CN112300202A - 一种荧光探针、神经性毒剂检测元件及制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及荧光探针技术领域，具体公开一种荧光探针、神经性毒剂检测元件及制备方法和应用。所述荧光探针的结构如式3所示。本发明提供了一种新型结构的荧光探针，其将水杨醛肟基通过炔基与氟硼荧(BODIPY)荧光发色团桥连，形成刚性平面的分子结构，构建发色团和反应基团间的光致电子转移通路，可有效降低探针分子的自身荧光，减弱背景噪声，增强检测效果。本发明提供的神经性毒剂的荧光探针分子，响应速度快，检测灵敏度高，检出限可达4.0×10‑9mol，选择性好，以荧光探针制备的检测元件能够同时实现对气相和液相中神经性毒剂分子的检测，可应用于真实环境中的神经性毒剂的可视化检测，具有良好的应用前景。
Figure DDA0002759002250000011

Description

一种荧光探针、神经性毒剂检测元件及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及荧光探针技术领域，尤其涉及一种荧光探针、神经性毒剂检测元件及制备方法和应用。
背景技术
神经性毒剂是一类高毒性的有机磷酸酯或有机膦酸酯类化合物，分为G类神经性毒剂和V类神经性毒剂。G类神经性毒剂是指甲氟膦酸烷酯或二烷氨基氰膦酸烷酯类毒剂，主要代表物有塔崩(GA)、沙林(GB)、梭曼(GD)。V类神经性毒剂是指S-二烷氨基乙基甲基硫代膦酸烷酯类毒剂，主要代表物有维埃克斯(VX)。当神经性毒剂通过呼吸或皮肤接触进入人体后，能够很快与乙酰胆碱酯酶上的丝氨酸结合，破坏酶活性，从而引起人体痉挛甚至导致死亡。因此，寻找快速、简单、高灵敏度和高选择性的神经性毒剂检测方法，无论是在军事上还是在公共安全领域都具有十分重要的意义。
现有的神经性毒剂的检测方法包括离子迁移谱法、质谱法、光子晶体法和电化学法等，尽管这些方法灵敏度高，但由于检测时间较长，相关仪器不便携，很难满足部队作战环境下的使用需求。相对而言，荧光探针检测技术具有成本低、可制成便于携带、操作简单的荧光器件等优势，在实时快速检测领域具有重要潜力。但是，现有报道的荧光探针均存在一些不足，如选择性较差、检测灵敏低或响应时间长等，严重制约了荧光探针在神经性毒剂检测领域的实际应用。因此，设计合成一种选择性好、灵敏度高、响应速度快的神经性毒剂荧光探针具有十分重要的意义。
发明内容
针对现有用于神经性毒剂检测的荧光探针存在选择性较差、检测灵敏低、响应时间长等问题，本发明提供一种荧光探针、神经性毒剂检测元件及制备方法和应用。
为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案是：
一种荧光探针，其结构如式3所示：
Figure BDA0002759002230000021
相对于现有技术，本发明提供了一种新型结构的荧光探针，其将水杨醛肟基通过炔基与氟硼荧(BODIPY)荧光发色团桥连，相对于单键，炔基更具刚性，能够将连接的两个基团固定在同一平面内，从而促进水杨醛肟基与发色团之间的光致电子转移作用，最大限度降低探针分子的自身荧光，减弱背景噪声，增强检测效果；加入神经性毒剂后，水杨醛肟基可快速与加入的神经性毒剂发生亲核作用，引起荧光探针分子内电荷分布改变，导致光致电子转移过程受阻，荧光得到增强，基于加入神经性毒剂前后荧光的显著变化，实现神经性毒剂的高效检测。
本发明提供的荧光探针适用于神经性毒剂的检测，可在1s内出现可见的荧光变化，6s内出现显著的荧光差异，且具有较高的选择性，对常见的有机磷干扰物，如甲基膦酸二甲酯、磷酸三苯酯、磷酸三甲酯等均无明显的荧光响应，检出限可达4.0×10-9mol，且以荧光探针制备的检测元件能够同时实现对气相和液相中神经性毒剂分子的检测，可应用于真实环境中的神经性毒剂的检测，实现对神经性毒剂的实时可视化检测，具有良好的应用前景。
本发明还提供了一种上述荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
5-乙炔基-2-羟基苯甲醛和式1所示的碘代氟硼荧在催化剂的作用下发生取代反应，得式2所示的化合物；
式2所示的化合物与盐酸羟胺进行肟化反应，得式3所示的荧光探针。
Figure BDA0002759002230000031
本发明提供的荧光探针的合成方法的原料易得，合成路线简单，反应条件温和，产品收率高。
优选的，所述5-乙炔基-2-羟基苯甲醛和碘代氟硼荧的摩尔比为1.8～2.2:1。
优选的，所述取代反应的催化剂为双(三苯基膦)二氯化钯和碘化亚铜，所述碘代氟硼荧、双(三苯基膦)二氯化钯和碘化亚铜的摩尔比为18～22:1:1。
优选的催化剂以及催化剂的加入量，可加快反应的进行，降低副反应的发生，提高产品的收率。
优选的，所述式2所示的化合物与盐酸羟胺的摩尔比为1:1.8～2.0。
优选的，所述取代反应的温度为-5～0℃，反应时间为8～12h。
优选的，所述肟化反应的温度为15～30℃，反应时间为6～8h。
优选的反应原料的摩尔比、反应温度和反应时间，有利于使反应充分进行，提高原料的转化率，进而提高产品的收率。
优选的，所述荧光探针的制备方法具体包括如下步骤：
步骤a，将式1所示的碘代氟硼荧和催化剂加入三乙胺溶液中，经液氮冷冻、抽真空、充氮气和解冻后，加入5-乙炔基-2-羟基苯甲醛溶液，然后经液氮冷冻、抽真空、充氮气和解冻后，于密闭条件下反应，然后经柱层析，旋干，得式2所示的化合物；
步骤b，将式2所示的化合物溶于乙醇中，加入盐酸羟胺和氢氧化钠溶液，反应结束后调节pH至5.8～6.2，过滤，洗涤，重结晶，得所述荧光探针。
优选的，所述三乙胺溶液为三乙胺的四氢呋喃溶液，其与碘代氟硼荧的体积质量比为13～15:100，其中，质量的单位是毫克，体积的单位是毫升。
进一步优选的，所述三乙胺与四氢呋喃的体积比为3～5:10。
优选的，所述5-乙炔基-2-羟基苯甲醛溶液为5-乙炔基-2-羟基苯甲醛的甲苯溶液，5-乙炔基-2-羟基苯甲醛的浓度为0.04～0.05mol/L。
优选的，步骤a中，柱层析的洗脱剂为体积比为1:1.8～2.2的二氯甲烷和正己烷。
优选的，步骤b中，氢氧化钠与盐酸羟胺的摩尔比为1:0.8～1.2。
优选的，步骤b中，洗涤采用体积比为9～11:1的乙酸和水的混合溶液。
优选的，所述5-乙炔基-2-羟基苯甲醛的制备方法包括如下步骤：
将5-溴水杨醛、双(三苯基膦)二氯化钯、碘化亚铜、三甲基硅乙炔、三乙胺加入四氢呋喃中，于45～55℃反应，然后经柱层析后加入四丁基氟化铵溶液中，于15～30℃反应12～18h，经柱层析、浓缩和干燥，得5-乙炔基-2-羟基苯甲醛。
进一步优选的，所述四氢呋喃与5-溴水杨醛的体积质量比为15-17:1，其中，体积的单位是毫升，质量的单位是克。
进一步优选的，所述5-溴水杨醛、双(三苯基膦)二氯化钯、碘化亚铜和三甲基硅乙炔的摩尔比为1:0.03～0.04:0.03～0.04:1.4～1.6。
进一步优选的，所述5-溴水杨醛与三乙胺的质量体积比为1:6～7，其中，质量的单位是克，体积的单位是毫升。
进一步优选的，所述5-溴水杨醛与四丁基溴化铵溶液的质量体积比为1:28～32，其中，质量的单位是克，体积的单位是毫升。
进一步优选的，所述四丁基溴化铵溶液为四丁基溴化铵的四氢呋喃溶液，其中，四丁基溴化铵与四氢呋喃的体积比为1:85～95。
进一步优选的，所述柱层析的分离温度为15～40℃，流速为0.1～10mL/min，洗脱剂为体积比为1:1～2的二氯甲烷和正己烷。
优选的制备方法，有利于制备得到高收率的5-乙炔基-2-羟基苯甲醛。
优选的，所述碘代氟硼荧的制备方法包括如下步骤：
将苯甲醛、2,4-二甲基吡咯和三氟乙酸加入二氯乙烷中，于15～30℃反应，反应结束后降温至-5～0℃，加入2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌、三乙胺和三氟化硼-乙醚络合物，于15～30℃反应，反应结束后经洗涤、萃取、干燥、柱层析，将所得产物加入N-碘代丁二酰亚胺溶液中进行反应，反应结束后经柱层析，浓缩，干燥，得所述碘代氟硼荧。
进一步优选的，所述苯甲醛与2,4-二甲基吡咯的摩尔比为1:1.8～2.2。
进一步优选的，所述2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌与苯甲醛的摩尔比为1.0～1.2:1。
进一步优选的，所述二氯乙烷与2,4-二甲基吡咯的体积质量比为1:4～5，其中，体积的单位是毫升，质量的单位是毫克。
进一步优选的，所述三氟乙酸与苯甲醛的体积比为0.8～1.2:1。
进一步优选的，所述三乙胺与苯甲醛的体积比为9～11:1。
进一步优选的，所述三氟化硼-乙醚络合物与苯甲醛的体积比为18～22:1。
进一步优选的，所述N-碘代丁二酰亚胺与苯甲醛的摩尔比为1.6～1.8:1。
进一步优选的，所述N-碘代丁二酰亚胺溶液为N-碘代丁二酰亚胺的二氯乙烷溶液，N-碘代丁二酰亚胺的浓度为79～80mmol/L。
进一步优选的，柱层析的洗脱液均为体积比为1:1～2的二氯甲烷和正己烷。
本发明还提供了上述荧光探针在神经性毒剂检测中的应用。
本发明还提供了一种神经性毒剂检测元件，其包括所述的荧光探针。
优选的，所述神经性毒剂检测元件为试纸条或薄膜。
本发明制备的荧光探针可与聚氧化乙烯溶解于二氯甲烷制成溶液，将滤纸在该溶液中浸渍后晾干得到胶片，裁剪后作为试纸。还可以制备成聚氧化乙烯薄膜，用于气相和液相中神经性毒剂的检测。
本发明制备的荧光探针适用于中性和碱性溶液，可检测的神经性毒剂包括G系列的沙林、梭曼、塔崩、乙基沙林等，以及V系列的VX、VG、VM、VE等，检测灵敏度高，响应迅速，抗干扰能力强，具有较好的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的5-乙炔基-2-羟基苯甲醛的1H NMR谱图；
图2为本发明实施例1制备的碘代氟硼荧的1H NMR谱图；
图3为本发明实施例1制备的荧光探针的1H NMR谱图；
图4为本发明实施例1制备的荧光探针的质谱图；
图5为本发明实施例2中向含3％三乙胺的探针乙腈溶液中加入不同浓度的神经性毒剂VX溶液的紫外可见吸收光谱图，内插图为加入VX前后溶液的颜色变化图；
图6为本发明实施例2中向含3％三乙胺的探针乙腈溶液中加入不同浓度的神经性毒剂VX溶液在520nm激发波长下的荧光光谱图；
图7为本发明实施例2中向含3％三乙胺的探针乙腈溶液中加入30μLVX储备液的溶液的荧光随时间的变化图；
图8为本发明实施例3中检测VX和不同有机磷干扰物的荧光强度变化图，其中，a为不同有机磷干扰物以及空白对照的荧光强度变化图，b为VX的荧光强度变化图；
图9为由实施例1制备的荧光探针制备的试纸片对气相中神经性毒剂GD的荧光响应图；
图10为由实施例1制备的荧光探针制备的试纸片对液相中神经性毒剂GD的荧光响应图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
为了更好的说明本发明，下面通过实施例做进一步的举例说明。
实施例1
本实施例提供一种荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
(1)5-乙炔基-2-羟基苯甲醛的合成：
向反应瓶中依次加入5-溴水杨醛(3.00g，14.92mmol)，双(三苯基膦)二氯化钯PdCl2(PPh3)2(315.0mg，0.449mmol)，碘化亚铜(85.0mg，0.446mmol)，三乙胺20mL，三甲基硅基乙炔(2.20g，22.40mmol)和50mL四氢呋喃，于50℃搅拌反应，TLC检测原料消失后，将反应液旋干，然后以体积比为1:2的二氯甲烷和正己烷作为洗脱剂进行柱层析，将收集所得的洗脱剂于低压下30-60℃旋干，得白色产物，将产物溶于90mL四氢呋喃中，加入1mL四丁基氟化铵(TBFA)，于25℃搅拌反应18h，将反应液旋干，然后以体积比为1:2的二氯甲烷和正己烷作为洗脱剂进行柱层析，收集含有5-乙炔基-2-羟基苯甲醛的洗脱剂，于低压下30-60℃旋干，得5-乙炔基-2-羟基苯甲醛(1.4g，9.58mmol)，产率64.2％。反应方程式如下：
Figure BDA0002759002230000071
5-乙炔基-2-羟基苯甲醛的氢谱谱图如图1所示，数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ11.13(s,1H),9.87(s,1H),7.73(s,1H),7.63(d,J＝8.7Hz,1H),6.96(d,J＝8.7Hz,1H),3.04(s,1H)。
(2)碘代氟硼荧的合成
将2,4-二甲基吡咯(950.0mg，9.98mmol)加入200mL二氯乙烷中，混合均匀，然后加入0.5mL苯甲醛(4.90mmol)，0.5mL三氟乙酸，于25℃反应完全后，降温至0℃，冰水浴条件下加入2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌(1.135g，5.0mmol)，三乙胺5mL和三氟化硼-乙醚络合物10mL，于25℃反应10h后淬灭反应，水洗后用二氯乙烷萃取(3×30mL)，无水硫酸钠干燥，旋干，以体积比为1:2的二氯甲烷和正己烷作为洗脱剂进行柱层析，收集洗脱剂于低压下30-60℃旋干，所得产物溶于50mL二氯乙烷中，加入100mLN-碘代丁二酰亚胺(1.79g，7.95mmol)的二氯乙烷溶液，于25℃搅拌反应12h后直接进行柱层析，洗脱液为体积比2:1的正己烷和二氯甲烷，收集含有碘代氟硼荧的洗脱剂，于低压下30-60℃旋干，得淡黄色碘代氟硼荧(1.30g，2.89mmol)，产率63.7％。具体反应方程式如下：
Figure BDA0002759002230000081
碘代氟硼荧的氢谱谱图如图2所示，数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.58-7.45(m,3H),7.26(d,J＝2.9Hz,2H),6.04(s,1H),2.60(d,J＝26.5Hz,6H),1.38(s,6H)。
(3)荧光探针的合成
依次将上述制备的碘代氟硼荧(100mg，0.22mmol)，PdCl2(PPh3)2(7.02mg，0.01mmol)，碘化亚铜(1.90mg，0.01mol)，10mL四氢呋喃和4mL三乙胺加入安剖瓶中，经液氮冷冻、抽真空、充氮气和解冻后，加入10mL5-乙炔基-2-羟基苯甲醛(64.40mg，0.44mmol)的甲苯溶液，然后经液氮冷冻、抽真空、充氮气和解冻后，封管，于0℃反应12h，旋干，以体积比1:2的二氯甲烷和正己烷为洗脱剂进行柱层析，收集洗脱液，旋干，然后将所得产物(41.8mg，0.089mmol)溶于15mL乙醇中，加入到3mL盐酸羟胺(12.4mg，0.178mmol)和氢氧化钠(7.1mg，0.178mmol)的水溶液中，于25℃搅拌反应7h后调节pH至6.0，过滤，用乙酸和水(50mL，体积比10:1)的混合溶液洗涤，重结晶，过滤，干燥，得所述荧光探针(34.8mg，0.072mmol)，产率32.7％。具体反应方程式如下：
Figure BDA0002759002230000091
所述荧光探针的氢谱谱图如图3所示，数据如下：
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ9.86(s,1H),8.18(s,1H),7.51(dd,J＝5.0,1.9Hz,3H),7.37(dd,J＝8.5,2.1Hz,1H),7.31-7.29(m,2H),7.28(d,J＝2.0Hz,1H),7.20(s,1H),6.93(d,J＝8.5Hz,1H),6.03(s,1H),2.69(s,3H),2.58(s,3H),1.49(s,3H),1.40(s,3H)。
质谱谱图如图4所示，HR-MS(C28H24BF2N3O2):理论计算值483.33，实验测定值[M+H]+为484.20，实际值与理论值相符。
实施例2
荧光探针在神经性毒剂VX检测中的应用：
以乙腈为溶剂，将实施例1制备的荧光探针配制成浓度为1.0×10-3M的荧光探针储备液，将VX配制成1.0×10-2M的神经性毒剂VX的储备液。
将20μL的荧光探针储备液加入到含有60μL三乙胺和2mL乙腈的比色皿中，逐次滴加2μL的VX储备液，每次滴加结束后震荡2min，然后测定紫外可见吸收光谱和荧光光谱。测定结果如图5和图6所示。
由图5可以看出，随着VX的加入，溶液的吸收峰由527nm蓝移到523nm，吸收强度出现明显增强。由图5的插图中可以看到，不加VX时溶液的颜色为裸眼可见的紫色，当VX浓度为1.5×10-4M时溶液的颜色出现裸眼可见的由紫色变为橙色的显著差异(左边小瓶是不加VX的，为紫色；右边小瓶是加入VX后的，为橙色)。同时，从图6可以看出，随着VX浓度的增加，荧光发射峰由590nm蓝移至560nm，荧光强度大幅度增强，当VX的浓度为1.2×10-4M时达到饱和，继续增加VX强度，荧光强度不再继续增加。560nm处的荧光强度与VX浓度呈现良好的线性相关，相关系数为0.982，线性方程为Y＝176.54×10-5X+11.91，检测限为4.0×10-9M。表明荧光探针能够实现对神经性毒剂VX的高灵敏度的可视化检测。
将20μL的荧光探针储备液加入到含有60μL三乙胺和2mL乙腈的比色皿中，加入30μL的VX储备液，立即记录紫外灯下的溶液荧光变化，结果如图7所示，从图中可以看出，加入中VX 1s后溶液出现可见的荧光变化，6s后溶液的荧光颜色与加入VX前出现显著差异，由最初的紫色到6s变为黄色。表明本发明制备的荧光探针能够实现对神经性毒剂VX的快速检测。
实施例3
荧光探针对神经性毒剂的选择性检测：
以乙腈为溶剂，分别配制浓度为1.0×10-2M的有机磷干扰物：甲基膦酸二甲酯、磷酸三苯酯、磷酸三甲酯、乙酰甲胺磷、水胺硫磷、乐果和对硫磷的储备液。
以乙腈为溶剂，将实施例1制备的荧光探针配制成浓度为1.0×10-3M的荧光探针储备液，将VX配制成1.0×10-2M的神经性毒剂VX的储备液。
取9个样品瓶，向每个样品瓶中分别加入1.89mL乙腈、20μL的荧光探针储备液、60μL三乙胺，然后分别向前7个样品瓶中每个样品瓶里加入上述制备的一种干扰物储备液30μL，并向第8个样品瓶中加入30μLVX储备液，第9个样品瓶为荧光探针空白对照。测定上述9个样品瓶的荧光强度，结果如图8所示，由图中可以看出，加入VX后，溶液的荧光强度出现显著增强，加入其它干扰物后溶液强度无明显变化，因此，图中7个干扰物的荧光强度以及空白荧光探针对照的曲线完全重合。表明，常规的有机磷干扰物对本发明制备的荧光探针的检测性能无影响，本发明制备的神经性毒剂荧光探针具有较高的选择性。
实施例4
荧光探针对气相和液相中神经性毒剂的检测：
以乙腈为溶剂，配制浓度为1.0×10-4M的神经性毒剂GD的储备液。
用马克笔蘸取荧光探针浓度为1.0×10-4M含3％三乙胺的乙腈溶液，在滤纸上画上“GD”字样的图案，自然干燥后将其放入含有GD蒸汽(5ppb)的密闭容器中，静置15min，于紫外灯下观察结果。结果如图9所示。
将滤纸浸泡在荧光探针浓度为1.0×10-4M含3％三乙胺的乙腈溶液中，5min后取出在空气中自然干燥，然后蘸取神经性毒剂GD溶液(共约50μg)，在滤纸上画上“GD”字样的图案，于紫外灯下观察结果。结果如图10所示。
由图9和图10可以看出，上述两种滤纸在紫外灯下均出现强烈的荧光增强效应，表明本发明制备的荧光探针分子能够应用于真实环境中神经性毒剂的检测。
采用本发明限定的其他反应条件，如反应原料的比例、反应温度和时间等，只要在本发明说明书限定的范围内，均可达到与实施例1基本相当的收率，以及基本相当的检测效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种荧光探针，其特征在于，其结构如式3所示：
Figure FDA0002759002220000011
2.一种权利要求1所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
5-乙炔基-2-羟基苯甲醛和式1所示的碘代氟硼荧在催化剂的作用下发生取代反应，得式2所示的化合物；
式2所示的化合物与盐酸羟胺进行肟化反应，得式3所示的荧光探针。
Figure FDA0002759002220000012
3.如权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述5-乙炔基-2-羟基苯甲醛和碘代氟硼荧的摩尔比为1.8～2.2:1；和/或
所述取代反应的催化剂为双(三苯基膦)二氯化钯和碘化亚铜，所述碘代氟硼荧、双(三苯基膦)二氯化钯和碘化亚铜的摩尔比为18～22:1:1。
4.如权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述式2所示的化合物与盐酸羟胺的摩尔比为1:1.8～2.0。
5.如权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述取代反应的温度为-5～0℃，反应时间为8～12h；和/或
所述肟化反应的温度为15～30℃，反应时间为6～8h。
6.如权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述5-乙炔基-2-羟基苯甲醛的制备方法包括如下步骤：
将5-溴水杨醛、双(三苯基膦)二氯化钯、碘化亚铜、三甲基硅乙炔和三乙胺加入四氢呋喃中，于45～55℃反应，然后经柱层析后加入四丁基氟化铵溶液中，于15～30℃反应12～18h，经柱层析、浓缩和干燥，得5-乙炔基-2-羟基苯甲醛。
7.如权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于，所述碘代氟硼荧的制备方法包括如下步骤：
将苯甲醛、2,4-二甲基吡咯和三氟乙酸加入二氯乙烷中，于15～30℃反应，反应结束后降温至-5～0℃，加入2,3-二氯-5,6-二氰对苯醌、三乙胺和三氟化硼-乙醚络合物，于15～30℃反应，反应结束后经洗涤、萃取、干燥、柱层析，将所得产物加入N-碘代丁二酰亚胺溶液中进行反应，反应结束后经柱层析，浓缩，干燥，得所述碘代氟硼荧。
8.权利要求1所述荧光探针在神经性毒剂检测中的应用。
9.一种神经性毒剂检测元件，其特征在于，其包括权利要求1所述的荧光探针。
10.如权利要求9所述的神经性毒剂检测元件，其特征在于，所述神经性毒剂检测元件为试纸条或薄膜。
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