CN112322728B - 适用于前列腺癌预后的标志物及检测方法与试剂 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了适用于前列腺癌预后的标志物及检测方法与试剂，包括尿液外泌体fam230a；本发明还公开了适用于前列腺癌预后的标志物的检测方法，包括以下步骤：S1.准备尿液15‑25毫升；S2.温度在3‑5°C条件下，离心力为2500‑3500g，离心8‑12分钟，去除尿液中脱落细胞；S3.温度在3‑5°C条件下，离心力为9000‑11000g，离心8‑12分钟，去除尿液中杂质；本发明还公开了适用于前列腺癌预后的标志物的检测方法用试剂，包括尿液、磷酸缓冲液、荧光PCR Mix、cDNA、上游引物、下游引物、fam230a探针和RNase‑free水。本发明中采用的标志物fam230a在尿液外泌体中的表达稳定，fam230a相比miRNAs具有更优良的判断前列腺癌预后的临床价值。
Description
技术领域
本发明属于前列腺癌技术领域，具体涉及适用于前列腺癌预后的标志物及检测方法与试剂。
背景技术
前列腺癌(PCa)是癌症相关的第二大原因男性死亡率，在中国每年有超过20万患者确诊为前列腺癌，同时每年有7万人死于前列腺癌。在前列腺癌晚期转移阶段，雄激素去势疗法(ADT)是临床一线治疗的标准方法，能够有效缓解并控制前列腺癌症状，疗效平均持续30个月以上。在美国，当ADT失效后，前列腺癌进入去势抵抗阶段(CRPC)，循环肿瘤细胞计数(CTCC)是唯一获得美国食品药品监督管理局(FDA)批准的前列腺癌预后标志物。CTCC需要在至少7.5毫升的血液中检测到超过5个循环肿瘤细胞，该技术使用昂贵并且从检测技术层面具有极高的挑战性。因此找到更易于使用的预后标志物是临床亟需解决的问题。不依赖于循环肿瘤细胞的核酸检测，特别是血液中的外泌体RNA为前列腺癌预后提供了更有优势的检测方向。外泌体是直径在40-150nm的囊泡，由细胞内形成并释放到细胞外环境，在人体内的循环系统中存在大量的外泌体。越来越多的临床研究证明，外泌体可以选择性富集RNA，而血液中外泌体RNA具有诊断，预后甚至治疗癌症患者的临床价值。已有数据证明，检测外泌体miRNA的表达量可用于预测前列腺癌去势抵抗患者的存活率。ADT疗法失效后的前列腺癌患者预后很不理想，并且患者的临床表现存在很大的差异。因此对患者个体预后情况的了解非常重要，并可以根据预后来选择治疗方案控制前列腺癌的进展。以目前的临床应用来看，除CTCC法以外，并没有很好的预后标志物供临床参考，而CTCC本身也存在极大的技术应用挑战。国际上的研究证实血液中的外泌体miRNA能够指导CRPC患者的预后，是比CTCC更有参考价值的前列腺癌预后标志物。
虽然外泌体miRNA在血液中的检测相比于CTCC更容易，但是miRNA数量有限，并且检测的miRNA靶点在不同肿瘤以及器官炎症中都有较高的表达，因此作为标志物的特异性不够理想，此外联合检测miR-375和miR-1290对CRPC患者预后的AUC仅有0.68，远低于作为有效标志物AUC需要高于0.8这一临床应用共识。因此寻找与前列腺癌预后相关性更高的分子标志物是临床亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供适用于前列腺癌预后的标志物及检测方法与试剂，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
适用于前列腺癌预后的标志物，包括尿液外泌体fam230a。
优选的，所述尿液外泌体fam230a的检测所用的引物探针序列包括：上游引物fam230a-F：AGTGAATGAACGGCAACACTTG；下游引物fam230a-R：AAACGCATGGTCTCCCAGAA；探针fam230a-P：CTCTCCTCCAGAGCCTCCA。
本发明还提供了适用于前列腺癌预后的标志物的检测方法，包括以下步骤：
S1.准备尿液15-25毫升；
S2.温度在3-5℃条件下，离心力为2500-3500g，离心8-12分钟，去除尿液中脱落细胞；
S3.温度在3-5℃条件下，离心力为9000-11000g，离心8-12分钟，去除尿液中杂质；
S4.用95-110kDa超滤管浓缩尿液至1.8-2.2毫升；
S5.温度在3-5℃条件下，离心力为90000-110000g，离心110-130分钟，去除1.75-2.0毫升上层溶液；
S6.在剩余的50-250微升溶液中再次加入50-150微升磷酸缓冲液并反复轻柔吹吸得到150-250微升外泌体溶液；
S7.用RNeasy Micro Kit提取外泌体的核酸；
S8.用TPrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA；
S9.在40-60微升体系中加入20-30微升荧光PCR Mix，4-6微升cDNA，0.8-1.2微升4-6微摩尔浓度的上游引物，0.8-1.2微升4-6微摩尔浓度的下游引物，0.8-1.2微升8-12微摩尔浓度的fam230a探针以及16-18微升RNase-free水；
S10.设置荧光PCR程序：S101.在温度为35-40℃工作4-6分钟；S102.在温度为90-100℃工作8-12分钟；S103.在温度为90-100℃工作13-17秒；S104.在温度为55-65℃工作40-50秒；S105.S103和S104将循环进行35-45次；
S11.根据荧光PCR仪器的运行结果统计CT值。
优选的，所述尿液为晨尿。
优选的，所述S11中荧光PCR仪器的阈值设置为自动。
优选的，包括以下步骤：
S1.准备尿液15-20毫升；
S2.温度在3-4℃条件下，离心力为2500-3000g，离心8-10分钟，去除尿液中脱落细胞；
S3.温度在3-4℃条件下，离心力为9000-10000g，离心8-10分钟，去除尿液中杂质；
S4.用95-100kDa超滤管浓缩尿液至1.8-2.0毫升；
S5.温度在3-4℃条件下，离心力为90000-100000g，离心110-120分钟，去除1.75-1.9毫升上层溶液；
S6.在剩余的50-200微升溶液中再次加入50-100微升磷酸缓冲液并反复轻柔吹吸得到150-200微升外泌体溶液；
S7.用RNeasy Micro Kit提取外泌体的核酸；
S8.用TPrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA；
S9.在40-50微升体系中加入20-25微升荧光PCR Mix，4-5微升cDNA，0.8-1.0微升4-5微摩尔浓度的上游引物，0.8-1.0微升4-5微摩尔浓度的下游引物，0.8-1.0微升8-10微摩尔浓度的fam230a探针以及16-17微升RNase-free水；
S10.设置荧光PCR程序：S101.在温度为35-37℃工作4-5分钟；S102.在温度为90-95℃工作8-10分钟；S103.在温度为90-95℃工作13-15秒；S104.在温度为55-60℃工作40-45秒；S105.S103和S104将循环进行35-40次；
S11.根据荧光PCR仪器的运行结果统计CT值。。
优选的，包括以下步骤：
S1.准备尿液20毫升；
S2.温度在4℃条件下，离心力为3000g，离心10分钟，去除尿液中脱落细胞；
S3.温度在4℃条件下，离心力为10000g，离心10分钟，去除尿液中杂质；
S4.用100kDa超滤管浓缩尿液至2.0毫升；
S5.温度在4℃条件下，离心力为100000g，离心120分钟，去除1.9毫升上层溶液；
S6.在剩余的100微升溶液中再次加入100微升磷酸缓冲液并反复轻柔吹吸得到200微升外泌体溶液；
S7.用RNeasy Micro Kit提取外泌体的核酸；
S8.用TPrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA；
S9.在50微升体系中加入25微升荧光PCR Mix，5微升cDNA，1.0微升5微摩尔浓度的上游引物，1.0微升5微摩尔浓度的下游引物，1.0微升10微摩尔浓度的fam230a探针以及17微升RNase-free水；
S10.设置荧光PCR程序：S101.在温度为37℃工作5分钟；S102.在温度为95℃工作10分钟；S103.在温度为95℃工作15秒；S104.在温度为60℃工作45秒；S105.S103和S104将循环进行40次；
S11.根据荧光PCR仪器的运行结果统计CT值。
本发明还提供了适用于前列腺癌预后的标志物的检测方法用试剂，包括尿液、磷酸缓冲液、荧光PCR Mix、cDNA、上游引物、下游引物、fam230a探针和RNase-free水。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明中采用的标志物fam230a在尿液外泌体中的表达稳定，fam230a相比miRNAs具有更优良的判断前列腺癌预后的临床价值。
附图说明
图1为本发明实施例6中30例出现CRPC患者与40例未出现CRPC患者尿液外泌体中长片段非编码RNA(lncRNA)表达谱示意图；
图2为本发明实施例6中在CRPC前列腺癌组织与癌旁对照组织、非CRPC前列腺癌组织与癌旁对照组织以及健康前列腺组织中分别检测fam230a的表达示意图；
图3为本发明实施例6中平行比较晚期肾癌组织、膀胱癌组织与肺癌组织中fam230a的表达示意图；
图4为本发明实施例6中四个时间点统计fam230a在外泌体中的荧光PCR的CT值示意图；
图5为本发明实施例6中以36个月作为评估fam230a是否能够有效指导前列腺癌CRPC预后的时间段示意图；
图6为本发明实施例6中用fam230a在尿液外泌体中的表达量预测100例前列腺癌术后患者1年内出现CRPC的示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明提供了适用于前列腺癌预后的标志物，包括尿液外泌体fam230a。
本实施例中，优选的，所述尿液外泌体fam230a的检测所用的引物探针序列包括：上游引物fam230a-F：AGTGAATGAACGGCAACACTTG；下游引物fam230a-R：AAACGCATGGTCTCCCAGAA；探针fam230a-P：CTCTCCTCCAGAGCCTCCA，且所有序列均是从5’端到3’端的顺序。
实施例2
本发明提供了适用于前列腺癌预后的标志物的检测方法，包括以下步骤：
S1.准备尿液15毫升；
S2.温度在3℃条件下，离心力为2500g，离心8分钟，去除尿液中脱落细胞；
S3.温度在3℃条件下，离心力为9000g，离心8分钟，去除尿液中杂质；
S4.用95kDa超滤管浓缩尿液至1.8毫升；
S5.温度在3℃条件下，离心力为90000g，离心110分钟，去除1.75毫升上层溶液；
S6.在剩余的50微升溶液中再次加入100微升磷酸缓冲液并反复轻柔吹吸得到150微升外泌体溶液；
S7.用RNeasy Micro Kit提取外泌体的核酸；
S8.用TPrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA；
S9.在40微升体系中加入20微升荧光PCR Mix，4微升cDNA，0.8微升4微摩尔浓度的上游引物，0.8微升4微摩尔浓度的下游引物，0.8微升8微摩尔浓度的fam230a探针以及16微升RNase-free水；
S10.设置荧光PCR程序：S101.在温度为35℃工作4分钟；S102.在温度为90℃工作8分钟；S103.在温度为90℃工作13秒；S104.在温度为55℃工作40秒；S105.S103和S104将循环进行35次；
S11.根据荧光PCR仪器的运行结果统计CT值。
实施例3
本发明提供了适用于前列腺癌预后的标志物的检测方法，包括以下步骤：
S1.准备尿液25毫升；
S2.温度在5℃条件下，离心力为3500g，离心12分钟，去除尿液中脱落细胞；
S3.温度在5℃条件下，离心力为11000g，离心12分钟，去除尿液中杂质；
S4.用110kDa超滤管浓缩尿液至2.2毫升；
S5.温度在5℃条件下，离心力为110000g，离心130分钟，去除2.0毫升上层溶液；
S6.在剩余的200微升溶液中再次加入50微升磷酸缓冲液并反复轻柔吹吸得到250微升外泌体溶液；
S7.用RNeasy Micro Kit提取外泌体的核酸；
S8.用TPrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA；
S9.在60微升体系中加入30微升荧光PCR Mix，6微升cDNA，1.2微升6微摩尔浓度的上游引物，1.2微升6微摩尔浓度的下游引物，1.2微升12微摩尔浓度的fam230a探针以及18微升RNase-free水；
S10.设置荧光PCR程序：S101.在温度为40℃工作6分钟；S102.在温度为100℃工作12分钟；S103.在温度为100℃工作17秒；S104.在温度为65℃工作50秒；S105.S103和S104将循环进行45次；
S11.根据荧光PCR仪器的运行结果统计CT值。
实施例4
本实施例为最佳实施例，提供了适用于前列腺癌预后的标志物的检测方法，包括以下步骤：
S1.准备尿液20毫升；
S2.温度在4℃条件下，离心力为3000g，离心10分钟，去除尿液中脱落细胞；
S3.温度在4℃条件下，离心力为10000g，离心10分钟，去除尿液中杂质；
S4.用100kDa超滤管浓缩尿液至2.0毫升；
S5.温度在4℃条件下，离心力为100000g，离心120分钟，去除1.9毫升上层溶液；
S6.在剩余的100微升溶液中再次加入100微升磷酸缓冲液并反复轻柔吹吸得到200微升外泌体溶液；
S7.用RNeasy Micro Kit提取外泌体的核酸，RNeasy Micro Kit为QIAGEN公司的产品；
S8.用TPrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，TPrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit为TAKARA公司的产品；
S9.在50微升体系中加入25微升荧光PCR Mix，5微升cDNA，1.0微升5微摩尔浓度的上游引物，1.0微升5微摩尔浓度的下游引物，1.0微升10微摩尔浓度的fam230a探针以及17微升RNase-free水；
S10.设置荧光PCR程序：S101.在温度为37℃工作5分钟；S102.在温度为95℃工作10分钟；S103.在温度为95℃工作15秒；S104.在温度为60℃工作45秒；S105.S103和S104将循环进行40次；
S11.根据荧光PCR仪器的运行结果统计CT值。
实施例5
本发明提供了适用于前列腺癌预后的标志物的检测方法用试剂，包括尿液、磷酸缓冲液、荧光PCR Mix、cDNA、上游引物、下游引物、fam230a探针和RNase-free水。
实施例6
本发明数据验证如下：
通过比较前列腺癌术后2年，30例出现CRPC患者与40例未出现CRPC患者尿液外泌体中长片段非编码RNA(lncRNA)表达谱，如图1所示；
发现非编码RNA名称为fam230a(转录本ENST00000624459.2)在出现CRPC的前列腺癌术后患者中具有高表达，而未出现CRPC的前列腺癌术后患者中表达量很低。
进一步，我们在CRPC前列腺癌组织与癌旁对照组织、非CRPC前列腺癌组织与癌旁对照组织以及健康前列腺组织中分别检测fam230a的表达，如图2所示；
发现仅有出现CRPC患者的前列腺癌组织中，fam230a才有非常高的表达量，非CRPC前列腺癌组织中，fam230a的表达量与癌旁以及健康对照组无显著差异。
进一步，平行比较晚期肾癌组织、膀胱癌组织与肺癌组织中fam230a的表达情况，如图3所示；
发现fam230a在CRPC组织中的表达量最高，膀胱癌组织的表达量居中而肾癌和肺癌组织中表达量最低，说明fam230a高表达的表型存在于CRPC前列腺癌组织中。
此前并无fam230a在前列腺癌研究中的相关报道，因此连续检测20例前列腺癌术后患者的尿液外泌体中fam230a的表达量，在术后1周、术后3个月、术后6个月和术后12个月，四个时间点统计fam230a在外泌体中的荧光PCR的CT值，如图4所示；
发现术后12个月出现CRPC的前列腺癌患者，fam230a的表达显著升高(CT值越低表示表达量越高)，最终6例出现CRPC的前列腺癌术后患者的CT值小于30的有4例，另外2例分别为31.08和33.86，与之比较的是，术后12个月后仍未出现CRPC的前列腺癌患者，fam230a的CT值均大于34。
以36个月作为评估fam230a是否能够有效指导前列腺癌CRPC预后的时间段，如图5所示；
在这段时间内，当患者尿液外泌体中fam230a的表达量较低时(CT值高于34)，前列腺癌患者的预后情况明显好于fam230a表达量较高(CT值低于34)，统计检验p值为0.018。
用fam230a在尿液外泌体中的表达量预测100例前列腺癌术后患者1年内出现CRPC，如图6所述；
其ROC曲线的AUC为0.811，特异性为0.670，灵敏性为0.829，cutoff值为33.68，其AUC高于miR-375和miR-1290结合的AUC为0.68。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (7)
1.检测尿液外泌体fam230a的引物探针在制备前列腺癌预后的检测试剂中的用途，其特征在于：尿液外泌体fam230a的检测所用的引物探针序列分别为：上游引物fam230a-F：AGTGAATGAACGGCAACACTTG；下游引物fam230a-R：AAACGCATGGTCTCCCAGAA；探针fam230a-P：CTCTCCTCCAGAGCCTCCA。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述预后包括以下检测步骤：
S1.准备尿液15-25毫升；
S2.温度在3-5°C条件下，离心力为2500-3500g，离心8-12分钟，去除尿液中脱落细胞；
S3.温度在3-5°C条件下，离心力为9000-11000g，离心8-12分钟，去除尿液中杂质；
S4.用95-110kDa超滤管浓缩尿液至1.8-2.2毫升；
S5.温度在3-5°C条件下，离心力为90000-110000g，离心110-130分钟，去除1.75-2.0毫升上层溶液；
S6.在剩余的50-250微升溶液中再次加入50-150微升磷酸缓冲液并反复轻柔吹吸得到150-250微升外泌体溶液；
S7.用RNeasy Micro Kit提取外泌体的核酸；
S8.用TPrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA；
S9.在40-60微升体系中加入20-30微升荧光PCR Mix，4-6微升cDNA，0.8-1.2微升4-6微摩尔浓度的上游引物，0.8-1.2微升4-6微摩尔浓度的下游引物，0.8-1.2微升8-12微摩尔浓度的fam230a探针以及16-18微升RNase-free水；
S10.设置荧光PCR程序：S101.在温度为35-40°C 工作4-6分钟；S102.在温度为90-100°C 工作8-12分钟；S103.在温度为90-100°C 工作13-17秒；S104.在温度为55-65°C 工作40-50秒；S105.S103和S104将循环进行35-45次；
S11.根据荧光PCR仪器的运行结果统计CT值。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述尿液为晨尿。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：所述S11中荧光PCR仪器的阈值设置为自动。
5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，包括以下步骤：
S1.准备尿液15-20毫升；
S2.温度在3-4°C条件下，离心力为2500-3000g，离心8-10分钟，去除尿液中脱落细胞；
S3.温度在3-4°C条件下，离心力为9000-10000g，离心8-10分钟，去除尿液中杂质；
S4.用95-100kDa超滤管浓缩尿液至1.8-2.0毫升；
S5.温度在3-4°C条件下，离心力为90000-100000g，离心110-120分钟，去除1.75-1.9毫升上层溶液；
S6.在剩余的50-200微升溶液中再次加入50-100微升磷酸缓冲液并反复轻柔吹吸得到150-200微升外泌体溶液；
S7.用RNeasy Micro Kit提取外泌体的核酸；
S8.用TPrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA；
S9.在40-50微升体系中加入20-25微升荧光PCR Mix，4-5微升cDNA，0.8-1.0微升4-5微摩尔浓度的上游引物，0.8-1.0微升4-5微摩尔浓度的下游引物，0.8-1.0微升8-10微摩尔浓度的fam230a探针以及16-17微升RNase-free水；
S10.设置荧光PCR程序：S101.在温度为35-37°C 工作4-5分钟；S102.在温度为90-95°C工作8-10分钟；S103.在温度为90-95°C 工作13-15秒；S104.在温度为55-60°C 工作40-45秒；S105.S103和S104将循环进行35-40次；
S11.根据荧光PCR仪器的运行结果统计CT值。
6.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，包括以下步骤：
S1.准备尿液20毫升；
S2.温度在4°C条件下，离心力为3000g，离心10分钟，去除尿液中脱落细胞；
S3.温度在4°C条件下，离心力为10000g，离心10分钟，去除尿液中杂质；
S4.用100kDa超滤管浓缩尿液至2.0毫升；
S5.温度在4°C条件下，离心力为100000g，离心120分钟，去除1.9毫升上层溶液；
S6.在剩余的100微升溶液中再次加入100微升磷酸缓冲液并反复轻柔吹吸得到200微升外泌体溶液；
S7.用RNeasy Micro Kit提取外泌体的核酸；
S8.用TPrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA；
S9.在50微升体系中加入25微升荧光PCR Mix，5微升cDNA，1.0微升5微摩尔浓度的上游引物，1.0微升5微摩尔浓度的下游引物，1.0微升10微摩尔浓度的fam230a探针以及17微升RNase-free水；
S10.设置荧光PCR程序：S101.在温度为37°C 工作5分钟；S102.在温度为95°C 工作10分钟；S103.在温度为95°C 工作15秒；S104.在温度为60°C 工作45秒；S105.S103和S104将循环进行40次；
S11.根据荧光PCR仪器的运行结果统计CT值。
7.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述检测试剂还包括尿液、磷酸缓冲液、荧光PCR Mix、cDNA和RNase-free水。
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