CN111542547A

CN111542547A - 对bdca2抗原具有特异性的嵌合抗原受体

Info

Publication number: CN111542547A
Application number: CN201980007360.5A
Authority: CN
Inventors: R·巴里; M·格兰青; W·伦格; A·德兹内克; M·迈耶
Original assignee: Meitianshi Biotechnology Co ltd
Current assignee: Meitianshi Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-01-04
Filing date: 2019-01-04
Publication date: 2020-08-14
Anticipated expiration: 2039-01-04
Also published as: CN111542547B; EP3735425A1; US20200353003A1; WO2019134950A1; US11701387B2

Abstract

本发明公开了一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含对BDCA2具有特异性的抗原结合结构域，表达所述CAR的工程化细胞群及其药物组合物。所述工程化细胞用于治疗受试者中的癌症，其中所述癌症的癌细胞表达BDCA2，如母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤(BPDCN)。

Description

对BDCA2抗原具有特异性的嵌合抗原受体

技术领域

本发明涉及癌症治疗领域，特别是涉及使用抗原BDCA2作为靶标的癌症治疗。

背景技术

母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤(Blastic Plasmacytoid Dendritic CellNeoplasm)(BPDCN)是一种罕见的骨髓和血液疾病。术语BPDCN是指影响母细胞或未成熟的浆细胞样树突状细胞的恶性肿瘤或癌症。世界卫生组织于2008年对术语母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤进行了标准化，将其列为“急性髓性白血病和相关肿瘤”之下(Var diman JW等，Blood.2009)。BPDCN影响包括皮肤和淋巴结在内的多个器官。与大多数其他白血病不同，BPDCN具有明显的男性优势；约75％至90％的病例出现在男性中(Taylor J等，Blood.2013)。尽管接受了各种化疗方案，但大多数患者在诊断后仅能存活10至14个月(Roos-Weil D等，Blood.2013)。

目前，尚无统一、达成共识的BPDCN全球性护理治疗标准。一些医师使用专为AML和ALL设计的化疗方案来治疗这种疾病，而另一些医师则像治疗非霍奇金氏淋巴瘤一样治疗该疾病。使用多种药物，强化化疗最初可缓解，但是往往很快发生复发。尽管接受了各种化疗方案，但大多数患者在诊断后仅能存活10至14个月。但是，据报道，使用骨髓移植可将中位生存期延长至2至4年(Roos-Weil D等，Blood.2013)。

嵌合抗原受体(CAR)T细胞已证明工程化的免疫细胞可以作为强大的新型癌症治疗剂(Sadelain M等，Nature.2017)。现在，该技术已在多个临床试验中进行了检测，并获得了惊人的效果，通常可以完全缓解。CAR工程化的NK细胞在临床前研究中也显示出令人鼓舞的结果。浆细胞样树突状细胞特异性表达抗-BDCA2。还建议将BDCA2(CD303)作为BPDCN的标志物(Boiocchi L等，Blood 2013)。

本领域中需要改善或替代的治疗诸如恶性肿瘤(如BPDCN)的癌症的疗法。

发明内容

本发明人已经工程化了NK和T细胞，其表达对在BPDCN癌细胞中高表达的抗原BDCA2具有特异性的嵌合抗原受体(“BDCA2-CAR”)。令人吃惊的是，工程化的CAR-NK和T细胞能够高效特异性地杀死表达BDCA2的细胞，所述细胞对其自然杀伤具有高度的抗性(见图2)。由于已知BDCA-2仅在浆细胞样树突状细胞中表达，因而表达BDCA2 CAR的工程化免疫细胞(NK和T细胞)将特异性杀死受体(recipient)中表达BDCA2的癌细胞(如BPDCN)。本发明人还发现，BDCA2-CAR NK细胞比CAR T细胞分泌更少的细胞因子(参见图3)，表明在要用此类细胞治疗的受试者中具有更少的细胞因子释放综合征(CRS)。这表明在患者中BDCA2-CARNK细胞比BDCA2-CAR T细胞毒性更低和更安全。此外，NK细胞寿命较短，因此在治疗两个月后，预计不会有CAR-NK细胞在受体体内残留，并且寿命较短将会进一步降低毒性。因此，与BDCA2-CAR T细胞相比，BDCA2-CAR NK细胞可能甚至更优选用于治疗BPDCN，尽管这两种工程化细胞类型都能有效杀死BDCA2靶细胞。

附图说明

图1：BDCA2 CAR构建体的设计以及在NK和T细胞中的表达。

(图1A)BDCA2 CAR构建体由EFla启动子、具有独特接头的BDCA-2结合物、来自CD8受体的铰链和跨膜区、4-1BB反式激活结构域和CD3ζ信号传导结构域组成。使用针对aBDCA-scFV产生的特异性独特型来检测NK(图1B)和T(图1C)细胞中BDCA2 CAR的表达。使用特异性针对BDCA2的mAB检测在报告子(小鼠A95-KK)和RS4-11(分别为图1D和图1E)细胞系中BDCA-2的表达情况。

图2：CAR-NK和CAR-T细胞特异性杀死表达BDCA2的靶细胞。

进行基于流式细胞术的细胞毒性测定以评估CAR-NK和CAR-T细胞针对表达BDCA2的靶细胞的细胞毒性。将不表达BDCA2的报告子(A95-KK)和RS4-11细胞作为对照靶细胞(分别为报告子对照和RS4-11对照)。将稳定表达BDCA2的报告子和RS4-11作为靶细胞(报告子-BDCA2和RS4-11-BDCA2)。将表达BDCA2 CAR的工程化NK和T细胞用于评估特异性杀伤作用，而将未转导的NK和T细胞(未转导的)作为阴性对照。

图3：当与表达BDCA2的靶细胞共培养时，与CAR-NK细胞相比，CAR-T细胞产生显著更高的量的细胞因子。

使用来自Miltenyi Biotec的MACSPlex细胞因子试剂盒，在将其与靶细胞共培养24hr后，评估CAR-NK和CAR-T细胞的细胞因子产生情况。BDCA2表示表达BDCA2的靶细胞；母体表示无BDCA2的靶细胞。

图4：在转导后第8天通过流式细胞术确定未转导的和经BDCA2-CAR转导的NK细胞中常见NK细胞受体的表达。BDCA2转导后，NK细胞表型没有明显改变。

图5：转导后第8天，未转导的和BDCA2-C AR转导的NK细胞的耗氧率(OCR)。测量基础OCR，然后依次添加寡霉素(ATP合成抑制剂)，羰基氰-对三氟甲氧基苯腙(FCCP；解偶联离子载体)，和鱼藤酮与抗霉素A(分别用于电子传输链的复合物I和III的封闭剂)，来区分线粒体和非线粒体耗氧机理的相对贡献。

图6：使用BDCA2-CAR转导后NK细胞的细胞代谢没有明显变化。在转导后第8天，未转导细胞和转导细胞之间的基础OCR水平(图6A)以及最大呼吸水平(图6B)相似。在转导后第8天，未转导细胞和转导细胞之间的胞外酸化率(ECAR)没有显著差异(图6C)。

具体实施方式

令人吃惊的是，我们发现被表达特异性针对抗原BDCA2的CAR的工程化免疫细胞直接靶向的表达BDCA2的癌细胞以这些细胞不能生长和/或引起死亡的方式受到影响。

在第一个方面中，本发明提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含对抗原BDCA2具有特异性的抗原结合结构域(“BDCA2-CAR”)。

所述BDCA2-CAR的抗原结合结构域可以包含例如一条或多条全长免疫球蛋白重链和/或轻链、Fab片段、单链Fv(scFv)片段、二价单链抗体或双体，其各自对靶抗原BDCA2具有特异性。

所述BDCA2-CAR的抗原结合结构域可以包含SEQ ID NO:l和SEQ ID NO:2的氨基酸序列。BDCA2-CAR的抗原结合结构域内的这两条序列的顺序(方向)可以是从N末端到C末端为SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:l，优选地，BDCA2-CAR的抗原结合结构域内的顺序可以是从N末端到C末端为SEQ ID NO:l-SEQ ID NO:2。令人吃惊的是，从N末端到C末端SEQ ID NO:l-SEQ ID NO:2的方向比顺序SEQ ID NO:2-SEQ ID NO:l更好地起作用。所述BDCA2-CAR的抗原结合结构域可以包含含有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列的scFv。

所述CAR可以包含跨膜结构域和胞内信号传导结构域。所述胞内信号传导结构域可以包含至少免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。所述胞内信号传导结构域可以包含至少初级信号传导结构域，如CD28、CD137、OX40或CD3ζ。所述跨膜结构域可以包含例如来源于CD8α和/或CD28的跨膜结构域的序列。所述胞内信号传导结构域还可以包含共刺激信号传导结构域，如CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-l、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-l)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3。

或者，CAR可以由其他部分组成，如接头和/或铰链，和/或可以由如下所述的双链或多链CAR组成。

CAR可以是CAR，其中所述CAR可以包含

i)对抗原BDCA2具有特异性的抗原结合结构域

ii)跨膜结构域

ii)胞内信号传导结构域，其包含至少初级信号传导结构域和至少共刺激结构域。

在本发明的一个方面中，本发明的BDCA2-CAR用于在患有癌症的受试者中治疗癌症，并且其中所述癌症的癌细胞表达BDCA2。所述BDCA2-CAR的抗原结合结构域可以包含SEQID NO:l和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。所述BDCA2-CAR的抗原结合结构域可以包含scFv，其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

所述癌症可以是恶性肿瘤，如母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤(BPDCN)。

在本发明的一个优选实施方式中，表达BDCA2的癌细胞被工程化细胞靶向，优选地T细胞或NK细胞，更优选地人T细胞或NK细胞，其表达如本文公开的特异性针对BDCA2的嵌合抗原受体。该工程化T细胞或NK细胞可以用于过继性T细胞或NK细胞疗法中。

在一个方面中，本发明提供了一种细胞群，所述细胞群包含表达如本文公开的特异性针对抗原BDCA2的嵌合抗原受体(BDCA2-CAR)的遗传修饰的细胞。所述BDCA2-CAR的抗原结合结构域可以包含SEQ ID NO:l和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。所述BDCA2-CAR的抗原结合结构域包含scFv，其包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。优选地，包含表达特异性针对抗原BDCA2的嵌合抗原受体(BDCA2-CAR)的遗传修饰细胞的所述细胞群是分离的细胞群。所述修饰细胞可以是免疫细胞，优选地T细胞或NK细胞。

在一个方面中，本发明提供了用于免疫疗法的如本文所公开的表达BDCA2-CAR的工程化细胞群或分离的群。免疫疗法可以用于在患有癌症的受试者中治疗癌症，其中所述癌症的癌细胞表达BDCA2。所述BDCA2-CAR的抗原结合结构域可以包含SEQ ID NO:l和SEQID NO:2所示的氨基酸序列。所述BDCA2-CAR的抗原结合结构域可以包含scFv，其包含SEQID NO:4所示的氨基酸序列。

在需要的情况下，在用于所述免疫疗法之前，将所述工程化细胞的群或分离的群扩增至治疗有效的细胞数。所述细胞可以是免疫细胞或免疫细胞子集，优选地T细胞或T细胞子集或者NK细胞或NK细胞子集。

在一个方面中，本发明提供了一种治疗癌症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效治疗所述癌症的量的如本文所公开的表达BDCA2-CAR的富集的、工程化的细胞。治疗癌症可以是在患有癌症的受试者中进行，其中所述癌症的癌细胞表达BDCA2。所述癌症可以是恶性肿瘤，如母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤(BPDCN)。所述细胞可以是免疫细胞或免疫细胞子集，优选地T细胞或T细胞子集或者NK细胞或NK细胞子集。

在一个方面中，本发明提供了一种药物组合物，其包含如本文所公开的表达特异性针对抗原BDCA2的CAR的遗传修饰的细胞和药学上可接受的载体。

所述药物组合物可以用于在患有癌症的受试者中治疗癌症。所述癌症可以是恶性肿瘤，如母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤(BPDCN)。

在一个方面中，本发明提供了核酸分子和核酸构建体(如载体)，其编码如本文所公开的本发明的BDCA2-CAR。

在另一个方面中，本发明提供了一种组合物，其包含

a)表达CAR的免疫细胞，所述CAR包含

i)对标签化多肽的标签具有特异性的抗原结合结构域，

ii)跨膜结构域，

iii)胞内信号传导结构域，

其中所述抗原结合结构域特异性结合标签化多肽的标签，其中所述多肽特异性结合在靶细胞表面上表达的抗原BDCA2，其中所述靶细胞是表达BDCA2的癌细胞，和

b)所述标签化多肽。

所述癌细胞可以是恶性肿瘤，如母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤(BPDCN)。

所述免疫细胞可以是T细胞或NK细胞。

所述CAR，其中所述胞内信号传导结构域包含至少初级信号传导结构域(如CD3ζ)和至少共刺激信号传导结构域(如CD137或CD28)。

标签可以是半抗原，如生物素或FITC或化学或重组偶联至所述多肽的肽。用于“抗-标签CAR系统”的标签是本领域熟知的，并且本文中可以使用任何适于此类抗-标签CAR系统和标签化多肽的标签。与在细胞表面上表达的抗原结合的标签化多肽可以是抗体或其抗原结合片段。标签化多肽可以包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或SEQID NO:4所示的氨基酸序列。

在另一个方面中，本发明提供了一种药物组合物，其包含

a)表达CAR的免疫细胞，所述CAR包含

i)对标签化多肽的标签具有特异性的抗原结合结构域，

ii)跨膜结构域，

iii)胞内信号传导结构域，

其中所述抗原结合结构域特异性结合标签化多肽的标签，其中所述多肽特异性结合在靶细胞表面上表达的抗原BDCA2，其中所述靶细胞是癌细胞，和

b)所述标签化多肽。

所述药物组合物任选地可以包含药学上可接受的载体以及所述免疫细胞和/或以及所述标签化多肽。

在另一个方面中，本发明提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的组合物，其中所述癌细胞表达BDCA2，优选地所述癌症可以是恶性肿瘤，如母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤(BPDCN)，所述组合物包含

a)表达CAR的免疫细胞，所述CAR包含

i)对标签化多肽的标签具有特异性的抗原结合结构域，

ii)跨膜结构域，

iii)胞内信号传导结构域，

b)所述标签化多肽。

在另一个方面中，本发明提供了一种用于治疗患有癌症的受试者的方法，其中所述癌细胞表达BDCA2，优选地所述癌症可以是恶性肿瘤，如母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤(BPDCN)，所述方法包括向所述患者应用如本文所公开的CAR的步骤，所述CAR包含对抗原BDCA2具有特异性的至少一个抗原结合结构域，或者应用如本文所公开的组合物，所述组合物包含

a)表达CAR的免疫细胞，所述CAR包含

i)对标签化多肽的标签具有特异性的抗原结合结构域，

ii)跨膜结构域，

iii)胞内信号传导结构域，

b)所述标签化多肽。

在本发明的一个实施方式中，本发明的表达特异性针对BDCA2的CAR(BDCA2-CAR)的免疫细胞用于在患有癌症的受试者中治疗癌症，其中所述癌症的癌细胞表达BDCA2，例如恶性肿瘤，如母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤(BPDCN)。受试者的免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)是分离的。受试者可以患有所述癌症或可以是健康受试者。这些细胞是在体外或体内遗传修饰的以表达BDCA2-CAR。这些工程化的细胞可以在体外或体内激活和扩增。在细胞疗法中，将这些工程化的细胞输注至有需要的受体。这些细胞可以是药物组合物(所述细胞加药学上可接受的载体)。输注的细胞能够杀死(或至少阻止其生长)在受体中表达BDCA2的癌细胞。受体可以是从其获得细胞的同一受试者(自体细胞疗法)，也可以是来自同一物种的其他受试者。

在本发明的一个实施方式中，如上文所公开的，将表达特异性针对BDCA2的CAR的免疫细胞(表达BDCA2-CAR的细胞)作为细胞疗法用于患有癌症的受试者，但将其与也在同一工程化细胞上表达的第二激活CAR联用，所述第二激活CAR识别另外的表位，以增加表达这两种CAR的工程化细胞的特异性。

在本发明的一个实施方式中，如上文所公开的，将表达BDCA2-CAR的细胞作为细胞疗法用于患有癌症的受试者，但将其与也在同一工程化细胞上表达的第二抑制CAR联用，所述第二抑制CAR识别另外的表位，以增加表达这两种CAR的工程化细胞的特异性。

工程化以表达BDCA2-CAR的免疫细胞(优选T细胞或NK细胞)可以单独施用，或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分(如IL-2或其他细胞因子或细胞群)联用。简言之，本发明的药物组合物可以包含如本文所述的遗传修饰细胞的细胞群，以及联用一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。此类组合物可以包含缓冲剂，如中性缓冲盐溶液、磷酸盐缓冲盐溶液等；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白；多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。

优选地，将本发明的组合物配制用于静脉内施用。可以以本领域公知的任何方便的方式向受试者施用细胞组合物。

本发明的药物组合物可以以适于所治疗疾病的方式施用。可以通过临床试验确定适宜剂量。但是施用的量和频率也将由诸如患者的身体状况以及患者疾病的类型和严重程度等因素来确定以及受到上述因素的影响。如本文所公开的，包含免疫细胞(优选T细胞或NK细胞)的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重(优选地，10⁵至10⁶个细胞/kg体重)的剂量施用。细胞组合物也可以这些剂量多次施用。可以直接将细胞组合物注射至肿瘤、淋巴结或感染部位。

可以采用本领域公知的方法将细胞激活并扩增至治疗有效量。

可以将本发明的细胞与例如化疗、放疗、免疫抑制剂、抗体或抗体疗法联用。

在另一个实施方式中，CAR系统(组合物，其包含特异性针对标签化多肽的标签的CAR(“抗-标签CAR”)和特异性结合至BDCA2的所述多肽，如本文所公开的)可以用于治疗患有癌症的受试者。细胞(如免疫细胞，例如受试者的T细胞或NK细胞)可以是分离的，或可以使用已建立的免疫细胞系。受试者可以患有所述癌症(患者)或者可以是健康受试者。如本文所公开的，这些免疫细胞在体外被遗传修饰，以表达特异性针对标签化多肽的标签的CAR。可以将这些工程化的细胞在体外激活和扩增成治疗有效的表达细胞群。在细胞疗法中，可以将这些工程化的细胞作为药物组合物(或治疗有效量的表达抗-标签CAR的细胞群的制剂)输注至有需要的受体中，此外还有第二药物组合物如本文公开的标签化多肽的制剂。在受体中的输注细胞可能能够杀死(或至少阻止其生长)表达抗原的癌细胞，所述抗原被如本文所公开的CAR系统所识别。受体可以是从其获得细胞的同一受试者(自体细胞疗法)，或者可以来自同一物种的其他受试者(同种异体细胞疗法)。

可以在向受试者施用标签化多肽制剂之前，向患者施用治疗有效的表达抗-标签CAR的细胞群。或者，在向受试者施用治疗有效的表达抗-标签CAR的细胞群之前或同时，可以向受试者施用标签化多肽的制剂。进一步的变化包括在向受试者施用之前，使用标签化多肽制剂的标签化多肽体外培养治疗有效的表达抗-LLE CAR的细胞群。

可以使用本领域技术人员公知的技术配制向受试者施用的表达抗-标签-CAR的(免疫)细胞群。

包含一种或多种治疗有效的表达抗-标签CAR的细胞群的制剂可以包含一种或多种药学上可接受的赋形剂(载体或稀释剂)。在制剂中包含的赋形剂将取决于不同目的，例如取决于抗-标签-CAR的标签结合结构域的性质，所使用的免疫细胞(亚)群和施用方式。通常使用的赋形剂的实例包括但不限于：盐水、缓冲盐溶液、右旋糖、注射用水、甘油、乙醇及其组合、稳定剂、增溶剂和表面活性剂、缓冲剂和防腐剂、张度剂、膨胀剂和润滑剂。

一种或多种治疗有效的表达抗-标签CAR的细胞群的制剂可以包含一种表达抗-标签CAR的(免疫)细胞群，或者可以包含一种以上表达抗-标签CAR的(免疫)细胞群。不同抗-标签CAR的(免疫)细胞群可以基于标签结合结构域的特性、激活结构域的特性、免疫细胞(亚)群的特性或其组合而改变。

可以使用本领域技术人员公知的方式和技术向受试者施用包含一种或多种治疗有效的表达抗-标签CAR的细胞群的制剂。示例性的方式包括但不限于静脉内注射。其他方式包括但不限于瘤内、皮内、皮下(s.c、s.q.、sub-Q、Hypo)、肌内(i.m.)、腹腔内(i.p.)、动脉内、髓内、心内、关节内(关节)、滑膜内(关节液区域)、颅内、椎管内和鞘内(脊液)。

向受试者施用的包含一种或多种治疗有效的表达抗-标签CAR的细胞群的制剂包含多个表达抗-标签CAR的细胞，如有效治疗特定适应证或病症的免疫细胞。在通常情况下，可以施用包含约1x 10⁴至约1x 10¹⁰个之间表达抗-标签CAR的细胞(如免疫细胞)的制剂。在大多数情况下，制剂可以包含约1x 10⁵至约1x 10⁹个之间表达抗-标签CAR的细胞(如免疫细胞)，约5x 10⁵至约5x 10⁸个之间表达抗-标签CAR的细胞(如免疫细胞)，或约1x 10⁶至约1x10⁷个之间表达抗-标签CAR的细胞(如免疫细胞)。然而，向受试者施用的表达抗-标签CAR的细胞(如免疫细胞)的数量可以在很宽的范围内变化，这取决于病症的位置、来源、特性、程度和严重性，所要治疗个体的年龄和病况等等。医师可以最终决定所使用的适当剂量。

可以使用本领域技术人员公知的技术配制如本文所公开的标签化多肽以用于向受试者施用。标签化多肽的制剂可以包含一种或多种药学上可接受的赋形剂(载体或稀释剂)。在制剂中包含的赋形剂将具有不同目的，其取决于例如标签的性质、标签化多肽的抗原结合结构域和施用方式。通常使用的赋形剂的实例包括但不限于：盐水、缓冲盐溶液、右旋糖、注射用水、甘油、乙醇及其组合、稳定剂、增溶剂和表面活性剂、缓冲剂和防腐剂、张度剂、膨胀剂和润滑剂。

标签化多肽的制剂可以包含一种类型的标签化多肽，或者包含一种以上类型的标签化多肽。标签化多肽的不同类型可以基于标签的特性、标签化多肽的抗原结合部分或其组合而改变。

可以使用本领域技术人员公知的方式和技术向受试者施用标签化多肽。示例性的方式包括但不限于静脉内、腹腔内和瘤内注射。其他方式包括但不限于皮内、皮下(s.c、s.q.、sub-Q、Hypo)、肌内(i.m.)、动脉内、髓内、心内、关节内(关节)、滑膜内(关节液区域)、颅内、椎管内和鞘内(脊液)。

以有效治疗特定适应证或病症的量向受试者施用包含多肽的制剂。在通常情况下，可以向需要治疗的受试者施用包含至少约1μg/kg至约100mg/kg体重的标签化多肽的制剂。在大多数情况下，考虑到施用途径、症状等，剂量可以是每天从约100μg/kg至约10mg/kg体重的标签化多肽。向受试者施用的在制剂中的标签化多肽的量可以在很宽的范围内变化，这取决于病症的位置、来源、特性、程度和严重性，所要治疗个体的年龄和病况等等。医师可以最终决定所使用的适当剂量。

表达CAR细胞的制剂与标签多肽制剂的施用之间的时间安排可以在很宽的范围内变化，这取决于下述因素，包括所使用的(免疫)细胞类型，CAR的结合特异性，标签的特性，标签化多肽的抗原结合部分，靶细胞(例如，所治疗的癌细胞)的特性，在受试者中靶细胞的位置，用于向受试者施用制剂的方法以及所治疗的受试者的健康状况、年龄和体重。实际上，标签化多肽制剂可以在基因工程化(免疫)细胞制剂之前、同时或之后施用。

取决于所治疗的病症，施用表达CAR细胞的制剂的步骤，或施用标签化多肽制剂的步骤，或者这两者可以重复一次或多次。当可以向受试者应用两种或多种标签化多肽制剂时，所应用的制剂可以包含相同或不同的标签化多肽。当向受试者应用两种或多种工程化细胞(如表达本发明CAR的免疫细胞)的制剂时，工程化细胞可以是相同细胞类型或不同细胞类型，例如T细胞和/或NK细胞。细胞(如免疫细胞)的制剂也可以包含一种以上细胞类型，每种均表达本发明的CAR。

涉及如本文所公开的本发明第一个方面的本文所定义的所有定义、特征和实施方式在进行必要的变通之后也适用于如本文所公开的本发明的其他方面。

除了上文所述的本发明的应用和实施方式之外，下面描述了本发明的其他实施方式，而并非旨在限于这些实施方式。

实施方式

本发明还包括核酸(DNA或RNA)构建体，其包含编码对BDCA2具有特异性的CAR的氨基酸序列(如SEQ ID NO:l和SEQ ID NO:2)的序列。

在本发明的一个实施方式中，产生编码对BDCA2具有特异性的CAR的DNA构建体(载体、质粒)。将编码对BDCA2具有特异性的抗原结合结构域的核酸序列至少与编码跨膜结构域的核酸序列融合，然后与编码胞内域的核酸序列融合。可以通过本领域熟知的重组方法进行此类表达载体的构建。或者，可以合成生产核酸序列。

在本发明的一个实施方式中，产生表达本发明CAR的细胞。可以通过本领域熟知的方法(例如，基于病毒的系统、物理方法、生物方法、化学方法)将编码本发明CAR的DNA构建体转染或转导进入宿主细胞。不管用于在宿主细胞中整合(优选稳定整合)本发明的编码CAR的核酸的方法如何，结果宿主细胞均表达特异性针对BDCA2的CAR。

在本发明的一个实施方式中，在免疫细胞或免疫细胞子集中表达特异性针对抗原BDCA2的CAR。

在本发明的一个实施方式中，在T细胞或T细胞子集中表达特异性针对抗原BDCA2的CAR。

在本发明的一个实施方式中，在NK细胞或NK细胞子集中表达特异性针对抗原BDCA2的CAR。

在本发明的一个实施方式中，在通过本领域熟知的方法(例如，基于荧光的分离技术如

或磁性细胞分离方法如

)从非转染/转导的细胞产生这种工程化BDCA2-CAR细胞的转染/转导过程之后，表达对BDCA2具有特异性的CAR的工程化细胞(“BDCA2-CAR”)被分离(富集或分离)。

在本发明的一个实施方式中，免疫细胞(优选T细胞或NK细胞)是从受试者获得的。免疫细胞(优选T细胞或NK细胞)可以从多种来源获得，如外周血单核细胞(PMBC)、骨髓、淋巴结组织、脐带血或胸腺组织。为了富集这些细胞，可以使用本领域熟知的方法，如通过Ficoll^TM或PERCOLL^TM梯度离心或阳性/阴性选择技术，如荧光分选(例如，FCASsort)或磁性分选(例如，

)。

在一个实施方式中，对受试者血液样品的T细胞进行磁性标记(例如，分别使用与对CD4和CD8具有特异性的抗体偶联的磁珠)，洗涤，磁力富集和收集。然后，可以将这些T细胞工程化以便在其细胞表面上表达BDCA2-CAR。

在一个实施方式中，对受试者血液样品的NK细胞进行磁性标记(例如，分别使用与对CD3和CD56具有特异性的抗体偶联的磁珠)，洗涤，磁力耗竭CD3⁺细胞，富集CD56⁺细胞和收集。然后，可以将这些NK细胞进行工程化以便在其细胞表面上表达BDCA2-CAR。

在一个实施方式中，对受试者血液样品的NK细胞进行磁性标记(例如，使用与对CD56具有特异性的抗体偶联的磁珠)，洗涤，磁力富集CD56⁺细胞和收集。然后，可以将这些CD56⁺细胞(NK细胞)进行工程化以便在其细胞表面上表达BDCA2-CAR。

在本发明的一个实施方式中，通常使用本领域熟知的方法，例如IL-2、IL-15、IL-21和IL-l家族细胞因子的不同组合，或基于饲养细胞的扩增方法，可以在基因修饰之前或之后将表达BDCA2-CAR的分离的/富集的工程化NK细胞激活和扩增，以增加工程化NK细胞的量。优选地，将所述工程化NK细胞的量增加至治疗有效量。

在本发明的一个实施方式中，通常使用本领域熟知的方法，例如使用抗-CD3/抗-CD28小珠或抗-CD3/抗-CD28纳米基质进行多克隆刺激(EP2711418B1)，可以在基因修饰之前或之后将表达BDCA2-CAR的分离的/富集的工程化T细胞激活和扩增，以增加工程化T细胞的量。优选地，将所述工程化T细胞的量增加至治疗有效量。

在本发明的一个实施方式中，产生表达本发明CAR的细胞。可以通过本领域熟知的方法(例如，基于病毒的系统、物理方法、生物方法、化学方法)将编码本发明CAR的RNA转染或转导进入宿主。在通常情况下，这种“RNA工程化细胞”在WO2013/040557中详细公开。不管用于将编码本发明CAR的RNA整合至宿主细胞中的方法如何，结果宿主细胞均表达特异性针对BDCA2的CAR。使用“RNA工程化细胞”导致在细胞中在有限的时间内表达CAR(瞬时表达)。

在本发明的一个实施方式中，在封闭的细胞培养系统中自动化生产表达BDCA2-CAR的遗传修饰的细胞，优选NK和T细胞。用于生产遗传修饰细胞(优选NK和T细胞、NK和T细胞子集或NK和T细胞祖细胞)的方法包括下述步骤：

a)提供细胞样品，

b)通过离心制备细胞样品，

c)磁性分离细胞，优选NK和T细胞、NK和T细胞子集或NK和T细胞祖细胞，

d)使用调节剂激活富集的细胞，优选NK和T细胞、NK和T细胞子集或NK和T细胞祖细胞，

e)对细胞(优选NK和T细胞、NK和T细胞子集或NK和T细胞祖细胞)进行遗传修饰以表达BDCA2-CAR，

f)在培养室中扩增遗传修饰的NK和T细胞、NK和T细胞子集或NK和T细胞祖细胞，

g)洗涤培养的细胞，优选NK和T细胞、NK和T细胞子集或NK和T细胞祖细胞。

所有这些步骤可以在密封和无菌的系统中进行。

该方法特别适于制备基因修饰的细胞(优选NK和T细胞、NK和T细胞子集或NK和T细胞祖细胞)，其中通过使用病毒和/或非病毒载体对富集的细胞(优选NK和T细胞、NK和T细胞子集或NK和T细胞祖细胞)进行基因修饰。

这些步骤中的任何一步可以进行多次、省略或可以按照不同顺序进行。

在本发明的一个实施方式中，调节剂选自激动性抗体和/或细胞因子。

在本发明的一个实施方式中，在所述自动方法中，基因修饰的细胞(优选NK和T细胞、NK和T细胞子集或NK和T细胞祖细胞)在培养之前或之后通过细胞的磁性标记和磁力分离来富集，以便在最终细胞产物中获得更高频率的基因修饰细胞，优选NK和T细胞、NK和T细胞子集或NK和T细胞祖细胞。

作为用于细胞修饰的封闭和无菌的系统，可以使用全自动细胞处理装置CliniMACS

和相关的管组件(Miltenyi Biotec GmbH,Germany)(W02009/072003)。该封闭系统满足几乎任何种类细胞产品的GMP级处理要求并且可以允许降低洁净室要求，改善技术转让和细胞生产工艺的协调。已开发了全自动和标准化的细胞治疗剂生产工艺。该仪器可以进行样品加载、细胞洗涤、基于密度的细胞分离(包括减少红细胞和收集血浆)、磁分离、细胞激活、细胞修饰(转导)、细胞培养和最终产品制剂。

因此，能够在封闭、自动化和安全的符合GMP的工作流程中灵活集成工艺模块(“步骤”)，从而再现复杂的期望生物过程。

在本发明的一个实施方式中，本发明的BDCA2-CAR用于治疗患有与BDCA2的异常表达相关的疾病、病症或病况的受试者。

在本发明的一个实施方式中，本发明的BDCA2-CAR用于在患有癌症的受试者中治疗癌症，其中所述癌症的癌细胞表达BDCA2。受试者的免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)是分离的。受试者可以患有所述癌症或者可以是健康受试者。这些细胞是在体外或在体内遗传修饰的以表达BDCA2-CAR。这些工程化细胞可以在体外或在体内激活和扩增。在细胞疗法中，将这些工程化的细胞输注至有需要的受体。这些细胞可以是药物组合物(所述细胞加药学上可接受的载体)。输注细胞能够杀死(或至少停止其生长)在受体中表达BDCA2的癌细胞。受体可以是从其获得细胞的同一受试者(自体细胞疗法)，也可以是来自同一物种的其他受试者。

在本发明的一个实施方式中，如上文所述，将表达BDCA2-CAR的细胞作为细胞疗法用于患有癌症的受试者，但将其与也在同一工程化细胞上表达的第二激活CAR联用，所述第二激活CAR识别另外的表位，以增加表达这两种CAR的工程化细胞的特异性。该表位可以是膜结合的，胞外基质的一部分或可溶性组分。

在本发明的一个实施方式中，如上文所述，将表达BDCA2-CAR的细胞作为细胞疗法用于患有癌症的受试者，但将其与也在同一工程化细胞上表达的第二抑制CAR联用，所述第二抑制CAR识别另外的表位，以增加表达这两种CAR的工程化细胞的特异性。该表位可以是膜结合的，胞外基质的一部分或可溶性组分。

定义

除非另有定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

在通常情况下，如本文公开的CAR可以包含含有抗原结合结构域的胞外域(胞外部分)、跨膜结构域和胞质信号传导结构域(胞内信号传导结构域)。胞外域可以通过接头或间隔子连接至跨膜结构域。胞外域还可以包含信号肽。在本发明的一些实施方式中，CAR的抗原结合结构域结合与多肽偶联的标签或半抗原(“半抗原化”或“标签化”多肽)，其中所述多肽可以结合至与疾病相关的抗原，如肿瘤相关抗原(TAA)，其可以在癌细胞表面上表达。

也可以将此类CAR称为“抗-标签”CAR或“衔接子CAR”或“通用CAR”，如在例如US9233125B2中所公开的。

半抗原或标签可以直接或间接地与多肽(标签化多肽)偶联，其中所述多肽可以结合至在靶标(细胞)表面上表达的所述疾病相关的抗原(即，BDCA2)。标签可以是例如半抗原如生物素或荧光素异硫氰酸酯(FITC)或藻红蛋白(PE)，但标签也可以是肽序列，例如化学或重组偶联至标签化多肽的多肽部分。标签也可以是链霉亲和素。标签化多肽的标签部分仅受可被CAR的对标签具有特异性的抗原结合结构域识别并特异性结合的分子限制。例如，当标签是FITC(荧光素异硫氰酸酯)时，标签结合结构域可以构成抗-FITC scFv。或者，当标签是生物素或PE(藻红蛋白)时，标签结合结构域可以构成抗-生物素scFv或抗-PE scFv。

“信号肽”指肽序列，其指导蛋白在细胞内转运和定位，例如至某个细胞器(如内质网)和/或细胞表面。

通常，“抗原结合结构域”指特异性地结合至抗原(例如，肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA))或标签化多肽的标签的CAR的区域。本发明的CAR可以包含一个或多个抗原结合结构域(例如，串联CAR)。通常，在CAR上的靶向区域是细胞外的。抗原结合结构域可以包含抗体或其抗原结合片段。抗原结合结构域可以包含例如免疫球蛋白全长重链和/或轻链、Fab片段、单链Fv(scFv)片段、二价单链抗体或双体。与给定抗原特异性结合的任何分子，如天然存在的受体的亲和体或配体结合结构域，都可以作为抗原结合结构域。通常，抗原结合结构域是scFv。通常，在scFv中，免疫球蛋白重链和轻链的可变区通过柔性接头融合以形成scFv。此类接头可以是例如“(G₄/S)3-接头”。

在一些情况下，有益的是抗原结合结构域来源于其中将使用CAR的相同物种。例如，当计划将其治疗性地在人类中使用时，CAR的抗原结合结构域包含人或人源化抗体或其抗原结合片段可能是有益的。人或人源化抗体或其抗原结合片段可以由各种本领域熟知的方法制备。

如在本文中使用的，“间隔子”或“铰链”指位于抗原结合结构域和跨膜结构域之间的亲水性区域。本发明的CAR可以包含胞外间隔子结构域，但其也可以不含此类间隔子。间隔子可以包括例如抗体或其片段的Fc片段、抗体或其片段的铰链区、抗体的CH2或CH3区、辅助蛋白、人工间隔子序列或其组合。间隔子的著名实例是CD8α铰链。CAR的跨膜结构域可以来源于此类结构域的任何期望的天然或合成来源。当来源是天然的时，结构域可以来源于任何膜结合的或跨膜蛋白。跨膜结构域可以来源于例如CD8α或CD28。当关键信号传导和抗原识别模块(结构域)是在两个(或甚至更多个)多肽上时，则CAR可以具有两个(或更多个)跨膜结构域。由于CAR的每个多肽中的小分子依赖性异源二聚化结构域，分离关键信号传导和抗原识别模块使得能够对CAR细胞表达进行小分子依赖的、可滴定的和可逆的控制(例如，WO2014127261A1)。

CAR的胞质信号传导结构域(或胞内信号传导结构域)负责激活其中表达CAR的免疫细胞的至少一种正常效应功能。“效应功能”指细胞的专门功能，例如在T细胞中，效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。胞内信号传导结构域指转导效应功能信号并指导表达CAR的细胞以执行专门功能的蛋白的部分。胞内信号传导结构域可以包括足以转导启动或阻断免疫细胞效应功能的信号的给定蛋白的胞内信号传导结构域的任何完整的、突变的或截短的部分。

用于CAR的胞内信号传导结构域的著名实例包括T细胞受体(TCR)的胞质信号传导序列和在抗原受体接合后启动信号转导的共受体。

通常，T细胞激活可以由两种不同类型的胞质信号传导序列介导，首先是通过TCR启动抗原依赖性初级激活的那些(初级胞质信号传导序列)，其次是以抗原非依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质信号传导序列，共刺激信号传导结构域)。因此，CAR的胞内信号传导结构域可以包含一个或多个初级胞质信号传导结构域和/或一个或多个次级胞质信号传导结构域。

以刺激方式起作用的初级胞质信号传导结构域可以包含ITAM(免疫受体酪氨酸激活基序)。

在CAR中常用的含有初级胞质信号传导结构域的ITAM的实例是来源于TCRζ(CD3ζ)、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。最著名的是来源于CD3ζ(CD3zeta)的序列。

可以将CAR的胞质结构域设计为其自身包含CD3ζ信号传导结构域或者与一个或多个任何其他期望的胞质结构域组合。CAR的胞质结构域可以包含CD3ζ链部分和共刺激信号传导区(结构域)。共刺激信号传导区指CAR的一部分，其包含共刺激分子的胞内域。共刺激分子是除抗原受体或其配体以外的细胞表面分子，其是淋巴细胞对抗原的有效应答所需的。共刺激分子的实例是CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-l、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3。

CAR的胞质信号传导部分内的胞质信号传导序列可以按随机或特定顺序用或不用接头相互连接。短寡肽或多肽接头(其长度优选为2至10个氨基酸)可以形成连接。著名的接头是甘氨酸-丝氨酸双联体。

作为实例，胞质结构域可以包含CD3ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在另一个实例中，胞质结构域可以包含CD3ζ的信号传导结构域和CD137的信号传导结构域。在进一步的实例中，胞质结构域可以包含CD3ζ的信号传导结构域、CD28的信号传导结构域和CD137的信号传导结构域。

如上所述，出于分离CAR的关键信号传导和抗原识别模块的目的，CAR的胞外部分或跨膜结构域或胞质结构域也可以包含异源二聚化结构域。

可以对CAR进行进一步修饰，使其在编码CAR的核酸水平上包括一个或多个通过自杀开关消除表达CAR的免疫细胞的操作元件。自杀开关可以包括例如诱导信号传导级联的凋亡或诱导细胞死亡的药物。在一个实施方式中，可以对表达和编码CAR的核酸进行进一步修饰以表达酶，如胸腺嘧啶激酶(TK)或胞嘧啶脱氨酶(CD)。

在一些实施方式中，内结构域可以包含初级胞质信号传导结构域或共刺激区，但不同时包含这两者。在这些实施方式中，仅当包含缺失结构域的另一个CAR也结合其各自的抗原时，才会激活包含所公开的CAR的免疫效应细胞。

在本发明的一些实施方式中，CAR可以是“SUPRA”(分离的、通用的和可编程的)CAR，其中“zipCAR”结构域可以连接细胞内共刺激结构域和细胞外亮氨酸拉链(WO2017/091546)。这种拉链可以利用与例如scFV区融合的互补拉链被靶向，以赋予SUPRA CAR T细胞肿瘤特异性。这种方法对于产生针对各种肿瘤的通用CAR T细胞是特别有用的；可以针对肿瘤特异性对衔接子分子进行设计，并为改变过继转移后的特异性提供选择，这是选择压力和抗原逃逸情况的关键。

可以将本发明的CAR设计为以任何顺序和/或组合包含本文所述的上述结构域的任何部分或一部分，从而导致产生功能性CAR，即介导表达如本文所公开的CAR的免疫效应细胞的免疫效应应答的CAR。

术语“肿瘤”在医学上被称为瘤(neoplasm)。不是所有肿瘤都是癌性的；良性肿瘤不侵入临近组织，也不扩散至整个机体。

术语“癌症”在医学上被称为恶性瘤。癌症是一组涉及失控的细胞生长的广泛疾病。在癌症中，细胞(癌细胞)失控地分裂和生长，形成恶性肿瘤并侵入机体的邻近部分。癌症也可以通过淋巴系统或血液系统传播至机体的较远部分。有超过200种不同的影响人类的已知癌症。

抗原BDCA2(也称为CLEC4C)是浆细胞样树突状细胞的膜蛋白，用作此类细胞的标志物，在分化簇命名法中表示为CD303。优选地，如本文所使用的BDCA2抗原是人BDCA2抗原。

如本文所使用的术语“自体的”指来源于之后向其重新引入的同一受试者的任何物质。

如本文所使用的“同种异体的”指来源于与重新引入该物质的受试者属于相同物种的不同受试者的任何物质。

术语“分离的”指从天然状态改变或移除。例如，分离的细胞群指此类细胞富集并与其他细胞分离，所述其他细胞在其天然存在的状态通常与所述分离的细胞相关联。分离的细胞群指基本上纯化的细胞群，其是同质的细胞群。

关于抗体、其片段或CAR的抗原结合结构域的术语“特异性结合”或“对……具有特异性”指识别和结合特定抗原(即，BDCA2)，但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗原结合结构域。特异性结合来自一个物种的抗原的抗原结合结构域也可以结合来自另一物种的抗原。这种跨物种反应性与该抗原结合结构域特异性的定义并不矛盾。特异性结合抗原的抗原结合结构域也可以结合抗原的不同等位形式(等位变体、剪接变体、同种型等)。这种交叉反应性与该抗原结合结构域特异性的定义并不矛盾。

如本文所使用的术语“工程化细胞”和“遗传修饰细胞”可以互换使用。这些术语指含有和/或表达外来基因或核酸序列，其进而改变细胞或其后代的基因型或表型。特别是，这些术语指细胞(优选T细胞或NK细胞)能够通过本领域公知的重组方法操纵以稳定或瞬时地表达在天然状态下这些细胞中不表达的肽或蛋白质。例如，T细胞或NK细胞(优选人T细胞或NK细胞)被工程化以在其细胞表面上表达人工构建体，如嵌合抗原受体。例如，CAR序列可以使用逆转录病毒或慢病毒载体递送至细胞中。

BDCA2 V_L和BDCA2 V_H的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:l和SEQ ID NO:2中所示，并且在SEQ ID NO:4中用接头连接。SEQ ID NO:l至SEQ ID NO:4中给出的氨基酸序列(蛋白、多肽)是指各氨基酸序列的所有构象，其保留了本文所定义的各氨基酸序列的预期功能。换言之，分别与SEQ ID NO:l、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的差异不应影响其特异性结合抗原BDCA2和/或作为功能性CAR的潜力。因此，SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4的氨基酸序列可以分别是SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4的全长氨基酸序列。其也可以是其变体，所述变体缺失、添加或替换了一些氨基酸，同时仍保留了本文所述的预期功能。因此，在该定义中包括分别在SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4中的氨基酸序列的变体，如分别与SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4基本上相似的氨基酸序列，在氨基酸序列水平上具有至少70％或至少75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％的序列同一性。在本发明的上下文中，可以使用配对比对，利用本领域熟知的氨基酸序列比对程序来确定“序列同一性”。

T细胞或T淋巴细胞是在细胞介导的免疫中起关键作用的一种淋巴细胞类型。通过在细胞表面上存在的T细胞受体(TCR)，可以将其与其他淋巴细胞(如B细胞和自然杀伤细胞(NK细胞))区分开。有几种T细胞子集，每个子集具体不同功能。

辅助性T细胞(T_H细胞)在免疫过程中协助其他白细胞，包括B细胞成熟为浆细胞和记忆B细胞，以及激活细胞毒性T细胞和巨噬细胞。这些细胞也称为CD4⁺T细胞，因为在其表面上表达CD4糖蛋白。当辅助性T细胞被MHC II类分子呈递肽抗原时，其被激活，所述MHC II类分子在抗原呈递细胞(APC)的表面上表达。一旦激活，其就会迅速分裂并分泌被称为细胞因子的小蛋白，这些小蛋白调控或协助主动免疫应答。这些细胞能够分化为几种亚型之一，包括T_H1、T_H2、T_H3、T_H17、Th9或T_FH，其分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。来自APC的信号引导T细胞成为特定亚型。

细胞毒性T细胞(Tc细胞或CTL)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并且也与移植排斥反应有关。这些细胞也称为CD8⁺T细胞，因为在其表面上表达CD8糖蛋白。这些细胞通过结合与存在于所有有核细胞表面上的MHC I类分子相关联的抗原来识别其靶标。记忆T细胞是抗原特异性T细胞的子集，其在感染恢复后长期存在。当其再次暴露于相关(cognate)抗原时，其会迅速扩增为大量效应T细胞，从而为免疫系统提供针对过去感染的“记忆”。记忆T细胞包括三种亚型：中央记忆T细胞(T_CM细胞)和两种类型的效应记忆T细胞(T_EM细胞和T_EMRA细胞)。记忆细胞可以是CD4⁺或CD8⁺。记忆T细胞通常表达细胞表面蛋白CD45RO。

调节性T细胞(T_reg细胞)，此前称为抑制性T细胞，对于维持免疫耐受性至关重要。其主要作用是在免疫反应结束时关闭T细胞介导的免疫，并抑制逃避胸腺中负选择过程的自身反应性T细胞。

已描述了两种主要的CD4⁺T_reg细胞类型—Foxp3+T_reg细胞和Foxp3-T_reg细胞。

自然杀伤T细胞(NKT细胞-不要与先天性免疫系统的自然杀伤细胞相混淆)将适应性免疫系统与先天性免疫系统联系在一起。与识别由主要组织相容性复合物(MHC)分子呈递的肽抗原的常规T细胞不同，NKT细胞识别由称为CD1d的分子呈递的糖脂抗原。一旦激活，这些细胞就能够执行归因于T_h和T_c细胞两者的功能(即，产生细胞因子和释放溶细胞/杀细胞分子)。

术语“自然杀伤细胞(NK细胞)”定义为大颗粒淋巴细胞(LGL)，并构成由产生B和T淋巴细胞的常见淋巴样祖细胞分化的第三类细胞。已知NK细胞在骨髓、淋巴结、脾脏、扁桃体和胸腺中分化和成熟，然后进入循环系统。NK细胞在表型上与自然杀伤T细胞(NKT)不同，其具有不同的来源和效应功能；通常，NKT细胞活性通过分泌IFNγ促进NK细胞活性。与NKT细胞不同的是，NK细胞不表达T细胞抗原受体(TCR)或泛T标志物CD3或表面免疫球蛋白(Ig)B细胞受体，但其通常在人类中表达表面标志物CD16(FcγRIII)和CD56，在C57BL/6小鼠中表达NK1.1或NK1.2。多达80％的人类NK细胞也表达CD8。可以从癌症患者中建立持续生长的NK细胞系，例如，常见的NK细胞系为NK-92、NKL和YTS。

免疫疗法是一个医学术语，将其定义为“通过诱导、增强或抑制免疫应答来治疗疾病”。将设计为激发或增强免疫应答的免疫疗法分类为激活免疫疗法，而将减少或抑制免疫应答的免疫疗法分类为抑制免疫疗法。癌症免疫疗法是一种激活免疫疗法，其试图刺激免疫系统以排斥并破坏肿瘤。过继性细胞转移使用基于细胞的(优选基于T细胞的或基于NK细胞的)细胞毒性应答来攻击癌细胞。对患者的癌症具有天然或基因工程化反应性的T细胞是在体外产生的，然后转移回癌症患者中。

如本文所使用的术语“治疗”指降低疾病的至少一种体征或症状的频率或严重程度。

术语“生物标志物”或“标志物”在本领域中是广泛使用的，并且可以广泛地表示生物分子和/或其可检测部分(例如，核酸、肽或脂质，如糖脂)，对于个体表型和/或基因型的一个或多个方面，例如对于个体的状态，在个体中对其定性和/或定量评价是预测性的或信息性的(例如，预测、诊断和/或预后)。例如，就在个体中的癌症化疗结局而言，生物标志物是预测性或信息性的。如果生物标志物是使用本领域公知的方法可检测的，则生物标志物是表达的(“生物标志物的表达”)。因此，生物标志物的表达不仅包括在核酸水平(DNA和/或RNA)和蛋白水平的表达，而且还包括在细胞上或细胞内其他生物结构(如糖脂)的表达(存在情况)或蛋白的活性。

如在本文中所使用的，术语“受试者”指动物。优选地，受试者是哺乳动物，如小鼠、大鼠、奶牛、猪、山羊、鸡、犬、猴或人。更优选地，个体是人。受试者可以是患有疾病如癌症的受试者(患者)，但受试者也可以是健康受试者。

如在本文中所使用的，术语“靶标”是指与细胞相关的抗原或表位，其应被抗原结合结构域(例如，抗体或CAR的抗原结合结构域)特异性识别。抗原或表位可以结合至细胞表面，但也可以是分泌的，作为细胞外膜的一部分或从细胞脱落。

如在本文中所使用的，术语“抗体”指多克隆或单克隆抗体及其抗原结合片段，其可以由本领域技术人员熟知的方法产生。抗体可以是任何物种的，例如小鼠、大鼠、绵羊、人。出于治疗目的，如果要使用非人抗原结合片段，则可以通过本领域公知的任何方法将其人源化。抗体也可以是经修饰的抗体(例如，寡聚物、还原的、氧化的和标记的抗体)。

术语“免疫细胞”或“免疫效应细胞”指可以是免疫系统的一部分并执行特定效应功能的细胞，如α-βT细胞、NK细胞、NKT细胞、B细胞、先天性淋巴样细胞(ILC)、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞、γ-δT细胞、间充质干细胞或间充质基质细胞(MSC)、单核细胞或巨噬细胞。优选地，这些免疫细胞是人免疫细胞。优选的免疫细胞是具有细胞毒性效应功能的细胞，如α-βT细胞、NK细胞、NKT细胞、ILC、CIK细胞、LAK细胞或γ-δT细胞。最优选的免疫效应细胞是T细胞和NK细胞。“效应功能”指细胞的专门功能，例如在T细胞中，效应功能可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。

如本文所使用的，术语“标签化多肽”指直接或间接结合至至少一种另外的组分(即，标签)的多肽。多肽可以是与在靶细胞表面上表达的抗原(如癌细胞上的肿瘤相关抗原)结合的抗体或其抗原结合片段。标签可以是半抗原，如FITC、生物素、PE或链霉亲和素，并且半抗原可以被CAR的抗半抗原(抗标签)结合结构域结合。

半抗原是小分子，仅在与大的载体(如蛋白)连接时才引发免疫应答；载体可以是本身也不引发免疫应答的载体。一旦人体产生了针对半抗原载体加合物的抗体，小分子半抗原也可能能够结合至抗体，但其将通常不会引发免疫应答；通常仅有半抗原载体加合物才能做到这一点。

或者，标签也可以是肽序列，例如化学或重组偶联至标签化多肽的多肽部分。用于“抗-标签CAR系统”的标签是本领域中熟知的，并且本文中可以使用适于此类抗-标签CAR系统和标签化多肽的任何标签。

如在本文中所使用的，术语“抗原”旨在包括结合至或激发一种或多种抗体产生的物质，并且可以包括但不限于蛋白、肽、多肽、寡肽、脂质、碳水化合物(如右旋糖)、半抗原及其组合，例如糖基化蛋白或糖脂。如在本文中所使用的，术语“抗原”指可以在靶细胞表面上表达并且可以被下述方式所识别的分子实体：包括但不限于抗体或TCR的适应性免疫系统、或包括但不限于内源性或转基因TCR的工程化分子、CAR、scFv或其多聚体、Fab片段或其多聚体、抗体或其多聚体、单链抗体或其多聚体或者能够以高亲和性结合至结构的任何其他分子。

如在本文中所使用的，肿瘤相关抗原(TAA)指在肿瘤细胞中产生的抗原性物质。肿瘤相关抗原在使用诊断测试鉴定肿瘤/癌细胞中是有用的肿瘤或癌症标志物，并且是用于癌症治疗的潜在候选物。优选地，TAA可以在肿瘤/癌细胞的细胞表面上表达，从而可以被如本文所公开的抗原结合受体所识别。

如在本文所使用的，术语“靶细胞”指在其细胞表面上表达抗原的细胞，所述抗原能够被如本文所公开的CAR的抗原结合结构域或被如本文所公开的标签化多肽的标签的抗原结合结构域所识别(结合)。

如在本文中所使用的，术语“受试者”指哺乳动物，如小鼠、大鼠、奶牛、猪、山羊、鸡、犬、猴或人。优选地，受试者是人。受试者可以是患有病症如癌症的受试者(患者)，但受试者也可以是健康受试者。

术语“治疗有效量”或“治疗有效群”指在受试者中提供治疗获益的细胞群的量。

关于如在如本文所公开的例如CAR中所使用的抗体、其抗原结合片段，或在标签化多肽中的抗原结合结构域的术语“特异性结合”或“对……具有特异性”指识别和结合特定抗原，但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗原结合结构域。特异性结合来自一个物种的抗原结合结构域也可以结合来自另一物种的抗原。这种跨物种反应性对很多抗体是典型的，并因此与该抗原结合结构域特异性的定义并不矛盾。特异性结合抗原的抗原结合结构域也可以结合抗原的不同等位形式(等位变体、剪接变体、同种型等)或来自同一基因家族的该抗原的同源变体。这种交叉反应性对很多抗体是典型的，并因此与该抗原结合结构域特异性的定义并不矛盾。

如在本文中所使用的，将术语“表达”定义为由细胞中的其启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。

实施例

实施例1：表达BDCA2 CAR的NK和T细胞的产生

我们已经将aBDCA2-scFV克隆到慢病毒载体主链(backbone)中，并产生了高滴度慢病毒载体(LV)。从供体外周血单核细胞(PBMC)中分离出原代NK和T细胞。将NK细胞在含有IL-2和IL-15的NK细胞培养基(Miltenyi Biotec)中培养2天。在第2天，我们使用含有aBDCA2-scFV的慢病毒载体转导预先激活的NK和T细胞。在第8天，我们通过针对aBDCA2-scFV的特异性独特型(idiotype)确定了CAR的表达情况(图1B和1C)。由这些细胞表达的BDCA2CAR包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的BDCA2结合结构域，其从N末端至C末端的顺序为：SEQ ID NO:l，随后为SEQ ID NO:2。

NK细胞对很多细胞系具有天然的细胞毒性。我们发现两种细胞系(人RS411和小鼠A95-KK)对NK细胞的自然杀伤作用具有抗性，因此表明其是工程化CAR-NK和CAR-T细胞的靶标的很好选择。RS411是购自ATCC的pre B细胞系，报告子是获自Miltenyi GmbH,Germany的小鼠T细胞杂交瘤(A95-KK)细胞系。这两种细胞系均使用BDCA2转导，并产生表达BDCA2的稳定细胞系(图1D，报告子，和2E，RS4-11)。

实施例2：BDCA2-CAR转导效应细胞的细胞毒性

通过基于流式细胞术的细胞毒性测定确定BDCA2-CAR的特异性细胞毒性(GranzinM等，Cytotherapy.2015)。不含CAR-BDCA2的激活的NK和T细胞对表达BDCA2的靶细胞几乎没有杀伤作用(<10％杀伤)(图2)。然而，工程化T细胞对未转导的靶细胞(报告子-对照和RS4-11-对照，未转导)显示出略高的背景杀伤作用。表达BDCA2-CAR的两种效应细胞对表达BDCA2的靶细胞具有较高的细胞毒性(在E:T＝1:1时，>70％杀伤)(图2，报告子-BDCA2和RS4-11-BDCA2，分别为上小图和下小图)。令人吃惊的是，这些靶细胞系对非工程化NK细胞的自然杀伤作用具有很高的抗性，表明工程化CAR-NK细胞能够克服癌细胞的天然抗性。尽管aBDCA2 CAR的表达更低，但是CAR-NK细胞比CAR-T细胞显示出略高的靶细胞杀伤作用(图2)。

实施例3：BDCA2-CAR NK和BDCA2-CAR T细胞的细胞因子产生

我们使用来自Miltenyi Biotec的MACSPlex细胞因子试剂盒在存在靶细胞的条件下分析了BDCA2-CAR-NK和BDCA2-CAR-T细胞的细胞因子产生情况。与不含BDCA2的靶细胞共培养后，BDCA2-CAR-NK细胞产生非常低或不可检测的量的INF-γ和TNF-α，但当与表达BDCA2的靶细胞共培养时，产生更高量的细胞因子(图3，RS4-11 NK和报告子NK)。另一方面，当将其与表达BDCA2的靶细胞共培养时，BDCA2-CAR-T细胞产生的细胞因子的量比NK细胞高约100倍(图3)。令人吃惊的是，甚至当将其与不含BDCA2的靶细胞共培养时，BDCA2-CAR-T细胞产生显著的量的细胞因子。

实施例4：未转导和BDCA2-CAR转导的NK细胞的表型特征

为了理解BDCA2-CAR转导后NK细胞表型的任何改变，我们比较了未转导和转导NK细胞之间常见NK细胞标志物的表达情况。根据生产厂商的说明书，使用来自MiltenyiBiotec的NK细胞分离试剂盒从PBMC中分离原代NK细胞。在含有IL-2和IL-15的NKMACS培养基(Miltenyi Biotec)中培养细胞。如上文所述，在第2天，使用BDCA2-CAR转导NK细胞。在与转导NK细胞相同的条件下处理和培养未转导NK细胞，并将其作为对照。在转导后第8天，洗涤转导和未转导的细胞，计数并使用针对不同NK细胞受体的单克隆抗体染色，并使用流式细胞术确定表达情况。在未转导和转导NK细胞中常见已知NK细胞标志物的表达情况相似(图6)，提示在使用BDCA2-CAR转导后在NK细胞中无表型异常。

实施例5：BDCA2-CAR对NK细胞细胞代谢的影响

已知与未转导的T细胞相比，在CD19 CAR转导T细胞中细胞代谢显著不同(Kawalekar OU等，2016)。为了了解NK细胞中细胞代谢与CAR信号传导的相互作用关系，我们根据生产厂商的说明书，使用胞外通量分析仪(seahorse,Agilent)，对BDCA2-CAR转导NK细胞与未转导NK细胞的代谢谱进行了比较。我们测量了转导后8天未转导和BDCA2-CAR转导NK细胞的耗氧率(OCR)。测量基础OCR，然后依次添加寡霉素(ATP合成抑制剂)，羰基氰-对三氟甲氧基苯腙(carbonyl cyanide-ptrifluoromethoxyphenylhydrazone)(FCCP；解偶联离子载体)，和鱼藤酮与抗霉素A(分别用于电子传输链的复合物I和III的封闭剂)，来区分线粒体和非线粒体耗氧机理的相对贡献。如所预期的，未转导和BDCA2-CAR转导NK细胞之间的基础OCR性质(profile)相似(图5，图6A)。尽管在转导后8天CAR转导NK细胞似乎没有更高的呼吸，但是我们在两组之间的最大呼吸方面没有发现显著差异(图6B)。我们还测量了未转导和转导NK细胞的胞外酸化率(ECAR)，并且发现其是相似的(图6C)。总之，这些结果表明，与T细胞不同，使用CAR转导后，NK细胞在其代谢活性方面未显示出变化。

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