CN112370446B - Egcg药物组合物及其制备方法和在卵巢功能保护中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种EGCG药物组合物及其制备方法和在卵巢功能保护中的应用，属于生物学和药学技术领域。该EGCG药物组合物包括含有效剂量的EGCG与载体，载体为一种或两种及两种以上混合物的辅料，其中每100质量份EGCG药物组合物中包含50～90质量份的EGCG，余量为辅料。对受试哺乳动物体给予上述EGCG药物组合物，给药量为：受试哺乳动物体每日每千克给予80～120mg EGCG，且连续给药12～16天，构建化疗性卵巢损伤模型后继续连续给药12～16天，检测受试哺乳动物体的卵巢功能。结果发现该EGCG药物组合物有利于减轻化疗药物所致的卵巢损伤，同时对受试哺乳动物体的重要脏器也没有产生不良反应。

Description

EGCG药物组合物及其制备方法和在卵巢功能保护中的应用

技术领域

本发明涉及一种卵巢功能保护措施，属于生物学和药学技术领域，具体地涉及一种EGCG药物组合物及其制备方法和在卵巢功能保护中的应用。

背景技术

卵巢功能和生育能力是影响女性生存质量的重要因素。现有影响女性卵巢功能的因素有：年龄、遗传、免疫、医源性、感染性、环境、行为学、社会心理等多种因素。其中化疗导致的医源性卵巢损伤在临床常见且急需得到改善。

全球范围内，癌症的发生率仍逐年升高。和全球数据相同，在我国，乳腺癌位居女性癌症发病率的第一位。根据年龄划分后，0～14岁儿童和青春期女性最常见的癌症是白血病，其发病率为30.1％；15～24岁青少年和青年女性最常见肿瘤为淋巴瘤，其发病率为21.0％。随着医疗技术的飞速发展，癌症患者的生存率得到显著提升，女性肿瘤幸存患者将面临关乎生命尊严的生存质量问题：卵巢功能和生育能力。

化疗性卵巢损伤是肿瘤幸存患者卵巢功能和生育力丧失的主要原因，化疗引起的卵巢损伤有逐年增多的趋势，主要有以下原因：首先肿瘤患者年轻化和人均寿命的增加使得人群可患肿瘤的时间跨度增大；其次，肿瘤的发病率总体在逐渐增高；同时，随着医疗技术的发展，肿瘤的病死率逐渐下降，这就使得，会有越来越多患者达到临床治愈的标准，当他们生存的需求得到满足之后，生活质量的需求就会慢慢得到重视；因此越来越多的女性患者在接受化疗后饱受卵巢功能下降甚至绝经不育的痛苦。

卵巢功能和生育能力是影响女性生活质量的重要原因之一。同时，女性绝经后，体内雌激素水平降低，和雌激素有关的衰老相关疾病如心血管疾病、骨质疏松等的发病率显著上升，化疗药物导致的过早绝经会对女性进入中老年后的工作和生活产生严重不良影响。因此，女性肿瘤幸存患者生存质量急需得到改善。

现有卵巢功能保护措施主要有胚胎、卵母细胞和卵巢组织冻存，GnRHa等。但这些措施多为有创操作，适用范围窄，可能耽误化疗，效果尚存争议；且主要适用于生育力保护，无法长期维持卵巢功能。

药物性防治策略具有很大潜力，但新药的研发耗时费力，从老药或者天然化合物中寻找潜在药物成为趋势。EGCG作为绿茶的主要活性成分，已被证明在抗氧化、抗癌、免疫调节、抗炎、抗衰老等多个方面发挥作用。因此EGCG能否作为一种新型药物用于减轻化疗药物所致卵巢损伤是当前亟需解决的技术问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明公开了一种EGCG药物组合物及其制备方法和在卵巢功能保护中的应用。其中，含有效剂量的EGCG药物组合物有利于减轻化疗药物所致的卵巢损伤，同时对受试哺乳动物体的重要脏器也没有产生不良反应，故其作为新型药物在减轻化疗药物所致卵巢损伤中发挥重要作用。

为实现上述技术目的，本发明公开了一种EGCG药物组合物，它包括含有效剂量的EGCG与载体，所述载体为一种或两种及两种以上混合物的辅料，其中每100质量份EGCG药物组合物中包含50～90质量份的EGCG，余量为辅料。

进一步地，每100质量份EGCG药物组合物中包含70～90质量份的EGCG。

进一步地，每100质量份EGCG药物组合物中包含80质量份的EGCG。

进一步地，所述EGCG药物组合物通过注射、口服、喷鼻、灌胃、直肠、阴道中任意一种方式给与受试哺乳动物体。

为更好的实现本发明技术目的，本发明还公开了一种上述EGCG药物组合物的制备方法，它包括将有效剂量的EGCG与载体进行掺合并制成需要的剂型。

此外，本发明还公开了上述EGCG药物组合物在制备卵巢功能保护药物中的应用。

进一步地，具体包括对受试哺乳动物体给予所述EGCG药物组合物，给药量为：受试哺乳动物体每日每千克给予80～120mg EGCG，且连续给药12～16天，对所述受试哺乳动物体构建化疗性卵巢损伤模型后继续连续给药12～16天。

进一步地，给药量为：受试哺乳动物体每日每千克给予100mg EGCG，且连续给药14天。

进一步地，所述受试哺乳动物体的化疗性卵巢损伤模型为通过对所述受试哺乳动物体给予CTX溶液建立得到，给药量为：受试哺乳动物体每日每千克给予100～140mg CTX，所述CTX溶液为采用生理盐水配置的浓度为8～12mg/mL的溶液。

进一步地，还包括对所述受试哺乳动物体完成所述EGCG药物组合物治疗后，检测所述受试哺乳动物体的卵巢内分泌功能和/或生殖功能和/或卵巢储备功能。

结果发现含有效剂量的EGCG药物组合物有利于减轻化疗药物所致的卵巢损伤，同时对受试哺乳动物体的重要脏器也没有产生不良反应。

有益效果：

本发明公开了一种EGCG药物组合物，通过对受试哺乳动物体给予一定剂量EGCG药物组合物后，检测受试哺乳动物体的卵巢功能，结果发现该EGCG药物组合物有利于减轻化疗药物所致的卵巢损伤，同时对受试哺乳动物体的重要脏器也没有产生不良反应。其作为新型药物在减轻化疗药物所致卵巢损伤中发挥重要作用。

附图说明

图1为实施例中步骤三的系列评价测试图，其中，图1A为实验流程以及小鼠和人年龄对照图；图1B为各组小鼠体重监测；图1C为小鼠重要脏器照片；图1D为各组小鼠卵巢指数(卵巢质量/体重)图1E为各组小鼠子宫指数(子宫质量/体重)；

图2为实施例中步骤四的系列评价测试图，其中，图2A为动情周期监测时间点；图2B为各组小鼠动情周期结果；图2C为规律和不规律动情周期鼠百分比；图2D为平均动情周期长度；图2E为血清雌激素水平；图2F为血清孕激素水平；

图3为实施例中步骤五的系列评价测试图，其中，图3A为总产仔数-时间图；图3B为每窝产仔数；图3C为平均产仔次数；图3D为子代雌雄比例；

图4为实施例中步骤六的系列评价测试图，其中，图4A为卵巢HE染色图；图4B为各级卵泡计数结果；图4C为各级卵巢占总卵泡数比例；图4D为Western blot检测始基卵泡激活相关通路和AMH蛋白。

具体实施方式

本发明公开了一种EGCG药物组合物及其制备方法和在卵巢功能保护中的应用。化疗导致的卵巢损伤，是实验研究中常见且得到公认的卵巢损伤模型，基于此模型研究的治疗方式对多种卵巢损伤因素的治疗均具有借鉴意义。具体的，通过给与受试哺乳动物体一定剂量的CTX溶液以诱导产生化疗性卵巢损伤，并对受试哺乳动物体给与含有效剂量的EGCG药物组合物及单纯对照组的受试哺乳动物体给与生理盐水，连续给药一段时间后检测受试哺乳动物体的卵巢功能，结果发现含有效剂量的EGCG药物组合物有利于减轻化疗药物所致的卵巢损伤，同时对受试哺乳动物体的重要脏器也没有产生不良反应。

术语的定义和使用

EGCG：即表没食子儿茶素没食子酸酯，分子式为C₂₂H₁₈O₁₁，是绿茶茶多酚的主要组成成分，是从茶叶中分离得到的儿茶素类单体，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗动脉硬化、抗血栓形成、抗血管增生、抗炎以及抗肿瘤作用。

化疗：是化学药物治疗的简称，通过使用化学治疗药物杀灭癌细胞达到治疗目的。在临床上化疗药物也有不同的种类，根据其作用机制不同，可以分为烷化剂，抗代谢类，抗生素类，抗肿瘤药物，植物类抗肿瘤药物，激素类抗肿瘤药物，以及杂类的药物等。大部分患者需要联合使用两种以上的化疗药物治疗的，也包括口服化疗药物以及静脉用药等，另外，部分患者也可以采取介入的方式通过动脉灌注药物。

CTX：环磷酰胺，是进入人体内被肝脏或肿瘤内存在的过量的磷酰胺酶或磷酸酶水解，变为活化作用型的磷酰胺氮芥而起作用的氮芥类衍生物。

首先，本发明公开了一种用于减轻化疗药物所致卵巢损伤的EGCG药物组合物，它包括含有效剂量的EGCG与载体，所述载体为一种或两种及两种以上混合物的辅料，其中，每100质量份EGCG药物组合物中包含50～90质量份的EGCG，余量为辅料。进一步地，每100质量份EGCG药物组合物中包含70～90质量份的EGCG。优选的，每100质量份EGCG药物组合物中包含80质量份的EGCG

其中，所述载体为常用药物辅料，如稳定剂、增溶剂、缓冲剂、防腐剂、增稠剂或其他赋形剂中任意一种。

所述EGCG药物组合物可通过任何合适途径施用，例如以注射形式通过肠胃外施用，或以以下形式通过口服途径施用：例如，片剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、锭剂、糖衣丸、丸剂、糖锭剂、含水或无水溶液、混悬剂、油包水或水包油乳剂、酏剂或糖浆剂。对于肠胃外施用，所述药物组合物可制备成分散剂、混悬剂、乳剂、无菌注射溶液或含无菌粉的分散剂。所述药物组合物也作为长效注射剂提供。所述药物组合物的其他合适施用形式为：栓剂、喷雾剂、膏剂、霜剂、凝胶剂、吸入剂和皮肤贴剂。所述药物组合物可使用本领域任何已知方法来制备成上述所列举的任何形式。

并且以受试哺乳动物体可接受的方式，如注射、口服、喷鼻、灌胃、直肠、阴道等各种方式给与受试个体。本发明优选灌胃。

与此同时，本发明优选所述EGCG药物组合物为液剂，并且进一步优选每100质量EGCG份药物组合物中包含80质量份的EGCG。

本发明还保护一种药盒，它包括上述的EGCG药物组合物和使用说明书。

本发明设计的药物制剂可以方便地呈单位剂量规格并使用药学领域众所周知的任何方法制备。具体的，将活性化合物EGCG与载体均匀且紧密地掺合在一起，并制成所需要的液剂。

其次，本发明还公开了制备的药物组合物在制备减轻化疗药物所致卵巢损伤的药物中的应用。

其中，所述受试哺乳动物体包括但不限于大鼠、小鼠、非人灵长类、人、犬、猫、马、牛、绵羊、猪、山羊。优选为人或小鼠。

为更好的解释本发明，下面进一步通过具体实施例详细描述本发明的具体实验过程。

实施例

实验动物及材料：

1、实验动物：小鼠；

来源、种系、品系：SPF(specific pathogen-free,无特定病原体)级C57BL/6J小鼠订购于北京维通利华实验动物技术有限公司(Beijing Vital River Laboratory AnimalTechnology Co.,Ltd.)，中国北京。

育龄：雌性小鼠6周龄，体重16～18g；雄性小鼠10周龄，体重20～24g。

2、实验材料：

生理盐水：四川科伦药业股份有限公司，中国成都；

CTX：C0768-1G,Sigma-Aldrich,USA；

Elisa试剂盒：Cayman Chemical Company,Ann Arbor,USA；

福尔马林：谷歌生物科技有限公司，中国武汉；

光学显微镜型号：Olympus,Japan；

3、实验方法：

步骤一：制备化疗性卵巢损伤小鼠模型；

避光条件下，用生理盐水配置浓度为10mg/mL的CTX溶液，充分混匀溶解；称取小鼠体重，根据给药量为120mg CTX每千克的量计算每只小鼠注射量；

左手固定小鼠，右手吸取相应量CTX溶液腹腔注射入小鼠体内，并编号为受试A1组和受试A2组，该受试A1组对应附图中CTX+NS组，该受试A2组对应附图中CTX+EGCG组；空白对照组的小鼠给予相应体积的生理盐水，其余过程与上述相同，并编号为对照B组，该对照B组对应附图中NC组；

步骤二：药物治疗；

在化疗以前通过灌胃方式给与受试A2组的小鼠所述EGCG药物组合物，其中给药量为100mg EGCG每千克老鼠体重，连续给药14天，在化疗手术后继续给与100mg EGCG每千克老鼠体重，连续给药14天，空白对照组B组和受试A1组给予相同体积生理盐水；

步骤三：一般状况和安全性：

给药期间每两天检测一次上述受试A1组、受试A2组及对照B组小鼠体重并记录；

干预结束后，动情间期处死小鼠，取重要脏器称重并拍照，计算脏器指数；结果如图1，结合图1A可知小鼠6周龄开始干预，10周龄结束，对应人的13.2岁到16.7岁；结合图1B可知第14天给予CTX干预后A1和A2组小鼠体重出现下降，最终A2组小鼠体重高于A1组；结合图1C可知小鼠重要脏器(心、肝、脾、肾、子宫、卵巢)形态基本正常；结合图1D可知A2组小鼠卵巢指数显著高于A1组；结合图1E可知A2组小鼠子宫指数显著高于A1组。

步骤四：卵巢内分泌功能检测；

连续十天用生理盐水蘸取小鼠阴道分泌物进行动情周期检测；

利用Elisa试剂盒检测小鼠血清雌孕激素水平；结果如图2，结合图2A可知小鼠从9周龄到11周龄进行阴道涂片，对应人的15.8岁到17.5岁；结合图2B可知A1组小鼠动情周期始终不规律；结合图2C可知B、A1和A2组小鼠动情周期规律比率分别为90％、0％、60％；结合图2D可知和A1组相比，A2组小鼠动情周期长度显著缩短；结合图2E可知A2组小鼠雌激素水平较A1组有升高的趋势；结合图2F可知A2组小鼠孕激素水平较A1组显著升高。

步骤五：生殖功能检测；

上述受试A1组、受试A2组及对照B组中留取5只小鼠进行合笼，合笼期间将每只雌鼠和一只雄鼠单独放一起，10天后将雄鼠取出，随后20天期间观察雌鼠有无怀孕和产仔数；以每30天为一个周期，共进行6个周期的生殖功能检测；结果如图3，结合图3A可知A2组小鼠总产仔数较A1组显著增多；结合图3B可知A2组小鼠每窝产仔数较A1组显著增多，结合图3C可知A2组小鼠平均产仔次数较A1组显著增多，结合图3D可知各组子代雌雄比例无显著差异；

步骤六：卵巢储备功能检测；

小鼠卵巢同福尔马林固定后送连续切片，每隔80μm取一张卵巢切片进行HE染色，光学显微镜下计数各级卵泡；利用Western blot检测小鼠卵巢AMH水平，检测始基激活关键通路，结果如图4，其中，图4A为光学显微镜下所看到的各级卵泡，其中B组可见大量始基卵泡和生长卵泡，A1组以闭锁卵泡为主，A2组则以始基卵泡和生长卵泡为主；结合图4B可知和A1组相比，A2组小鼠始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡和窦卵泡数目均显著增加，闭锁卵泡数目有下降的趋势；结合图4C可知小鼠各级卵泡比例和4B组卵泡数目呈现相同趋势；结合图4D可知A2组小鼠卵巢AMH蛋白表达量较A1组显著升高，A2组小鼠始基卵泡激活相关通路蛋白(p-AKT,p-mTOR,p-RPS6)表达量较A1组显著降低。

由上述实施例探究可知，在EGCG本身具备抗癌效果的前提下，申请人探究发现EGCG还具有保护基于化疗导致的卵巢损伤，虽然本发明并未公开其它因素，如年龄、遗传、免疫、医源性、环境、行为学、社会心理等可能造成的卵巢损害情况，但基于化疗导致的卵巢损伤，是实验研究中常见且得到公认的卵巢损伤模型，故其它因素导致的卵巢损伤情况也在本发明要求保护的范围内。

因此，EGCG药物组合物可以在不影响抗癌效果情况下保护卵巢功能，其作为新型药物在减轻化疗药物所致卵巢损伤中发挥重要作用。

Claims (3)

1.一种EGCG在制备卵巢功能保护药物中的应用，其特征在于，包括对所述受试哺乳动物体给予CTX溶液建立由CTX化疗引起所述受试哺乳动物体的双侧卵巢指数、血清雌激素水平、孕激素水平和AMH水平发生变化的卵巢损伤模型：

具体对受试哺乳动物体每日每千克给予100～140mg CTX，CTX溶液为采用生理盐水配置的浓度为8～12mg/mL的溶液；

还包括对所述构建化疗性卵巢损伤模型的受试哺乳动物体给予EGCG，在给予EGCG以前与以后分别检测所述受试哺乳动物体的双侧卵巢指数、血清雌激素水平、孕激素水平和AMH水平；

所述卵巢功能保护包括所述受试哺乳动物体的卵巢内分泌功能和/或生殖功能和/或卵巢储备功能；

所述受试哺乳动物体为小鼠；

给药量为：受试哺乳动物体每日每千克给予80～120mgEGCG，且连续给药12～16天。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，给药量为：受试哺乳动物体每日每千克给予100mg EGCG，且连续给药14天。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述EGCG通过注射、口服、喷鼻、灌胃、直肠、阴道中任意一种方式给与受试哺乳动物体。

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