备血栓靶向的血小板递药系统的方法，包括以下步骤：
a)提供血小板；
b)将需要嵌合在血小板膜表面的蛋白与脂质复合物共价连接，获得蛋白-脂质复合物；
c)将血小板、蛋白-脂质复合物和抗血小板物质混合，得到血栓靶向的血小板递药系统。
附图说明
为了更完整地理解本发明，下面结合附图提供以下说明。
图1显示了尿激酶-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺复合物的制备与表征。其中，图A为尿激酶和尿激酶-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺复合物的 SDS-PAGE凝胶电泳图片，可见，尿激酶结合PEG-DSPE后分子量增加，其凝胶图谱和尿激酶相比明显上移；图B为尿激酶和尿激酶-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺复合物的酶活性，尿激酶经PEG-DSPE修饰后未见活性有明显改变。
图2显示了NO@uPA/PLT的尿激酶和精氨酸载药量和包载率。其中，图A 为NO@uPA/PLT的尿激酶载药量和包载率；在血小板数量为6×109个条件下，尿激酶载药量在尿激酶投药量为1500μg条件下达到最大值，为38.55±4.73 μg/6×109个血小板，此时包载率为2.57±0.32％；图B为NO@uPA/PLT的精氨酸载药量和包载率；在血小板数量为6×109个条件下，精氨酸载药量在精氨酸投药量1000μg时达到最大值，为62.00±5.29μg/6×109个血小板，此时装载效率为6.20±0.53％。
图3显示了NO@uPA/PLT的免疫蛋白印迹和NO生成表征。其中，图A为免疫蛋白印迹实验证明NO@uPA/PLT的尿激酶负载，血小板在34kDa没有明显的蛋白印迹信号，而NO@uPA/PLT在相应位置具有明显的蛋白印迹；图B为NO荧光探针标记的NO@uPA/PLT共聚焦图片，uPA/PLT未见NO的绿色荧光信号， NO@uPA/PLT可见明显的绿色荧光，7h内绿色荧光信号显著。
图4显示了，NO@uPA/PLT在高精氨酸投药量时(1500μg/6×109个血小板) 被激活。其中，图A为马尔文粒径仪表征激活后NO@uPA/PLT的粒径分布变化，出现粒径大于10μm的聚集体；图B为DiD标记的NO@uPA/PLT悬液出现粒径大于20μm的血小板聚集体；图C为扫描电镜表征激活后NO@uPA/PLT聚集体的形成。
图5显示了NO@uPA/PLT的形态和药物共载表征。其中，图A为血小板和 NO@uPA/PLT的透射电镜和扫描电镜图片；图B为NO@uPA/PLT的荧光标记共聚焦图片，绿色标记一氧化氮，红色标记尿激酶，具有明显的共定位结果。
图6显示了NO@uPA/PLT激活状态的表征。其中，图A为激活状态 NO@uPA/PLT以及血小板微粒(PMPs)的透射电镜图片；图B为激活状态 NO@uPA/PLT以及PMPs的扫描电镜图片；图C为静息和激活状态NO@uPA/PLT 的马尔文粒径变化表征。电镜下静息状态NO@uPA/PLT呈现类梭形结构，粒径在1-2μm。激活状态NO@uPA/PLT的形态变成不规则状，细胞伪足生成，且分泌粒径大小不均一的囊泡，马尔文粒径仪结果显示，原有静态条件下1-2μm的分布峰消失，激活后出现200-500nm的PMPs分布峰和10000nm的血小板聚集峰。
图7显示了NO@uPA/PLT的体外血栓靶向性。其中，图A为静息和激活状态 uPA/PLT对荧光标记纤维蛋白原的结合效果，结果表明激活uPA/PLT的纤维蛋白黏附能力是未激活的12倍，图B为静息和激活状态NO@uPA/PLT对荧光标记纤维蛋白原的结合效果；图C为静息和激活状态uPA/PLT、NO@uPA/PLT对荧光标记纤维蛋白原的结合的半定量结果，结果表明激活uPA/PLT组的荧光强度是未激活的12倍，激活NO@uPA/PLT组的荧光强度是未激活的16倍，证明 uPA/PLT和NO@uPA/PLT被激活后显著增强的纤维蛋白黏附性能。图D为uPA/PLT、NO@uPA/PLT对未活化和活化的HUVEC黏附的共聚焦图片；活化 HUVEC组具有较强的红色荧光信号(NO@uPA/PLT标记为红色)，证明 NO@uPA/PLT显著增强的活化HUVEC黏附效果。
图8显示了NO@uPA/PLT的体外溶栓效果。其中，图A为光浊度法评估静态条件下NO@uPA/PLT对血浆凝块的溶解效果；图B为荧光法评估动态条件下 NO@uPA/PLT对荧光标记血浆凝块的溶解效果(0-35min)；图C为B图0-10min 的放大图；实验结果表明尿激酶的血小板膜嵌合(NO@uPA/PLT)提高了血栓降解效率。
图9显示了NO@uPA/PLT的肺栓塞靶向效果。其中，图A为正常鼠和肺栓塞模型鼠尾静脉注射uPA/PLT、NO@uPA/PLT 30分钟后，不同脏器中uPA/PLT、 NO@uPA/PLT的荧光分布结果；图B为uPA/PLT、NO@uPA/PLT在正常肺组织和凝血酶诱导的栓塞肺组织中荧光半定量结果。由图可见，uPA/PLT和 NO@uPA/PLT组在肺栓塞小鼠肺部观察到荧光信号的显著增强，其荧光强度分别是正常小鼠的6.8倍(uPA/PLT)和5.9倍(NO@uPA/PLT)，证明NO@uPA/PLT 良好的肺栓塞小鼠肺部靶向性。
图10显示了NO@uPA/PLT的肺栓塞溶栓效果。其中，图A为NO@uPA/PLT 的肺栓塞溶栓效果。图B为图A的荧光半定量结果。由图可见，给药2h后，uPA (0.5mg/kg)组肺的荧光强度未见明显降低，和PBS组没有统计学差异； uPA/PLT(0.5mg/kg)组和NO@uPA/PLT(0.5mg/kg)组肺的荧光强度可见显著下降，和uPA(5mg/kg)组没有统计学差异，说明NO@uPA/PLT显著增强的肺部血栓溶解效果。
图11显示了NO@uPA/PLT的抑制颈动脉血栓形成效果。其中，图A为抑制颈动脉血栓形成实验示意图；图B为相应时间点损伤颈动脉的荧光代表性图像；图C为图B各实验组荧光均一化数据随时间的变化。由图可见， NO@uPA/PLT(0.5mg/kg)组在前10min荧光强度少量增加，随后荧光强度缓慢降低直至趋于稳定，血栓荧光强度与uPA(5mg/kg)组没有统计学差异，表明 NO@uPA/PLT较好的颈动脉血栓形成抑制能力。
图12显示了NO@uPA/PLT溶解颈动脉血栓和避免颈动脉的再栓塞。其中，图A为颈动脉血栓溶栓实验示意图；图B为相应时间点损伤颈动脉的荧光代表性图像；图C为图B各实验组荧光均一化数据随时间的变化；图D为避免颈动脉再栓塞实验示意图；图E为三氯化铁再损伤后颈动脉的荧光代表性图像；图F为图 E的荧光均一化数据比较结果。由图可见，uPA/PLT(0.5mg/kg)组和 NO@uPA/PLT(0.5mg/kg)组在60min时血管内血栓团块基本消失，显示出较好的血栓溶解效果。但是，uPA/PLT(0.5mg/kg)组在二次诱导后血管内血栓团块再次形成，说明其无抑制血栓复发的作用，而NO@uPA/PLT(0.5mg/kg) 组在二次诱导后，未见血管内形成明显的血栓，说明NO@uPA/PLT因其负载精氨酸具有良好的抑制血栓复发的效果。
图13显示了NO@uPA/PLT的体内安全性。其中，图A、B、C、D、E分别为各实验组的纤维蛋白原浓度、凝血酶原时间、凝血酶时间、活化部分凝血活酶时间、尾部出血时间；图F为各实验组心、肝、脾、肺、肾、脑的组织H&E 切片代表性图像。uPA的血小板膜嵌合显著降低小鼠尾部出血时间，降低对凝血系统的副作用。小鼠各主要脏器H&E切片结果未见明显的脏器毒性，结果表明NO@uPA/PLTs良好的体内安全性。
具体实施方式
本文说明书中所用的“一个”或“一种”可指一个/种或多个/种。如本文中权利要求中所用，当于词语“包含”联用时，该词“一个”或“一种”可指一种/个或多于一种/个。本文中所用的“另一种/个”可指至少第二种/个或更多种/个。在特定实施方式中，本发明的方面可“基本由”或“由”例如本发明的一种或多种要素或步骤“组成”。本发明的一些实施方式可能由一个或多个本发明的要素、方法步骤和/或方法组成或基本由其组成。考虑到本文所述的任意方法或组合物可相对于本文所述的任意其他方法或组合物实施。
本领域的技术人员应理解，所揭示的观念和具体实施方式可以方便地被用作改进或设计实现本发明的同样目的的其他结构的基础。本领域的技术人员还应认识到这种等价结构没有偏离所附权利要求书中提出的本发明的精神和范围，被认为是本发明的特征的新特征，对于其构建和方法的操作，还有其他对象和优点等，可以结合以下详细的说明和附图一起，得到更好的理解。但应理解，各附图仅仅是为了示意和说明，并不旨在对本发明进行限定。
本发明提供了一种血栓靶向的血小板递药系统，其可将蛋白溶栓药物和/ 或抗血小板药物递送至血栓部位，提高药物在血栓部位的浓度，减少游离药物在血中暴露量，在增强治疗效果同时预防溶栓治疗后血栓复发，降低出血副作用，克服现有主动靶向溶栓药物递送系统的靶向性能不强和易从血中清除的不足。
在具体的实施方式中，本发明提供的血栓靶向的血小板递药系统包括血小板、嵌合在血小板膜表面的蛋白以及直接或间接方式加载到血小板内的抗血小板物质。
本发明的血栓靶向的血小板递药系统在体外靶向性评价和体外溶栓实验中表现优异。而且，这种血小板递送系统还在体内抑制血栓形成。同时，通过两次三氯化铁损伤颈动脉实验证明，本发明的血小板递药系统(例如， NO@uPA/PLT)能够避免三氯化铁损伤颈动脉的再栓塞。在体内安全性实验中，通过测定凝血参数(活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间、纤维蛋白原浓度、凝血酶时间)、尾部出血时间，未见明显的脏器毒性，显示出良好的体内安全性。
嵌合在血小板膜表面的蛋白
本发明所述血栓靶向的血小板递药系统中嵌合在血小板膜表面的蛋白可以是任何能够嵌合在血小板膜表面的具有血栓溶解效果的蛋白。在具体的实施方式中，本发明所述血栓靶向的血小板递药系统中嵌合在血小板膜表面的蛋白是溶栓酶。
溶栓酶也称为纤维蛋白水解酶，它可使纤维蛋白分解成纤维蛋白降解物，而使纤维蛋白溶解，同时能够快速有效的启动机体纤溶系统溶解血栓，是机体内血纤维蛋白溶酶原最有效的活化剂。上世纪60年代起，链激酶(溶栓酶的一种)作为药物用来治疗心肌梗塞，它是第一个用于临床的溶栓药物蛋白酶。
在优选的实施方式中，溶栓酶包括但不限于：蚓激酶、尿激酶、链激酶、组织纤溶酶等。
在本发明的一些实施方式中，所述血栓靶向的血小板递药系统中基于每 6×109个血小板的溶栓酶的投药量为500-3000μg。在更优选的实施方式中，所述血栓靶向的血小板递药系统中基于每6×109个血小板的溶栓酶的投药量为 1000-2000μg。在一个具体的实施方式中，所述血栓靶向的血小板递药系统中基于每6×109个血小板的溶栓酶的投药量为1500μg。
在本发明的一些实施方式中，所述血栓靶向的血小板递药系统中溶栓酶的装载量为20-50μg/6×109个血小板。在更优选的实施方式中，所述血栓靶向的血小板递药系统中溶栓酶的装载量为30-45μg/6×109个血小板。在一个具体的实施方式中，所述血栓靶向的血小板递药系统中溶栓酶的装载量为35-40μg/6×109个血小板。
在本发明的一些实施方式中，所述血栓靶向的血小板递药系统中溶栓酶的包载率为2-4％。在更优选的实施方式中，所述血栓靶向的血小板递药系统中溶栓酶的包载率为2-3％。
抗血小板物质
本发明所述血小板递药系统包括直接加载到血小板内的抗血小板物质和/ 或间接加载到血小板内的抗血小板物质。
这些抗血小板物质包括但不限于：化学合成药物、天然来源药物以及它们的组合。在具体的实施方式中，这些抗血小板物质选自：精氨酸、阿斯匹林、氯吡格雷、双嘧达莫或它们的组合。
在具体的实施方式中，间接加载的抗血小板物质是指将抗血小板物质(化学合成药物、天然来源药物或其组合)封装在纳米载体内，通过纳米制剂将抗血小板物质荷载到血小板内。
在优选的实施方式中，可以封装抗血小板物质的纳米载体包括但不限于：介孔二氧化硅纳米粒、金纳米粒、金纳米棒、磁性纳米粒、脂质体、胶束、纳米粒、纳米囊、树枝状聚合物中的任意一种或几种。
在优选的实施方式中，纳米制剂为的粒径为2-2000nm的纳米制剂，优选的纳米制剂粒径为10-200nm。
在本发明的一些实施方式中，所述血栓靶向的血小板递药系统中基于每 6×109个血小板的抗血小板物质的投药量为200-2000μg。在更优选的实施方式中，所述血栓靶向的血小板递药系统中基于每6×109个血小板的抗血小板物质的投药量为500-1000μg。
在本发明的一些实施方式中，所述血栓靶向的血小板递药系统中抗血小板物质的装载量为20-70μg/6×109个血小板。在更优选的实施方式中，所述血栓靶向的血小板递药系统中抗血小板物质的装载量为40-70μg/6×109个血小板。在一个具体的实施方式中，所述血栓靶向的血小板递药系统中抗血小板物质的装载量为60-70μg/6×109个血小板。
在本发明的一些实施方式中，所述血栓靶向的血小板递药系统中抗血小板物质的包载率为5-20％。在更优选的实施方式中，所述血栓靶向的血小板递药系统中抗血小板物质的包载率为5-10％。
脂质复合物
本发明提供的血栓靶向的血小板递药系统中，嵌合在血小板膜表面的蛋白是通过与脂质复合物偶联，实现在血小板表面的嵌合。
在一些实施方式中，嵌合在血小板膜表面的蛋白通过侧链的活性基团氨基、巯基、羟基或羧基中的任意一种与脂质复合物偶联。
在具体的实施方式中，脂质复合物具有通式R-聚乙二醇-脂质分子，其中R 为反应基团。
在具体的实施方式中，脂质分子包括但不限于：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、1,2-十六烷基-3-甘油 -磷酸乙醇胺或胆固醇，优选二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺。
在具体的实施方式中，聚乙二醇包括但不限于数均分子量选自1000、2000、 3400、5000、6000道尔顿的聚乙二醇，优选数均分子量为3400道尔顿的聚乙二醇。
在本发明的具体实施方式中，反应基团R包括但不限于：酸酐、酰氯、醛基、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺酯，优选琥珀酰亚胺酯。
Figure RE-GDA0003231088060000091
在一个具体的实施方式中，制备本发明所述血栓靶向的血小板递药系统中采用的脂质复合物是DSPE-PEG3400-NHS。
血小板递药系统
在本发明的一个具体的实施方式中，提供了嵌合尿激酶并负载精氨酸的血小板递送系统(NO@uPA/PLT)。
本发明的NO@uPA/PLT可有效避免巨噬细胞系统的识别和吞噬，同时利用其天然的血栓部位趋向性将溶栓药物和抗血小板药物主动递送至血栓部位，提高药物在血栓部位的浓度，减少游离溶栓药物在血中暴露量；在溶栓同时，血栓原位递送的抗血小板药物(一氧化氮，由精氨酸在血小板内一氧化氮合成酶的作用下生成)抑制血管损伤处血小板的激活和聚集，预防溶栓治疗后血栓复发，增强治疗效果和用药安全性。
本发明还涉及制备血栓靶向的血小板递药系统的方法，包括以下步骤：
a)提供血小板；
b)将需要嵌合在血小板膜表面的蛋白(例如，uPA)与脂质复合物(例如， DSPE-PEG3400-NHS)共价连接，获得蛋白-脂质复合物(例如， uPA-PEG3400-DSPE)；
c)将血小板、蛋白-脂质复合物和抗血小板物质(例如，精氨酸)混合，得到血栓靶向的血小板递药系统(例如，NO@uPA/PLT)。
实施例
通过结合具体实施例对本发明提供的实施方式作详细说明，但本发明不局限于下述范围。
纳入下列实施例以显示本发明的优选实施方式。本领域的普通技术人员应理解，根据代表本发明人所发现技术的实施例中公开的技术能很好地实施本发明，从而可将其视为实施本发明的优选模式。但是，本领域技术人员根据本公开应理解，在不偏离本发明精神和范围的前提下，可对所公开的具体实施方式进行许多变化，同时仍能获得相同或类似的结果。
本申请所使用的血小板来源于活体小鼠全血提取，但已有离体获取血小板的技术。血小板是巨核细胞产生的无核细胞。已有临床前研究证明可以体外大规模获取临床使用级别的血小板，人胚胎干细胞、人造血干细胞、人诱导多能干细胞已被用于大规模产生人巨核细胞，从而为大规模生产血小板提供了一种新颖的方法。
实施例1：NO@uPA/PLT的制备和表征
1)血小板的提取
采用肝素钠(美仑生物技术有限公司)粉末抗凝处理的塑封管(规格为10 mL)获取雄性ICR小鼠(上海西普尔-必凯试验动物有限公司)全血，差速离心得血小板。具体来说，200g/min离心12min，取上清得富血小板血浆，再次 200g/min离心纯化富血小板血浆，500g/min离心12min弃上清得到血小板沉淀。
2)尿激酶-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺的制备
于PBS中配制1mL 2mg/mL的尿激酶(uPA，上海阿拉丁生化科技有限公司)溶液，在uPA溶液中加入uPA 1.5倍摩尔量的琥珀酰亚胺酯-聚乙二醇- 二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE-PEG3400-NHS，10mg/mL，溶于二甲亚砜，上海拓旸生物科技有限公司)，过夜搅拌反应即得尿激酶-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(uPA-PEG-DSPE)。
SDS-PAGE凝胶电泳(凝胶电泳仪(BIO-RAD，美国))证明尿激酶-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺的成功制备，结果见附图1A。图1A为尿激酶和尿激酶-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺复合物的SDS-PAGE凝胶电泳图片，可见，尿激酶结合PEG-DSPE后分子量增加，其凝胶图谱和尿激酶相比明显上移。尿激酶底物(S-2444，上海船夫生物科技有限公司)法测定尿激酶- 聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和尿激酶的活性，结果见附图1B。图1B为尿激酶和尿激酶-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺复合物的酶活性，尿激酶经PEG-DSPE修饰后未见活性有明显改变。
3)NO@uPA/PLT的制备
获取雄性ICR小鼠(上海西普尔-必凯试验动物有限公司)全血于塑封管 (规格为10mL)中，室温放置1h使其自然凝固。随后5000rpm/min离心15min，取上清即得小鼠血清。取上述制备得到的小鼠血清1mL，添加PBS 4mL，混匀即得20％小鼠血清。
实施例1的1)所得的血小板沉淀用PBS悬浮，取上述1mL血小板悬液 (含血小板数6×109个)添加尿激酶-聚乙二醇(数均分子量3400)-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺溶液(1mL，2mg/mL，溶于PBS)和精氨酸溶液(1mL，1 mg/mL，溶于PBS，上海阿拉丁生化科技有限公司)，同时添加ICR小鼠血清 1mL，低速搅拌后500g/min，10min离心除去未包载的尿激酶-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和精氨酸，即得NO@uPA/PLT。
NO@uPA/PLT的尿激酶和精氨酸载药量和包载率或包载率结果见附图 2A-2B和表1-2。
图2A显示NO@uPA/PLT的尿激酶载药量和包载率：在血小板数量为 6×109个条件下，尿激酶载药量在尿激酶投药量为1500μg条件下达到最大值，为38.55±4.73μg/6×109个血小板，此时包载率为2.57±0.32％。图2B为 NO@uPA/PLT的精氨酸载药量和包载率：在血小板数量为6×109个条件下，随着精氨酸投药量的增加，载药量增加；在精氨酸投药量1000μg时为62.00±5.29 μg/6×109个血小板，此时装载效率为6.20±0.53％。
进一步增加投药量，当精氨酸投药量为1500μg/6×109个血小板时，透射电镜和扫描电镜检测发现血小板形态改变，由静息状态下的类梭形结构变为多触角的无规则状，表明血小板在无其它刺激因素(如凝血酶)作用下，仅因为精氨酸投药量增加导致制备时即被激活；马尔文粒径仪表征粒径可见出现大量粒径大于10μm的聚集体，DiD标记的NO@uPA/PLT悬液(制备过程见实施例4)出现粒径大于20μm的血小板聚集体，因而此条件下制备的NO@uPA/PLT 不能满足于静脉注射给药的要求(附图4)。该结果说明，NO@uPA/PLT制备时精氨酸的投药量必须在合适的范围内。
选取精氨酸载药量为62.00±5.29μg/6×109个血小板(此时投药量为1000 μg/6×109个血小板)。选取尿激酶载药量为38.55±4.73μg/6×109个血小板，精氨酸载药量为62.00±5.29μg/6×109个血小板的NO@uPA/PLT进行后续考察。
表1为不同尿激酶投药量下的尿激酶载药量和包载率。表2为不同精氨酸投药量下的精氨酸载药量和包载率。
表1
Figure RE-GDA0003231088060000121
表2
Figure RE-GDA0003231088060000122
图3A为免疫蛋白印迹实验证明NO@uPA/PLT的尿激酶负载，血小板在 34kDa没有明显的蛋白印迹信号，而NO@uPA/PLT在相应位置具有明显的蛋白印迹。
精氨酸经内吞作用载入血小板，构建的NO@uPA/PLT会在血小板内一氧化氮合成酶的作用下由精氨酸生成NO。NO荧光探针(DAF-FM DA， Sigma-Aldrich)证明NO@uPA/PLT内NO的产生，结果见附图3B。图3B为 NO荧光探针标记的NO@uPA/PLT共聚焦图片，uPA/PLT未见NO的绿色荧光信号，NO@uPA/PLT可见明显的绿色荧光，7h内绿色荧光信号显著。
4)NO@uPA/PLT的表征
于1mL NO@uPA/PLT悬液中加入凝血酶(5μL，40U/mL，溶于PBS，美仑生物技术有限公司)使其产生激活状态的NO@uPA/PLT，扫描电镜(FEI， NovaNanoSEM450)、透射电镜(日立场发射透射电子显微镜，JEM-2100F)、激光共聚焦显微镜(Leica SP8)、马尔文粒径仪(Zetasizer Nano-ZS激光粒度仪)进行静息(NO@uPA/PLT悬液中未加凝血酶)和激活状态NO@uPA/PLT 的表征，结果见附图5A-B和6A-C，NO@uPA/PLT被凝血酶激活后能够分泌粒径在50-200nm的载药血小板微粒。
图5A为血小板和NO@uPA/PLT的透射电镜和扫描电镜图片。图5B为 NO@uPA/PLT的荧光标记共聚焦图片，绿色标记一氧化氮，红色标记尿激酶，具有明显的共定位结果。
图6A为激活状态NO@uPA/PLT以及血小板微粒(PMPs)的透射电镜图片。图6B为激活状态NO@uPA/PLT以及PMPs的扫描电镜图片。图6C为静息和激活状态NO@uPA/PLT的马尔文粒径变化表征。电镜下静息状态 NO@uPA/PLT呈现类梭形结构，粒径在1-2μm。激活状态NO@uPA/PLT的形态变成不规则状，细胞伪足生成，且分泌粒径大小不均一的囊泡，马尔文粒径仪结果显示，原有静态条件下1-2μm的分布峰消失，激活后出现200-500nm 的PMPs分布峰和10000nm的血小板聚集峰。
综合上述结果可以看出，尿激酶-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺和精氨酸与血小板悬液孵育制备NO@uPA/PLT。SDS-PAGE凝胶电泳证明尿激酶- 聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺复合物的成功制备；精氨酸经内吞作用载入血小板后会在血小板内一氧化氮合成酶的作用下生成NO，NO荧光探针 (DAF-FM DA)用来特异性表征NO@uPA/PLT生成的NO。透射电镜、扫描电镜、马尔文粒径仪表征NO@uPA/PLT的粒径及其凝血酶诱导激活后粒径的变化；共聚焦荧光图像证明NO@uPA/PLT的成功制备。
实施例2：NO@uPA/PLT的体外靶向性
本实验制备荧光标记的纤维蛋白原，用荧光标记人脐静脉内皮细胞 (HUVEC)，通过细胞流式实验证明NO@uPA/PLT对纤维蛋白原和HUVEC 的特异亲和力。
1)考察静息和激活状态NO@uPA/PLT(或uPA/PLT)对荧光标记纤维蛋白原的结合
称量7mg纤维蛋白原(美仑生物技术有限公司)溶解于1mL 0.1M NaHCO3溶液中。超声促进纤维蛋白原溶解，完全溶解后加入三倍摩尔量的 Cy5-NHS(10mg/mL，溶于二甲亚砜，美仑生物技术有限公司)。室温反应2h，透析(透析液选用0.1M NaHCO3)。透析后4℃避光保存备用。
于NO@uPA/PLT悬液中加入凝血酶(5μL，40U/mL，溶于PBS，美仑生物技术有限公司)使其产生激活状态的NO@uPA/PLT，uPA/PLT的激活状态制备同NO@uPA/PLT。将Cy5标记的纤维蛋白原与静息和激活状态的 NO@uPA/PLT(或uPA/PLT)孵育，500g/分钟离心8分钟除去未黏附的纤维蛋白原，贝克曼流式细胞分析仪测定静息和激活状态NO@uPA/PLT(或 uPA/PLT)对荧光标记纤维蛋白原的结合。结果如附图7A-C所示，激活状态 NO@uPA/PLT(或uPA/PLT)对纤维蛋白原具有较强的黏附效果。
图7A为静息和激活状态uPA/PLT对荧光标记纤维蛋白原的结合效果。图 7B为静息和激活状态NO@uPA/PLT对荧光标记纤维蛋白原的结合效果。图7C 为静息和激活状态uPA/PLT、NO@uPA/PLT对荧光标记纤维蛋白原的结合的半定量结果，结果表明，激活uPA/PLT组的荧光强度是未激活的12倍，激活 NO@uPA/PLT组的荧光强度是未激活的16倍，证明uPA/PLT和NO@uPA/PLT 被激活后显著增强的纤维蛋白黏附性能。
2)考察NO@uPA/PLT(或uPA/PLT)对活化和未活化HUVEC的黏附效果
将人脐静脉内皮细胞(
Figure RE-GDA0003231088060000141
中科院上海生科院细胞库)在人内皮细胞生长培养基(DMEM培养液，Gibco)中传代培养。用50ng/mL的THF-α(赛默飞世尔科技有限公司)刺激HUVEC细胞24小时使HUVEC活化。将活化或未活化的HUVEC细胞用4％多聚甲醛(武汉赛维尔生物科技有限公司)在4℃固定30分钟，添加WGA-Alexa 488(赛默飞世尔科技有限公司)标记HUVEC，并用20％小鼠血清(制备过程见实施例1项3))封闭30分钟。然后将其分别与NO@uPA/PLT(或uPA/PLT)在4℃孵育1小时。然后用冷的 PBS(4℃预先冷藏)洗涤细胞三次，共聚焦(Leica SP8)观察NO@uPA/PLT (或uPA/PLT)对活化和未活化HUVEC的黏附效果。结果如附图7D所示， NO@uPA/PLT、uPA/PLT对活化的HUVEC具有较好的黏附效果。
图7D为uPA/PLT、NO@uPA/PLT对未活化和活化的HUVEC黏附的共聚焦图片；活化HUVEC组具有较强的红色荧光信号(NO@uPA/PLT标记为红色)，证明NO@uPA/PLT显著增强的活化HUVEC黏附效果。
实施例3：NO@uPA/PLT的体外溶栓效果
本实验制备血浆凝块，评估静态条件下NO@uPA/PLT的凝块溶解效果；通过平行板流动小室评估动态条件下NO@uPA/PLT的凝块溶解效果。
1)静态条件下NO@uPA/PLT对血浆凝块的溶解效果
将富含血小板的血浆(制备过程见实施例1的1))加入到96孔板中，每孔150μL。然后加入30μL凝血酶(美仑生物技术有限公司)溶液(3U/mL)， 10μL氯化钙溶液(0.5mol/L)，20μL ADP(美仑生物技术有限公司)溶液(5 μmol/L)37℃下孵育30分钟制备富血小板血浆凝块。然后加入uPA(10μg/mL、 30μg/mL)、uPA/PLT(10μg/mL)、NO@uPA/PLT(10μg/mL)在37℃条件下孵育，每隔1分钟测定每孔在650nm处的吸光度。结果见附图8A。图8A 为光浊度法评估静态条件下NO@uPA/PLT对血浆凝块的溶解效果。
2)动态条件下NO@uPA/PLT对血浆凝块的溶解效果
取150μL Cy5标记的纤维蛋白原溶液(制备过程见实施例2中1))、30 μL凝血酶溶液(3U/mL)、10μL氯化钙溶液(0.5mol/L)、20μL ADP溶液 (5μmol/L)混合，涂布在酸洗干燥后的载玻片上，37℃下孵育30分钟制备荧光标记的纤维蛋白凝块。采用平行板流动小室系统(Cat#:31-010，Glycotech) 以20dyne/cm2的剪切力分别输注uPA(10μg/mL)、uPA(30μg/mL)、uPA/PLTs(10 μg/mL)。评估35min内倒置荧光显微镜视野内荧光的变化情况，并用Image J 软件进行相应时间点纤维蛋白图片的荧光半定量处理，以初始时刻纤维蛋白图片的荧光强度为基准获取血栓残留随时间的变化曲线。结果见附图8B、C。图 7B为荧光法评估动态条件下NO@uPA/PLT对荧光标记血浆凝块的溶解效果 (0-35min)。图8C为图8B的0-10min的放大图。实验结果表明尿激酶的血小板膜嵌合(NO@uPA/PLT)提高了血栓降解效率。
实施例4：NO@uPA/PLT的肺栓塞靶向效果
取2mL实施例1中制备的NO@uPA/PLT悬液(或uPA/PLT悬液)，添加DiD(10μL，10mg/mL，溶于二甲亚砜，美仑生物技术有限公司)37℃、 100rpm/min，低速搅拌30min后500g/10min离心除去未插入血小板的荧光素 DiD，再次用2mL PBS重悬即得DiD标记的NO@uPA/PLT悬液(或uPA/PLT 悬液)。
取ICR雄性小鼠，尾静脉注射凝血酶溶液(250U/kg，美仑生物技术有限公司)制备肺栓塞动物模型。肺栓塞模型形成后尾静脉注射DiD(美仑生物技术有限公司)荧光标记的uPA/PLT(0.5mg/kg)、NO@uPA/PLT(0.5mg/kg)。随后将上述实验小鼠麻醉，取肺组织，小动物荧光活体(Caliper Perkinelmer) 于640/660nm的激发发射检测肺部的荧光强度。结果见附图9A、B。
图9A为正常鼠和肺栓塞模型鼠尾静脉注射uPA/PLT、NO@uPA/PLT 30 分钟后，不同脏器中uPA/PLT、NO@uPA/PLT的荧光分布结果。图9B为 uPA/PLT、NO@uPA/PLT在正常肺组织和凝血酶诱导的栓塞肺组织中荧光半定量结果。由图可见，uPA/PLT和NO@uPA/PLT组在肺栓塞小鼠肺部观察到荧光信号的显著增强，其荧光强度分别是正常小鼠的6.8倍(uPA/PLT)和5.9倍 (NO@uPA/PLT)，证明NO@uPA/PLT良好的肺栓塞小鼠肺部靶向性。
实施例5：NO@uPA/PLT的肺栓塞溶栓效果
取ICR雄性小鼠，尾静脉注射Cy5标记的纤维蛋白原溶液(5mg/kg，制备过程见实施例2项1))，5分钟后尾静脉注射凝血酶溶液(250U/kg)制备荧光标记的肺栓塞动物模型。肺栓塞模型形成后尾静脉注射uPA(0.5mg/kg、 5mg/kg)、uPA/PLT(0.5mg/kg)、NO@uPA/PLT(0.5mg/kg)。给药两小时后将上述实验小鼠麻醉，取肺组织，小动物荧光活体(CaliperPerkinelmer)于 640/660nm的激发发射检测肺部纤维蛋白凝块的荧光，并进行荧光强度的半定量处理。结果见附图10A、B。
图10A为NO@uPA/PLT的肺栓塞溶栓效果。图10B为图10A的荧光半定量结果。由图可见，给药2h后，uPA(0.5mg/kg)组肺的荧光强度未见明显降低，和PBS组没有统计学差异；uPA/PLT(0.5mg/kg)组和NO@uPA/PLT(0.5 mg/kg)组肺的荧光强度可见显著下降，和uPA高剂量(5mg/kg)组没有统计学差异，说明NO@uPA/PLT显著增强的肺部血栓溶解效果。
实施例6：NO@uPA/PLT的抑制颈动脉血栓形成效果
取ICR雄性小鼠，腹腔注射戊巴比妥溶液(150μL，1％，国药集团化学试剂有限公司)麻醉ICR小鼠。在血栓形成前将罗丹明6G溶液(200μL，1mmol/L，溶于PBS，Sigma-Aldrich)注入右侧颈静脉以标记血小板。注射罗丹明溶液5 分钟后，三氯化铁(7.5％，国药集团化学试剂有限公司)损伤颈动脉制备血栓模型(制备过程：将滤纸剪成2mm×2mm的小片，用7.5％FeCl3溶液饱和，敷在小鼠颈动脉上1min，生理盐水冲洗，颈动脉血栓形成)。血栓形成5分钟前，尾静脉注射uPA(0.5mg/kg、5mg/kg)、uPA/PLT(0.5mg/kg)、NO@uPA/PLT(0.5mg/kg)。体式荧光显微镜(奥林巴斯体式显微镜)实时观察颈动脉损伤处血栓荧光的变化，并用Image J软件进行相应时间点颈动脉血栓的荧光半定量处理。结果见附图11。
图11A为抑制颈动脉血栓形成实验示意图；图10B为相应时间点损伤颈动脉的荧光代表性图像；图11C为图B各实验组荧光均一化数据随时间的变化。由图可见，NO@uPA/PLT(0.5mg/kg)组在前10min荧光强度少量增加，随后荧光强度缓慢降低直至趋于稳定，血栓荧光强度与uPA高剂量(5mg/kg)组没有统计学差异，表明NO@uPA/PLT较好的颈动脉血栓形成抑制能力。
实施例7：NO@uPA/PLT对颈动脉血栓的溶栓和防止再栓塞效果
取ICR雄性小鼠，在血栓形成前将罗丹明6G溶液注入右侧颈静脉以标记血小板(实验过程同实施例6)。注射罗丹明溶液5分钟后，三氯化铁损伤颈动脉制备血栓模型(制备过程同实施例6)。血栓形成5分钟后，尾静脉注射 uPA(0.5mg/kg、5mg/kg)、uPA/PLT(0.5mg/kg)、NO@uPA/PLT(0.5mg/kg)。第一次三氯化铁损伤颈动脉1.5小时后，再次用三氯化铁损伤颈动脉，考察 NO@uPA/PLT抑制血栓复发的效果。体式荧光显微镜实时观察颈动脉损伤处血栓荧光的变化，并用Image J软件进行相应时间点颈动脉血栓的荧光半定量处理。结果见附图12。
图12A为颈动脉血栓溶栓实验示意图；图12B为相应时间点损伤颈动脉的荧光代表性图像；图12C为图12B各实验组荧光均一化数据随时间的变化；图 12D为避免颈动脉再栓塞实验示意图；图12E为三氯化铁再损伤后颈动脉的荧光代表性图像；图12F为图12E的荧光均一化数据比较结果。由图可见， uPA/PLT(0.5mg/kg)组和NO@uPA/PLT(0.5mg/kg)组在60min时血管内血栓团块基本消失，显示出较好的血栓溶解效果。但是，uPA/PLT(0.5mg/kg)组在二次诱导后血管内血栓团块再次形成，说明其无抑制血栓复发的作用，而 NO@uPA/PLT(0.5mg/kg)组在二次诱导后，未见血管内形成明显的血栓，说明 NO@uPA/PLT不仅具有良好的溶栓效果，同时因其负载精氨酸而具有良好的抑制血栓复发的效果，可显著提高血栓的治疗效果。
实施例8：NO@uPA/PLT的体内安全性
本实验通过测定凝血参数(活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间、纤维蛋白原浓度、凝血酶时间)、尾部出血时间考察NO@uPA/PLT对凝血系统的副作用；组织切片考察NO@uPA/PLT对心、肝、脾、肺、肾、脑的副作用。
取ICR雄性小鼠，每隔一天尾静脉注射uPA(0.5mg/kg、5mg/kg)、uPA/PLT (0.5mg/kg)、NO@uPA/PLT(0.5mg/kg)，持续给药三次。采用全自动生化分析仪(Chemray420，深圳雷杜生命科技)测定纤维蛋白原浓度、凝血酶原时间、凝血酶时间、活化部分凝血活酶时间、尾部出血时间考察各制剂对凝血系统的副作用；取心、肝、脾、肺、肾、脑组织，H&E切片考察各制剂造成的组织损伤。结果见附图13。
图13A、13B、13C、13D、13E分别为各实验组的纤维蛋白原浓度、凝血酶原时间、凝血酶时间、活化部分凝血活酶时间、尾部出血时间；图13F为各实验组心、肝、脾、肺、肾、脑的组织H&E切片代表性图像。尿激酶的血小板膜嵌合显著降低小鼠尾部出血时间，降低对凝血系统的副作用。小鼠各主要脏器H&E切片结果未见明显的脏器毒性，结果表明NO@uPA/PLT良好的体内安全性。
本发明的实验结果表明：尿激酶-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺复合物可有效插入血小板膜上；精氨酸也能被血小板内吞载入血小板，并在血小板内一氧化氮合成酶的作用下生成一氧化氮；肺栓塞和颈动脉血栓溶栓实验证明，NO@uPA/PLT能利用血小板对天然血栓部位趋向性将溶栓药物和抗血小板药物主动递送至血栓部位，被凝血酶诱导激活，分泌50-200nm的载药血小板微粒，提高血栓部位的药物浓度，降低药物用量，减小与剂量相关的全身出血等副作用，抑制溶栓治疗后血栓复发，提高治疗效果。
尽管已经详细描述了本发明和其优势，但是应当理解，可对本文进行各种变化、替代和改变而不背离所附权利要求所定义的本发明的精神和范围。此外，本申请的范围不是旨在限制于本说明书所述的形式、手段、方法和步骤的过程、机器、制造、组合物的具体实施方式。本领域普通技术人员通过本发明的内容将容易理解，现存或后续开发的与本文所述相应实施方式实施基本相同功能或实现基本相同结果的形式、手段、方法、或步骤的过程、机器、制造、组合物均可使用。因此，所附权利要求旨在将形式、手段、方法、或步骤的过程、机器、制造、组合物包括在其范围内。

Claims (10)

1.一种血栓靶向的血小板递药系统，包括：
血小板，
嵌合在血小板膜表面的蛋白，所述嵌合在血小板膜表面的蛋白是溶栓酶，所述溶栓酶选自：蚓激酶、尿激酶、链激酶、组织纤溶酶或它们的组合，以及
直接或间接加载在血小板内的抗血小板物质，所述直接或间接加载在血小板内的抗血小板物质选自：精氨酸、阿斯匹林、氯吡格雷、双嘧达莫或它们的组合。
2.如权利要求1所述的血小板递药系统，其特征在于，所述嵌合在血小板膜表面的蛋白通过脂质复合物偶联而嵌合在血小板膜表面，所述脂质复合物具有下式：
R-聚乙二醇-脂质分子
其中，R为反应基团，选自酸酐、酰氯、醛基、马来酰亚胺或琥珀酰亚胺酯；
其中，脂质分子选自：二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺、1,2-十六烷基-3-甘油-磷酸乙醇胺或胆固醇；以及
其中，聚乙二醇选自数均分子量为1000-6000道尔顿的聚乙二醇。
3.如权利要求2所述的血小板递药系统，其特征在于，所述脂质复合物是DSPE-PEG3400-NHS。
4.如权利要求1-3中任一项所述的血小板递药系统，其特征在于，所述血小板递药系统中嵌合在血小板膜表面的蛋白的装载量为30-45 μg/6
Figure DEST_PATH_IMAGE002
109个血小板。
5.如权利要求1-3中任一项所述的血小板递药系统，其特征在于，所述血小板递药系统中抗血小板物质的装载量为40-70 μg/6
Figure DEST_PATH_IMAGE002A
109个血小板。
6.如权利要求1所述的血小板递药系统，其特征在于，间接加载在血小板内的抗血小板物质是通过封装血小板物质的粒径为10-200nm的纳米载体实现的。
7.如权利要求6所述的血小板递药系统，其特征在于，所述纳米载体是纳米粒。
8.如权利要求6所述的血小板递药系统，其特征在于，所述纳米载体是纳米囊。
9.如权利要求6所述的血小板递药系统，其特征在于，所述纳米载体选自：介孔二氧化硅纳米粒、金纳米粒、金纳米棒、磁性纳米粒、脂质体、胶束、树枝状聚合物中的任意一种或几种。
10.一种制备如权利要求1所述的血小板递药系统的方法，包括以下步骤：
a）提供血小板；
b) 将需要嵌合在血小板膜表面的蛋白与脂质复合物共价连接，获得蛋白-脂质复合物；
c) 将血小板、蛋白-脂质复合物和抗血小板物质混合，得到血栓靶向的血小板递药系统。
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