CN112292448A - 表达cd19-car的nk细胞消除cd19阳性淋巴系统恶性肿瘤 - Google Patents
表达cd19-car的nk细胞消除cd19阳性淋巴系统恶性肿瘤 Download PDFInfo
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Abstract
本文提供了表达CD19 CAR、CD16和IL2的
细胞的组合物，以及使用这些细胞和治疗患者的癌症的方法。
Description
本申请要求2018年10月31日提交的序列号为62/753,719的我们共同未决的美国临时申请的优先权。
序列表
名为104077.0008PCT Seq_ST25、大小为38KB的序列表的ASCII文本文件创建于2019年7月15日，通过EFS-Web与本申请一起以电子方式提交，将其内容通过引用以其整体并入。
技术领域
本发明的领域是与癌症治疗有关的工程改造的细胞。
背景技术
背景描述包括可用于理解本发明的信息。并不承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明相关，也不承认具体地或隐含地提到的任何出版物是现有技术。
本文中的所有出版物和专利申请都通过引用并入，其程度如同每个单独的出版物或专利申请被具体地且单独地指明通过引用并入一样。在并入的参考文献中的术语的定义或用法与本文提供的该术语的定义不一致或相反时，适用本文提供的该术语的定义，而不适用该术语在该参考文献中的定义。
自然杀伤(NK)细胞是构成先天免疫系统的主要组分的细胞毒性淋巴细胞。自然杀伤(NK)细胞通常代表循环淋巴细胞的约10％-15％，其结合并杀灭对抗原不具有特异性并且没有既往免疫致敏的靶细胞(包括病毒感染的细胞和许多恶性细胞)。Herberman等人,Science[科学]214:24(1981)。靶细胞的杀灭是通过诱导细胞裂解发生的。用于自体NK细胞移植的NK细胞是从受试者血液的外周血淋巴细胞(“PBL”)部分分离的，在细胞培养物中扩增以获得足够数量的细胞，然后重新输注到受试者体内。此类自体NK细胞在体内治疗中显示出一些有效性。然而，此种疗法仅限于自体情况，并且由于并非所有NK细胞都具有细胞溶解性这一事实而进一步复杂化。
发明内容
在一些实施例中，本披露提供了一种表达CD19 CAR和Fc受体的
细胞。在一些实施例中，该
细胞包含编码该CD19CAR和该Fc受体的多顺反子构建体。在一些实施例中，该Fc受体是CD16。在一些实施例中，该Fc受体包含SEQ ID NO:2。在一些实施例中，该多顺反子转基因还包含编码IL-2或其变体的序列。在一些实施例中，该IL-2变体是erIL-2。在一些实施例中，该CD19 CAR、该Fc受体或erIL-2中的一种或多种的编码序列经密码子优化以在人系统中表达。
在一些实施例中，
细胞能够杀灭CD19表达细胞，例如肿瘤细胞。在一些实施例中，该肿瘤细胞是SUP-B15细胞。在一些实施例中，该CD19 CAR包含scFv抗体片段。在一些实施例中，该scFv抗体片段具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列。在一些实施例中，该多顺反子构建体包含SEQ ID NO:9的序列，其中该序列编码该scFv抗体片段。在一些实施例中，该
细胞包含编码自切割肽的序列，其中该序列位于该CD19 CAR与CD16之间，并且其中该序列允许等摩尔表达该CD19 CAR和该FcR。在一些实施例中，该
细胞在编码CD16的序列与编码IL-2或其变体的序列之间包含内部核糖体进入序列(IRES)。
在一些实施例中，当效应子与靶标的比率为10时，该
细胞对CD19表达细胞的直接细胞毒性为70％-100％。在一些实施例中，当效应子与靶标的比率为10时，该
细胞的ADCC活性为30％-90％。在一些实施例中，该CD19 CAR包含与SEQ ID NO:10具有至少90％同一性的序列。
在一些实施例中，本披露提供了一种试剂盒，该试剂盒包含含有本文披露的
细胞的药物组合物。
在一些实施例中，本披露提供了一种用于产生
细胞的方法，该方法包括提供载体，以及将该载体引入
细胞中以产生该
细胞，其中该载体编码CD19CAR和CD16。在一些实施例中，该载体还包含编码IL-2的序列。在一些实施例中，该载体包含编码自切割肽的序列，其中该序列位于CAR与CD16之间，并且其中该序列允许等摩尔表达CAR和CD16。在一些实施例中，该载体在CD16编码序列与IL-2编码序列之间包含内部核糖体进入序列(IRES)。
在一些实施例中，本披露提供了一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向该受试者向该受试者施用治疗有效量的组合物，该组合物包含多种如说明书和权利要求书中公开的
细胞。在一些实施例中，向该受试者施用约1x108至约1x1011个修饰的细胞/m2受试者体表面积。
在一些实施例中，该癌症是白血病或淋巴瘤。
在一些实施例中，该癌症是以下中的一种或多种：B细胞恶性肿瘤、HSCT后的B细胞恶性肿瘤、CLL、B-ALL、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、UCBT后的B谱系淋巴系统恶性肿瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B-非霍奇金氏淋巴瘤(B-Non-Hodgkin's Lymphoma，B-NHL)、HSCT后ALL；淋巴瘤、难治性滤泡性淋巴瘤或淋巴母细胞性白血病。在一些实施例中，该B细胞恶性肿瘤是套细胞淋巴瘤。在一些实施例中，静脉内施用多个
细胞。在一些实施例中，肿瘤内施用该多个
细胞。
前面的一般描述和下面的详细描述是示例性和说明性的，并且旨在提供对本披露的进一步说明。对于本领域技术人员而言，其他目的、优点和新颖特征将是显而易见的。
附图说明
在结合附图考虑的同时参考以下披露后，将更容易理解本披露的目的、特征和优点。
图1是第一代、第二代和第三代CAR的结构域的示意图。
图2显示了三顺反子质粒的组分，这些组分包含CAR编码序列、P2A序列、CD16编码序列和erIL-2编码序列。
图3A和3B显示了流式细胞术分析的结果，这些结果显示CD16和CD19-CAR在CD19t-haNKTM细胞表面上的表达。每个小图右侧的峰表示表达CD16或CD19的细胞的群体。
图4A显示了CD19 t-haNKTM细胞对K562细胞的细胞毒性作用。16B1和18B1是从两个不同日期进行的两次电穿孔事件获得的两个CD19 t-haNKTM群体。图4B显示了所选的CD19t-haNKTM克隆在细胞毒性测定中对K562的细胞毒性作用。
图5A显示了CD19 t-haNKTM细胞对SUP-B15细胞的细胞毒性作用。16B1和18B1是从两个不同日期进行的两次电穿孔事件获得的两个CD19 t-haNKTM群体。图5B显示了所选的CD19 t-haNKTM克隆在细胞毒性测定中对SUP-B15的细胞毒性作用。
图6A显示了当与赫赛汀(Herceptin)(抗Her2抗体)组合时，CD19 t-haNKTM细胞对SKBr3细胞的ADCC活性。使用抗CD20抗体美罗华(Rituxan)作为对照。图6B显示了当与抗CD20抗体利妥昔单抗(rituximab)组合时，所选的CD19 t-haNKTM克隆对表现为CD19KO/CD20+的SUP-B15细胞的ADCC活性。
图7显示了所选的CD19 t-haNKTM克隆的倍增时间。
图8显示了在培养条件下从所选的CD19 t-haNKTM克隆释放IL-2。
图9显示了静脉内Raji荷瘤动物的存活曲线。通过对数秩(Mantel-Cox)检验进行统计分析。****，P<0.0001。
图10显示了静脉内Raji肿瘤模型中的动物体重变化。数据是平均值±SEM。SEM计算为标准差除以N的平方根。
图11显示了皮下Raji模型的肿瘤生长曲线。数据是平均值±SEM。使用双因素方差分析，随后通过Tukey检验进行的多重比较来进行统计分析；***，P<0.001；****，P<0.0001。
图12显示CD19 t-haNKTM减少了皮下Raji荷瘤小鼠肝中的转移性疾病负荷。(a)第13天，来自指示处理组的动物的全肝图像。黄色箭头指示转移性病变。在照相之前，将肝固定在10％福尔马林中至少24小时，(b)在指定之日定量肝中肿瘤细胞的受累百分比(通过H&E染色评价)。在第13天：*，P＝0.0257，通过不配对的双尾t检验。由于样品量有限，无法进行第11天和第15天的统计分析。有关原始数据，请参见表4。
图13显示了皮下Raji肿瘤模型中的动物体重变化。数据为平均值±SEM。
具体实施方式
概述
本披露提供了表达CD19 CAR和Fc受体的
细胞。在一些实施例中，这些细胞还表达IL-2。在一些实施例中，这些
细胞包含三顺反子构建体，该三顺反子构建体包含编码CD19 CAR、Fc和IL2的核酸序列。
术语
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本领域的普通技术人员通常所理解相同的含义。
在本说明书和随后的权利要求书中，将参考许多术语，这些术语应被定义为具有以下含义：
本文中所用术语仅用于描述具体实施例的目的，而不意图具有限制性。除非上下文另外明确指出，否则如本文所用，单数形式“一种”、“一个”和“该”也旨在包括复数形式。因此，例如，提及“一种自然杀伤细胞”包括多种自然杀伤细胞。
所有数字指称，例如pH、温度、时间、浓度、量和分子量，包括范围，都是近似值，这些值在适当的情况下以0.1或1.0的增量变化，即(+)或(-)。应当理解，尽管并非总是明确地陈述，但是所有数字指称前均可以有术语“约”。
如本文所用，“+”当用于指示特定细胞标志物的存在时，是指该细胞标志物在荧光活化的细胞分选中相对于同种型对照可检测地存在；或在定量或半定量RT-PCR中可检测到高于背景值。
如本文所用，“-”当用于指示特定细胞标志物的存在时，是指该细胞标志物在荧光活化的细胞分选中相对于同种型对照不可检测地存在；或在定量或半定量RT-PCR中不可检测到高于背景值。
如本领域技术人员将理解，出于任何和所有目的，特别是在提供书面描述方面，本文披露的所有范围也涵盖任何和所有可能的亚范围及其亚范围的组合。任何列出的范围均可以被容易地识别为充分描述并且能够将相同范围分解为至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为一个非限制性实例，可以容易地将本文讨论的每个范围分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。还如本领域技术人员所理解，所有语言，诸如“最多”、“至少”、“大于”、“小于”等均包括所述数字，并且指可以随后分解成上述亚范围的范围。最后，如本领域技术人员所理解，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组，等等。
如本文所用，当提及
细胞的某些可量化的特性，诸如细胞毒性、生存力或细胞倍增时间等时，术语“基本上相同”与术语“相当”或“基本上类似”可互换使用，是指这些特性中的两个测量值彼此相差不超过15％，不超过10％，不超过8％或不超过5％。
还应理解，尽管并非总是明确指出，本文所述的试剂仅是示例性的，并且其等同物是本领域已知的。
出于本发明的目的并且除非另外指示，否则术语
旨在指原始
细胞系以及NK-92细胞系、
细胞的克隆和已经修饰(例如，通过引入外源基因)的
细胞。
细胞及其示例性和非限制性的修饰描述于美国专利号7,618,817；8,034,332；8,313,943；9,181,322；9,150,636；和公开的美国申请号10/008,955中，这些专利均通过全文引用的方式并入本文中，并且包括野生型
-CD16、
-CD16-γ、
-CD16-ζ、
-CD16(F176V)、
MI和
CI。
细胞是本领域普通技术人员已知的，对于本领域普通技术人员，此类细胞可从南克维斯特公司(
Inc)容易地获得。
如本文所用，术语
细胞”是指来源于Gong等人(Leukemia[白血病],四月；8(4):652-8(1994))中所述的高效独特细胞系的自然杀伤细胞，其权利由南克维斯特公司拥有(下文中的
细胞”)。
如本文所用，术语“aNK细胞”是指来源于Gong等人(Leukemia[白血病],四月；8(4):652-8(1994))中所述的高效独特细胞系的未修饰的自然杀伤细胞，其权利由南克维斯特公司拥有(下文中的“aNK细胞”)。
如本文所用，术语“haNK细胞”是指来源于Gong等人(Leukemia[白血病],四月；8(4):652-8(1994))中所述的高效独特细胞系的自然杀伤细胞，其权利由南克维斯特公司拥有，经修饰以在细胞表面上表达CD16(下文中的“CD16+
细胞”或“haNK细胞”)。
如本文所用，术语“taNK
是指来源于Gong等人(Leukemia[白血病],四月；8(4):652-8(1994))中所述的高效独特细胞系的自然杀伤细胞，其权利由南克维斯特公司拥有，经修饰以表达嵌合抗原受体(下文中的“CAR修饰的
细胞”或“taNK
)。
如本文所用，术语“t-haNKTM”细胞是指来源于Gong等人(Leukemia[白血病],四月；8(4):652-8(1994))中所述的高效独特细胞系的自然杀伤细胞，其由南克维斯特公司拥有，经修饰以在细胞表面上表达CD 16并且表达嵌合抗原受体(下文中的“CAR修饰的CD16+
细胞”或“t-haNKTM细胞”)。在一些实施例中，肿瘤特异性抗原是CD19，并且这些
细胞被称为CD19t-haNKTM细胞。
如本文所用，术语“多顺反子构建体”是指将被转录成单个mRNA分子的重组DNA构建体，并且该单个mRNA分子编码两个或更多个转基因。如果多顺反子构建体编码两个转基因，则将其称为双顺反子构建体，并且如果其编码三个基因，则将其称为三顺反子构建体，并且如果其编码四个基因，则将其称为四顺反子构建体，等等。
如本文所用，术语“嵌合抗原受体”(CAR)是指与细胞内信号传导结构域融合的细胞外抗原结合结构域。CAR可以在T细胞或NK细胞中表达以增加细胞毒性。通常，细胞外抗原结合结构域是对目的细胞上发现的抗原具有特异性的scFv。基于scFv结构域的特异性，表达CAR的
细胞靶向在细胞表面上表达某些抗原的细胞。可以对scFv结构域进行工程改造以识别任何抗原，包括肿瘤特异性抗原和病毒特异性抗原。例如，CD19 CAR识别CD19，CD19是一些癌症表达的细胞表面标志物。
如本文所用的术语“肿瘤特异性抗原”是指存在于癌细胞或赘生性细胞上但不能在来源于与癌细胞相同的组织或谱系的正常细胞上检测到的抗原。如本文所用，肿瘤特异性抗原还指肿瘤相关抗原，即与来源于与癌细胞相同的组织或谱系的正常细胞相比，在癌细胞上以更高水平表达的抗原。
如本文所用，术语“靶”在提及肿瘤的靶向时是指
细胞识别和杀灭肿瘤细胞(即靶细胞)的能力。本文中的术语“靶向”是指例如由
细胞表达的CAR识别并结合由肿瘤表达的细胞表面抗原的能力。
术语“抗体”是指任何同种型的完整免疫球蛋白或其可以与完整抗体竞争地特异性结合靶抗原的片段，并且包括嵌合的、人源化的、完全人的和双特异性的抗体。完整抗体通常包含至少两条全长重链和两条全长轻链，但在一些情况下可包括更少的链，诸如天然存在于骆驼科动物中的抗体，其可仅包含重链。抗体可以仅来源于单一来源，或者可以是“嵌合的”，使得抗体的不同部分来源于两种不同的抗体。抗原结合蛋白、抗体或结合片段可以在杂交瘤中通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割产生。除非另有说明，否则术语“抗体”除了包含两条全长重链和两条全长轻链的抗体外，还包括其衍生物、变体、片段和突变蛋白。此外，除非明确排除，抗体包括：单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、结构域抗体、合成抗体(有时在本文中称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、抗体融合物(有时在本文中称为“抗体缀合物”)、及分别地其片段。在一些实施例中，所述术语还包括肽体。
术语“受试者”是指非人动物(包括哺乳动物，诸如猫、狗、牛、马、猪、绵羊和山羊)和人。术语受试者还指需要治疗本文所述疾病的患者。
“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能发生或不发生，并且所述描述包括其中事件或情况发生的例子以及其中事件或情况不发生的例子。
术语“包含”旨在表示组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由……组成”应意指排除对组合具有任何重要意义的其他要素。例如，基本上由本文所定义的成分组成的组合物将不排除不会实质上影响权利要求书的一个或多个基本和新颖特征的其他成分。“由……组成”是指排除多于痕量的其他成分和实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施例都在本披露的范围内。
如本文所用，术语“细胞毒性”和“细胞溶解性”当用于描述效应细胞诸如NK细胞的活性时，旨在是同义的。通常，细胞毒性活性涉及通过多种生物学、生化或生物物理机制中的任一种杀灭靶细胞。细胞溶解更具体地是指效应子裂解靶细胞的质膜从而破坏其物理完整性的活性。这导致靶细胞的杀灭。在不希望被理论束缚的情况下，据信NK细胞的细胞毒性作用是由于细胞溶解。
针对细胞/细胞群的术语“杀灭”旨在包括将导致该细胞/细胞群死亡的任何类型的操纵。
术语“细胞因子(cytokine)”或“细胞因子(cytokines)”是指影响免疫系统细胞的生物分子的一般类别。示例性细胞因子包括但不限于FLT3配体、干扰素和白介素(IL)，特别是IL-2、IL-12、IL-15、IL-18和IL-21。
术语“患者”、“受试者”、“个体”等在本文中可互换使用，并且指可用于本文所述方法的任何动物或其细胞，无论是体外还是原位。在某些非限制性实施例中，患者、受试者或个体是人。
术语“治疗”涵盖受试者诸如人的本文所述的疾病或障碍的治疗，并且包括：(i)抑制疾病或障碍，即阻止其发展；(ii)减轻疾病或障碍，即使障碍消退；(iii)减缓障碍的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病或障碍的一种或多种症状的进展。术语向受试者“施用”单克隆抗体或自然杀伤细胞包括引入或递送抗体或细胞以执行预期功能的任何途径。施用可以通过适用于递送细胞或单克隆抗体的任何途径进行。因此，递送途径可以包括静脉内、肌内、腹膜内或皮下递送。在一些实施例中，例如通过注射到肿瘤中直接向肿瘤施用修饰的
细胞。在一些实施例中，例如通过注射、输注或植入(皮下、静脉内、肌内、囊内、肿瘤内或腹膜内)肠胃外施用本文所述的修饰的
细胞。
术语“表达”是指基因产物的产生。
如本文所用，术语“细胞毒性”当用于描述效应细胞诸如NK细胞的活性时，涉及通过多种生物学、生物化学或生物物理机制中的任一种杀灭靶细胞。
术语“减少”和“降低”在本文中全部用于指与参考水平相比减少至少10％，例如减少至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％或减少最多并且包括减少100％(即，与参考样品相比零水平)，或者与参考水平相比在10％-100％之间的任何减少。
术语“癌症”是指在哺乳动物中发现的癌症、赘生物或恶性肿瘤中的所有类型，包括白血病、癌和肉瘤。示例性癌症包括脑癌、乳腺癌、子宫颈癌、结肠癌、头颈癌、肝癌、肾癌、肺癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤、间皮瘤、卵巢癌、肉瘤、胃癌、子宫癌和髓母细胞瘤。其他实例包括霍奇金氏病(Hodgkin's Disease)、非霍奇金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin's Lymphoma)、多发性骨髓瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、横纹肌肉瘤、原发性血小板增多症、原发性巨球蛋白血症、原发性脑肿瘤、癌症、恶性胰腺胰岛瘤、恶性类癌、膀胱癌、恶变前皮肤病变、睾丸癌、淋巴瘤、甲状腺癌、神经母细胞瘤、食道癌、泌尿生殖道癌、恶性高钙血症、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、内分泌和外分泌胰腺赘生物以及前列腺癌。
术语“治疗有效量”或“有效量”是指相对于未治疗的患者，改善疾病症状所要的量。用于实践本披露以治疗性地处理疾病的一种或多种活性化合物的有效量随施用方式、受试者的年龄、体重以及总体健康状况而变化。最终地，主治医生或兽医会决定适当的量以及给药方案。这样的量被称为“有效”量。
为了方便读者，可以在说明书中使用标题或副标题，其不意图影响本披露的范围。另外，本说明书中使用的一些术语在下面更具体地定义。
载体
本文描述了用于转染细胞以产生本文描述的经修饰的细胞的载体。在一个实施例中，本文描述的载体是瞬时表达载体。使用这类载体引入的外源转基因没有整合到细胞的核基因组中；因此，在没有载体复制的情况下，外源转基因将随着时间而降解或稀释。
在一个实施例中，本文描述的载体允许细胞的稳定转染。在一个实施例中，载体允许将一个或多个转基因并入细胞的基因组中。在一个实施例中，载体具有正选择标志物。正选择标志物包括任何基因，所述任何基因允许细胞在杀灭不表达所述基因的细胞的条件下生长。非限制性实例包括抗生素抗性，例如遗传霉素(来自Tn5的Neo基因)。
在一个实施例中，载体是质粒载体。在一个实施例中，载体是病毒载体。如本领域技术人员将理解的，可以使用任何合适的载体。合适的载体是本领域众所周知的。
在一些实施例中，用编码目的蛋白质(例如，CAR)的mRNA转染细胞。mRNA的转染导致蛋白质的瞬时表达。在一个实施例中，在即将施用细胞之前将mRNA转染到
细胞中。在一个实施例中，即将施用细胞“之前”是指施用之前约15分钟与约48小时之间。优选地，在施用前约5小时至约24小时进行mRNA转染。
CD19
CD19是属于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白。其具有单个跨膜结构域、一个细胞质C末端和一个细胞外N末端。CD19是正常和赘生性B细胞以及滤泡树突状细胞的生物标志物，并且通过调节B细胞受体依赖性和独立信号传导关键性参与建立固有B细胞信号传导阈值。
CD19在大多数急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和B细胞淋巴瘤中表达。大多数B细胞恶性肿瘤以正常至高水平表达CD19(ALL为80％，B细胞淋巴瘤为88％并且B细胞白血病为100％)。尽管CD19是B细胞标志物，但其在骨髓恶性肿瘤病例中也已观察到，包括2％的AML病例。Wang等人,Exp.Hematol.Oncol.[实验血液学与肿瘤学],2012年11月29日；1:36。表1显示了与CD19相关的恶性肿瘤的非限制性实例。
表1：CD19和相关的恶性肿瘤
CAR
区分肿瘤细胞和来源于同一组织的正常细胞的表型变化通常与特定基因产物表达方面的一种或多种变化有关，包括正常细胞表面组分的丢失或其他细胞表面组分的获得(在相应的正常非癌组织中无法检测到的抗原)。在赘生性细胞或肿瘤细胞中表达但在正常细胞中不表达的抗原或在赘生性细胞中表达的水平大大高于正常细胞中发现的水平的抗原被称为“肿瘤特异性抗原”或“肿瘤相关抗原”。肿瘤特异性抗原已被用作癌症免疫疗法的靶标。一种这样的疗法利用在包括T细胞和NK细胞在内的免疫细胞表面上表达的嵌合抗原受体(CAR)来改善针对癌细胞的细胞毒性。CAR包含连接至至少一个细胞内信号传导结构域的单链可变片段(scFv)。scFv识别并结合靶细胞(例如癌细胞)上的抗原，并触发效应细胞活化。信号传导结构域含有基于免疫受体酪氨酸的活化结构域(ITAM)，ITAM对通过受体的细胞内信号传导非常重要。
本披露提供了已经被工程改造以在细胞表面上表达至少一种嵌合抗原受体(CAR)的
细胞。CAR将细胞外抗原识别部分(通常来源于特异性抗体的可变结构域)与细胞内信号传导结构域(单个或具有其他共刺激元件)组合，在识别特定抗原后，该细胞内信号传导结构域可以触发细胞溶解反应。有多种类型的CAR，这些CAR均可以用于本申请中。第一代CAR含有一个细胞质信号传导结构域。该信号传导结构域可以来自例如含有一个ITAM的Fcε受体γ(FcεRIγ)，或来自含有三个ITAM的CD3ζ。据信，CD3ζCAR在根除肿瘤方面比FcεRIγCAR有效。参见例如，Haynes等人,2001,J.Immunology[免疫学杂志]166:182-187；Cartellieri等人,2010,J.Biomed andBiotech[生物医学与生物技术杂志],第2010卷,文章ID 956304。第二代和第三代CAR将多个信号传导结构域例如CD3ζ的细胞质信号传导结构域，和共刺激信号传导结构域，诸如CD28/CD134/CD137/ICOS和CD28/CD134，与单个CAR组合，以促进
细胞的活化和增殖。因此，在一些实施例中，由CD19t-haNKTM细胞表达的CD19 CAR包含来自CD8的铰链区和/或CD28的跨膜结构域。在一些实施例中，CD19 CAR包含FcεRIγ的细胞质信号传导结构域。在一些实施例中，CD19 CAR包含CD3ζ的细胞质信号传导结构域。铰链区、CD28的跨膜结构域和FcεRIγ或CD3ζ的细胞质信号传导结构域的实例披露于美国临时申请号62/674,936中，该申请的全部内容通过引用并入本文中。
尽管先前的出版物，诸如Haynes等人,2001,J.Immunology[免疫学杂志]166:182-187和Cartellieri等人,2010,J.Biomed and Biotech[生物医学与生物技术杂志],第2010卷,文章ID 956304已经披露CD3ζCAR在根除肿瘤方面可能比FcεRIγCAR有效，但在这种情况下，本发明人惊奇且出乎意料地发现，本文披露的细胞、组合物和方法并非如此。实际上，本发明人发现当本文所披露的
细胞具有FcεRIγCAR结构域时，其与具有CD3ζCAR一样有效，或者在一些实施例中甚至更有效。
任选地，CAR对CD19具有特异性。在一些实施例中，CD19是人CD19。在一些实施例中，CD19 CAR包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的scFv片段。在一些实施例中，CD19 CAR包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些实施例中，CD19 t-haNKTM细胞包含SEQ ID NO:9的核酸序列，该核酸序列编码SEQ ID NO:10。在一些实施例中，CD19 t-haNKTM细胞包含SEQ IDNO:11的核酸序列，该核酸序列编码SEQ ID NO:12。在一些实施例中，CD19 t-haNKTM细胞包含SEQ ID NO:13的三顺反子构建体。
在一些实施例中，CD19 CAR多肽包含与SEQ ID NO:10具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施例中，可以将表位标签肽，诸如FLAG、myc、聚组氨酸或V5添加至多肽的氨基末端结构域，以通过使用抗表位标签肽单克隆或多克隆抗体来辅助细胞表面检测。
在实例中，使用本领域已知的方法，诸如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变来制备变体多肽。可以对克隆的DNA进行位点直接诱变(Carter,1986；Zoller和Smith,1987)、盒式诱变、限制性选择诱变(Wells等人,1985)或其他已知技术以产生CD16变体(Ausubel,2002；Sambrook和Russell,2001)。
在一些实施例中，将编码CD19 CAR的多核苷酸突变以在不改变CAR的功能的情况下改变编码CAR的氨基酸序列。例如，可以在SEQ ID NO:9或11中进行引起在“非必需”氨基酸残基处的氨基酸取代的多核苷酸取代。
SEQ ID NO:10或12中的保守取代(其中一种类别的氨基酸被相同类别的另一种氨基酸替代)，只要该取代不实质性地改变多肽的活性，即属于所披露的变体的范围内。保守取代是本领域技术人员众所周知的。非保守取代(其影响(1)多肽主链的结构，诸如β-折叠或α-螺旋构象，(2)电荷，(3)疏水性，或(4)靶位点侧链的体积)可以修饰多肽的功能或免疫学特性。非保守取代需要将其中一个类别的成员交换为另一个类别。可以将取代引入保守取代位点或更优选引入非保守位点。
在实例中，使用本领域已知的方法，诸如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变来制备变体多肽。可以对克隆的DNA进行位点直接诱变(Carter,1986；Zoller和Smith,1987)、盒式诱变、限制性选择诱变(Wells等人,1985)或其他已知技术以产生变体(Ausubel,2002；Sambrook和Russell,2001)。
任选地，CD19 t-haNKTM细胞可以用于治疗癌症，特别是表达CD19的癌症。任选地，该癌症选自由以下组成的组：白血病(包括急性白血病(例如，急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病(包括髓母细胞性、早幼粒细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红血球性白血病))和慢性白血病(例如，慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病))、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，霍奇金氏病和非霍奇金氏病)、多发性骨髓瘤、沃尔登斯特伦巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)、重链疾病、实体瘤，包括但不限于肉瘤和癌诸如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮细胞肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮细胞肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、威尔姆氏肿瘤(Wilm's tumor)、子宫颈癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、髓膜瘤(menangioma)、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
FC受体
在一些实施例中，修饰
细胞以表达至少一种Fc受体，使得该至少一种Fc受体呈现在
细胞的细胞表面上。Fc受体与抗体的Fc部分结合。几种Fc受体是已知的，并且根据它们优选的配体、亲和力、表达和与抗体结合后的作用而不同。
表2.说明性Fc受体
在一些实施例中，修饰
细胞以在细胞表面上表达Fc受体蛋白。
在一些实施例中，Fc受体是CD16。出于本披露的目的，参照SEQ ID NO:2或SEQ IDNO:1(其相对于SEQ ID NO:1在一个位置上不同)指定CD16的特定氨基酸残基。因此，当将CD16多肽与SEQ ID NO:2最大地对准时，CD16多肽“位置158”处的氨基酸残基是对应于SEQID NO:2(或SEQ ID NO:1)的位置158处的氨基酸残基。在一些实施例中，修饰
细胞以表达人CD16，该人CD16在蛋白质的成熟形式例如SEQ ID NO:1的位置158处具有苯丙氨酸。在典型的实施例中，修饰
细胞以表达人CD16的高亲和力形式，该人CD16的高亲和力形式在蛋白质的成熟形式例如SEQ ID NO:2的位置158处具有缬氨酸。成熟蛋白的位置158对应于包括天然信号肽的CD16序列的位置176。在一些实施例中，CD16多肽由编码SEQID NO:3或SEQ ID NO:4前体(即具有天然信号肽)多肽序列的多核苷酸编码。因此，在一个实施例中，Fc受体包含FcγRIII-A(CD16)。在一些实施例中，
细胞经遗传修饰以表达Fc受体，该Fc受体编码与SEQ ID NO:1(FcγRIII-A或在位置158处具有苯丙氨酸(F-158)的CD16)具有至少90％序列同一性；或与SEQ ID NO:2(在位置158处具有缬氨酸(F158V)的CD 16，更高亲和力形式)具有至少90％同一性的多肽。
在一些实施例中，编码CD16多肽的多核苷酸与编码全长(包括信号肽)的天然存在的CD16(其在全长CD16的位置176(对应于成熟CD16蛋白的位置158)处具有苯丙氨酸)的多核苷酸序列具有至少约70％的多核苷酸序列同一性。在一些实施例中，编码CD16多肽的多核苷酸与编码全长(包括信号肽)的天然存在的CD16(其在位置176(对应于成熟蛋白的位置158)处具有缬氨酸)的多核苷酸序列具有至少约70％的多核苷酸序列同一性。在一些实施例中，编码CD16的多核苷酸与SEQ ID NO:13具有至少70％、80％、90％或95％同一性，并且包含在编码全长(包括信号肽)CD16多肽的位置176的多核苷酸位置处编码缬氨酸的密码子。在一些实施例中，编码CD16的多核苷酸包含SEQ ID NO:13，但是具有编码全长CD16的位置176处的缬氨酸的密码子。
在一些实施例中，CD16多核苷酸编码与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少70％、80％、90％或95％同一性的多肽。在一些实施例中，多核苷酸编码与SEQ ID NO:2具有至少70％、80％、90％或95％同一性的多肽，并且如参照SEQ ID NO:2所测定，在位置158处包含缬氨酸。在一些实施例中，多核苷酸编码SEQ ID NO:2。在一些实施例中，CD16多核苷酸编码具有或不具有信号序列的CD16的细胞外结构域、或全长CD16的任何其他片段、或包含与另一种蛋白质的氨基酸序列融合的至少部分CD16序列的嵌合受体。在其他实施例中，可以将表位标签肽，诸如FLAG、myc、聚组氨酸或V5添加至成熟多肽的氨基末端结构域，以通过使用抗表位标签肽单克隆或多克隆抗体来辅助细胞表面检测。
在一些实施例中，同源CD16多核苷酸的长度可以是约150至约700、约750或约800个多核苷酸，尽管具有超过700至800个多核苷酸的CD16变体在本披露的范围内。
同源多核苷酸序列包括编码对CD16变体进行编码的多肽序列的那些序列。同源多核苷酸序列还包括与SEQ ID NO:1有关的天然存在的等位基因变异。用编码具有SEQID.NO:1或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的多肽、其天然存在的变体或与SEQ ID.NO:1或SEQ ID NO:2至少70％相同或至少80％、90％或95％相同的序列的任何多核苷酸转染
细胞在本披露的范围内。在一些实施例中，同源多核苷酸序列编码SEQ ID.NO:1或SEQ ID NO:2中的保守氨基酸取代。在一些实施例中，使用与天然多核苷酸序列不同但编码相同多肽的简并同源CD16多核苷酸序列转染
细胞。
在其他实例中，具有改变CD16氨基酸序列的多态性的cDNA序列用于修饰
细胞，诸如像在CD16基因中表现出遗传多态性的个体之间的等位基因变异。在其他实例中，使用来自其他物种的具有与SEQ ID NO:1的序列不同的多核苷酸序列的CD16基因来修饰
细胞。
可以使用本领域已知的方法，诸如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨酸扫描和PCR诱变来制备变体多肽。可以对克隆的DNA进行位点直接诱变(Carter,1986；Zoller和Smith,1987)、盒式诱变、限制性选择诱变(Wells等人,1985)或其他已知技术以产生CD16变体(Ausubel,2002；Sambrook和Russell,2001)。
在一些实施例中，将编码CD16的多核苷酸突变以在不改变CD16的功能的情况下改变编码CD16的氨基酸序列。例如，可以在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中进行引起在“非必需”氨基酸残基处的氨基酸取代的多核苷酸取代。
SEQ ID.NO:1或SEQ ID NO:2中的保守取代(其中一种类别的氨基酸被相同类别的另一种氨基酸替代)，只要该取代不实质性地改变多肽的活性，即属于所披露的CD16变体的范围内。保守取代是本领域技术人员众所周知的。非保守取代(其影响(1)多肽主链的结构，诸如β-折叠或α-螺旋构象，(2)电荷，(3)疏水性，或(4)靶位点侧链的体积)可以修饰CD16多肽的功能或免疫学特性。非保守取代需要将其中一个类别的成员交换为另一个类别。可以将取代引入保守取代位点或更优选引入非保守位点。
在一些实施例中，CD16多肽变体的长度为至少200个氨基酸，并且与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少70％的氨基酸序列同一性，或至少80％或至少90％的同一性。在一些实施例中，CD16多肽变体的长度为至少225个氨基酸，并且与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2具有至少70％的氨基酸序列同一性，或至少80％或至少90％的同一性。在一些实施例中，如参照SEQ ID NO:2所测定，CD16多肽变体在位置158处具有缬氨酸。
在一些实施例中，编码CD16多肽的核酸可以编码CD16融合蛋白。CD16融合多肽包括与非CD16多肽融合的任何CD16部分或整个CD16。使用重组方法方便地产生融合多肽。例如，将编码CD16多肽例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的多核苷酸与非CD16编码多核苷酸(诸如编码异源蛋白质的信号肽的多核苷酸序列)框内融合。在一些实施例中，可以产生融合多肽，其中异源多肽序列与CD16的C末端融合或位于CD16的内部。典型地，多达约30％的CD16细胞质结构域可以被替换。这样的修饰可以增强表达或增强细胞毒性(例如，ADCC应答性)。在其他实例中，嵌合蛋白(诸如来自其他淋巴细胞活化受体的结构域，包括但不限于Ig-a，Ig-B，CD3-e，CD3-d，DAP-12和DAP-10)取代了一部分CD16细胞质结构域。
融合基因可以通过常规技术合成，包括自动DNA合成仪和使用锚定引物的PCR扩增，所述锚定引物在两个连续基因片段之间产生互补的突出端，所述两个连续基因片段随后可以进行退火并再扩增以生成嵌合基因序列(Ausubel，2002)。许多载体是可商购的，其有助于将CD16框内亚克隆到融合部分。
细胞因子
在一个实施例中，修饰
细胞以表达至少一种细胞因子。特别地，该至少一种细胞因子是IL-2(SEQ ID NO:6)、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21或其变体。在一些实施例中，细胞因子是IL-2、IL-15或其变体。在某些实施例中，IL-2是靶向内质网的变体，并且IL-15是靶向内质网的变体。
在一个实施例中，将IL-2克隆并用将IL-2引导至内质网(erIL-2)的信号序列(SEQID NO:7)表达。这允许IL-2以足以自分泌活化的水平表达，但不会在细胞外释放IL-2。参见Konstantinidis等人“Targeting IL-2to the endoplasmic reticulum confinesautocrine growth stimulation to
cells[使IL-2靶向内质网将自分泌生长刺激限制于
细胞中]”Exp Hematol.[实验血液学]2005年2月；33(2):159-64。可以例如通过自杀基因的存在来阻止表达FcR的
细胞的持续活化。
自杀基因
术语“自杀基因”是指允许对表达自杀基因的细胞进行负选择的转基因。自杀基因被用作安全系统，允许表达该基因的细胞通过引入选择剂而被杀灭。在重组基因引起导致不受控制的细胞生长的突变或者细胞本身能够进行这种生长情况下，这是理想的。已经鉴定出许多自杀基因系统，包括单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因、胞嘧啶脱氨酶基因、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶基因、硝基还原酶基因、大肠杆菌gpt基因和大肠杆菌Deo基因。典型地，自杀基因编码的蛋白质对细胞没有不良影响，但是在存在特定化合物的情况下会杀灭细胞。因此，自杀基因典型地是系统的一部分。
在一个实施例中，自杀基因在
细胞中有活性。在一个实施例中，自杀基因是胸苷激酶(TK)基因。TK基因可以是野生型或突变TK基因(例如，tk30、tk75、sr39tk)。可以使用更昔洛韦杀灭表达TK蛋白的细胞。
在另一个实施例中，自杀基因是胞嘧啶脱氨酶，其在5-氟胞嘧啶存在下对细胞有毒。Garcia-Sanchez等人,“Cytosine deaminase adenoviral vector and 5-fluorocytosine selectively reduce breast cancer cells 1million-fold when theycontaminate hematopoietic cells:apotential purging method for autologoustransplantation[当乳腺癌细胞污染造血细胞时，胞嘧啶脱氨酶腺病毒载体和5-氟胞嘧啶选择性地将乳腺癌细胞降低100万倍：这是自体移植的潜在清除方法].”Blood.[血液]1998年7月15日；92(2):672-82。
在另一个实施例中，自杀基因是细胞色素P450，其在异环磷酰胺或环磷酰胺存在下有毒。参见例如，Touati等人“A suicide gene therapy combining the improvementofcyclophosphamide tumor cytotoxicity and the development of an anti-tumorimmune response[组合了环磷酰胺肿瘤细胞毒性的改进与抗肿瘤免疫反应的发展的自杀基因疗法].”Curr Gene Ther.[当前基因疗法]2014；14(3):236-46。
在另一个实施例中，自杀基因是iCasp9。Di Stasi,(2011)“Inducible apoptosisas a safety switch for adoptive cell therapy[诱导型凋亡作为过继细胞治疗的安全开关].”N Engl J Med[新英格兰医学杂志]365:1673-1683。还参见Morgan,“Live and LetDie:A New Suicide Gene Therapy Moves to the Clinic[生存和死亡：一种新型自杀基因疗法转向临床]”Molecular Therapy[分子疗法](2012)；20:11-13。iCasp9在小分子AP1903存在下诱导凋亡。AP1903是生物学惰性的小分子，在临床研究中已显示出良好的耐受性，并已用于过继细胞疗法背景中。
密码子优化
在一些实施例中，将用于转化aNK细胞的构建体的序列密码子优化以最大化人系统中CD19 CAR、CD16和/或erIL-2的表达效率。密码子优化典型地通过用表达系统基因中更常用或最常用的密码子替换天然序列中的至少一个、超过一个或大量密码子进行核酸序列修饰来进行。密码子优化可以用于翻译的评价，或产生与使用非优化序列产生的转录本相比，具有所需特性诸如更长的半衰期的重组RNA转录本。密码子优化的方法是容易获得的，例如，GeneArtTM，来自赛默飞世尔科技公司(Thermo Fisher Scientific)(马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham,MA))；Optimizer，可从http://genomes.urv.es/OPTIMIZER免费获得，以及来自DNA 2.0公司(加利福尼亚州纽瓦克(Newark,California))的GeneGPS表达优化技术。在特定实施例中，CD19 CAR的编码序列经密码子优化，并且包含SEQ ID NO:9所示的序列。
转基因表达
可以通过本领域技术人员已知的任何机制将转基因工程改造进入表达载体。在将多个转基因插入细胞中的情况下，可以将转基因工程改造进入相同的表达载体或不同的表达载体中。
在一些实施例中，用编码待表达的转基因蛋白的mRNA转染细胞。
可以使用本领域已知的任何转染方法(包括但不限于感染、电穿孔、脂质转染、核转染或“基因枪”)将转基因和mRNA引入
细胞。
表达CD19 CAR的
细胞
本披露提供了一种表达CD19 CAR和FcR的修饰的
细胞。任选地，修饰的
细胞进一步表达IL-2。
在一些实施例中，修饰的
细胞包含多顺反子转基因，并且该多顺反子转基因编码嵌合抗原受体和Fc受体，并且任选地编码IL-2。
在一些实施例中，FcR是CD16。在一些实施例中，CD16是高亲和力CD16，其包含SEQID NO:2或由SEQ ID NO:2组成。在一些实施例中，IL-2是erIL-2，其包含SEQ ID NO:7或由SEQ ID NO:7组成。
在一些实施例中，CD19 CAR编码序列与CD16编码序列由编码自切割肽的序列分隔，以产生由相同mRNA编码的CD19 CAR和CD16的等摩尔表达水平。自切割肽及其编码序列是众所周知的，例如，如Wang等人,Scientific Reports 5[科学报道5]，文章编号16273(2015)中所披露，其相关披露内容通过引用并入本文中。自切割肽的非限制性实例包括猪破伤风病毒-12A(P2A)、扁刺蛾病毒(thosea asigna virus)2A(T2A)、马鼻炎A病毒2A(E2A)、细胞质多角体病毒(BmCPV 2A)和家蚕(B.mori)的软化病病毒(BmIFV 2A)。在一些实施例中，自切割肽是由SEQ ID NO:8编码的P2A肽：ggaagcggagctactaacttcagcctgctgaagcaggctggagacgtggaggagaaccctggacct。
在一些实施例中，CD16编码序列和erIL-2编码序列由内部核糖体进入序列(IRES)分隔，该内部核糖体进入序列允许由从核酸序列转录的mRNA的内部区域起始翻译。
在一些实施例中，
细胞包含从单个mRNA表达CAR、高亲和力CD16和erIL-2的三顺反子构建体。CAR的整合使效应细胞能够特异性地衔接并杀灭表达CAR所识别的靶标的靶细胞；当与治疗性单克隆抗体组合时，CD16的整合使ADCC成为可能；而erIL2，允许细胞在没有外源IL-2的情况下扩增并维持转基因表达的选择压力。一种说明性的三顺反子构建体如图2中所示。
为了产生表达CAR和CD16(例如，高亲和力CD16)和erIL-2的修饰的
细胞，通过例如电穿孔将多顺反子质粒引入aNK细胞中。使转化的
细胞在不含IL-2的培养基中生长，并且可以通过限制稀释克隆从转化的
细胞中选择单个克隆，并根据包括例如高水平的CAR和CD16表达、细胞毒性、ADCC、生长速率和/或IL-2分泌的标准表征。合适的克隆也可以表达表面标志物，例如CD3、CD16、CD54、CD56、NKG2D和/或NKp30，其水平基本上类似于aNK细胞的水平。任选地，进行全基因组测序(WGS)以确定转基因整合位点。可以选择满足这些标准中的一个或多个的克隆来进行进一步开发，并用于治疗临床患者。
表达
IL-2的表达可以通过修饰的
细胞在无IL-2的条件下的能力来证实。可以通过流式细胞术测量CAR和CD16的表达。对于已经用包含CD19 CAR、CD16和IL-2(例如，erIL-2)的编码序列的三顺反子构建体转化的
细胞，转化细胞中能够在无IL-2的条件下生长的典型地至少70％、至少80％、至少85％也显示出高的CAR和CD16两者的表达水平。
任选地，可以使用本领域众所周知的方法，例如通过ELISA，在各个时间点测量转化的
细胞的IL-2分泌水平。
在一些实施例中，测量培养上清液中的IL-2水平，以确定释放到细胞培养基中的IL-2的水平。在一些实施例中，测量细胞沉淀中的IL-2水平以评定IL-2的总细胞内水平。在一些实施例中，测量上清液中的IL-2量和细胞沉淀中的IL-2量两者，以确定由转化的
细胞产生的IL-2的总量。
任选地，可以通过流式细胞术测量转化的
细胞的其他表面标志物。这些标志物包括但不限于CD54、CD56、NKG2D、NKp30和CD3。合适的克隆是已经展示在相同的生长条件下这些标志物的表达水平与aNK细胞基本上相似的克隆。
细胞毒性
任选地，可以使用基于流的细胞毒性测定评定用三顺反子质粒转化的
细胞的细胞毒性。将效应细胞(
细胞)与荧光团标记的靶细胞，例如肿瘤细胞，以不同的效应子与靶标比混合。可以将碘化丙啶(PI)添加到细胞中，并且可以通过流式细胞仪分析样品。优选地，可以在流式细胞仪中将用于标记靶细胞的荧光团与PI区分开。在一些实施例中，荧光团是CFSE。在一些实施例中，荧光团是PKHGL67。细胞毒性可以通过荧光团阳性靶标群体中PI阳性细胞的百分比来确定。
任选地，还可以使用本领域众所周知的方法测试用三顺反子质粒转化的
细胞的细胞毒性。
细胞的细胞毒性可以通过其直接的细胞毒性或ADCC活性来反映。产生的
细胞的直接细胞毒性、靶向和杀灭异常细胞诸如肿瘤细胞的能力可以通过本领域众所周知的方法评定，例如使用Klingemann等人(CancerImmunol.Immunother.[癌症免疫学免疫疗法]33:395-397(1991))描述的程序进行的51Cr释放测定(Gong等人(Leukemia[白血病],四月；8(4):652-8(1994)))。在一些实施例中，靶细胞表达可以被t-haNKTM细胞表面上表达的CAR识别的抗原。简而言之，将51Cr标记的靶细胞与
细胞混合并裂解。可以根据释放的51Cr的量计算特定细胞毒性的百分比。参见专利公开号US 20020068044。
替代性地，还可以使用钙黄绿素释放测定评定产生的
细胞的直接细胞毒性。例如，可以将
细胞(在测定中称为效应子)与负载有钙黄绿素的靶细胞(在测定中称为靶标)以某些比率混合。孵育一段时间后，可以例如通过荧光板读数器评定从靶细胞释放的钙黄绿素。
每个测定中使用的效应子与靶标的比率可以变化，任选地，效应子:靶标比率可以是20:1、15:1、10:1、8:1或5:1；优选地，效应子:靶标比率是10:1。靶细胞可以是表达抗原分子的任何细胞，该抗原分子可以被
细胞(t-haNKTM细胞)上的CAR识别。例如，SUP-B15细胞可以被CD19 CAR识别，并且是CD19 t-haNKTM细胞的靶细胞。
细胞的细胞毒性值可能会根据所用靶细胞的类型以及效应子:靶标比率而变化。通常，使用本文所述的方法产生的
细胞可以具有60％-100％，例如70-100％或80％-100％的细胞毒性。在一些情况下，在使用1:10的效应子:靶标比率时，通过钙黄绿素释放测定可知，
细胞的细胞毒性为80％-100％，例如82％-100％、85％-100％、87％-100％、88％-100％或89％-100％。
任选地，评定的
细胞例如t-haNKTM细胞的细胞毒性是抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。用于测量
细胞的ADCC活性的方法与上述测量直接细胞毒性的方法相似，但还添加了可以识别靶细胞的抗体。NK细胞的Fc受体识别细胞结合的抗体，并触发细胞溶解反应并杀灭靶细胞。在一个说明性实例中，可以将t-haNKTM细胞与赫赛汀(一种抗Her2抗体)和SKBr3(靶细胞)一起孵育，并且可以通过释放靶细胞的内部组分例如上述的51Cr或钙黄绿素，或通过靶细胞的PI染色来测量SKBr3细胞的杀灭。
倍增时间
WGS
任选地，进行转化的
细胞的全基因组测序(WGS)以鉴别多顺反子构建体的插入位点。
治疗应用
本披露还提供了一种治疗处于疾病任何阶段的受试者的任何类型的癌症的方法。合适的癌症的非限制性实例包括癌、黑色素瘤或肉瘤。在一些实施例中，本发明用于治疗造血来源的癌症，诸如白血病或淋巴瘤。在一些实施例中，癌症是实体瘤。
在一些实施例中，治疗受试者的任何类型的癌症的方法包括向患者施用治疗有效量的上述
细胞，其中由此治疗癌症。在一些实施例中，
细胞表达Fc受体，例如具有SEQ ID NO:2所示序列的高亲和力Fc受体。在一些实施例中，
细胞表达CD19CAR、Fc受体和IL-2。在一些实施例中，修饰的
细胞包含多顺反子构建体，并且其中该多顺反子构建体编码嵌合抗原受体和Fc受体。
还提供了用本文所述的修饰的
细胞治疗有需要的受试者的方法。在一些实施例中，受试者或患者患有癌症或感染性疾病，诸如病毒感染。
修饰的
细胞可以以细胞的绝对数量向个体施用，例如，可以向所述个体施用约1000个细胞/注射至多达约100亿个细胞/注射，诸如每次注射约、至少约或最多约1x108、1x107、5x107、1x106、5x106、1x105、5x105、1x104、5x104、1x103、5x103个(等等)
细胞，或这些数字中任何两个之间的任何范围(包括端点)。因此，本披露还提供了一种包含多种
细胞的组合物，其中细胞数量为1x108、1x107、5x107、1x106、5x106、1x105、5x105、1x104、5x104、1x103或5x103个(等等)。
在其他实施例中，可以以约1000个细胞/注射/m2至多达约100亿个细胞/注射/m2向所述个体施用，诸如每次注射约、至少约或至多约1x108个/m2、1x107个/m2、5x107个/m2、1x106个/m2、5x106个/m2、1x105个/m2、5x105个/m2、1x104个/m2、5x104个/m2、1x103个/m2、5x103个/m2(等等)
细胞，或这些数字中任何两个之间的任何范围(包括端点)。
在其他实施例中，
细胞可以以细胞的相对数量向此个体施用，例如，可以向所述个体施用约1000个细胞至多达约100亿个细胞/千克个体，诸如约、至少约或最多约1x108、1x107、5x107、1x106、5x106、1x105、5x105、1x104、5x104、1x103或5x103个(等等)
细胞/千克个体，或这些数字中任何两个之间的任何范围(包括端点)。
在其他实施例中，总剂量可以按m2体表面积来计算，包括约1x1011、1x1010、1x109、1x108、1x107个/m2，或这些数字中任何两个之间的任何范围(包括端点)。人平均为约1.6至约1.8m2。在一个优选的实施例中，向患者施用约10亿个与约30亿个之间的
细胞。在其他实施例中，每次剂量注射的
细胞的量可以按m2体表面积来计算，包括1x1011、1x1010、1x109、1x108、1x107个/m2。人的平均体表面积为1.6-1.8m2。
在其他实施例中，
细胞可以以细胞的相对数量向此个体施用，例如，可以向所述个体施用约1000个细胞至多达约100亿个细胞/千克个体，诸如约、至少约或最多约1x108、1x107、5x107、1x106、5x106、1x105、5x105、1x104、5x104、1x103或5x103个(等等)
细胞/千克个体，或这些数字中任何两个之间的任何范围(包括端点)。
在一些实施例中，以包含
细胞和培养基，诸如人血清或其等效物的组合物形式施用
细胞。在一些实施例中，培养基包含人血清白蛋白。在一些实施例中，培养基包含人血浆。在一些实施例中，培养基包含约1％至约15％的人血清或人血清等效物。在一些实施例中，培养基包含约1％至约10％的人血清或人血清等效物。在一些实施例中，培养基包含约1％至约5％的人血清或人血清等效物。在一个优选的实施例中，培养基包含约2.5％的人血清或人血清等效物。在一些实施例中，血清是人AB血清。在一些实施例中，使用可接受用于人治疗剂的血清替代物代替人血清。此类血清替代物可能是本领域已知的，或者将来会开发。尽管可以使用超过15％的人血清浓度，但是设想到大于约5％的浓度将是成本高昂的。在一些实施例中，以包含
细胞和支持细胞活力的等渗液体溶液的组合物形式施用
细胞。在一些实施例中，以从冷冻保存的样品重构的组合物形式施用
细胞。
包含
细胞的药学上可接受的组合物可以包含多种载体和赋形剂。可以使用多种水性载体，例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的，并且通常不含不需要的物质。合适的载体和赋形剂及其配制品描述于Remington:The Science andPractice ofPharmacy[雷明顿：药物科学与实践],第21版,David B.Troy编,Lippicott Williams&Wilkins[利平科特威廉姆斯&威尔金斯公司](2005)中。药学上可接受的载体是指不是生物学上或其他方面不适宜的材料，即，向受试者施用该材料不会引起不适宜的生物学效应或以有害的方式与药物组合物中含有的其他组分相互作用。如果向受试者施用，则任选地选择载体以最小化活性成分的降解和最小化受试者的不良副作用。如本文所用，术语药学上可接受与生理学上可接受以及药理学上可接受同义使用。药物组合物通常包含用于在储存中缓冲和保存的试剂，并且可以根据施用途径而定包括用于适当递送的缓冲剂和载体。
用于体内或体外使用的这些组合物可以通过用于细胞的灭菌技术来灭菌。这些组合物可以含有接近生理条件所需的可接受的辅助物质，诸如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些配制品和/或其他药剂中的细胞浓度可以变化，并且将根据所选择的特定施用模式和受试者的需要，主要根据流体体积、粘度、体重等进行选择。
在一个实施例中，将
细胞与用于所治疗癌症的一种或多种其他治疗或药剂一起施用至患者。在一些实施例中，用于所治疗癌症的一种或多种其他治疗包括例如抗体、辐射、化学疗法、干细胞移植或激素疗法。
在一些实施例中，
细胞和其他癌症药剂/治疗同时或近似同时(例如，在彼此的约1、5、10、15、20或30分钟内)施用。在一些实施例中，依序施用
细胞和其他癌症药剂/治疗。在一些实施例中，在施用
细胞后一天、两天或三天施用其他癌症治疗/药剂。
在一个实施例中，其他癌症药剂是抗体。在一个实施例中，将
细胞与靶向患病细胞的抗体一起施用。在一个实施例中，将
细胞和抗体以如下方式施用至患者：一起，例如在同一个配制品中；分别，例如在单独的配制品中，同时；或可以分别施用，例如按不同的给药时间表或在一天的不同时间。当分别施用时，可以通过任何合适的途径，诸如静脉内或肿瘤内注射来施用抗体。
在一些实施例中，将本披露的
细胞与治疗性抗体和/或其他抗癌剂组合使用。治疗性抗体可以用于靶向表达癌症相关或肿瘤相关标志物的细胞。表4显示了癌症治疗性单克隆抗体的实例。在一些实施例中，
细胞表达Fc受体，例如具有SEQ ID NO:2所示序列的高亲和力Fc受体。在一些实施例中，这些
细胞是
细胞。在一个实施例中，治疗性抗体是阿维鲁单抗。
表3.说明性的治疗性单克隆抗体
FDA批准的治疗性单克隆抗体的实例
FDA批准的治疗性单克隆抗体的实例
此类
细胞的施用可以与单克隆抗体的施用同时进行，或者以依序的方式进行。在一些实施例中，在已经用单克隆抗体治疗受试者之后，向该受试者施用
细胞。替代性地，可以在施用单克隆抗体的同时，例如在24小时内，施用
细胞。
在一些实施例中，静脉内施用
细胞。在一些实施例中，将
细胞直接输注到骨髓中。
因此，本披露提供了一种治疗有需要的患者的癌症或病毒感染的方法，该方法包括向患者施用治疗有效量的本文所披露的
细胞，从而治疗癌症。
试剂盒
还披露了使用包含本文所述的多种
细胞的组合物治疗癌症或感染性疾病的试剂盒。在一些实施例中，本披露的试剂盒还可以包括至少一种单克隆抗体。试剂盒中包括的
细胞表达CAR和Fc受体。在一些实施例中，
细胞进一步表达IL-2，例如erIL-2，或IL-15，例如erIL-15。在一些实施例中，
细胞包含多顺反子构建体，并且其中该多顺反子构建体编码嵌合抗原受体、Fc受体，并且任选地编码IL-2或IL-15。
在某些实施例中，试剂盒可以含有其他化合物，诸如治疗活性化合物或欲在施用
细胞之前、同时或之后施用的药物。此类化合物的实例包括抗体、维生素、矿物质、氟可的松(fludrocortisone)、布洛芬(ibuprofen)、利多卡因(lidocaine)、奎尼丁(quinidine)、化学治疗剂等。
在各种实施例中，试剂盒的使用说明书将包括在治疗癌症或感染性疾病中使用试剂盒组分的指导。说明书可以进一步含有关于如何处理
细胞(例如，解冻和/或培养)的信息。说明书可以进一步包括关于施用剂量和频率的指南。
在某些实施例中，试剂盒进一步包含一个或多个填充有本文所述的一种或多种组合物，例如包含本文所述的
细胞的组合物的容器。指示试剂盒用于治疗癌症，诸如本文所述的癌症的标签可以任选地与此类容器结合。任选地，标签还包括政府机构规定形式的规范药物或生物产品的制造、使用或销售的通知，该通知反映了制造、使用或销售的机构对人施用的批准。
披露了如下材料、组合物和组分，其可以用于披露的方法和组合物的产物，可以与这些产物结合使用，可以用于制备这些产物，或披露了这些产物。本文披露了这些和其他材料，并且应理解，当披露这些材料的组合、亚群、相互作用、基团等时，尽管这些化合物的各个单独和总体组合以及变换的具体提及可能未明确披露，但每个都在本文中进行了特别设想和描述。例如，除非特别相反地指示，否则如果披露并讨论了一种方法，并且讨论了可对多个分子进行的多个修饰(包括该方法)，则特别地设想该方法的每种和每个组合和变换以及可能的修饰。同样地，也特别设想和披露其任何亚群或组合。此概念适用于本披露的所有方面，包括但不限于使用所披露组合物的方法中的步骤。因此，如果可以进行多个其他的步骤，则应理解，这些其他的步骤中的每一个均可以用所披露方法的任何特定方法步骤或方法步骤的组合来进行，并且特别设想并且应该认为披露每个此种组合或组合的亚群。
实例
以下实例仅用于说明目的，并且不应解释为具有限制性。本领域技术人员可以使用多种替代技术和程序，这些替代技术和程序将类似地允许人们成功地进行以下实例。
实例1：产生CD19 CAR修饰的
细胞
将CD19 CAR克隆到三顺反子质粒pNEUKv l FcR_IL-2载体中，该载体也含有CD16和erIL-2转基因。将这些三顺反子质粒电穿孔到aNK细胞中。通过IL-2缺乏培养基选择表达CD19 CAR的
细胞，因为依赖IL-2的未转化aNK细胞不能在IL-2缺乏培养基中存活。
限制性稀释克隆
将多克隆CD19 t-haNKTM群培养物的等分试样在不添加IL-2的生长培养基中稀释至3个细胞/ml的密度。将此细胞悬浮液以每孔200μl的体积等分在96孔板中，这相当于每孔平均0.6个细胞。将培养板在37℃下孵育10天，然后目视检查细胞生长。总共挑取了20种培养物(现在称为克隆)，并将其转移到更大的容器中，并根据其初始生长速度进行编号，其中克隆#1至#10首先进行传代。
实例2.生物分析方法
细胞培养：
将多克隆和克隆CD19 t-haNKTM细胞在补充有5％热灭活的人AB血清(来自CMV阴性的测试供体)且不含IL-2的生长培养基中培养。
将aNK细胞在补充有5％热灭活的人AB血清(来自CMV阴性的测试供体)和500IU/ml重组人IL-2的生长培养基中培养。
将haNK细胞在补充有5％热灭活的人AB血清(来自CMV阴性的测试供体)且不含IL-2的生长培养基中培养。
将K562细胞在补充有10％热灭活的胎牛血清和抗生素/抗真菌剂混合物的RPMI-1640中培养。每2-5天或每当培养基出现黄色时就将K562细胞传代。
将SUP-B15和SUP-B15CD19KO/CD20+细胞在补充有20％热灭活的胎牛血清、55uMβ-巯基乙醇和抗生素/抗真菌剂混合物的RPMI-1640中培养。另外如以上的K562细胞将细胞传代。
用于流式细胞术分析的抗体染色：
通过离心收集细胞，在FACS缓冲液(5％FBS在1X D-PBS中的溶液)中洗涤两次，并再悬浮于1ml FACS缓冲液中。为进行表面蛋白的直接荧光团偶联的抗体染色，将细胞与适当的偶联抗体(或同种型对照)在4℃下在黑暗中一起孵育20分钟，然后用FACS缓冲液洗涤两次。为了检测CAR蛋白，将细胞与生物素化的抗F(ab')2片段抗体一起孵育，随后与抗生蛋白链菌素-APC抗体一起孵育。在MACSQuant流式细胞仪上分析样品。
生长测定：
从再悬浮于补充有5％热灭活的人AB血清的生长培养基中的初始浓度1x105个细胞/mL起(第1天)，在第3天、第5天和第7天通过自动细胞计数器对培养物进行计数。通过下式计算生长速率：
倍增时间(小时)＝
[持续时间(小时)x log(2)]/[log(最终细胞密度)-log(初始细胞密度)]
细胞毒性：
通过将细胞培养物上下移液使悬浮生长的细胞系再悬浮。通过自动计数(锥虫蓝排除法)确定细胞活力。用CFSE染料标记靶细胞，并在补充有10％热灭活的FBS和抗生素/抗真菌剂的RPMI-1640中将靶细胞和效应细胞稀释至所需的细胞浓度。将效应细胞和靶细胞以不同的效应子与靶标(E:T为20:1、10:1、5:1、2.5:1、1.25:1、0.62:1、0.31:1和0.15:1)比率在96孔板中混合，并在5％CO2氛围和37℃下的孵育箱中共孵育4h。然后添加PI以对死细胞进行荧光标记，并在MACSquant流式细胞术装置上分析该测定。
ADCC：
通过将细胞培养物上下移液使悬浮生长的细胞系再悬浮。通过自动计数(锥虫蓝排除法)确定细胞活力。用PKH67-GL染料标记靶细胞，并在补充有10％热灭活的FBS和抗生素/抗真菌剂的RPMI-1640中将靶细胞和效应细胞稀释至所需的细胞浓度。在室温下将靶细胞与单克隆抗体曲妥珠单抗、利妥昔单抗或无抗体一起预孵育30min。然后将抗体标记的靶细胞(和无抗体对照)和效应细胞以不同的效应子与靶标比率(E:T为20:1、10:1、5:1、2.5:1、1.25:1、0.62:1、0.31:1和0.15:1)在96孔板中混合，并在5％CO2氛围和37℃下的孵育箱中共孵育4h。然后添加PI以对死细胞进行荧光标记，并在MACSquant流式细胞术装置上分析该测定。
IL-2的定量
将用于分析的细胞在D-PBS中洗涤1次，以去除残留的培养基，再悬浮于新鲜的生长培养基中，并一式三份地分别以105个细胞/孔(＝200μl/孔)的密度分装在两个96孔板中，并将板在37℃下在5％CO2下的湿润孵育箱中孵育。孵育24h后，取一组板进行分析，另一组在48h时进行。通过在500x g下5min的第一离心步骤以去除细胞，随后在2000x g下5min的第二离心步骤以去除细胞碎片来制备用于分析的样品上清液。将样品上清液在-80℃下冷冻直至分析。将来自500x g离心步骤的细胞沉淀再悬浮，一式三份地汇集并记录细胞密度。使用人IL-2ELISA检测试剂盒(可从赛默飞世尔科技公司(马萨诸塞州沃尔瑟姆)获得)，按照制造商的说明测量样品上清液中的IL-2浓度，并与提供的标准品比较。将IL-2浓度标准化为24和48h的细胞数，并表示为pg/ml/105个细胞。
实例3：修饰的
细胞的表型
通过流式细胞术测量CD19 t-haNKTM细胞中CD19 CAR的表达，并且结果显示CD19t-haNKTM细胞能够在没有IL-2的情况下生长，并且这些细胞中超过80％表达高水平的CD16(图3A)和CAR(图3B)两者。
在一个独立的实验中，通过流式细胞术关于CD19CAR(通过生物素化的F(ab')2片段特异性一抗和抗生蛋白链菌素-APC二抗检测)和CD16(通过3G8单克隆抗体检测)的表面表达对二十个所选克隆进行了筛选。丢弃呈现多个阳性群体，CD16染色强度低或背景高的克隆。
表4.确定CD19 t-haNKTM克隆上CD19CAR和CD16表达的百分比和强度
通过抗体染色和流式细胞术确定了所选的CD19 t-haNKTM克隆中六种NK细胞标志物的表达谱，并与aNK进行了比较。所有克隆和aNK的CD3表达均为阴性，而只有aNK的CD16表达为阴性。所有克隆的CD54、CD56、NKp30和NKG2D表达均为阳性，并且其表达水平与aNK对照类似。
表5.确定CD19 t-haNKTM克隆上NK细胞表面标志物表达的百分比和强度
实例4：CD19 t-haNKTM细胞对靶细胞系的细胞毒性
CD19 t-haNKTM细胞的细胞毒性通过将其与靶细胞K562细胞、SUP-B15细胞和SKBr细胞一起孵育来分析。图4A显示在杀灭K562细胞(靶细胞)时，CD19 t-haNKTM细胞维持与亲本aNK细胞相当的细胞毒性。16B1和18B1是从在不同日期进行的两次电穿孔事件获得的两个CD19 t-haNKTM群体。
在一个独立的实验中，所选的CD19 t-haNKTM克隆在针对K562靶细胞系(CD19-，NK敏感)的基于流式细胞术的体外细胞毒性测定中用作效应子。在4h细胞毒性测定中，所有克隆均呈现出针对K562的有效细胞溶解活性。在10:1比率下，CD19 t-haNKTM克隆的平均最大杀灭效率在70.9％±10.1％与84.4％±0.6％之间，相比之下，aNK对照则为84.1±2.4％(n＝2至5)。参见图4B。
图5A显示CD19 t-haNKTM细胞展示对aNKTM抗性，CD19阳性的SUP-B15细胞系的特异性杀灭增强-在效应子与靶标比率为10时，相对于仅约10％-20％的细胞被aNK细胞杀灭，约80％-90％的细胞被CD19 t-haNKTM细胞杀灭。
在一个独立的实验中，将所选的CD19 t-haNKTM克隆在基于流式细胞术的体外细胞毒性测定中用作针对SUP-B15靶细胞系(CD19+，NK抗性)的效应子。所有克隆均能够在4h细胞毒性测定中有效靶向并杀灭抗性SUP-B15。在10:1比率下，CD19 t-haNKTM克隆的平均最大杀灭效率在85.7±0.1％与92.2±1.2％之间，相比之下，aNK对照则为10.8±7.4％(n＝2至5)。参见图5B。
图6A显示，当与抗Her2/neu抗体赫赛汀组合时，CD19 t-haNKTM细胞对SKBr3细胞(CD19-，Her2/neu+)的ADCC活性与仅表达CD16(158V)受体的
细胞相当。。
在另一个实验中，将所选的CD19 t-haNKTM克隆在基于流式细胞术的体外ADCC测定中与抗CD20利妥昔单抗单克隆抗体或抗Her2-neu曲妥珠单抗单克隆抗体组合用作针对修饰的SUP-B15靶细胞系(CD19-，CD20+，Her2-neu-，NK抗性)的效应子。在4h的细胞毒性测定中，当与抗CD20抗体利妥昔单抗组合时，所有克隆均能够有效靶向并杀灭抗性SUP-B15CD19KO/CD20+。在10:1比率下，CD19 t-haNKTM克隆的最大杀灭效率在63.7％与77.8％之间，相比之下，
对照则为67.1％(n＝1至2)。当与抗Her2/neu对照抗体曲妥珠单抗组合时，
和CD19t-haNKTM克隆均不能杀灭靶标SUP-B 15CD19KO/CD20+细胞(在10:1比率下，CD19 t-haNKTM克隆的最大杀灭效率为7.7％与21.9％之间，而
为4.1％)。在10:1比率下，CD19 t-haNKTM克隆的ADCC介导的杀灭在46.4％与65.2％之间，相比之下，
对照为62.7％。参见图6B。
实例5：CD19 t-haNKTM细胞的其他特性
在不改变培养基的情况下，通过7天的细胞生长测定确定所选CD19 t-haNKTM克隆的群体倍增时间，并计算平均倍增时间。与aNK对照的34.5小时相比，所有克隆的群体倍增时间在33.1至54.5小时之间。参见图7。
将CD19 t-haNKTM克隆以10e5个细胞/ml的密度在无IL-2的6孔板中培养，并在24和48h后收获培养上清液。通过ELISA分析上清液，以检测和测量CD19 t-haNKTM细胞的潜在ERIL-2释放。在培养24h时，CD19 t-haNKTM克隆释放16.1与1278.5pg/ml/105个之间的细胞。参见图8。
实例6：CD19 t-haNKTM：评价CD19靶向性t-haNKTM细胞在NSG小鼠的Raji人伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's Lymphoma)的静脉内和皮下模型中的抗肿瘤活性
CD19 t-haNKTM是自然杀伤细胞，其表达针对CD19的嵌合抗原受体(CAR)以治疗B细胞谱系的血液癌。在本研究中，在NSG小鼠的静脉内和皮下(SC)Raji异种移植模型中评价了重复静脉内(IV)施用CD19 t-haNKTM的抗肿瘤作用。在两个模型中，CD19 t-haNKTM细胞均展示显著的治疗功效。具体地，在静脉内肿瘤模型中，与媒介物对照相比，CD19 t-haNKTM细胞显著改进了动物存活。在皮下肿瘤模型中，CD19 t-haNKTM能够显著抑制肿瘤生长，减少动物发病/死亡事件的数量，并显著降低肝脏中的转移性疾病负荷。
先前已经显示，表达针对CD19的嵌合抗原受体(CAR)的靶向aNK细胞在Raji荷瘤NSG小鼠中表现出功效，这很可能是由于CAR表达细胞中的靶标特异性细胞毒性(参见，例如，Oelsner等人,Cytotherapy[细胞疗法],2017)。在此研究中，在Raji异种移植模型的两个不同变体中评价了CD19 t-haNKTM细胞的功效：1)静脉内(IV)接种的Raji细胞；和2)皮下(SC)接种的Raji肿瘤，其中两个模型均接受CD19 t-haNKTM细胞的重复的静脉内给予。请注意，其他动物组(B和E组)也包括在原始研究方案中以在此模型中进行评价，但由于与CD19t-haNKTM功效确定无关，因此不包括在本报告中(简短的实验设计请参见表6)。
实例7：用于CD19 t-haNKTM研究的材料
CD19 t-haNKTM细胞(克隆19.6)：通过遵循由托里派的南克维斯特公司公司的工艺开发部(Process Development,
Inc.,Torrey Pines)提供的方案，在补充有5％热灭活的人AB血清的生长培养基中培养CD19 t-haNKTM细胞。
测试动物：使用的测试动物是在研究开始(隔离后)时9-10周龄并且在研究开始时体重在20-27克之间的雌性NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠。静脉内肿瘤模型有20只动物，而皮下肿瘤模型有12只。动物的供应商是杰克逊实验室(The JacksonLaboratory)(美国缅因州(04609)巴尔港大街610号(610Main Street Bar Harbor,ME04609US))。用手持式施加器将无菌不锈钢耳标施加在每只小鼠上以进行鉴别。另外，每个笼子均具有一张笼卡，该笼卡含有研究编号和动物编号信息。
Raji癌细胞系：Raji细胞最初购自ATCC(目录号CCL-86TM；批号61723871)，然后由南克维斯特公司的临床前开发部(Preclinical Development,
Inc)进行扩增和制备。这些细胞由IDEXX在2018年3月18日进行了验证(有关验证报告，请参见附录2)。细胞培养基是ATCC配制的RPMI-1640培养基，该培养基补充有10％的胎牛血清以及青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)。通过离心收集指数期的Raji细胞(第12代)。洗涤细胞，并以5x105个活细胞/mL的浓度再悬浮于无血清培养基中以进行静脉内接种，并以2.5x106个活细胞/mL的浓度再悬浮于培养基/基质胶(Matrigel)(1:1v/v)中以进行皮下植入。在动物注射之前，将细胞储存在冰上。体内研究中使用的细胞具有96％的活力。
Raji静脉内模型：用27号针通过侧尾静脉向20只动物静脉内注射0.2mL Raji细胞悬浮液(1x105个细胞接种物)。
Raji皮下模型：用25号针在两个侧腹向12只动物皮下植入0.1mL Raji细胞悬浮液(2.5x105个细胞接种物)。
实例8：CD19 t-haNKTM研究的实验程序
静脉内Raji模型：在癌细胞接种后的24小时内(其被定义为第1天)，根据体重将20只动物伪随机分为2组，每组10只，以实现组间类似的平均体重。在第2、5、8、10、12和17天，通过离心收获在指数期生长的CD19 t-haNKTM细胞，并以5x107个细胞/mL的浓度配制在生长培养基中，以通过200μL的注射体积以每只小鼠1x107个细胞的剂量静脉内施用。如表6所示，A组中的动物接受媒介物对照，而C组中的动物接受CD19 t-haNKTM细胞。
在注射肿瘤细胞之前将动物称重，并且每周称重两次。每天观察动物的死亡率/发病率(G0至G4)和毒性的临床征象(T1至T12；参见表6)。将瘫痪或濒死的动物安乐死。通过吸入CO2随后进行颈脱位将动物安乐死。在死亡日志中记录死亡事件(安乐死或自发性死亡)，并进行计算以计算存活曲线。
皮下Raji模型：皮下植入肿瘤后，每周至少两次检查动物的肿瘤形成情况。当肿瘤变得明显时，每周用数字手持卡尺测量肿瘤体积(TV)一次至两次，并使用此式计算：TV＝长度x宽度2/2[长度是肿瘤的最大直径，并且宽度是最短直径]。当平均肿瘤体积达到可注射的大小(在此情况下为195mm3；植入后24天)时，将12只荷瘤动物伪随机分为2组，每组6只，以实现组间类似的肿瘤体积。此被定义为第0天。在第1、4、7、9、11和13天，通过离心收获在指数期生长的CD19 t-haNKTM细胞，进行1000cGyγ照射并以5x107个细胞/mL的浓度配制在生长培养基中，以通过200μL的注射体积以每只小鼠1x107个细胞的剂量静脉内施用。如表6所示，D组中的动物接受媒介物溶液，而F组中的动物接受CD19 t-haNKTM细胞。在注射肿瘤细胞之前将动物称重，然后每周称重两次。
每天观察动物的死亡率/发病率(G0至G4)和毒性的临床征象(T1至T12)。将瘫痪或濒死的动物安乐死。一旦濒死的动物表现出发病就将其安乐死，而对存活的动物进行预定安乐死以收集组织。具体地，在第13天，在测试物施用的最后一次剂量后6小时，将存活动物的一半(最多3只小鼠/组)安乐死。在第15天，在最后一次给药后48小时，将其余动物安乐死。安乐死通过在动物在最终心脏内出血后处于深度麻醉状态时进行颈脱位来进行。在此部分研究中未对血液/血清样品进行分析，因此不包括在此报告中。
终止后，进行尸检，并收集具有明显肉眼可见病变的器官，固定在10％福尔马林中，并送至合同病理实验室(第七波实验室(Seventh Wave Laboratories))进行肿瘤/转移性疾病负荷的组织学评价。
表6：研究设计(简略)
IR，照射(1000cGy)；非IR，非照射；IV，静脉内；SC，皮下；Tx，治疗。
实例9：CD19 t-haNKTM研究的数据分析
使用以下等式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝长度x宽度2/2(长度和宽度分别是肿瘤的最长和最短直径)。
肿瘤生长抑制(TGI)计算如下进行：TGI＝(TC-Tt)/△TC x100％，其中TC和Tt分别是研究结束时对照和处理组的平均肿瘤体积，并且△TC是对照组中平均肿瘤体积的变化。
通过2因素ANOVA，随后通过Tukey检验进行多重比较来分析肿瘤生长曲线。通过对数秩(Mantel-Cox)检验分析存活曲线。通过未配对的2尾t检验分析各天肝脏转移性疾病负荷的差异。P<0.05被认为是统计学上显著的。所有统计分析均使用GraphPad Prism 7版进行。
实例10：CD19 t-haNKTM研究的静脉内Raji模型结果
静脉内肿瘤模型中的主要读数是动物存活期。当发现动物死亡或因疾病相关的发病和/或瘫痪而被安乐死时，计数死亡事件。如图9所示，与媒介物对照相比，CD19 t-haNKTM细胞处理能够显著改进动物的存活率，使得中位存活为27天，而媒介物对照组为21.5天(P<0.0001)。在整个研究中还监测了动物体重变化。如图10所示，CD19t-haNKTM处理的动物在首次开始处理时展示中等(少于10％)和短期的体重减轻，这在接受静脉内NK输注的动物中是不常见的，并且不是CD19 t-haNKTM细胞特异性的。在处理第一周后，其体重能够恢复，然后由于疾病进展而再次下降。
实例11：CD19 t-haNKTM研究的皮下Raji模型结果
皮下肿瘤模型中的主要读数是肿瘤生长。如图11所示，与媒介物对照组相比，CD19t-haNKTM细胞在第7天及之后展示明显且统计学显著的肿瘤生长抑制，其中研究结束时(第13天)的TGI为49％。
此外，由于Raji是一种侵袭性淋巴瘤模型，因此，即使在皮下接种时，癌细胞也能够扩散并产生多个转移位点，从而最终导致动物发病和/或死亡。在媒介物组中，在第11天和第13天之间共有3只动物(50％)濒死，因此被安乐死。相反，在CD19 t-haNKTM细胞组中，没有非预定的死亡事件(表7)。
另外，在尸检期间在CD19 t-haNKTM处理的动物中观察到肝转移的质的减少(图12a)。由合同病理实验室(第七波实验室)对代表性采样的H&E染色的肝脏切片进行了疾病负荷的半定量估计。如图12b和表8中所总结，随着研究的进行，有明显的疾病负荷增加的趋势。与媒介物对照相比，CD19 t-haNKTM处理的动物的肝脏表现出显著较低的癌症浸润区百分比。由于对照组中的样品数量少和非预定的早期死亡，所以只能对第13天的数据进行统计分析。此分析显示疾病负荷有显著差异，其中在CD19 t-haNKTM处理的动物中平均浸润为10％，而对照组为30％。在整个研究中监测体重变化，并且与静脉内Raji模型类似，CD19 t-haNKTM处理的动物在治疗方案开始时展示中等(少于10％)和短暂的体重减轻(图13)。
表7：皮下Raji模型中动物的死亡/死亡记录
预定：预定的安乐死以进行组织收集。
表8：肝脏肿瘤细胞的受累百分比
实例12：CD19 t-haNKTM研究的结论
为了评定CD19 t-haNKTM细胞在重复静脉内给药方案中的抗肿瘤功效，在此研究中分别使用了进行静脉内和皮下肿瘤接种的Raji异种移植模型的2种变体。在静脉内肿瘤模型中，与媒介物对照组相比，CD19 t-haNKTM细胞能够显著改进动物存活，将中位存活期延长了5.5天(增加26％)。在皮下肿瘤模型中，CD19 t-haNKTM细胞能够显著抑制肿瘤生长，使得研究结束时的TGI为49％。此外，CD19 t-haNKTM处理能够减少动物发病/死亡事件的数量(CD19 t-haNKTM处理的动物为0/6，而对照组为3/6)，并显著降低了皮下Raji荷瘤动物肝脏中的转移性疾病负荷。总体而言，在Raji异种移植模型的两种变体中，与媒介物对照相比，CD19 t-haNKTM细胞呈现出显著的治疗功效。
对于本领域技术人员应当清楚的是，在不脱离本文的发明构思的情况下，除了已经描述的那些之外，更多修改是可能的。因此，本发明主题仅受限于所附权利要求的范围。此外，在解释说明书和权利要求时，所有术语应当以与上下文一致的尽可能广泛的方式解释。特别地，术语“包含”(“comprises”和“comprising”)应当被解释为以非排他性方式提及要素、组分或步骤，从而指示所提及的要素、组分或步骤可以与未明确提及的其他要素、组分或步骤一起存在、或使用、或组合。当说明书权利要求涉及选自由A、B、C……和N组成的组中的至少一种时，该文字应解释为只需要该组中的一个要素，而不是A加N、或B加N等。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种NK-92细胞，其表达CD19 CAR和Fc受体，其中该NK-92细胞包含多顺反子DNA构建体，并且其中该多顺反子构建体编码该CD19 CAR和该Fc受体，并且其中该多顺反子构建体还包含编码IL-2或其变体或IL-15或其变体的序列。
2.取消。
3.如权利要求1所述的NK-92细胞，其中该Fc受体是CD16。
4.如权利要求1所述的NK-92细胞，其中该Fc受体包含SEQ ID NO:2。
5.取消。
6.如权利要求1所述的NK-92细胞，其中该IL-2变体是erIL-2或其中该IL-15变体是erIL-15。
7.如权利要求6所述的NK-92细胞，其中该CD19 CAR、该Fc受体、该erIL-15或erIL-2中的一种或多种的编码序列经密码子优化以在人系统中表达。
8.如权利要求1-7中任一项所述的NK-92细胞，其中NK-92细胞能够杀灭CD19表达细胞。
9.如权利要求8所述的NK-92细胞，其中该CD19表达细胞是肿瘤细胞。
10.如权利要求9所述的NK-92细胞，其中该肿瘤细胞是SUP-B15细胞。
11.如权利要求1所述的NK-92细胞，其中该CD19 CAR包含scFv抗体片段。
12.如权利要求11所述的NK-92细胞，其中该scFv抗体片段具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
13.如权利要求1所述的NK-92细胞，其中该多顺反子构建体包含SEQ ID NO:9的序列，其中该序列编码该scFv抗体片段。
14.如权利要求1所述的NK-92细胞，其中该NK-92细胞包含编码自切割肽的序列，其中该序列位于该CD19 CAR与CD16之间，并且其中该序列允许等摩尔表达该CD19 CAR和该FcR。
15.如权利要求1所述的NK-92细胞，其中该NK-92细胞在编码CD16的序列与编码IL-2或其变体的序列或者编码IL-15或其变体的序列之间包含内部核糖体进入序列(IRES)。
16.如权利要求1所述的NK-92细胞，其中当效应子与靶标的比率为10时，该NK-92细胞对CD19表达细胞的直接细胞毒性为70％-100％。
17.如权利要求1所述的NK-92细胞，其中当效应子与靶标的比率为10时，该NK-92细胞的ADCC活性为30％-90％。
18.如权利要求1所述的NK-92细胞，其中该CD19 CAR包含与SEQ ID NO:10具有至少90％同一性的序列。
19.如权利要求1所述的NK-92细胞，其中该CD19 CAR包含细胞质信号传导结构域。
20.如权利要求19所述的NK-92细胞，其中该细胞质信号传导结构域是Fcε受体γ(FcεRIγ)。
21.一种试剂盒，其包含含有如权利要求1所述的NK-92细胞的药物组合物。
22.一种用于产生NK-92细胞的方法，该方法包括：
提供多顺反子载体，其中该多顺反子载体编码CD19 CAR和CD16以及IL-2或IL-15，以及
将该载体引入NK-92细胞中以产生该NK-92细胞。
23.取消。
24.如权利要求22所述的方法，其中该载体包含编码自切割肽的序列，其中该序列位于CAR与CD16之间，并且其中该序列允许等摩尔表达CAR和CD16。
25.如权利要求22所述的方法，其中该载体在CD16编码序列与IL-2或IL-15编码序列之间包含内部核糖体进入序列(IRES)。
26.一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向该受试者向该受试者施用治疗有效量的组合物，该组合物包含多种如权利要求1所述的NK-92细胞。
27.如权利要求26所述的方法，其中向该受试者施用约1x108至约1x1011个修饰的细胞/m2该受试者的体表面积。
28.如权利要求26所述的方法，其中该癌症是白血病或淋巴瘤。
29.如权利要求26所述的方法，其中该癌症是以下中的一种或多种：B细胞恶性肿瘤、HSCT后的B细胞恶性肿瘤、CLL、B-ALL、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、UCBT后的B谱系淋巴系统恶性肿瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B-非霍奇金氏淋巴瘤(B-NHL)、HSCT后ALL；淋巴瘤、难治性滤泡性淋巴瘤或淋巴母细胞性白血病。
30.如权利要求29所述的方法，其中该B细胞恶性肿瘤是套细胞淋巴瘤。
31.如权利要求26所述的方法，其中静脉内施用多个所述NK-92细胞。
32.如权利要求26所述的方法，其中肿瘤内施用多个所述NK-92细胞。
33.一种向个体施用NK细胞的方法，该方法包括施用包含表达CD19 CAR的NK细胞的第一组合物和包含原代NK细胞的第二组合物。
Claims (33)
1.一种NK-92细胞，其表达CD19 CAR和Fc受体。
2.如权利要求1所述的NK-92细胞，其中该NK-92细胞包含多顺反子构建体，并且其中该多顺反子构建体编码该CD19 CAR和该Fc受体。
3.如权利要求1所述的NK-92细胞，其中该Fc受体是CD16。
4.如权利要求1所述的NK-92细胞，其中该Fc受体包含SEQ ID NO:2。
5.如权利要求2所述的NK-92细胞，其中该多顺反子转基因还包含编码IL-2或其变体或者IL-15或其变体的序列。
6.如权利要求5所述的NK-92细胞，其中该IL-2变体是erIL-2或其中该IL-15变体是erIL-15。
7.如权利要求6所述的NK-92细胞，其中该CD19 CAR、该Fc受体、该erIL-15或erIL-2中的一种或多种的编码序列经密码子优化以在人系统中表达。
8.如权利要求1-7中任一项所述的NK-92细胞，其中NK-92细胞能够杀灭CD19表达细胞。
9.如权利要求1-8中任一项所述的NK-92细胞，其中该CD19表达细胞是肿瘤细胞。
10.如权利要求9所述的NK-92细胞，其中该肿瘤细胞是SUP-B15细胞。
11.如权利要求1-10中任一项所述的NK-92细胞，其中该CD19CAR包含scFv抗体片段。
12.如权利要求11所述的NK-92细胞，其中该scFv抗体片段具有SEQ ID NO:10的氨基酸序列。
13.如权利要求2所述的NK-92细胞，其中该多顺反子构建体包含SEQ ID NO:9的序列，其中该序列编码该scFv抗体片段。
14.如权利要求1所述的NK-92细胞，其中该NK-92细胞包含编码自切割肽的序列，其中该序列位于该CD19 CAR与CD16之间，并且其中该序列允许等摩尔表达该CD19 CAR和该FcR。
15.如权利要求1-14中任一项所述的NK-92细胞，其中该NK-92细胞在编码CD16的序列与编码IL-2或其变体的序列或者编码IL-15或其变体的序列之间包含内部核糖体进入序列(IRES)。
16.如权利要求1所述的NK-92细胞，其中当效应子与靶标的比率为10时，该NK-92细胞对CD19表达细胞的直接细胞毒性为70％-100％。
17.如权利要求1所述的NK-92细胞，其中当效应子与靶标的比率为10时，该NK-92细胞的ADCC活性为30％-90％。
18.如权利要求1-17中任一项所述的NK-92细胞，其中该CD19CAR包含与SEQ ID NO:10具有至少90％同一性的序列。
19.如权利要求1所述的NK-92细胞，其中该CD19 CAR包含细胞质信号传导结构域。
20.如权利要求19所述的NK-92细胞，其中该细胞质信号传导结构域是Fcε受体γ(FcεRIγ)和/或CD3ζ信号传导结构域。
21.一种试剂盒，其包含含有如权利要求1-20中任一项所述的NK-92细胞的药物组合物。
22.一种用于产生NK-92细胞的方法，该方法包括：
提供载体，其中该载体编码CD19 CAR和CD16，以及
将该载体引入NK-92细胞中以产生该NK-92细胞。
23.如权利要求22所述的方法，其中该载体还包含编码IL-2或IL-15的序列。
24.如权利要求22所述的方法，其中该载体包含编码自切割肽的序列，其中该序列位于CAR与CD16之间，并且其中该序列允许等摩尔表达CAR和CD16。
25.如权利要求23所述的方法，其中该载体在CD16编码序列与IL-2或IL-15编码序列之间包含内部核糖体进入序列(IRES)。
26.一种治疗受试者的癌症的方法，该方法包括向该受试者向该受试者施用治疗有效量的组合物，该组合物包含多种如权利要求1-20中任一项所述的NK-92细胞。
27.如权利要求26所述的方法，其中向该受试者施用约1x 108至约1x 1011个修饰的细胞/m2该受试者的体表面积。
28.如权利要求26所述的方法，其中该癌症是白血病或淋巴瘤。
29.如权利要求26所述的方法，其中该癌症是以下中的一种或多种：B细胞恶性肿瘤、HSCT后的B细胞恶性肿瘤、CLL、B-ALL、急性淋巴母细胞性白血病(ALL)、UCBT后的B谱系淋巴系统恶性肿瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、B-非霍奇金氏淋巴瘤(B-NHL)、HSCT后ALL；淋巴瘤、难治性滤泡性淋巴瘤或淋巴母细胞性白血病。
30.如权利要求29所述的方法，其中该B细胞恶性肿瘤是套细胞淋巴瘤。
31.如权利要求26-30中任一项所述的方法，其中静脉内施用多个所述NK-92细胞。
32.如权利要求26-30中任一项所述的方法，其中肿瘤内施用多个所述NK-92细胞。
33.一种向个体施用NK细胞的方法，该方法包括施用包含表达CD19 CAR的NK细胞的第一组合物和包含原代NK细胞的第二组合物。
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