CN112351996A - 用于治疗应激相关病症和癌症的材料和方法 - Google Patents

用于治疗应激相关病症和癌症的材料和方法 Download PDF

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Abstract

本文公开了用于治疗应激相关病症和癌症的材料和方法。本公开提供了一种抗体或其抗原结合片段，其与促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）的区域特异性结合。本公开还提供了治疗与HPA轴活化相关的如应激相关病症或癌症等病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效治疗所述病症的量的本文所述的抗体或其抗原结合片段。

Description

用于治疗应激相关病症和癌症的材料和方法
政府支持声明
本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的CA195563下由政府支持进行的。政府拥有本发明的某些权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年6月11日提交的美国临时申请第62/683,369号、于2018年12月10日提交的美国临时申请第62/777,572号以及于2019年5月6日提交的美国临时申请第62/843,677号的优先权权益，所述美国临时申请的公开内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开涉及促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)肽片段、抗CRH抗体以及此类肽片段和抗体在治疗与下丘脑-垂体肾上腺(HPA)轴活化相关的病症(例如，应激相关病症和癌症)中的用途。
通过引用并入电子提交的材料
本申请含有作为公开的单独部分的计算机可读形式的序列表(文件名称：52978_Seqlisting.txt；大小：15,132字节；创建时间：2019年6月7日)，所述申请通过引用整体并入本文。
背景技术
促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)是对应激刺激的神经内分泌和行为应答的主要协调者。自从硬骨鱼类和四足动物之前的一段时间以来，CRH已经在脊椎动物谱系中进化地保存了超过5.5亿年。这种跨物种的保存突出了CRH在脊椎动物对应激刺激的应答中的重要性。
CRH通过其受体向CRHR1发送信号以控制下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴活化；从下丘脑的室旁核(PVN)释放CRH作用于垂体前叶中的CRHR1受体，从而引起促肾上腺皮质激素(ACTH)释放，其刺激肾上腺产生并释放糖皮质激素(GC)，即人类的皮质醇和啮齿类动物的皮质酮。糖皮质激素在整个体内自由扩散，并且作用于几乎每种脊椎动物细胞类型中表达的高亲和力盐皮质激素(MR)和低亲和力糖皮质激素(GR)受体。MR和GR信号传导除了通过糖皮质激素应答元件(GRE)的转录调节引起的长期效应之外，还在许多细胞类型中引起快速功能应答。对GR和MR受体活化的应答导致资源动员和细胞适应，所述资源动员和细胞适应使身体准备克服应激源。
在不存在应激刺激的情况下，PVN从下丘脑的视交叉上核(SCN)接收输入并且对褪黑激素水平作出应答，从而基于这些输入改变整天的CRH释放。CRH释放的这些每日波动进而产生GC释放的昼夜节律，其中GC的峰值水平在唤醒时存在并且谷值水平在恢复到睡眠之前存在。
除了其对HPA轴的作用之外，CRH和CRHR1广泛表达于大脑的涉及认知和焦虑的许多区域中，包含新皮质、海马体、杏仁核和蓝斑。已经显示CRH对焦虑具有区域特异性作用，并且最好被描述为神经调节剂：增强CRHR1表达性神经元的活性但不充当经典神经递质。
发明内容
在一方面，本公开提供了一种抗体或其抗原结合片段，其与促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)的包括SEQ ID NO:1的氨基酸1-21的区域特异性结合。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:12-17或SEQ ID NO:4-9中所示的一组六个CDR。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区，所述重链可变区包括SEQ IDNO:19或SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括轻链可变区，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:18或10中所示的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段是单克隆抗体。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段是人源化抗体。在一些实施例中，所述抗体或其抗原结合片段包括两条重链和两条轻链。在一些实施例中，所述抗体是IgG。在一些实施例中，所述抗原结合片段是Fab片段或scFv。在一些实施例中，scFv包括SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:23中所示的氨基酸序列。
考虑了治疗与HPA轴活化相关的病症(例如，应激相关病症或癌症)的方法。例如，在一些实施例中，本文描述了一种治疗应激相关病症的方法。在此方面，所述方法包括向有需要的受试者施用有效治疗所述病症的量的本文所述的抗体或其抗原结合片段。示例性应激相关病症包含但不限于焦虑症、抑郁症、阿尔茨海默氏病、创伤后应激病症、广泛性焦虑病症、重性抑郁症、神经性厌食症、创伤后应激病症、肾上腺病症、代谢综合征、1型糖尿病、少肌症和多发性硬化症。
还考虑了诱导受试者对促肾上腺皮质素释放激素(CRH)的免疫应答的方法。在此方面，所述方法包括向有需要的受试者施用有效诱导受试者的免疫应答的量的CRH的氨基末端肽片段。在一些实施例中，所述CRH的所述氨基末端片段由SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述CRH的所述氨基末端片段由SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列组成。在一些实施例中，所述肽片段与T细胞反应性表位(例如，破伤风类毒素(tetanus toxoid))缀合。任选地，所述方法进一步包括向所述受试者施用佐剂。
还考虑了治疗有需要的受试者的应激相关病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效治疗所述受试者的所述病症的量的CRH的氨基末端肽片段。
还考虑了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的抗CRH抗体与免疫治疗剂的组合。在一些实施例中，所述免疫治疗剂是检查点抑制剂。在一些实施例中，所述免疫治疗剂是抗PD1抗体。
附图说明
图1A和1B是条形图，其示出了用促肾上腺皮质素释放激素(CRH)(SEQ ID NO:2和3)的氨基末端片段接种在小鼠中产生抗CRH抗体(y轴，相对吸光度；x轴，血清稀释度)。在图1A中，图上的第一组五个条是小鼠I44，图上的第二组五个条是小鼠I45，并且最后一组五个条是小鼠I46。在图1B中，第一组四个条是小鼠96，第二组四个条来自小鼠97，第三组四个条来自小鼠98，第四组四个条来自小鼠99，第五组四个条来自小鼠100，第六组四个条来自小鼠144，并且第七组四个条来自小鼠146。
图2是示出了分离的单克隆抗体与CRH的亲和力的图。
图3A和3B是示出了抗CRH抗体对急性应激的作用的图(y轴，皮质酮(ng/mL)；x轴，血浆抽取时间)。
图4含有注射抗CRH抗体B的小鼠的照片，其显示施用抗CRH抗体B逆转库欣病小鼠模型的毛发缺损。
图5提供了抗CRH抗体A和B的可变区序列和用于产生抗体的N末端CRH肽的序列。
图6提供了显示测试产生的抗CRH ScFv与CRH的结合的ELISA结合测定的结果的条形图。提供了未经转染的HEK-293细胞的裂解物、用对包括抗体A可变区的ScFv进行编码的DNA构建体转导的细胞的裂解物、未经转染的细胞裂解物以及用对包括抗体B可变区的ScFv进行编码的DNA构建体转导的细胞的裂解物(x轴)的相对吸光度(y轴)。
图7提供了抗CRH抗体B的小鼠可变区和用于抗体人源化的类似人可变框架的比对。CDR被突出显示。
图8提供了显示抗体B在体外减少CRH诱导的环AMP增加的条形图。
图9提供了显示在轻度应激下用抗体B(抗CRH)处理的小鼠表现出降低皮质酮水平的剂量-应答作用的图。
图10提供了实例10中所描述的慢性可变应激实验的方案。
图11A是示出了在慢性应激下用抗体B(抗CRH)处理降低了小鼠中的皮质酮应答的图。图11B是示出了用抗体B处理的小鼠显著增加重量增加的图。图11C和D是示出了用抗体B(抗CRH)处理未导致小鼠的肠系膜或皮下脂肪增加的图。图11E、F和G是示出了用抗体B(抗CRH)处理显著增加脾细胞结构和转移的白细胞群以增加B细胞百分比和降低T细胞百分比的图。图11H和I是示出了抗体B(抗CRH)处理显著减少小鼠脾中的炎性单核细胞和NK细胞的图。
图12A和12B示出了用抗体B处理的小鼠的脑RNA转录物显著改变。图12A是示出了显著改变的基因的火山图(volcano plot)。图12B是示出了加权相关网络(WGCN)分析的结果的图，其揭示了相关改变基因的网络。
图13A-13Q提供了在实例12中进行的免疫图谱分析的结果。图13A-B是示出了用抗体B处理的活脾细胞结构的显著增加和脾重量的趋势增加的图。图13B-Q：另外，确定在这些活脾细胞中的图13O-Q NK细胞和图13L-N炎性单核细胞中，B细胞的百分比显著增加并且T细胞百分比减少，但其中(图13G和图13J)B和T细胞两者的绝对数量增加。
图14是示出了在GL261颅内小鼠神经胶质瘤模型中用抗体B处理增加了存活率的图。
图15是示出了直接ELISA的结果的图，其显示抗体B与UCN 1-3在1μM包被下没有交叉反应性，而与UCN2在10μM包被下具有少量的反应性。
图16示出了Octet red Biolayer干涉测量法，其计算了抗体B与UCN2肽的解离常数Kd＝4.0E-9。此亲和力比抗体B与CRF肽的亲和力低4000倍。
具体实施方式
本公开部分地基于以下发现：体内施用抗促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)抗体抑制对急性应激的皮质酮应答。
促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)是衍生自196-氨基酸前激素原(Genbank登录号：EAW86897.1)的41-氨基酸肽(SEEPPISLDLTFHLLREVLEMARAEQ LAQQAHSNRKLMEII(SEQ IDNO:1))。CRH由下丘脑的室旁核(PVN)响应于应激而分泌。已经观察到增加的CRH产生与阿尔茨海默氏病(Alzheimer's disease)和重性抑郁症相关(Raadsheer等人,《美国精神病学杂志(Am J Psychiatry.)》152(9):1372–6,1995)，并且常染色体隐性下丘脑促肾上腺皮质激素缺乏具有多种(并且潜在地致命的)代谢后果，包含低血糖症。
如实例1中所述，CRH肽片段(例如，氨基末端片段)用于通过主动免疫在体内产生抗CRH抗体。在此方面，特别考虑了使用CRH肽片段在受试者中产生对CRH的免疫应答(例如，产生抗CRH抗体)。如本文所使用的，术语“氨基末端片段”意指CRH的截短形式，其在SEQ IDNO:1的CRH的N末端处保留一段氨基酸并且在C末端处缺少一段氨基酸。在一些实施例中，CRH肽片段包括包含SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列的30个氨基酸或更少的肽。在一些实施例中，CRH肽片段包括长度为10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个氨基酸的肽。在一些实施例中，CRH肽片段的长度小于25个氨基酸。在一些实施例中，CRH肽片段的长度是10个氨基酸。在各个方面，CRM肽片段是包括不超过SEQ ID NO:1的前30个氨基酸的氨基末端CRM肽片段。在一些实施例中，CRH肽片段包括SEQ ID NO:1的氨基酸1-15(即，SEQ ID NO:2)。在一些实施例中，CRH肽片段包括SEQ ID NO:1的氨基酸1-21(即，SEQ ID NO:3)。
在一些实施例中，CRH肽包括与SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列至少85％(或至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％)相同的氨基酸序列。在一些实施例中，CRH肽包括与SEQ ID NO:3中所示的氨基酸序列至少85％(或至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少99％)相同的氨基酸序列。
在一些实施例中，CRH肽与钥孔虫戚血蓝蛋白(KLH)或卵清蛋白(OVA)缀合。
在一些实施例中，CRH肽片段与佐剂一起施用。如本文所使用的，术语“佐剂”是指当与肽组合使用时增强或以其它方式改变针对肽诱导的免疫应答的化合物。免疫应答的修饰可以包含强化或扩大抗体和/或细胞免疫应答的特异性。在本公开的范围内设想了在Vogel等人,《疫苗佐剂和赋形剂纲要(A Compendium of Vaccine Adjuvants andExcipients)》(第2版)中描述的包含的任何佐剂，所述文献出于所有目的通过引用整体并入本文。已知佐剂的实例包含完全弗氏佐剂(含有被杀死的结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)的免疫应答的非特异性刺激剂)、不完全弗氏佐剂和氢氧化铝佐剂。其它已知的佐剂包含粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSP)、卡介苗(BCG)、氢氧化铝、胞壁酰二肽(MDP)化合物(如thur-MDP和nor-MDP)、胞壁酰三肽磷脂酰乙醇胺(MTP-PE)、RIBI的佐剂(蒙大拿州哈密尔顿的Ribi免疫化学研究公司(Ribi ImmunoChem Research,Inc.)，其含有从细菌中提取的三种组分)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和含细胞壁骨架(CWS)的2％角鲨烯/Tween 80乳液。MF-59、
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以及主要组织相容性复合体(MHC)抗原是其它已知的佐剂。
抗体
本公开还提供了抗CRH抗体。术语“抗体”是指完整的免疫球蛋白分子(包含具有全长重链和/或轻链的多克隆、单克隆、嵌合、人源化和/或人类版本)。所述抗体可以是本领域已知的任何类型的抗体，即免疫球蛋白。在示例性实施例中，抗体是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM类或同种型的抗体。在示例性实施例中，本文所述的抗体包括一个或多个α、δ、ε、γ和/或μ重链。在示例性实施例中，本文所述的抗体包括一个或多个κ或轻链。在示例性方面，抗体是IgG抗体并且任选地是以下四种人类亚类之一：IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。而且，在一些实施例中，抗体是单克隆抗体。在其它实施例中，抗体是多克隆抗体。在一些方面，抗体是嵌合抗体或人源化抗体。当关于抗体使用时，术语“人源化”是指至少具有来自非人来源的CDR区并且被工程化以具有比原始来源抗体更类似于真人抗体的结构和免疫功能的抗体。例如，人源化可以涉及将来自非人抗体(如小鼠抗体)的CDR移植到人抗体框架中。人源化还可以涉及选择氨基酸取代以使非人序列看起来更像人序列。
在一些方面，抗体是人工程化TM抗体。人工程化技术将非人抗体转化成工程化人抗体。人工程化TM抗体具有高亲和力，并且高度类似于人种系抗体序列。参见例如，Tomasevic等人,《生长因子(Growth Factors)》32:223-235(2014)。
如本文使用的，“特异性结合”意指抗体(或抗原结合片段)相对于其它蛋白质优先地结合抗原(CRH肽)。在一些实施例中，“特异性结合”意指抗体对抗原的亲和力高于对其它蛋白质的亲和力。特异性结合抗原的抗体对抗原的结合亲和力可以小于或等于1×10-7M，小于或等于2×10-7M，小于或等于3×10-7M，小于或等于4×10-7M，小于或等于5×10-7M，小于或等于6×10-7M，小于或等于7×10-7M，小于或等于8×10-7M，小于或等于9×10-7M，小于或等于1×10-8M，小于或等于2×10-8M，小于或等于3×10-8M，小于或等于4×10-8M，小于或等于5×10-8M，小于或等于6×10-8M，小于或等于7×10-8M，小于或等于8×10-8M，小于或等于9×10- 8M，小于或等于1×10-9M，小于或等于2×10-9M，小于或等于3×10-9M，小于或等于4×10-9M，小于或等于5×10-9M，小于或等于6×10-9M，小于或等于7×10-9M，小于或等于8×10-9M，小于或等于9×10-9M，小于或等于1×10-10M，小于或等于2×10-10M，小于或等于3×10-10M，小于或等于4×10-10M，小于或等于5×10-10M，小于或等于6×10-10M，小于或等于7×10-10M，小于或等于8×10-10M，小于或等于9×10-10M，小于或等于1×10-11M，小于或等于2×10-11M，小于或等于3×10-11M，小于或等于4×10-11M，小于或等于5×10-11M，小于或等于6×10-11M，小于或等于7×10-11M，小于或等于8×10-11M，小于或等于9×10-11M，小于或等于1×10-12M，小于或等于2×10-12M，小于或等于3×10-12M，小于或等于4×10-12M，小于或等于5×10-12M，小于或等于6×10-12M，小于或等于7×10-12M，小于或等于8×10-12M或小于或等于9×10-12M。应当理解，在本公开的上下文中构想了具有上述值作为端点的范围。例如，抗体或其抗原结合片段可以以约1×10-7M到约9×10-12M的亲和力或1×10-9到约9×10-12的亲和力结合SEQ ID NO:1的CRH。
在一些或任何实施例中，抗体(或抗原结合片段)以小于或等于1×10-7M，小于或等于1×10-8M，小于或等于1×10-9M，小于或等于1×10-10M，小于或等于1×10-11M或小于或等于1×10-12M，或范围为1×10-9到1×10-10或范围为1×10-12到约1×10-13的亲和力(Kd)与SEQID NO:1的CRH或其天然存在的变体结合。使用多种技术来确定亲和力，所述多种技术的实例包含亲和力ELISA测定和表面等离子体共振(BIAcore)测定。
在一些或任何实施例中，抗体(或其抗原结合片段)以上述任何亲和力与包括SEQID NO:1的氨基酸1-21的CRH肽结合。可替代地或另外，抗体(或其抗原结合片段)以上述任何亲和力与包括SEQ ID NO:1的氨基酸1-15的CRH肽结合。
“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区。在重链和轻链的每个可变区中存在三个CDR，对于每个可变区分别指定为CDR1、CDR2和CDR3。如本文所使用的，术语“一组六个CDR”是指存在于轻链可变区和重链可变区中的能够结合抗原的一组三个CDR。CDR的准确边界已经根据不同的系统被不同地定义。Kabat所描述的系统(Kabat等人,《免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》(国立卫生研究院,贝塞斯达,马里兰州(1987)和(1991))不仅提供了适用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，而且提供了定义三个CDR的精确残基边界。这些CDR可以被称为Kabat CDR。Chothia和同事(Chothia和Lesk,《分子生物杂志(J.Mol.Biol.)》196:901-917(1987)和Chothia等人,《自然(Nature)》342:877-883(1989))发现Kabat CDR内的某些子部分采用几乎相同的肽主链构象，尽管在氨基酸序列水平上具有很大的多样性。这些子部分被指定为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别指定轻链区和重链区。这些区域可以被称为Chothia CDR，其边界与Kabat CDR重叠。Padlan(《美国实验生物学会联合会杂志(FASEB J.)》9:133-139(1995))和MacCallum(《分子生物杂志》262(5):73245(1996))已经描述了定义与Kabat CDR重叠的CDR的其它边界。仍其它CDR边界定义可能不会严格地遵循上述系统之一，但尽管如此将与Kabat CDR重叠，但是鉴于特定残基或残基组或甚至整个CDR不会显著影响抗原结合的预测或实验发现，所述边界可能会被缩短或加长。本文所使用的方法可以利用根据这些系统中的任一个定义的CDR，但是优选的实施例使用Kabat或Chothia定义的CDR。
CDR是通过例如构建编码感兴趣的CDR的多核苷酸并且在合适的宿主细胞中表达而获得的。例如，通过使用聚合酶链式反应以使用产生抗体的细胞的mRNA作为模板合成可变区来制备此类多核苷酸(参加例如，Larrick等人,《方法：酶学方法指南(Methods:ACompanion to Methods in Enzymology)》,2:106(1991)；Courtenay-Luck,《单克隆抗体生产、工程化和临床应用(Monoclonal Antibodies Production,Engineering and ClinicalApplication)》中的“单克隆抗体的基因操纵(Genetic Manipulation of MonoclonalAntibodies)”,Ritter等人(编辑),第166页,剑桥大学出版社(Cambridge UniversityPress)(1995)；以及Ward等人,《单克隆抗体：原理和应用(Monoclonal Antibodies:Principles and Applications)》中的“基因操纵和抗体表达(Genetic Manipulation andExpression of Antibodies)”,Birch等人(编辑),第137页,威利-里斯公司(Wiley-Liss,Inc.)(1995))。
在各个方面，抗体(或其抗原结合片段)包括与选自以下的CDR至少75％同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％或100％同一性)的至少一个CDR序列：CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1具有在SEQ ID NO:4中给出的序列，CDR-H2具有在SEQ ID NO:5中给出的序列，CDR-H3具有在SEQ ID NO:6中给出的序列，CDR-L1具有在SEQ ID NO:7中给出的序列，CDR-L2具有在SEQ ID NO:8中给出的序列，并且CDR-L3具有在SEQ ID NO:9中给出的序列。在各个方面，抗CRH抗体包括两个CDR、三个CDR、四个CDR、五个CDR或所有六个CDR。在优选的实施例中，抗CRH抗体包括如下的一组六个CDR：SEQ ID NO:4的CDR-H1、SEQ ID NO:5的CDR-H2、SEQ ID NO:6的CDR-H3、SEQ ID NO:7的CDR-L1、SEQ IDNO:8的CDR-L2以及SEQ ID NO:9的CDR-L3。
在各个方面，抗体(或其抗原结合片段)包括与选自以下的CDR至少75％同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％或100％同一性)的至少一个CDR序列：CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中CDR-H1具有在SEQ ID NO:12中给出的序列，CDR-H2具有在SEQ ID NO:13中给出的序列，CDR-H3具有在SEQ ID NO:14中给出的序列，CDR-L1具有在SEQ ID NO:15中给出的序列，CDR-L2具有在SEQ ID NO:16中给出的序列，并且CDR-L3具有在SEQ ID NO:17中给出的序列。在各个方面，抗CRH抗体包括两个CDR、三个CDR、四个CDR、五个CDR或所有六个CDR。在优选的实施例中，抗CRH抗体包括如下的一组六个CDR：SEQID NO:12的CDR-H1、SEQ ID NO:13的CDR-H2、SEQ ID NO:14的CDR-H3、SEQ ID NO:15的CDR-L1、SEQ ID NO:16的CDR-L2以及SEQ ID NO:17的CDR-L3。
在一些或任何实施例中，抗体包括轻链可变区和/或重链可变区，所述轻链可变区包括与SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列至少75％同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％或100％同一性)的氨基酸序列，所述重链可变区包括与SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列至少75％同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％或100％同一性)的氨基酸序列。在各个方面，与SEQ ID NO:10或11相比，序列中的差异位于对应序列中的CDR区之外。在一些或任何实施例中，抗体(或抗原结合片段)包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列，所述重链可变区包括SEQ ID NO:11中所示的氨基酸序列。在一些或任何实施例中，抗体(或抗原结合片段)包括由SEQ ID NO:22中所示的核苷酸序列编码的轻链可变区。在一些或任何实施例中，抗体(或抗原结合片段)包括由SEQ ID NO:23中所示的核苷酸序列编码的重链可变区。
在一些或任何实施例中，抗体包括轻链可变区和/或重链可变区，所述轻链可变区包括与SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列至少75％同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％或100％同一性)的氨基酸序列，所述重链可变区包括与SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列至少75％同一性(例如，至少75％、80％、85％、90％、95％或100％同一性)的氨基酸序列。在各个方面，与SEQ ID NO:18或19相比，序列中的差异位于对应序列中的CDR区之外。在一些或任何实施例中，抗体(或其抗原结合片段)包括轻链可变区和重链可变区，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:18中所示的氨基酸序列，所述重链可变区包括SEQ ID NO:19中所示的氨基酸序列。
还考虑了本文所述的抗CRH抗体的抗原结合片段。抗原结合片段可以是具有至少一个抗原结合位点的抗体的任何部分，并且抗原结合片段可以是保留抗原结合片段识别CRH的能力的较大结构(“抗体产物”)的部分。为了便于参考，包含抗原结合片段的这些抗体产物包含在本文的“抗原结合片段”的公开内容中。抗原结合片段的实例包含但不限于Fab、F(ab')2、单特异性或双特异性Fab2、三特异性Fab3、scFv、dsFv、scFv-Fc、双特异性双抗体、三特异性三抗体、微型抗体、IgNAR的片段(例如，V-NAR)、hcIgG的片段(例如，VhH)、双scFv、由Fab表达文库表达的片段等。在示例性方面，抗原结合片段是结构域抗体、VhH结构域、V-NAR结构域、VH结构域、VL结构域等。然而，本公开的抗体片段不限于这些示例性类型的抗体片段。在示例性方面，抗原结合片段是Fab片段。在示例性方面，抗原结合片段包括两个Fab片段。在示例性方面，抗原结合片段包括通过连接子连接的两个Fab片段。在示例性方面，抗原结合片段包括微型抗体或是包括两个Fab片段的微型抗体。在示例性方面，抗原结合片段包括微型抗体或是包括通过连接子连接的两个Fab片段的微型抗体。微型抗体是本领域已知的。参见例如，Hu等人,《癌症研究(Cancer Res)》56:3055-3061(1996)。在示例性方面，抗原结合片段包括微型抗体或是包括通过连接子连接的两个Fab片段，任选地包括碱性磷酸酶结构域的微型抗体。
结构域抗体包括抗体的功能性结合单元，并且可以与抗体的重链(VH)或轻链(VL)的可变区相对应。结构域抗体的分子量可以为大约13kDa，或全抗体的大约十分之一。结构域抗体可以衍生自完全抗体，如本文所述的那些完全抗体。
在一些实施例中，scFv与人Fc结构域连接。在一些实施例中，Fc结构域不使Fc效应子功能活化。
抗体或抗原结合片段产生的方法
制备抗体的合适方法是本领域已知的。例如，标准杂交瘤方法描述于例如Harlow和Lane(编辑),《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》,CSH出版社(CSHPress)(1988)，以及CA.Janeway等人(编辑),《免疫生物学(Immunobiology)》,第5版,加兰出版社(Garland Publishing),纽约市,纽约州(2001))中。用于本公开的方法中的单克隆抗体可以使用任何技术来制备，所述技术提供通过培养中的连续细胞系产生抗体分子。这些技术包含但不限于最初通过Koehler和Milstein(《自然》256:495-497,1975)描述的杂交瘤技术；人B细胞杂交瘤技术(Kosbor等人,《今日免疫学(Immunol Today)》4:72,1983；Cote等人,《美国国家科学院院刊(Proc Natl Acad Sci)》80:2026-2030,1983)以及EBV-杂交瘤技术(Cole等人,《单克隆抗体和癌症疗法(Monoclonal Antibodies and CancerTherapy)》,艾伦R利斯公司(Alan R Liss Inc),纽约市,纽约州,第77-96页,(1985)。可替代地，其它方法，如EBV-杂交瘤方法(Haskard和Archer,《免疫方法杂志(J.Immunol.Methods)》74(2),361-67(1984)和Roder等人,《酶学方法(MethodsEnzymol.)》,121,140-67(1986))，以及细菌噬菌体载体表达系统(参见例如，Huse等人,《科学(Science)》,246,1275-81(1989))是本领域已知的。进一步地，在例如美国专利5,545,806、5,569,825和5,714,352，以及美国专利申请公开号2002/0197266Al中描述了产生非人类动物的抗体的方法。抗体还可以通过诱导淋巴细胞群中的体内产生或通过筛选重组免疫球蛋白文库或高度特异性结合试剂的组来产生，如在Orlandi等人(《美国国家科学院院刊》86:3833-3837；1989)和Winter G和Milstein C(《自然》349:293-299,1991)中公开的。如果抗体或抗原结合片段的全序列是已知的，则可以采用产生重组蛋白的方法。参见例如，“蛋白质生产和纯化(Protein production and purification)”《自然方法(Nat Methods)》5(2):135-146(2008)。在一些实施例中，抗体(或抗原结合片段)是从细胞培养物或生物样品(如果在体内产生)中分离的。
噬菌体展示还可以用于产生本公开的抗体。在此方面，可以使用标准分子生物学和重组DNA技术产生对抗体的抗原结合可变(V)结构域进行编码的噬菌体文库(参见例如，Sambrook等人(编辑),《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning,A LaboratoryManual)》,第3版,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),纽约(2001))。选择对具有所需特异性的可变区进行编码的噬菌体用于与所需抗原特异性结合，并且重构包括所选可变结构域的完整或部分抗体。将对重构抗体进行编码的核酸序列引入到合适的细胞系中，如用于杂交瘤生产的骨髓瘤细胞，使得具有单克隆抗体特性的抗体由细胞分泌(参见例如，Janeway等人,同上，Huse等人,同上以及美国专利6,265,150)。相关方法还描述于美国专利第5,403,484号；美国专利第5,571,698号；美国专利第5,837,500号；美国专利第5,702,892号中。所述技术描述于美国专利第5,780,279号；美国专利第5,821,047号；美国专利第5,824,520号；美国专利第5,855,885号；美国专利第5,858,657号；美国专利第5,871,907号；美国专利第5,969,108号；美国专利第6,057,098号；和美国专利第6,225,447号中。
抗体可以由对于特异性重链和轻链免疫球蛋白基因是转基因的转基因小鼠产生。此类方法是本领域已知的并且描述于例如美国专利第5,545,806号和第5,569,825号中，以及Janeway等人,同上。
用于产生人源化抗体的方法是本领域熟知的并且详细描述于例如Janeway等人,同上,美国专利第5,225,539号、第5,585,089号和第5,693,761号、欧洲专利第0239400Bl以及英国专利第2188638号中。人源化抗体还可以使用在美国专利第5,639,641号和Pedersen等人,《分子生物杂志》,235,959-973(1994)中描述的抗体表面重修技术(antibodyresurfacing technology)产生。优选的嵌合或人源化抗体具有人恒定区，而抗体的可变区或至少CDR衍生自非人物种。用于人源化非人抗体的方法是本领域熟知的。(参见美国专利第5,585,089号和第5,693,762号。)
可以使用开发用于生产“嵌合抗体”的技术，例如将小鼠抗体基因剪接成人抗体基因以获得具有适当抗原特异性和生物活性的分子(Morrison等人,《美国国家科学院院刊》81:6851-6855(1984)；Neuberger等人,《自然》312:604-608(1984)；Takeda等人,《自然》314:452-454(1985))。可替代地，所描述的用于产生单链抗体的技术(美国专利第4,946,778号)可以适用于产生CRH特异性单链抗体。
同样，使用本领域已知的技术分离CDR，产生了包括CDR的组合物。可以产生包括单克隆抗体的重链可变区或轻链可变区的一个、两个和/或三个CDR的组合物。示例性抗体的CDR在本文中提供为SEQ ID NOs:4-9和12-17。用于克隆和表达核苷酸和多肽序列的技术在本领域是得到确认的(参见例如，Sambrook等人,《分子克隆：实验室手册》,第2版,冷泉港,纽约(1989))。将经过扩增的CDR序列连接到适当的表达载体中。包括一个、两个、三个、四个、五个和/或六个克隆CDR的载体任选地含有连接到CDR的另外的多肽编码区。
化学构建的双特异性抗体可以借助于化学品通过化学交联异源Fab或F(ab')2片段来制备，如异双功能试剂琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫醇)-丙酸酯(SPDP,皮尔斯化学品公司(Pierce Chemicals),罗克福德,伊利诺伊州)。Fab和F(ab')2片段可以分别通过用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整抗体而从所述完整抗体中获得(Karpovsky等人,《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》160:1686-701(1984)；Titus等人,《免疫学杂志》,138:4018-22(1987))。
无论抗体如何产生，测试抗体与CRH表位结合的能力的方法是本领域已知的，并且包含例如放射免疫测定(RIA)、ELISA、蛋白质印迹、免疫沉淀、表面等离子体共振(例如，BIAcore)和竞争性抑制测定(参见例如，Janeway等人,在下文和美国专利申请公开号2002/0197266)。
含有抗体分子的抗原结合或独特型的抗体片段可以通过本领域已知的技术产生。例如，F(ab')2片段可以通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生；Fab'片段可以通过还原F(ab')2片段的二硫桥产生；并且两个Fab'片段，其可以通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子产生。本公开不限于产生抗原结合片段的酶方法；抗原结合片段可以是通过在合适的宿主细胞中表达对片段进行编码的多核苷酸而产生的重组抗原结合片段。
可以使用常规重组DNA技术(参见例如，Janeway等人,同上)产生单链可变区片段(scFv)，其由包括通过合成肽连接到抗体轻链的可变(V)结构域的抗体重链的V结构域的截短的Fab片段组成。类似地，二硫化物稳定的可变区片段(dsFv)可以通过重组DNA技术制备(参见例如，Reiter等人,《蛋白质工程化(Protein Engineering)》,7,697-704(1994))。
重组抗体片段(例如，scFv)还可以被工程化以组装成对不同靶抗原具有高结合亲合力和特异性的稳定多聚体寡聚物。此类双抗体(二聚体)、三抗体(三聚体)或四抗体(四聚体)是本领域熟知的，参见例如，Kortt等人,《生物分子工程(Biomol Eng.)》2001 18:95-108,(2001)和Todorovska等人,《免疫学方法杂志(J Immunol Methods.)》248:47-66,(2001)。
检测方法
有时期望检测样品中CRH的存在或测量样品中CRH的量。在此方面，本公开提供了一种使用本文所述的抗体或其片段测量样品中CRH的量的方法。为了确定CRH的测量，使来自哺乳动物受试者的生物样品与本文所述的抗CRH抗体(或其抗原结合片段)接触持续足以允许形成免疫络合物的一段时间。然后检测样品中抗体与CRH之间形成的免疫络合物。通过测量抗体与CRH之间形成的免疫络合物的量，任选地对生物样品中CRH的量进行定量。例如，如果抗体具有可检测标记，则可以定量地测量抗体，或可以使用二级抗体来对免疫络合物进行定量。
在一些实施例中，生物样品包括组织样品、细胞样品或生物流体样品，如血液、唾液、血清或血浆。
用于温育抗体与测试样品的条件不同。温育条件取决于测定中所采用的形式、所采用的检测方法以及测定中所使用的抗体的类型和性质。本领域的技术人员将认识到，任何一种通常可获得的免疫测定形式可以容易地适用于采用本公开的抗体(或其片段)。此类测定的实例可以在以下中找到：Chard,T.,《放射免疫测定和相关技术的介绍(AnIntroduction to Radioimmunoassay and Related Techniques)》,塞维尔科学出版社(Elsevier Science Publishers),阿姆斯特丹,荷兰(1986)；Bullock,G.R.等人,《免疫细胞化学技术(Techniques in Immunocytochemistry)》,学术出版社(Academic Press),奥兰多,佛罗里达州,第1卷(1982),第2卷(1983),第3卷(1985)；Tijssen,P.,《生物化学和分子生物学(Biochemistry and Molecular Biology)》,免疫测定的实践和理论：实验室技术(Practice and Theory of immunoassays:Laboratory Techniques),塞维尔科学出版社,阿姆斯特丹,荷兰(1985)。在上述方法中所使用的测试样品将基于测定形式、检测方法的性质和用作待测定样品的组织、细胞或流体而变化。
本文所述的测定可以用于例如评估动物研究、临床试验中的特定治疗方案的功效，或用于监测个体患者的治疗。
在一些实施例中，CRH或抗CRH抗体(或其片段)连接到固体支持物，并且通过检测固体支持物上的CRH与抗体(或其片段)之间的络合物来检测结合。抗体(或其片段)任选地包括可检测标记，并且通过检测CRH-抗体络合物中的标记来检测结合。
使用本领域已知的任何方法来实现CRH-抗体络合物的存在或不存在的检测。例如，由与靶分子(例如，抗体)相互作用的CRH肽的报告基因转录测定产生的转录物通常编码直接或间接可检测的产物(例如，β-半乳糖苷酶活性和荧光素酶活性)。对于无细胞结合测定，组分之一通常包含可检测标记或与可检测标记偶联。可以使用各种标记，如提供直接检测(如放射性、发光、光学或电子密度)或间接检测(如表位标签，如FLAG表位、酶标签，例如辣根过氧化物酶)的那些标记。标记可以与抗体结合，或掺入到抗体的结构中。
根据标记的性质和其它测定组分，可以使用各种方法来检测标记。例如，可以在与固体底物结合时或在与固体底物分离之后检测标记。标记可以通过光学或电子密度、放射性发射、非辐射能量转移直接检测，或用抗体缀合物或链霉亲和素-生物素缀合物间接检测。用于检测标记的方法是本领域熟知的。
药物组合物
对于本文所述的所有基于蛋白质的治疗剂(例如，抗体)，通过递送基因表达构建体的施用被考虑是一个实施例。任何合适的载体可以用于将编码本文所述的基于蛋白质的治疗剂的多核苷酸引入到宿主中。已经在文献中描述的示例性载体包含复制缺陷型逆转录病毒载体，包含但不限于慢病毒载体[Kim等人,《病毒学杂志(J.Virol.)》,72(1):811-816(1998)；Kingsman和Johnson,《脚本杂志(Scrip Magazine)》,10月,1998,第43 46页.]；腺相关病毒(AAV)载体[美国专利第5,474,935号；美国专利第5,139,941号；美国专利第5,622,856号；美国专利第5,658,776号；美国专利第5,773,289号；美国专利第5,789,390号；美国专利第5,834,441号；美国专利第5,863,541号；美国专利第5,851,521号；美国专利第5,252,479号；Gnatenko等人,《研究医学杂志(J.Invest.Med.)》,45:8798(1997)]；腺病毒(AV)载体[参见例如，美国专利第5,792,453号；美国专利第5,824,544号；美国专利第5,707,618号；美国专利第5,693,509号；美国专利第5,670,488号；美国专利第5,585,362号；Quantin等人,《美国国家科学院院刊》,89:2581 2584(1992)；Stratford Perricadet等人,《临床研究杂志(J.Clin.Invest.)》,90:626 630(1992)；以及Rosenfeld等人,《细胞(Cell)》,68:143155(1992)]；腺病毒腺相关病毒嵌合体(参见例如，美国专利第5,856,152号)或牛痘病毒或疱疹病毒(参见例如，美国专利第5,879,934号；美国专利第5,849,571号；美国专利第5,830,727号；美国专利第5,661,033号；美国专利第5,328,688号)；脂质体介导的基因转移(BRL)；脂质体载体[参见例如，美国专利第5,631,237号(包括仙台病毒(Sendaivirus)蛋白)]；及其组合。所有前述文档通过引用整体并入本文。复制缺陷型腺病毒载体构成优选实施例。
还考虑了包括本文所述的抗CRH抗体或其抗原结合片段(或CRH肽片段)的药物组合物。在一些实施例中，药物组合物含有用于修改、维持或保持例如组合物的pH、渗透压、粘度、透明度、颜色、等渗性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附性或渗透性的调配物材料。在此类实施例中，合适的调配物材料包含但不限于氨基酸(如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸或赖氨酸)；抗微生物剂；抗氧化剂(如还原剂、氧/自由基清除剂和螯合剂(例如，抗坏血酸、EDTA、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠))；缓冲液(如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其它有机酸)；膨胀剂(如甘露醇或甘氨酸)；螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖；二糖；和其它碳水化合物(如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐反离子(如钠)；防腐剂(如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(如甘露醇或山梨醇)；悬浮剂；表面活性剂或润湿剂(如普朗尼克(pluronic)、PEG、脱水山梨醇酯、聚山梨醇酯，如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯、曲通(triton)、氨丁三醇、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙帕(tyloxapal))；稳定性增强剂(如蔗糖或山梨醇)；张力增强剂(如碱金属卤化物，优选地氯化钠或氯化钾，甘露醇山梨醇)；递送载剂；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。参见《雷明顿药物科学(REMINGTON'S PHARMACEUTICALSCIENCES)》,第18版,(A.R.Genrmo编辑),1990,马克出版公司(Mack PublishingCompany)。
本文所述的特定调配物材料的选择可以由例如预期的施用途径、递送形式和所需剂量驱动。参见例如，《雷明顿药物科学》，同上。药物组合物中的主要载剂或载体本质上可以是水性或非水性的。例如，合适的载剂或载体可以是注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊液，可能地补充有用于肠胃外施用的组合物中常见的其它材料。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是另外的示例性载剂。在具体实施例中，药物组合物包括约pH 7.0-8.5的Tris缓冲液或约pH4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，并且可以进一步包含山梨醇或其合适的替代物。在某些实施例中，可以通过将具有所需纯度的所选组合物与呈冻干饼或水溶液形式的任选的调配物药剂(雷明顿药物科学,同上)混合来制备用于储存的组合物。进一步地，在一些实施例中，可以使用适当的赋形剂(如蔗糖)将抗体或(其抗原结合片段)调配成冻干物。
可以选择本发明的药物组合物用于肠胃外递送。可替代地，组合物可以被选择用于吸入或用于通过消化道递送，如口服递送。此类药学上可接受的组合物的制备在本领域的技术范围内。调配物组分优选地以施用位点可接受的浓度存在。在某些实施例中，使用缓冲液将组合物维持在生理pH或稍微更低的pH，通常处于约5到约8的pH范围内。
当考虑肠胃外施用时，组合物可以以无热原的、肠胃外可接受的水溶液的形式提供，所述水溶液包括在药学上可接受的载剂中的所需抗体或片段。用于肠胃外注射的特别合适的载剂是无菌蒸馏水，其中抗体或片段被调配成被适当地保存的无菌的等渗溶液。在某些实施例中，可植入药物递送装置可以用于引入所需抗体(或其抗原结合片段)。
另外的药物组合物对于本领域的技术人员将是显而易见的，包含涉及持续或受控递送调配物中的抗原结合蛋白的调配物。用于调配多种其它持续或受控递送方式(如脂质体载体、生物可蚀性微粒或多孔珠粒和仓库注射(depot injection))的技术也是本领域的技术人员已知的。参见例如国际专利申请号第PCT/US93/00829号，所述国际专利申请通过引用并入并且描述了用于递送药物组合物的多孔聚合物微粒的控制释放。持续释放制剂可以包含呈成型制品(例如，膜或微胶囊)形式的半渗透性聚合物基质。持续释放基质可以包含聚酯、水凝胶、聚交酯(如美国专利第3773919号和欧洲专利申请公开号EP058481中所公开的，所述专利申请中的每个专利申请通过引用并入)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等人,1983,《生物聚合物(Biopolymers)》2:547-556)、聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人,1981,《生物医学材料研究杂志(J.Biomed.Mater.Res.)》15:167-277和Langer,1982,《化学技术(Chem.Tech.)》12:98-105)、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人,1981,同上)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(欧洲专利申请公开号EP133988)。持续释放组合物还可以包含脂质体，所述脂质体可以通过本领域已知的若干方法中的任一种来制备。参见例如，Eppstein等人,1985,《美国国家科学院院刊》82:3688-3692；欧洲专利申请公开号EP036676；EP088046和EP143949，所述专利申请通过引用并入。
抗体调配物的实施例可以进一步包括一种或多种防腐剂。
待采用的含有抗体的药物组合物的治疗有效量将取决于例如治疗环境和目标。本领域的技术人员将理解，用于治疗的适当剂量水平将部分地根据所递送的分子、使用抗体的一种或多种适应症、施用途径以及患者的大小(体重、体表或器官大小)和/或病状(年龄和一般健康状况)而变化。
本文所述的组合物的施用将通过任何常见途径进行，只要靶组织是通过所述途径可获得的。可以将药物组合物通过任何常规方法引入到受试者中，例如通过静脉内、皮内、肌内、乳房内、腹膜内、鞘内、眼内、球后、肺内(例如，定期释放(term release))；通过口服、舌下、鼻、肛门、阴道或经皮递送，或通过在特定位点(例如，嵌入在脾囊、脑下或角膜中)的外科手术植入。治疗可以由单个剂量或一段时间内的多个剂量组成。在一些实施例中，组合物通过局部施用向大脑递送。
治疗方法
本文所述的抗体或其抗原结合片段、CRH肽片段和药物组合物可用于治疗或预防与CRH失调或下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴活化相关的病症(例如，应激相关病症和/或癌症)。HPA轴包含三种内分泌腺之间的正和负反馈相互作用：形成神经内分泌系统的下丘脑、脑下垂体和肾上腺。由内分泌腺释放的激素控制对应激的反应、身体过程(如消化)的调节、免疫系统、心情和情绪、性和能量储存和消耗。HPA轴在若干种精神病学和神经精神病学疾病中以及在酒精中毒和中风中是失调的。HPA轴生物标志物的实例包含ACTH和皮质醇。皮质醇抑制促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)的分泌，从而导致ACTH分泌的反馈抑制。当人类暴露于慢性应激时，这种正常反馈回路可能分解，并且可能是抑郁症的根本原因。
慢性心理应激和HPA-轴扰动与许多疾病和病状相关，包含但不限于阿尔茨海默氏病、焦虑病症、重性抑郁症、创伤后应激病症、成瘾、代谢综合征、骨质疏松症和少肌症。进一步地，慢性应激、HPA-轴功能障碍以及皮质醇升高已经被牵涉为对于衰老的负面生理后果的促进剂。具体考虑了通过向有需要的受试者施用本文所述的抗CRH抗体来治疗这些病症/病状中的一种或多种病症/病状。
“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是指至少改善与折磨患者的视网膜相关疾病相关的一种或多种症状，其中改善在广义上用于指代至少减小参数的量值，例如与所治疗的疾病相关的症状。如此，治疗进一步包含以下情况：病理病状或至少与其相关的症状被完全抑制，例如预防发生或停止(例如，终止)，使得患者不再患有损伤或至少表征损伤的症状。在某些情况下，“治疗”、“治疗”等是指获得所需的药理学和/或生理学作用。就完全或部分预防疾病或其症状而言，所述效果可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的副作用而言可以是治疗性的。“治疗”可以是受试者中疾病的任何治疗，且包含：(a)预防疾病在可能易患疾病但尚未诊断患有所述疾病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即，遏制其发展；或(c)缓解疾病，即，使疾病消退。治疗可以导致各种不同的身体表现，例如，基因表达的调节、神经发生增加、组织或器官的再生等。治疗正在进行的疾病在一些实施例中发生，其中治疗稳定或减少患者的不良临床症状。此类治疗可以在受影响组织中的功能完全丧失之前进行。可以在疾病的症状阶段期间，并且在一些情况下，在疾病的症状阶段之后，施用主题疗法。术语“预防(preventing)”不意指疾病的100％抑制。
慢性应激与许多行为和生理发病率相关。心理应激促成许多行为或精神病状，包含但不限于广泛性焦虑病症、惊恐病症、重性抑郁症、阿尔茨海默氏病和创伤后应激病症(PTSD)。还已经显示慢性应激具有不利的心血管和免疫作用。CRH是HPA应激反应的主要协调者，并且与焦虑症、成瘾、重性抑郁症和PTSD的动物模型密切相关。进一步地，阿尔茨海默氏病应激和CRH是淀粉样蛋白和tau病理学两者的强大促进剂，并且CRH在阿尔茨海默氏病的临床前模型中驱动淀粉样蛋白病理学。因此，本公开考虑了治疗或预防以下的方法：焦虑症、抑郁症、阿尔茨海默氏病(Alzheimer's Disease)、创伤后应激病症、广泛性焦虑病症、重性抑郁症、神经性厌食症、创伤后应激病症、肾上腺病症、代谢综合征、1型糖尿病、少肌症和多发性硬化症。
已经在癌组织和细胞系中检测到CRH并且可以刺激MCF7乳腺癌细胞的细胞运动性和侵袭性(Androulidaki等人,《分子癌症(Mol.Cancer)》,8:30,2009)。因此，本公开考虑了治疗有需要的受试者的癌症的方法。示例性癌症包含但不限于食管癌、胰腺癌、转移性胰腺癌、胰腺转移性腺癌、膀胱癌、胃癌(stomach cancer)、纤维化癌、神经胶质瘤、恶性神经胶质瘤、弥漫性真性脑桥神经胶质瘤、复发性儿童脑瘤肾细胞癌、透明细胞转移性肾细胞癌、肾癌、前列腺癌、转移性去势抵抗性前列腺癌、IV期前列腺癌、转移性黑素瘤、黑素瘤、恶性黑素瘤、皮肤的复发性黑素瘤、黑素瘤脑转移、IIIA期皮肤黑素瘤；IIIB期皮肤黑素瘤、IIIC期皮肤黑素瘤；IV期皮肤黑素瘤、头颈部恶性黑素瘤、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、鳞状细胞非小细胞肺癌、乳腺癌、复发性转移性乳腺癌、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin'slymphoma)、滤泡性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、晚期B细胞NHL、包含弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)的HL、多发性骨髓瘤、慢性髓性白血病、缓解期的成人急性髓性白血病；具有Inv(16)(p13.1q22)的成年急性髓性白血病；CBFB-MYH11；具有t(16；16)(p13.1；q22)的成人急性髓性白血病；CBFB-MYH11；具有t(8；21)(q22；q22)的成人急性髓性白血病；RUNX1-RUNX1T1；具有t(9；11)(p22；q23)的成人急性髓性白血病；MLLT3-MLL；具有t(15；17)(q22；q12)的成人急性早幼粒细胞白血病；PML-RARA；烷化剂相关的急性髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、里克特综合征(richter's syndrome)；华氏巨球蛋白血症(waldenstrommacroglobulinemia)、成人胶质母细胞瘤；成人神经胶质肉瘤、复发性胶质母细胞瘤、复发性儿童横纹肌肉瘤、复发性尤文肉瘤(recurrent Ewing sarcoma)/外周原始神经外胚层肿瘤、复发性神经母细胞瘤；复发性骨肉瘤、结肠直肠癌、MSI阳性结肠直肠癌；MSI阴性结肠直肠癌、鼻咽非角质化癌(nasopharyngeal nonkeratinizing carcinoma)；复发性鼻咽未分化癌(recurrent nasopharyngeal undifferentiated carcinoma)、宫颈腺癌；宫颈腺鳞状癌(cervical adenosquamous carcinoma)；宫颈鳞状细胞癌；复发性宫颈癌；IVA期宫颈癌；IVB期宫颈癌、肛管鳞状细胞癌；转移性肛管癌；复发性肛管癌、复发性头颈癌；头颈部鳞状细胞癌(carcinoma,squamous cell of head and neck)、头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma)(HNSCC)、卵巢癌、结肠癌、胃癌(gastriccancer)、晚期GI癌、胃腺癌；胃食管连接部腺癌(gastroesophageal junctionadenocarcinoma)、骨肿瘤、软组织肉瘤；骨肉瘤、胸腺癌、尿路上皮癌、复发性梅克尔细胞癌(recurrent merkel cell carcinoma)；III期梅克尔细胞癌；IV期梅克尔细胞癌、骨髓增生异常综合征和复发性蕈样真菌病(recurrent mycosis fungoides)和塞扎里综合征(Sezary syndrome)。
在一些实施例中，向患有结肠癌、乳腺癌或脑癌的受试者施用本文所述的抗CRH抗体。
考虑的是，一旦癌症已经进入缓解，本文的方法就减少肿瘤负荷和/或减少受试者的转移和/或减少或预防肿瘤的复发。在各个实施例中，所述方法将肿瘤大小减小10％、20％、30％或更多。在各个实施例中，所述方法将肿瘤大小减小10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
在一些实施例中，以有效减少或抑制皮质酮对应激的应答、治疗或预防应激相关病症、治疗癌症、降低肿瘤负荷或在CRH肽片段的情况下，诱导对CRH的免疫应答的量施用抗体或抗原结合片段(或CRH肽片段)的一个或多个剂量并且持续一段时间。例如，本文所述的抗体或其抗原结合片段(或CRH肽片段)的一次或多次施用任选地在治疗时间段内进行，例如约1周到约24个月(例如，约1个月到约12个月、约1个月到约18个月、约1个月到约9个月或约1个月到约6个月或约1个月到约3个月)。在一些实施例中，在以下治疗时间段内向受试者施用本文所述的抗体或其片段(或CRH肽)的一个或多个剂量：例如，约1个月到约12个月(52周)(例如，约2个月、约3个月、约4个月、约5个月、约6个月、约7个月、约8个月、约9个月、约10个月或约11个月)。
根据为特定受试者选择的治疗方案，以有规律的间隔施用多剂量的抗体或抗原结合片段(或CRH肽片段)可能是有利的。在一些实施例中，在一年(12个月，52周)或更短(例如，9个月或更短、6个月或更短或3个月或更短)的时间段内周期性地施用抗体或其片段。在此方面，抗体或其片段每隔约3天或约7天或2周或3周或4周或5周或6周或7周或8周或9周或10周或11周或12周或13周或14周或15周或16周或17周或18周或19周或20周或21周或22周或23周或6个月或12个月向人施用一次。
在各个实施例中，向受试者(例如，人受试者)施用包括约50毫克到约1,000毫克的抗体或其抗原结合片段(或CRH肽片段)的一个或多个剂量。例如，剂量可以包括至少约5mg、至少约15mg、至少约25mg、至少约50mg、至少约60mg、至少约70mg、至少约80mg、至少约90mg、至少约100mg、至少约120mg、至少约150mg、至少约200mg、至少约210mg、至少约240mg、至少约250mg、至少约280mg、至少约300mg、至少约350mg、至少约400mg、至少约420mg、至少约450mg、至少约500mg、至少约550mg、至少约600mg、至少约650mg、至少约700mg、至少约750mg、至少约800mg、至少约850mg、至少约900mg、至少约950mg或至多约1,000mg的抗体。还考虑了任何和所有这些端点之间的范围，例如约50mg到约80mg、约70mg到约140mg、约70mg到约270mg、约75mg到约100mg、约100mg到约150mg、约140mg到约210mg或约150mg到约200mg或约180mg到约270mg。剂量是以任何间隔施用的，如一周多次(例如，每周两次或三次)、一周一次、每两周一次、每三周一次或每四周一次。
在一些实施例中，所述一个或多个剂量可以包括每千克受试者体重(mg/kg)介于约0.1到约50毫克之间(例如，介于约5与约50毫克之间)或约1到约100毫克之间的抗体(或其抗原结合片段或CRH肽片段)。例如，剂量可以包括至少约0.1mg/kg、至少约0.5mg/kg、至少约1mg/kg、至少约2mg/kg、至少约3mg/kg、至少约4mg/kg、至少约5mg/kg、至少约6mg/kg、至少约7mg/kg、至少约8mg/kg、至少约9mg/kg、至少约10mg/kg、至少约20mg/kg、至少约25mg/kg、至少约26mg/kg、至少约27mg/kg、至少约28mg/kg、至少约29mg/kg、至少约30mg/kg、至少约31mg/kg、至少约32mg/kg、至少约33mg/kg、至少约34mg/kg、至少约35mg/kg、至少约36mg/kg、至少约37mg/kg、至少约38mg/kg、至少约39mg/kg、至少约40mg/kg、至少约41mg/kg、至少约42mg/kg、至少约43mg/kg、至少约44mg/kg、至少约45mg/kg、至少约46mg/kg、至少约47mg/kg、至少约48mg/kg、至少约49mg/kg、至少约50mg/kg、至少约55mg/kg、至少约60mg/kg、至少约65mg/kg、至少约70mg/kg、至少约75mg/kg、至少约80mg/kg、至少约85mg/kg、至少约90mg/kg、至少约95mg/kg或至多约100mg/kg。还考虑了任何和所有这些端点之间的范围，例如约1mg/kg到约3mg/kg、约1mg/kg到约5mg/kg、约1mg/kg到约8mg/kb、约3mg/kg到约8mg.kg、约1mg/kg到约10mg/kg、约1mg/kg到约20mg/kg、约1mg/kg到约40mg/kg、约5mg/kg到约30mg/kg或约5mg/kg到约20mg/kg。
组合疗法
在各个实施例中，将本文所述的抗CRH抗体或其片段与可用于治疗与HPA轴活化相关的病状或病症(例如，癌症)的另外的治疗剂组合施用。
两种治疗剂的同时施用不要求药剂同时或通过同一途径施用，只要在所述药剂发挥其治疗作用的时间段中存在重叠即可。考虑了同时或顺序施用，如在不同天或周施用。
另外的治疗剂可以是其它治疗剂，如细胞因子、生长因子、其它抑制剂以及可用于治疗癌症或免疫病症的靶抗原的抗体，例如伊匹木单抗(ipilimumab)(
Figure BDA0002853545120000281
百时美施贵宝公司(Bristol-Myers Squibb Company))，CTLA-4的抗体；贝伐单抗(bevacizumab)(
Figure BDA0002853545120000282
基因泰克公司(Genentech))，VEGF-A的抗体；厄洛替尼(
Figure BDA0002853545120000283
基因泰克公司和OSI制药公司(OSI Pharmaceuticals))，作用于EGFR、达沙替尼(dasatinib)(
Figure BDA0002853545120000284
百时美施贵宝公司)的酪氨酸激酶抑制剂，口服Bcr-Abl酪酮激酶抑制剂；IL-21；聚乙二醇化IFN-α2b；阿昔替尼(
Figure BDA0002853545120000285
辉瑞公司(Pfizer,Inc.))、酪氨酸激酶抑制剂；以及曲美替尼(trametinib)(
Figure BDA0002853545120000286
葛兰素史克公司(GlaxoSmithKline))，MEK抑制剂(Philips和Atkins,《国际免疫学杂志(Int Immunol.)》,27(1):39-46(2015)，所述文献通过引用并入)。
考虑的是，抗CRH抗体或抗体片段和另外的治疗剂可以在同一的调配物中同时给予。进一步考虑的是，抗CRH抗体和另外的治疗剂在分开的调配物中施用并且同时施用，同时是指在彼此的30分钟内给予的药剂。
在另一方面，在施用另外的治疗剂之前施用抗CRH抗体或其片段。预先施用是指在用另外的治疗剂治疗之前一周的范围内直到施用另外的治疗剂之前30分钟施用抗CRH抗体。进一步考虑的是，在施用另外的治疗剂之后施用抗CRH抗体。随后施用意在描述从施用另外的治疗剂之后30分钟到施用另外的治疗剂之后至多一周的施用。
进一步考虑的是，在适当的情况下，可以施用其它辅助疗法。例如，在适当的情况下，还可以向患者施用外科手术疗法、化学疗法、细胞毒性剂、光动力疗法或放射疗法。
考虑与本公开的药剂一起使用的化学治疗剂包含但不限于表I中列出的那些化学治疗剂：
表I
Figure BDA0002853545120000291
Figure BDA0002853545120000301
Figure BDA0002853545120000311
试剂盒
一旦药物组合物被调配，其就可以作为溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体、晶体或作为脱水或冻干粉末储存在无菌小瓶中。此类调配物可以以即用形式或以在施用之前重构的形式(例如，冻干)储存。本发明还提供了用于生产单剂量施用单位的试剂盒。本公开的试剂盒可以各自含有具有经干燥的蛋白质的第一容器和具有水性调配物的第二容器两者。在某些实施例中，提供了含有单室和多室预填充注射器(例如，液体注射器和冻干注射器)的试剂盒。
提供以下实例以进一步说明本公开的方面，并且不旨在将本公开限制于任何特定应用或操作理论。
实例
实例1—通过活性免疫生成抗CRH抗体
野生型小鼠皮下注射在200μL的完全弗氏佐剂中乳化的200μg的N末端CRH肽片段(肽A：SEEPPISLDLTFHLL(SEQ ID NO:1的氨基酸1-15；或SEQ ID NO:2)或肽B：SEEPPISLDLTFHLLREVLEM(SEQ ID NO:1的氨基酸1-21；或SEQ ID NO:3))，随后是以两周间隔IP注射的在不完全弗氏佐剂中乳化的200μg肽的两次加强。在最终加强之后，收集血清并且通过直接ELISA测定抗CRH滴度。参见图1。
实例2—N末端CRH肽片段在急性应激模型中的作用
向小鼠组(n＝17)仅施用CRH-OVA疫苗或OVA，并且接受如实例1中所描述的两次另外的加强。然后将小鼠暴露于90分钟的急性约束应激。在三个时间点抽取血浆并且通过放射免疫测定来测定皮质酮水平。CRH活性疫苗和对照以相同程度阻断对急性应激的皮质酮应答。
实例3—抗CRH单克隆抗体的亲和力
结合本文所述的N末端CRH肽的抗体表现出对CRH的高亲和力。结合SEQ ID NO:2的抗CRH抗体(抗体A)表现出对靶标的皮摩尔水平亲和力(Kd小于1×10-12)。结合SEQ ID NO:3的抗CRH抗体(抗体B)表现出对靶标的纳摩尔水平亲和力(Kd＝2.09×10-8)。
实例4—抗CRH抗体阻断对急性应激的皮质酮应答
野生型小鼠组(n＝9)在暴露于30分钟的约束应激之前12小时用25mg/kg的抗CRH抗体A或盐水进行腹膜内注射。在四个时间点(0分钟、30分钟、90分钟和150分钟)抽取血浆并且通过放射免疫测定来测定皮质酮水平。用抗CRH抗体B重复同一实验，除了使用更大的野生型小鼠组(n＝10)之外。如图4B所示，抗CRH抗体B阻断对急性应激的皮质酮应答。抗体B的施用在30分钟时将皮质酮水平降低至少四倍，此时去除约束应激并且皮质酮水平在对照小鼠中处于其最高水平。
实例5—库欣病(Cushing's Disease)的动物模型中的抗CRH抗体逆转的毛发缺损
野生型小鼠脑室内注射有AAV8-CRH，从而导致在脑内过表达CRH以诱导库欣样(cushingoid)表型(即，毛发缺损、红皮肤和肥胖)。如图5所示，抗CRH抗体B(0.3mg)的一次腹膜内注射逆转了观察到的毛发缺损。
实例6—单链可变片段结合CRH
ScFv构建体提供了能够通过AAV载体向脑递送的优点。产生了由通过连接子肽连接的抗体A和抗体B的重可变区和轻可变区构成的ScFv的DNA构建体。抗体A和抗体B scFv的氨基酸序列分别在SEQ ID NO:22和23中所示。然后将DNA构建体转染到人胚肾(HEK)293t细胞中并温育48小时。然后裂解细胞并且通过直接CRH ELISA分析其CRH结合。如图6所示，包括抗体A或抗体B的重可变区和轻可变区的所得ScFv与CRH结合。
实例7—抗CRH抗体的人源化
图7提供了抗CRH抗体B的可变区与类似的人可变框架之间的比较。突出显示的是抗体B的互补决定区(CDR)。在不改变抗体B的CDR的情况下，抗体B的可变区的框架可以被改变以与人框架的那些框架相匹配。
实例8—抗CRH抗体体外阻断CRHR1活化
将CRHR1稳定过表达性H4神经胶质瘤细胞与含合成CRH(巴亨公司(Bachem))或经过纯化的抗体B(QED生物科学公司(QED bio))的PBS组合温育10分钟。处理后，将细胞在0.1M HCl和1％Triton中裂解，并且然后通过竞争性ELISA试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher)EMSCAMPL)来分析环AMP水平。如图8所示，抗体B能够减少CRH诱导的环AMP的增加。
实例9-抗CRH抗体降低体内皮质酮水平
野生型(C3B6H)小鼠单独圈养2个月(轻度应激)。然后用不同剂量的抗体B(n＝4每组，性别平衡)处理小鼠并且使其经受30分钟的急性约束应激。如图9中所示，用抗体B处理的小鼠展示出清楚的剂量-应答类型的作用曲线(左侧)，并且甚至低剂量(1.5mg/kg)的抗体B能够降低单独圈养2个月的小鼠中的基线皮质酮水平。
实例10—慢性可变应激
使2.5个月龄的野生型(C3B6)小鼠经受2周的慢性可变应激。每天两个应激源×1小时。用25mg/kg的抗体B或小鼠IgG1同种型对照(以上n个数，性别平衡)处理小鼠。参见图10。
如图11A所示，在处理2.5周和慢性可变应激(CVS)2周之后，用抗体B处理抑制皮质酮应答。用抗体B处理还显著增加了应激小鼠的重量增加(重量增加适用于2.5个月龄的小鼠)。参见图10B。抗体B处理不会增加皮下脂肪并且显著降低肠系膜(内脏)脂肪水平。参见图10C和10D。
用抗体B处理显著增加了脾细胞结构和转移的白细胞群以增加B细胞百分比和降低T细胞百分比(图10E、F和G)。如图10H和10I所示，抗体B处理显著降低了脾中的炎性单核细胞和NK细胞。
实例11—脑RNA转录组学分析
用抗体B或小鼠IgG1对照抗体处理小鼠(n＝6M C57BL/6J小鼠)持续2.5周—25mg/kg IP初始注射，随后每周一次IP注射12.5mg/kg。
在2.5周结束时，从小鼠收获肌肉、肝脏、脾和脂肪。将收获的器官在干冰上冷冻的异戊烷中快速冷冻。在液氮下使用研钵和研杵粉碎经过抗体B处理的组织和对照组织，并且用Trizol(赛默飞世尔科技公司)试剂提取总RNA。通过Qiagen RNeasy柱，用柱上DNase处理来清洗RNA。使用无TURBO DNA的试剂盒(安柏恩公司(Ambion))进行随后的DNase处理。使用Qubit 4荧光计和RNA HS测定(赛默飞世尔科技公司)对RNA进行定量。使用片段分析仪自动CE系统和标准灵敏度RNA分析试剂盒(高级分析)来确定RNA质量。将1微克的总RNA富含polyA，并且使用TruSeq RNA样品制备试剂盒v2(依诺米那公司(Illumina))使其经受文库制备。使用文库定量试剂盒(KAPA生物系统公司(KAPA Biosystems))对文库进行定量。用高灵敏度NGS片段分析试剂盒(高级分析)确定文库大小。通过策略汇集文库，以使来自文库制备和测序的批次作用最小化并且实现每个样品30-50M读数。
使用STAR(Dobin等人,2013)针对小鼠基因组比对所得FASTQ文件。在R版本3.5.1内进行随后的分析。将用DESeq2进行差异基因表达分析。将每个组织内的处理组与对照组之间的基因表达水平的变化进行比较，以发现差异表达的基因。进行加权基因共表达网络分析(WGCNA)以确定样品中具有类似表达模式的基因的模块(Langfelder和Horvath,2007,2008)。使用分别针对脑、肌肉、肝脏、脾和脂肪组织的6、4、6、4和7的软功率设置(β)，用WGCNA检测有符号的混合网络。检查来自与抗体处理组显著相关的模块的模块内枢纽基因的标识，并且使用与WGCNA包装相关的anRichment分析显著模块内的基因的网络途径和基因本体。使用R内的geomnet包装，使用属于每个模块的前20％的基因，使网络可视化。参见图12。
实例12—免疫图谱
用磨砂载玻片处理来自上文实例11中所描述的同一小鼠的脾(用抗体B处理2.5周后)并过滤(70微米)以产生单细胞悬浮液。在冰上用氯化铵-钾裂解缓冲液裂解红细胞五分钟，并且在染色之前用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤其余的细胞。用可固定的活/死近红外Thermofisher(美国马萨诸塞州沃尔瑟姆)对每个样品1×106个细胞进行染色以排除死细胞。在用以下抗体在适当浓度下在冰上染色三十分钟之前，将细胞与Fc块(2.4G2；BD生物科学公司(BD Biosciences))在冰上温育五分钟：CD4-PerCP-Cy5.5(RM4-5；eBioscience)、CD8a-PE-Cy7(53-6.7；百进生技公司(Biolegend))、CD3e-BV605(145-2C11；百进生技公司)、NK1.1-APC(PK136；eBioscience)、CD19-BV711(6D5；百进生技公司)、Ly6G-BV421(1A8；BD百进生技公司(BD Biosciences))、Ly6C-PE(HK1.4；eBioscience)、CD11b-AF488(M1/70；eBioscience)。在LSR Fortessa(BD百进生技公司)上采集数据并使用FlowJo(v10.5.0；Tree Star公司(Tree Star))进行分析之前，将样品洗涤一次。百进生技公司(美国加利福尼亚州圣地亚哥)。eBioscience(美国加利福尼亚州圣地亚哥)。如图13所示，其显示了用抗体B处理的活脾细胞的量连同增加的B细胞和T细胞的显著增加。
实例13—用抗体B处理增加了GL261颅内小鼠神经胶质瘤模型中的存活率。
在8-12周龄的成年雌性C57Bl6/J小鼠(N＝8每组)中，使用立体定向注射，在颅骨下方3mm处和前囟侧2mm处，以2.5uL体积将1:1的PBS:甲基纤维素溶液中的10,000GL261细胞颅内注射。然后监测小鼠进展到如在UF IACUC201607966中所描述的人源化端点。经过处理的小鼠在肿瘤植入之后五天接受腹膜内注射400ug抗PD1抗体、400μg抗体B或两者(克隆RMP1-14，BioXCell)，然后每五天接受200μg抗PD1和200μg抗体B，总共五个剂量。如图14所示，用抗体B(以及抗体B和抗PD1抗体的组合)处理增加了GL261颅内小鼠神经胶质瘤模型中的存活率，存活时间比未经处理的动物长超过两倍。
实例14—抗体B对CRF具有特异性
直接ELISA，其中将1uM(左侧)或10uM(右侧)的CRF或CRF家族神经肽尿皮素(UCN)1、UCN2或UCN3包被到聚碳酸酯96孔ELISA板上。然后以13.33nM添加抗体B并温育两小时，随后添加抗小鼠IgG-HRP缀合的检测抗体。然后使用TMB试剂显色ELISA并且使用分光光度计在450nM下读取。
Octet red BLI:链霉亲和素探针与UCN 2-BTN结合，并且然后用不同浓度的抗体B测量缔合和解离常数。
直接ELISA显示，抗体B与UCN 1-3在1uM包被下没有交叉反应性，而与UCN2在10uM包被下具有少量的反应性(图15)。
如图16所示，Octet red Biolayer干涉测量法计算了抗体B与UCN2肽的解离常数Kd＝4.0E-9。此亲和力比抗体B与CRF肽的亲和力低4000倍。由于CRF和UCN2在体内以类似的500pM-2nM浓度运行，因此将不会假设在UCN2与抗体B之间在体内发生可感知量的靶接合。
整个文档旨在作为统一的公开而相关，并且应当理解，即使没有在本文档的同一句子或段落或部分中一起发现特征的组合，也考虑本文所述的特征的所有组合。另外，作为另外的方面，本公开包含以任何方式比上文具体提及的变型在范围上更窄的本公开的所有实施例。关于通过“一个(a)”或“一种(an)”描述或要求保护的方面，应当理解，这些术语意指“一个或多个”，除非上下文明确地要求更受限的含义。关于被描述为组内的一个或多个元件的元件，应当理解，考虑了组内的所有组合。如果本公开的各方面被描述为“包括(comprising)”特征，则还考虑了“由所述特征组成(consisting of)”或“基本上由所述特征组成(consisting essentially of)”的实施例。
本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利申请被具体且单独地指示通过引用并入本文。尽管已经出于清楚理解的目的通过说明和实例的方式相当详细地描述了前述内容，但是鉴于本发明的教导，对于本领域的普通技术人员将容易地清楚的是，在不偏离所附权利要求书的精神或范围的情况下，可以对其进行某些改变和修改。

Claims (34)

1. 一种抗体或其抗原结合片段，其与促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）的包括SEQ IDNO: 1的氨基酸1-21的区域特异性结合。
2. 根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQ ID NO: 12-17中所示的一组6个CDR。
3. 根据权利要求1或权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO: 19中所示的氨基酸序列。
4. 根据权利要求1到3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包括轻链可变区，所述轻链可变区包括SEQ ID NO: 18中所示的氨基酸序列。
5. 根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体与CRH的包括SEQ IDNO: 1的氨基酸1-15的区域特异性结合。
6. 根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQ ID NO: 4-9中所示的一组6个CDR。
7. 根据权利要求5或权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO: 11中所示的氨基酸序列。
8. 根据权利要求5到7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包括SEQ ID NO: 10中所示的轻链可变区。
9.根据权利要求1到8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其是单克隆抗体。
10.根据权利要求1到9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其是人源化抗体。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其是IgG。
12.根据权利要求1到11中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是Fab片段或scFv。
13. 根据权利要求12所述的抗体或抗原结合片段，其中所述scFv包括SEQ ID NO: 22或SEQ ID NO: 23中所示的氨基酸序列。
14.一种抑制受试者对应激的皮质酮应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效抑制对应激的所述皮质酮应答的量的根据权利要求1到13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
15.一种治疗有需要的受试者的应激相关病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效治疗所述病症的量的根据权利要求1到13中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
16. 根据权利要求15所述的方法，其中所述应激相关病症选自由以下组成的组：焦虑症、抑郁症、阿尔茨海默氏病（Alzheimer's Disease）、创伤后应激病症、广泛性焦虑病症、重性抑郁症、神经性厌食症、创伤后应激病症、肾上腺病症、代谢综合征、1型糖尿病、少肌症和多发性硬化症。
17.一种诱导有需要的受试者对促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效诱导所述受试者的免疫应答的量的CRH的氨基末端肽片段。
18. 根据权利要求17所述的方法，其中所述CRH的所述氨基末端片段由SEQ ID NO: 2中所示的氨基酸序列组成。
19. 根据权利要求17所述的方法，其中所述CRH的所述氨基末端片段由SEQ ID NO: 3中所示的氨基酸序列组成。
20.根据权利要求18或权利要求19所述的方法，其中所述肽片段与T细胞反应性表位缀合。
21. 根据权利要求20所述的方法，其中所述T细胞反应性表位是来自以下的抗原肽：破伤风类毒素、白喉类毒素、恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）、流感病毒或乙型肝炎病毒。
22.根据权利要求14到21中任一项所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用佐剂。
23. 一种治疗有需要的受试者的应激相关病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效治疗所述受试者的所述病症的量的SEQ ID NO: 1的氨基末端肽片段。
24.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1到13中任一项所述的抗体。
25.根据权利要求24所述的方法，其进一步包括向所述受试者施用癌症免疫疗法。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述癌症免疫疗法是抗PD1抗体和抗CTLA4抗体。
27.根据权利要求24所述的方法，其中所述癌症是癌、黑素瘤、肉瘤、骨髓瘤、白血病或淋巴瘤。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述癌症是脑癌、乳腺癌或结肠癌。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述乳腺癌是三阴性乳腺癌。
30.一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1到13中任一项所述的抗体以及抗PD1抗体。
31.一种诱导有需要的受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1到13中任一项所述的抗体。
32.根据权利要求31所述的方法，其中诱导免疫应答包括所述受试者的T细胞计数增加至少X%。
33.根据权利要求31所述的方法，其中诱导免疫应答包括所述受试者的B细胞计数增加至少X%。
34.一种抑制有需要的受试者的下丘脑垂体肾上腺（HPA）轴的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1到13中任一项所述的抗体。
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