CN112322657A - 一种人生长激素的体外活性检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种人生长激素的体外活性检测方法，包括以下步骤：获得功能性质粒：获得序列为SEQ ID NO.1的cDNA、SEQ ID NO.2的cDNA和SEQ ID NO.3的cDNA，然后克隆至真核表达质粒pcDNATM3.1(+)的两个限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ之间，分别得到质粒pCDNA3.1+flmGHR、质粒pCDNA3.1+STAT5a和pCDNA3.1+JAK2；获得质粒PGL4.52；获得检测细胞：将上述质粒按比例混合，共转染至真核细胞中得到检测细胞；活性检测：将检测细胞、被检测物和ONE‑GloTM检测试剂共混，根据化学发光值得到人生长激素的体外活性。

Description

一种人生长激素的体外活性检测方法
技术领域
本发明涉及人生长激素检测技术领域，尤其是涉及一种人生长激素的体外活性检测方法。
背景技术
人生长激素(Human Growth Hormone，hGH)是由脑垂体前叶后外侧嗜酸性细胞分泌的一种单一肽链的蛋白质激素，是调节人体生长代谢等多重功能的重要激素。hGH的基本功能是刺激所有机体组织的发育，增加体细胞的大小与数目，保证各器官均匀变大、骨骼增长，从而实现体型增长。如果儿童hGH分泌不足，会导致生长发育迟缓，如及时使用hGH进行合理治疗则可使患者实现健康发育。1985年Genentech上市了第一个重组 hGH(rhGH)产品，目前世界上共有约15个厂家，二十余个品牌的rhGH在售，国内rhGH 厂家5家。随着生活水平和医疗条件的提高，国内近年rhGH市场增速快于国际平均增速。
作为激素类生物制品，rhGH的生物学活性是其核心质量指标，上市产品均以rhGH的生物学活性作为剂量标准，因此rhGH的生物学活性检测在hGH的研究、开发以及产品质量放行中具有重要意义。另外在临床实践中，GH的检测常采用放射免疫分析法 (IRMA)，该方法仅是从分子结构上反映与免疫原相关的化合物的结合活性，但可能无法反映GH真实的生物活性水平。因此采用适当的活性检测方法测定患者血清中GH的生物学活性，有利于更加准确地判断患者病因，也有利于研究不同GH缺陷疾病的发病机理。
《中华人民共和国药典》(2015年版)收录有“生长激素生物测定法”，包括“去垂体大鼠体重法”和“去垂体大鼠胫骨法”，两种方法可以采用同一批大鼠同时开展，基本过程如下：取严格符合要求的大鼠，于检测前2～3周开展去垂体手术并恢复；hGH标准品和待检样品分别稀释成高低两种浓度(0.1～0.2IU/mL和0.025～0.05IU/mL)，取上述去垂体小鼠进行分组，每组8只，标准品和待测样品分别需要2组，用于分别注射上述高低浓度样品0.5mL，每日1次，连续6日。于最后一次给药24h后处死大鼠，称量并记录体重，解剖确认垂体确已去除，并取下两腿胫骨切片处理，测量胫骨骨骺板宽度。以体重和骨骺板宽度作为指标，统计计算待测样品生物学活性。
类似地，动物源的GH其生物学活性也需要通过动物实验进行分析。
上述hGH生物学活性检测方法存在时间长(3～4周)、大鼠去垂体技术难度高、对实验动物伤害大、检测结果偏差大、检测成本高等缺点，在一定程度上也限制了生长激素类产品的开发。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种可显著降低检测限的人生长激素的体外活性检测方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种人生长激素的体外活性检测方法，包括以下步骤：
1)获得功能性质粒：获得序列为SEQ ID NO.1的cDNA，然后克隆至真核表达质粒pcDNATM 3.1(+)的两个限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ之间，得到质粒 pCDNA3.1+flmGHR；获得序列为SEQ ID NO.2的cDNA，然后克隆至真核表达质粒 pcDNATM 3.1(+)的两个限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ之间，得到质粒 pCDNA3.1+STAT5a；获得质粒PGL4.52；获得序列为SEQ IDNO.3的cDNA，然后克隆至真核表达质粒pcDNATM 3.1(+)的两个限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ之间，得到质粒 pCDNA3.1+JAK2；
2)获得检测细胞：将所述质粒pCDNA3.1+flmGHR、所述质粒pCDNA3.1+STAT5a、质粒PGL4.52和质粒pCDNA3.1+JAK2以9～12:0.8～1.2:85～90：2～5的比例混合，共转染至真核细胞中得到检测细胞；
3)活性检测：将所述检测细胞在培养基中进行培养，然后加入被检测物和ONE-GloTM检测试剂，用酶标仪测定化学发光值，根据所述化学发光值得到人生长激素的体外活性。
作为优选，所述获得检测细胞步骤中的所述真核细胞为HEK293细胞。
作为优选，所述获得检测细胞步骤中所述质粒pCDNA3.1+flmGHR、所述质粒pCDNA3.1+STAT5a、质粒PGL4.52和质粒pCDNA3.1+JAK2的混合比例为10:1:85：4。
作为优选，所述获得检测细胞步骤中转染的具体操作为：HEK293细胞用DMEM和10％FBS培养基于37℃、5％二氧化碳条件下培养，然后采用转染试剂
Figure BDA0002775096090000021
HD进行转染。
作为优选，所述获得检测细胞步骤与所述活性检测步骤之间设有稳定细胞株筛选步骤；
所述稳定细胞株筛选步骤，将从所述获得检测细胞步骤中得到的所述检测细胞使用胰蛋白酶消化分离，然后将分离后的所述检测细胞接种至细胞培养皿中筛选培养得到第一筛选细胞群，所述细胞培养皿中的克隆培养基为含0.1mg/mL潮霉素B、0.75mg/mL 的G418、10％胎牛血清的DMEM培养基，将所述第一筛选细胞群采用胰蛋白酶消化分离，并使用有限稀释法进行分离，得到单克隆的第一筛选细胞；
所述第一筛选细胞转移到盛有所述克隆培养基的黑色细胞培养板进行扩增，所述细胞培养板的每个孔中均扩增得到单克隆细胞株。将所述每个单克隆细胞株均分为作为实验组和对照组，并采用饥饿培养基在黑色细胞培养板中培养过夜，实验组中加入rhGH 标准品，对照组中加入等量所述饥饿培养基，所述饥饿培养基为含有1％胎牛血清 (CertifiedCharcoal Stripped FBS)、0.1mg/mL潮霉素B和0.75mg/mL的G418的DMEM 培养基，37℃、5％二氧化碳条件下培养，然后加入ONE-GloTM检测试剂，用酶标仪测定化学发光值分别得到实验值和对照值，计算所述实验值和对照值的比值，若所述实验值和对照值的比值大于基准值时，则所述单克隆细胞株为阳性克隆株；若所述实验值和对照值的比值小于或等于基准值时，则所述单克隆细胞株为阴性克隆株；
将所述阴性克隆株丢弃，留存全部所述阳性克隆株，将所述阳性克隆株进行多代传代培养，检测所述阳性克隆株在rhGH存在环境下产生的化学发光值，挑取所述化学发光值最大的对应阳性克隆株作为所述活性检测步骤中的所述检测细胞。
作为优选，所述活性检测步骤中所述培养基为所述饥饿培养基。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明的检测对象是体外细胞(细胞复苏1周，检测1天)，相比标准的去垂体大鼠体重法及胫骨法(大鼠去垂体2～3周，检测1周)，大大缩短了检测周期。并且在需要连续检测的情况下，细胞可持续培养，能进一步缩短整个检测周期；
2、本发明的体外细胞活性检测法采用建株的细胞，使用细胞培养板进行体外培养，检测结果的偏差相对较小。标准的“去垂体大鼠体重法”和“去垂体大鼠胫骨法”实验过程受大鼠的个体差异、去垂体的彻底程度、检测样品的注射手法、垂体剥离过程中的其它组织的残留等因素影响，容易对检测结果的组内偏差造成影响；
3、本发明的体外细胞活性检测法省略了标准方法中大鼠去垂体步骤，大大简化了检测方法的操作难度；
4、将人生长激素受体基因、STAT5基因、JAK2基因、STAT5效应序列和萤光素酶报告基因共同转染至真核细胞，构建了一种对生长激素敏感的检测细胞。通过将生长激素与检测细胞共同孵育，检测细胞表面的生长激素受体结合生长激素后激活 JAK2-STAT5途径，使过表达的STAT5发生磷酸化，进入细胞核内进一步地激活萤光素酶报告基因，在底物的存在下产生化学发光信号。细胞内的化学发光强度与生长激素浓度在一定范围内成正相关，根据定量的化学发光信号可以间接测定生长激素的生物学活性。检测细胞中引入外源人生长激素受体基因，使得检测细胞表面的生长激素受体数量大幅增加，检测限降低；检测细胞中引入外源过表达的STAT5和JAK2，放大了下游信号，检测限进一步降低。
附图说明
图1为HEK293-GHR细胞活性检测法化学发光检测典型图谱；
附图标记说明：A：中检院rhGH标准品典型图谱；B：市售产品(
Figure BDA0002775096090000041
)典型图谱； C：本发明自制样品1rhGH典型图谱；D：本发明自制样品2rhGH典型图谱
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明进一步详细说明。
实施例1：
一种人生长激素的体外活性检测方法，包括以下步骤
1)获得功能性质粒：获得序列为SEQ ID NO.1的cDNA，然后克隆至真核表达质粒pcDNATM 3.1(+)的两个限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ之间，得到质粒 pCDNA3.1+flmGHR。获得序列为SEQ ID NO.2的cDNA，然后克隆至真核表达质粒 pcDNATM 3.1(+)的两个限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ之间，得到质粒 pCDNA3.1+STAT5a；获得质粒PGL4.52；获得序列为SEQ IDNO.3的cDNA，然后克隆至真核表达质粒pcDNATM 3.1(+)的两个限制性内切酶BamHⅠ和XhoⅠ之间，得到质粒 pCDNA3.1+JAK2；
2)获得检测细胞：将质粒pCDNA3.1+flmGHR、质粒pCDNA3.1+STAT5a、质粒PGL4.52和质粒pCDNA3.1+JAK2以9～12:0.8～1.2:85～90:2～5的比例混合，共转染至真核细胞中得到检测细胞；
3)活性检测：将检测细胞在培养基中进行培养，然后加入被检测物和ONE-GloTM检测试剂，用酶标仪测定化学发光值，根据化学发光值得到人生长激素的体外活性。
其中，获得检测细胞步骤中的真核细胞为HEK293细胞。
其中，获得检测细胞步骤中质粒pCDNA3.1+flmGHR、质粒pCDNA3.1+STAT5a、质粒PGL4.52和质粒pCDNA3.1+JAK2的混合比例为10:1:85:4。
其中，获得检测细胞步骤中转染的具体操作为：HEK293细胞(购自American TypeCulture Collection)用DMEM(Gibco,11995040)和10％FBS(胎牛血清)培养基于37 ℃、5％二氧化碳条件下培养至足够量，按5×105个细胞/孔，3mL/孔铺设6孔板，培养过夜后进行细胞转染。将四个质粒按上述比例混匀，稀释至终浓度为0.02μg/mL，共转染至HEK293细胞，3μg/孔。详细转染方法参考转染试剂
Figure BDA0002775096090000051
HD Transfection Reagent (Promega,E2311)的说明书，转染后的细胞为检测细胞，将其置于37℃、5％二氧化碳条件下培养24h。
其中，获得检测细胞步骤与活性检测步骤之间设有稳定细胞株筛选步骤；
稳定细胞株筛选步骤，将从获得检测细胞步骤中得到的检测细胞使用胰蛋白酶消化分离，然后将分离后的检测细胞接种至细胞培养皿中筛选培养得到第一筛选细胞群，细胞培养皿中的克隆培养基为含0.1mg/mL潮霉素B、0.75mg/mL的G418、10％胎牛血清的DMEM培养基，将第一筛选细胞群采用胰蛋白酶消化分离得到第一筛选细胞。
其中，获得上述第一筛选细胞群的具体操作为：在黑色96孔细胞培养板(Corning,3904)中每孔接入9×104个检测细胞，实验孔加入终浓度为0.6μg/mL重组人GrowthHormone蛋白(中检院标准品,140635)，对照孔加入等量培养基，37℃、5％二氧化碳条件下培养4h。加入ONE-GloTM检测试剂(Promega,E6120)，使用酶标仪(Ensight, PerkinElmer)读取化学发光值，结果显示添加0.6μg/mL中检院rhGH标准品和不添加中检院rhGH标准品相比，比值为11.6，实验证明转染的细胞池对rhGH有较好的应答反应。可以进行下一步的稳定细胞株筛选。将培养后的检测细胞使用胰蛋白酶(Gibco, 25200-072)消化，按5×105个细胞/皿/10mL接种至10cm细胞培养皿中，使用含0.1mg/mL 潮霉素B(生工,A600230-0001)、0.75mg/mL的G418(生工,A600958-0005)、10％胎牛血清(Gibco,10099141)的DMEM培养基筛选转染后的细胞，每3天换液1次。
制备条件培养基：转移用于制备条件培养基的HEK293细胞液至50mL离心管，1000rpm离心5min，小心吸取上清液至另一只离心管，用0.22μm针头滤器过滤至无菌离心管。按照20％的比例添加至含0.1mg/mL潮霉素B、0.75mg/mL的G418、10％胎牛血清的DMEM培养基中，即为铺板用克隆培养基。
第一筛选细胞克隆扩增的具体步骤为：筛选12天后铺设96孔板，将细胞采用胰蛋白酶消化，使用上述铺板用克隆培养基调整至密度为0.5个细胞/150μL，铺设15个96 孔板，每孔150μL。铺板后第1天取出，镜下观察，记录含有细胞的孔，孔上标注细胞数目，3个以上的不标注。第5、7、9、11、13天再观察，如果液体少于100μL，补加 100μL培养基。约15天后，个别孔细胞汇合率约40％，将细胞转移至24孔板继续扩增， 0.5mL/孔。待汇合率约80％，取4×104个细胞用于单克隆细胞株活性检测验证，剩余细胞继续在24孔板中培养。
第一筛选细胞克隆用盛有克隆培养基的细胞培养板进行扩增培养，细胞培养板的每个孔中均扩增得到单克隆细胞株。将每个单克隆细胞株传代接种至黑色细胞培养板中，并均分为平行的实验组和对照组，采用饥饿培养基培养过夜，实验组中加入rhGH标准品，对照组中加入等量饥饿培养基，饥饿培养基为含有1％Certified Charcoal Stripped FBS(Biological Industries,04-201-1)、0.1mg/mL潮霉素B和0.75mg/mL的G418的DMEM 培养基，37℃、5％二氧化碳条件下培养，然后加入ONE-GloTM检测试剂，用酶标仪测定化学发光值分别得到实验值和对照值，计算实验值和对照值的比值，若实验值和对照值的比值大于基准值时，则单克隆细胞株为阳性克隆株；若实验值和对照值的比值小于或等于基准值时，则单克隆细胞株为阴性克隆株；
将阴性克隆株丢弃，留存全部阳性克隆株，将阳性克隆株进行多代传代培养，检测阳性克隆株在rhGH存在环境下产生的化学发光值，挑取化学发光值最大的对应阳性克隆株作为活性检测步骤中的检测细胞。
单克隆细胞株活性验证的具体步骤为：每种克隆取4×104个细胞铺设黑色96孔板， 2×104个细胞/孔，90μL/孔，每种克隆各2孔，采用饥饿培养基培养过夜。使用饥饿培养基稀释中检院rhGH标准品，每种克隆各设一个对照孔和一个实验孔，实验孔加入10μL/ 孔的中检院rhGH，终浓度为0.6μg/mL，对照孔加入10μL/孔的饥饿培养基，37℃、5％二氧化碳条件下培养4h。加入ONE-GloTM检测试剂50μL/孔，使用酶标仪读取化学发光值，计算实验孔和对照孔的比值，若比值>50视为阳性克隆。
根据检测结果，丢弃阴性克隆，待阳性克隆汇合率约80％，转移至6孔板扩增，3mL/孔。待汇合率约80％，转移至T-25细胞培养瓶扩增，最后转移至T-75细胞培养瓶扩增。使用中检院rhGH作为标准品，选择多个阳性克隆进行验证比较，及验证不同阳性克隆连续传代2个月的稳定性，选择最优阳性克隆命名为HEK293-GHR细胞，冻存保种。
GH生物学活性的检测
在黑色96孔细胞培养板中每孔接入9×104个前述制备的HEK293-GHR细胞，90μL/孔，在饥饿培养基中，37℃、5％二氧化碳条件下培养16h。
使用饥饿培养基梯度稀释生长激素样品(样品1和样品2)、中检院rhGH标准品和
Figure BDA0002775096090000074
使其终浓度为600～0.03ng/mL(3倍梯度稀释)，每孔加入10μL稀释好的样品， 37℃、5％二氧化碳条件下培养4h。
每孔加入50μL ONE-GloTM检测试剂，酶标仪读取化学发光值。
典型的检测结果见图1。通过Dazdaq Ltd.WorkOut 1.5软件进行四参数拟合，输入对应样品和标准品的浓度和单位，样品和标准品各拟合一条曲线，得到各自的EC50，样品相对活性
Figure BDA0002775096090000072
以中检院rhGH为标准品，分析样品的相对活性，
Figure BDA0002775096090000073
的相对活性与中检院rhGH标准品相当，符合说明书活性单位的标注。另外，本发明表达的2种rhGH(样品1和样品2)也表现出与中检院rhGH标准品相当的细胞活性。
实验结果表明GH能刺激诱导HEK293-GHR细胞表达萤光素酶，萤光素酶表达表现出与GH浓度依赖的关系。在低浓度生长激素条件下，随着生长激素浓度的升高，诱导表达效果加大，在67ng/mL的浓度时，生长激素诱导萤光素酶表达达到最大峰值，随后，生长激素浓度升高，诱导效果不再增加，见图1。此方法在生长激素样品质量浓度为 600～0.03ng/mL范围内均存在良好的剂量反应曲线，符合四参数方程并且呈典型S型曲线，相关系数在0.99以上。本发明制得的HEK293-GHR细胞(即检测细胞)因引入外源人生长激素受体基因和外源结合蛋白基因，使得生长激素的检测限大幅下降。
本发明方法专属性强，准确性较好，信噪比约1200，线性范围回收率在80％-120％之间。将相同样品重复测定3次，CV<15％，精密度高，结果重现性好，适用于作为常规方法检测生长激素的体外活性。
以上对本发明的一个实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，不能被认为用于限定本发明的实施范围。凡依本发明申请范围所作的均等变化与改进等，均应仍归属于本发明的专利涵盖范围之内。
序列表
<110> 浙江新码生物医药有限公司
<120> 一种人生长激素的体外活性检测方法
<141> 2020-12-29
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1923
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
gccaccatgg atctctggca gctgctgttg accttggcac tggcaggatc aagtgatgct 60
ttttctggaa gtgaggccac agcagctatc cttagcagag caccctggag tctgcaaagt 120
gttaatccag gcctaaagac aaattcttct aaggagccta aattcaccaa gtgccgttca 180
cctgagcgag agactttttc atgccactgg acagatgagg ttcaccatgg aacaaagaac 240
ctaggaccca tacagctgtt ctataccaga aggaacactc aagaatggac tcaagaatgg 300
aaagaatgcc ctgattatgt ttctgctggg gaaaacagct gttactttaa ttcatcgttt 360
acctccatct ggatacctta ttgtatcaag ctaactagca atggtggtac agtggatgaa 420
aagtgtttct ctgttgatga aatagtgcaa ccagatccac ccattgccct caactggact 480
ttactgaacg tcagtttaac tgggattcat gcagatatcc aagtgagatg ggaagcacca 540
cgcaatgcag atattcagaa aggatggatg gttctggagt atgaacttca atacaaagaa 600
gtaaatgaaa ctaaatggaa aatgatggac cctatattga caacatcagt tccagtgtac 660
tcattgaaag tggataagga atatgaagtg cgtgtgagat ccaaacaacg aaactctgga 720
aattatggcg agttcagtga ggtgctctat gtaacacttc ctcagatgag ccaatttaca 780
tgtgaagaag atttctactt tccatggctc ttaattatta tctttggaat atttgggcta 840
acagtgatgc tatttgtatt cttattttct aaacagcaaa ggattaaaat gctgattctg 900
cccccagttc cagttccaaa gattaaagga atcgatccag atctcctcaa ggaaggaaaa 960
ttagaggagg tgaacacaat cttagccatt catgatagct ataaacccga attccacagt 1020
gatgactctt gggttgaatt tattgagcta gatattgatg agccagatga aaagactgag 1080
gaatcagaca cagacagact tctaagcagt gaccatgaga aatcacatag taacctaggg 1140
gtgaaggatg gcgactctgg acgtaccagc tgttgtgaac ctgacattct ggagactgat 1200
ttcaatgcca atgacataca tgagggtacc tcagaggttg ctcagccaca gaggttaaaa 1260
ggggaagcag atctcttatg ccttgaccag aagaatcaaa ataactcacc ttatcatgat 1320
gcttgccctg ctactcagca gcccagtgtt atccaagcag agaaaaacaa accacaacca 1380
cttcctactg aaggagctga gtcaactcac caagctgccc atattcagct aagcaatcca 1440
agttcactgt caaacatcga cttttatgcc caggtgagcg acattacacc agcaggtagt 1500
gtggtccttt ccccgggcca aaagaataag gcagggatgt cccaatgtga catgcacccg 1560
gaaatggtct cactctgcca agaaaacttc cttatggaca atgcctactt ctgtgaggca 1620
gatgccaaaa agtgcctccc tgtggctcct cacatcaagg ttgaatcaca catacagcca 1680
agcttaaacc aagaggacat ttacatcacc acagaaagcc ttaccactgc tgctgggagg 1740
cctgggacag gagaacatgt tccaggttct gagatgcctg tcccagacta tacctccatt 1800
catatagtac agtccccaca gggcctcata ctcaatgcga ctgccttgcc cttgcctgac 1860
aaagagtttc tctcatcatg tggctatgtg agcacagacc aactgaacaa aatcatgcct 1920
tag 1923
<210> 2
<211> 2385
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
atggcgggct ggatccaggc ccagcagctg cagggagacg cgctgcgcca gatgcaggtg 60
ctgtacggcc agcacttccc catcgaggtc cggcactact tggcccagtg gattgagagc 120
cagccatggg atgccattga cttggacaat ccccaggaca gagcccaagc cacccagctc 180
ctggagggcc tggtgcagga gctgcagaag aaggcggagc accaggtggg ggaagatggg 240
tttttactga agatcaagct ggggcactac gccacgcagc tccagaaaac atatgaccgc 300
tgccccctgg agctggtccg ctgcatccgg cacattctgt acaatgaaca gaggctggtc 360
cgagaagcca acaattgcag ctctccggct gggatcctgg ttgacgccat gtcccagaag 420
caccttcaga tcaaccagac atttgaggag ctgcgactgg tcacgcagga cacagagaat 480
gagctgaaga aactgcagca gactcaggag tacttcatca tccagtacca ggagagcctg 540
aggatccaag ctcagtttgc ccagctggcc cagctgagcc cccaggagcg tctgagccgg 600
gagacggccc tccagcagaa gcaggtgtct ctggaggcct ggttgcagcg tgaggcacag 660
acactgcagc agtaccgcgt ggagctggcc gagaagcacc agaagaccct gcagctgctg 720
cggaagcagc agaccatcat cctggatgac gagctgatcc agtggaagcg gcggcagcag 780
ctggccggga acggcgggcc ccccgagggc agcctggacg tgctacagtc ctggtgtgag 840
aagttggccg agatcatctg gcagaaccgg cagcagatcc gcagggctga gcacctctgc 900
cagcagctgc ccatccccgg cccagtggag gagatgctgg ccgaggtcaa cgccaccatc 960
acggacatta tctcagccct ggtgaccagc acattcatca ttgagaagca gcctcctcag 1020
gtcctgaaga cccagaccaa gtttgcagcc accgtacgcc tgctggtggg cgggaagctg 1080
aacgtgcaca tgaatccccc ccaggtgaag gccaccatca tcagtgagca gcaggccaag 1140
tctctgctta aaaatgagaa cacccgcaac gagtgcagtg gtgagatcct gaacaactgc 1200
tgcgtgatgg agtaccacca agccacgggc accctcagtg cccacttcag gaacatgtca 1260
ctgaagagga tcaagcgtgc tgaccggcgg ggtgcagagt ccgtgacaga ggagaagttc 1320
acagtcctgt ttgagtctca gttcagtgtt ggcagcaatg agcttgtgtt ccaggtgaag 1380
actctgtccc tacctgtggt tgtcatcgtc cacggcagcc aggaccacaa tgccacggct 1440
actgtgctgt gggacaatgc ctttgctgag ccgggcaggg tgccatttgc cgtgcctgac 1500
aaagtgctgt ggccgcagct gtgtgaggcg ctcaacatga aattcaaggc cgaagtgcag 1560
agcaaccggg gcctgaccaa ggagaacctc gtgttcctgg cgcagaaact gttcaacaac 1620
agcagcagcc acctggagga ctacagtggc ctgtccgtgt cctggtccca gttcaacagg 1680
gagaacttgc cgggctggaa ctacaccttc tggcagtggt ttgacggggt gatggaggtg 1740
ttgaagaagc accacaagcc ccactggaat gatggggcca tcctaggttt tgtgaataag 1800
caacaggccc acgacctgct catcaacaag cccgacggga ccttcttgtt gcgctttagt 1860
gactcagaaa tcgggggcat caccatcgcc tggaagtttg actccccgga acgcaacctg 1920
tggaacctga aaccattcac cacgcgggat ttctccatca ggtccctggc tgaccggctg 1980
ggggacctga gctatctcat ctatgtgttt cctgaccgcc ccaaggatga ggtcttctcc 2040
aagtactaca ctcctgtgct ggctaaagct gttgatggat atgtgaaacc acagatcaag 2100
caagtggtcc ctgagtttgt gaatgcatct gcagatgctg ggggcagcag cgccacgtac 2160
atggaccagg ccccctcccc agctgtgtgc ccccaggctc cctataacat gtacccacag 2220
aaccctgacc atgtactcga tcaggatgga gaattcgacc tggatgagac catggatgtg 2280
gccaggcacg tggaggaact cttacgccga ccaatggaca gtcttgactc ccgcctctcg 2340
ccccctgccg gtcttttcac ctctgccaga ggctccctct catga 2385
<210> 3
<211> 3399
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
atgggaatgg cctgccttac gatgacagaa atggagggaa catccacctc ttctatatat 60
cagaatggtg atatttctgg aaatgccaat tctatgaagc aaatagatcc agttcttcag 120
gtgtatcttt accattccct tgggaaatct gaggcagatt atctgacctt tccatctggg 180
gagtatgttg cagaagaaat ctgtattgct gcttctaaag cttgtggtat cacacctgtg 240
tatcataata tgtttgcttt aatgagtgaa acagaaagga tctggtatcc acccaaccat 300
gtcttccata tagatgagtc aaccaggcat aatgtactct acagaataag attttacttt 360
cctcgttggt attgcagtgg cagcaacaga gcctatcggc atggaatatc tcgaggtgct 420
gaagctcctc ttcttgatga ctttgtcatg tcttacctct ttgctcagtg gcggcatgat 480
tttgtgcacg gatggataaa agtacctgtg actcatgaaa cacaggaaga atgtcttggg 540
atggcagtgt tagatatgat gagaatagcc aaagaaaacg atcaaacccc actggccatc 600
tataactcta tcagctacaa gacattctta ccaaaatgta ttcgagcaaa gatccaagac 660
tatcatattt tgacaaggaa gcgaataagg tacagatttc gcagatttat tcagcaattc 720
agccaatgca aagccactgc cagaaacttg aaacttaagt atcttataaa tctggaaact 780
ctgcagtctg ccttctacac agagaaattt gaagtaaaag aacctggaag tggtccttca 840
ggtgaggaga tttttgcaac cattataata actggaaacg gtggaattca gtggtcaaga 900
gggaaacata aagaaagtga gacactgaca gaacaggatt tacagttata ttgcgatttt 960
tctaatatta ttgatgtcag tattaagcaa gcaaaccaag agggttcaaa tgaaagccga 1020
gttgtaacta tccataagca agatggtaaa aatctggaaa ttgaacttag ctcattaagg 1080
gaagctttgt ctttcgtgtc attaattgat ggatattata gattaactgc agatgcacat 1140
cattacctct gtaaagaagt agcacctcca gccgtgcttg aaaatataca aagcaactgt 1200
catggcccaa tttcgatgga ttttgccatt agtaaactga agaaagcagg taatcagact 1260
ggactgtatg tacttcgatg cagtcctaag gactttaata aatatttttt gacttttgct 1320
gtcgagcgag aaaatgtcat tgaatataaa cactgtttga ttacaaaaaa tgagaatgaa 1380
gagtacaacc tcagtgggac aaagaagaac ttcagcagtc ttaaagatct tttgaattgt 1440
taccagatgg aaactgttcg ctcagacaat ataattttcc agtttactaa atgctgtccc 1500
ccaaagccaa aagataaatc aaaccttcta gtcttcagaa cgaatggtgt ttctgatgta 1560
ccaacctcac caacattaca gaggcctact catatgaacc aaatggtgtt tcacaaaatc 1620
agaaatgaag atttgatatt taatgaaagc cttggccaag gcacttttac aaagattttt 1680
aaaggcgtac gaagagaagt aggagactac ggtcaactgc atgaaacaga agttctttta 1740
aaagttctgg ataaagcaca cagaaactat tcagagtctt tctttgaagc agcaagtatg 1800
atgagcaagc tttctcacaa gcatttggtt ttaaattatg gagtatgtgt ctgtggagac 1860
gagaatattc tggttcagga gtttgtaaaa tttggatcac tagatacata tctgaaaaag 1920
aataaaaatt gtataaatat attatggaaa cttgaagttg ctaaacagtt ggcatgggcc 1980
atgcattttc tagaagaaaa cacccttatt catgggaatg tatgtgccaa aaatattctg 2040
cttatcagag aagaagacag gaagacagga aatcctcctt tcatcaaact tagtgatcct 2100
ggcattagta ttacagtttt gccaaaggac attcttcagg agagaatacc atgggtacca 2160
cctgaatgca ttgaaaatcc taaaaattta aatttggcaa cagacaaatg gagttttggt 2220
accactttgt gggaaatctg cagtggagga gataaacctc taagtgctct ggattctcaa 2280
agaaagctac aattttatga agataggcat cagcttcctg caccaaagtg ggcagaatta 2340
gcaaacctta taaataattg tatggattat gaaccagatt tcaggccttc tttcagagcc 2400
atcatacgag atcttaacag tttgtttact ccagattatg aactattaac agaaaatgac 2460
atgttaccaa atatgaggat aggtgccctg gggttttctg gtgcctttga agaccgggat 2520
cctacacagt ttgaagagag acatttgaaa tttctacagc aacttggcaa gggtaatttt 2580
gggagtgtgg agatgtgccg gtatgaccct ctacaggaca acactgggga ggtggtcgct 2640
gtaaaaaagc ttcagcatag tactgaagag cacctaagag actttgaaag ggaaattgaa 2700
atcctgaaat ccctacagca tgacaacatt gtaaagtaca agggagtgtg ctacagtgct 2760
ggtcggcgta atctaaaatt aattatggaa tatttaccat atggaagttt acgagactat 2820
cttcaaaaac ataaagaacg gatagatcac ataaaacttc tgcagtacac atctcagata 2880
tgcaagggta tggagtatct tggtacaaaa aggtatatcc acagggatct ggcaacgaga 2940
aatatattgg tggagaacga gaacagagtt aaaattggag attttgggtt aaccaaagtc 3000
ttgccacaag acaaagaata ctataaagta aaagaacctg gtgaaagtcc catattctgg 3060
tatgctccag aatcactgac agagagcaag ttttctgtgg cctcagatgt ttggagcttt 3120
ggagtggttc tgtatgaact tttcacatac attgagaaga gtaaaagtcc accagcggaa 3180
tttatgcgta tgattggcaa tgacaaacaa ggacagatga tcgtgttcca tttgatagaa 3240
cttttgaaga ataatggaag attaccaaga ccagatggat gcccagatga gatctatatg 3300
atcatgacag aatgctggaa caataatgta aatcaacgcc cctcctttag ggatctagct 3360
cttcgagtgg atcaaataag ggataacatg gctggatga 3399

Claims (6)

1.一种人生长激素的体外活性检测方法，其特征在于包括以下步骤：
1)获得功能性质粒：获得序列为SEQ ID NO.1的cDNA，然后克隆至真核表达质粒pcDNATM3.1(+)的两个限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ之间，得到质粒pCDNA3.1+flmGHR；获得序列为SEQ ID NO.2的cDNA，然后克隆至真核表达质粒pcDNATM3.1(+)的两个限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ之间，得到质粒pCDNA3.1+STAT5a；获得质粒PGL4.52；获得序列为SEQ IDNO.3的cDNA，然后克隆至真核表达质粒pcDNATM3.1(+)的两个限制性内切酶BamH Ⅰ和Xho Ⅰ之间，得到质粒pCDNA3.1+JAK2；
2)获得检测细胞：将所述质粒pCDNA3.1+flmGHR、所述质粒pCDNA3.1+STAT5a、质粒PGL4.52和质粒pCDNA3.1+JAK2以9～12:0.8～1.2:85～90:2～5的比例混合，共转染至真核细胞中得到检测细胞；
3)活性检测：将所述检测细胞在培养基中进行培养，然后加入被检测物和ONE-GloTM检测试剂，用酶标仪测定化学发光值，根据所述化学发光值得到人生长激素的体外活性。
2.根据权利要求1所述的一种人生长激素的体外活性检测方法，其特征在于，所述获得检测细胞步骤中的所述真核细胞为HEK293细胞。
3.根据权利要求1所述的一种人生长激素的体外活性检测方法，其特征在于，所述获得检测细胞步骤中所述质粒pCDNA3.1+flmGHR、所述质粒pCDNA3.1+STAT5a、质粒PGL4.52和质粒pCDNA3.1+JAK2的混合比例为10:1:85:4。
4.根据权利要求2所述的一种人生长激素的体外活性检测方法，其特征在于，所述获得检测细胞步骤中转染的具体操作为：HEK293细胞用DMEM和10％FBS培养基于37℃、5％二氧化碳条件下培养，然后采用转染试剂
Figure FDA0002775096080000011
HD进行转染。
5.根据权利要求1或4所述的一种人生长激素的体外活性检测方法，其特征在于，所述获得检测细胞步骤与所述活性检测步骤之间设有稳定细胞株筛选步骤；
所述稳定细胞株筛选步骤，将从所述获得检测细胞步骤中得到的所述检测细胞使用胰蛋白酶消化分离，然后将分离后的所述检测细胞接种至细胞培养皿中筛选培养得到第一筛选细胞群，所述细胞培养皿中的克隆培养基为含0.1mg/mL潮霉素B、0.75mg/mL的G418、10％胎牛血清的DMEM培养基，将所述第一筛选细胞群采用胰蛋白酶消化，并使用有限稀释法进行分离，得到单克隆的第一筛选细胞；
所述第一筛选细胞转移到盛有所述克隆培养基的细胞培养板进行扩增，所述细胞培养板的每个孔中均扩增得到单克隆细胞株，将每个所述单克隆细胞株均分为实验组和对照组，并采用饥饿培养基在黑色细胞培养板中培养过夜，实验组中加入rhGH标准品，对照组中加入等量所述饥饿培养基，所述饥饿培养基为含有1％胎牛血清、0.1mg/mL潮霉素B和0.75mg/mL的G418的DMEM培养基，37℃、5％二氧化碳条件下培养，然后加入ONE-GloTM检测试剂，用酶标仪测定化学发光值分别得到实验值和对照值，计算所述实验值和对照值的比值，若所述实验值和对照值的比值大于基准值时，则所述单克隆细胞株为阳性克隆株；若所述实验值和对照值的比值小于或等于基准值时，则所述单克隆细胞株为阴性克隆株；
将所述阴性克隆株丢弃，留存全部所述阳性克隆株，将所述阳性克隆株进行多代传代培养，检测所述阳性克隆株在rhGH存在环境下产生的化学发光值，挑取所述化学发光值最大的对应阳性克隆株作为所述活性检测步骤中的所述检测细胞。
6.根据权利要求5所述的一种人生长激素的体外活性检测方法，其特征在于，所述活性检测步骤中所述培养基为所述饥饿培养基。
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