CN112279890A - 一种两亲性多肽、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于制药技术领域，公开了一种两亲性多肽P15(YIGSRHHHLLLGFLG)、制备方法及其应用。本发明通过优化树脂、催化剂、投料比后的固相合成法合成两亲性多肽，并将其应用于抗癌药物传递系统P15‑PTX的制备，制备方法是将两亲性多肽和紫杉醇(PTX)混合溶于水中，然后将体系进行多次透析，最后将透析后的体系进行离心处理去上清液得到。该新型抗癌药物传递系统具有靶向作用强、稳定性好、包载率高、副作用少、毒性低等优点，能够明显提高药效。

Description

一种两亲性多肽、制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物制药领域，涉及蛋白质多肽和抗癌药物传递系统。具体地，涉及两亲性多肽YIGSRHHHLLLGFLG、制备方法，以及其在新型抗癌药物传递中的应用。

背景技术

人们身体内所有器官都是由细胞组成的。有序的细胞增殖和分化可满足身体需要，维持身体健康。然而，如果细胞持续分裂，不再受身体控制，无限代谢生殖，那么这些额外的大量细胞就形成肿瘤。恶性肿瘤的细胞能侵犯、破坏邻近的组织和器官。而且，癌细胞可从肿瘤中穿出，进入血液或淋巴系统，危及生命。

目前已经研发出许多抗肿瘤药物，且都具有有效的药理活性，但是它们缺乏靶向性、溶解性差以及稳定性差，在体内容易很快会被清除，严重降低了治疗效果。此外，还具有一定的毒性和副作用，使得它们的临床应用受到了限制。

在药物研发中，多学科交叉越来越重要。高分子材料科学和药物制剂学的发展催生了药用高分子材料学，药用高分子材料直接促进了药物输送系统(drug deliverysystem)的发展。药用高分子材料为开发缓释制剂、靶向制剂、自调式给药制剂、生物药的非注射给药制剂以及中药制剂的现代化提供了物质基础。

近年来，研究发现，纳米粒制剂可通过对肿瘤细胞上特异性或过表达受体的识别作用来增强药物载体的主动靶向效果，改善药物疗效，降低毒副作用。层粘连蛋白(laminin,LN)作为细胞外基质(extra-cellular matrix,ECM)的重要组成成分因为与肿瘤细胞表达的层粘连蛋白受体(laminin receptor,LN-R)结合能产生多种生物学行为，并且LN-R与大多数肿瘤的转移和预后具有密切的关系，所以受到越来越多的关注。67kDa层粘连蛋白受体(67kD laminin receptor,67LR)广泛存在于上皮细胞、内皮细胞、周围神经细胞、巨噬细胞及大部分肿瘤细胞表面，而YIGSR肽序列已被鉴定是选择性识别67LR的结合位点，并且YIGSR区段通过与细胞表面层粘连蛋白受体的相互作用促进细胞摄取，提高了基因转染效率，并且表现出相比于未添加YIGSR区段的药物具有低毒性的效果。

高效准确的靶向识别技术能够靶向识别癌细胞受体并使药物与之接合，此外如何将高效活性药物保存至它能够传递到癌细胞受体上，是针对癌症治疗的关键难题，也是药物研发及运用的瓶颈问题。靶向识别癌细胞的技术和具有活性药物的稳定性技术目前均在进行着不断地改善和完善工作。但是，由于这两种技术的自身的限制，将两种技术结合的靶向药物传递技术有待提高。

发明内容

1.要解决的问题

针对目前抗肿瘤药物传递缺乏靶向性、溶解性差和稳定性差的问题，本发明提供了一种两亲性多肽P15(YIGSRHHHLLLGFLG)及其制备方法和一种新型抗癌药物传递系统及其制备方法，多肽中YIGSR序列能够靶向结合67LR；同时利用多肽两亲性包载抗肿瘤药物，尤其是疏水性抗肿瘤药物，如紫杉醇等，能够形成疏水核心亲水壳的两亲性球状聚合状态，既提高了包载率，又使其具有更好的稳定性。

2.技术方案

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

本发明提供了一种两亲性多肽，所述多肽的氨基酸序列为YIGSRHHHLLLGFLG，具有两亲性，且YIGSR序列能够靶向结合表达LN-R的肿瘤细胞。

本发明提供了一种上述两亲性多肽的制备方法，包括如下步骤：

步骤(1)：在溶剂的存在下，将树脂与N-(9-芴甲氧羰基)-O-叔丁基-L-酪氨酸(Fmoc-Tyr(tBu)-OH)、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)进行接触反应，然后进行洗涤，二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷(DCM)各洗一次；

优选地，步骤(1)中树脂选自2-cl树脂、Rink树脂和Wang树脂中的至少一者。更优选地，选用2-cl树脂。

优选地，步骤(1)中的树脂载药的取代度不低于0.5。

优选地，步骤(1)中相对于1g树脂，Fmoc-Tyr(tBu)-OH的用量为0.2-0.4g，DCM的用量为20-30mL，DIEA的用量为1-1.5mL。

优选地，步骤(1)中接触反应条件为：反应温度为10-30℃，反应时间为1.5-2.5h。

优选地，步骤(1)中的添料顺序为：先将树脂置于溶剂中浸泡，然后再添加DIEA与Fmoc-Tyr(tBu)-OH。更优选地，上述浸泡至少满足以下条件：浸泡温度为10-30℃，浸泡时间为1-3min。

优选地，步骤(1)中的溶剂选自二氯甲烷(DCM)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、四氢呋喃(THF)中的至少一者。

步骤(2)：在反应体系中进行封头处理，接着加入哌啶进行脱保护，然后洗涤直至反应体系经过茚三酮检测为蓝色；

优选地，步骤(2)中封头处理满足以下条件：处理温度为10-30℃，处理时间为30-60min。

优选地，步骤(2)中脱保护满足以下条件：温度为10-30℃，时间为15-30min。

优选地，步骤(2)中封头处理通过向反应体系中添加封头试剂而进行，并且封头试剂由DCM、甲醇和DIEA组成。

优选地，步骤(2)中封头试剂的各组分含量为：相对于1g的树脂，DCM的用量为20-30mL，甲醇的用量为1-1.5mL，DIEA的用量为1-1.5mL。

优选地，步骤(2)中相对于1g的树脂，哌啶的用量为15-20mL。

步骤(3)：在溶剂的存在下，将酪氨酸(Y)、1-羟基苯并三氮唑(HoBt)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)加入反应体系中进行接触反应，然后洗涤直至反应体系经过茚三酮检测为蓝色；

优选地，步骤(3)中相对于1g的树脂，Y的用量为0.4-0.6g，HoBt的用量为0.5-0.6g，TBTU的用量为1-1.5mL。

优选地，步骤(3)中接触反应满足以下条件：反应温度为10-30℃，反应时间为1-1.5h。

优选地，步骤(3)中溶剂选自二氯甲烷(DCM)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、四氢呋喃(THF)中的至少一者。。

步骤(4)：将精氨酸(R)、甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、组氨酸(H)、亮氨酸(L)、苯丙氨酸(F)依次加入反应体系中进行接触反应，接着加入哌啶进行脱保护，最后洗涤直至反应体系经过茚三酮检测为蓝色；

优选地，步骤(4)中物料用量为：相对于1g的树脂，R的用量为0.9-1.5g，G的用量为0.4-0.6g，S的用量为0.5-1.0g，H的用量为0.9-1.5g，L的用量为0.5-0.8g，F的用量为0.5-0.8g。

优选地，步骤(4)中接触反应至少满足以下条件：反应温度为10-30℃，每个缩合反应的时间为45-60min。

优选地，步骤(4)中脱保护至少满足以下条件：温度为10-30℃，时间为15-30min。

优选地，步骤(4)中相对于1g的树脂，哌啶的用量为15-20mL。

步骤(5)：将反应产物进行洗涤、干燥，然后加入切割液切割、沉降、纯化以制得两亲性链状多肽；

优选地，步骤(5)中切割液由三氟乙酸(TFA)和水组成；更优选地，TFA和水的体积比为(95-97)：(3-5)。

优选地，步骤(5)中相对于1g的所述树脂，切割液的用量为5-15mL。

优选地，步骤(5)中切割至少满足以下条件：切割温度为10-30℃，切割时间为2-2.5h。

优选地，步骤(5)中洗涤依次通过DMF、DCM、甲醇洗涤，并且，相对于1g的树脂，DMF、DCM、甲醇的用量各为15-20mL。

本发明提供了一种新型抗癌药物传递系统，所述系统是由上述两亲性多肽与紫杉醇(PTX)形成的YIGSRHHHLLLGFLG/PTX两亲性聚合胶束溶液。

本发明提供了一种上述新型抗癌药物传递系统的制备方法，包括如下步骤：

步骤(1)：将三乙胺和盐酸紫杉醇(PTX·HCL)在有机溶剂中进行避光反应，然后向体系中加入水且进行共沸蒸馏制得乳状PTX，最后冷冻干燥以制得疏水性紫杉醇；

优选地，步骤(1)中，相对于20mg的PTX·HCL，三乙胺的用量为2-3mL，有机溶剂的用量为5-10mL。

优选地，步骤(1)中，避光反应满足以下条件：反应温度为20-30℃，反应时间为4-6h。

优选地，步骤(1)中，共沸蒸馏的具体操作为：将体系和水以1-3：1的体积比混合，然后在10-30℃下旋蒸蒸馏30-60min。

优选地，步骤(1)中，冷冻干燥至少满足以下条件：温度为-80℃以下，压力为1000Pa以下，干燥时间为12-24h。

优选地，步骤(1)中，有机溶剂选自DMF、DCM和二甲基亚砜(DMSO)中的至少一者。

步骤(2)：将疏水性紫杉醇溶于水，再加入上述两亲性多肽、甲酸进行接触反应，然后将体系进行多次透析，最后将透析后的体系进行离心处理取上清液以得到新型抗癌药物传递系统，即YIGSRHHHLLLGFLG/PTX两亲性聚合胶束溶液；

优选地，步骤(2)中，各物料的用量为：相对于2-5mg的疏水性紫杉醇，两亲性多肽的用量为20-50mg，水的用量为6-10mL，甲酸的用量为2-5mL。

优选地，步骤(2)中，甲酸的浓度为88-98mg/mL，两亲性多肽的纯度为96％-98％(重量)。

优选地，步骤(2)中，接触反应至少满足以下条件：反应温度为15-35℃，反应时间为24-36h。

优选地，步骤(2)中，透析采用的透析袋的截留分子量为500-1000Da。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明的两亲性多肽，通过选择性识别67LR与过表达肿瘤细胞结合，具有较强的靶向作用；另一方面由于多肽的两亲性，可以使难溶性药物包裹于其胶束疏水性内核中，有利于提高难溶性药物的载药量和溶解度，从而将有效量更高的药物递送至作用靶点，如图6和图9所示，紫杉醇与本发明的多肽结合后，与未结合紫杉醇相比，不同浓度下抑制效果均提升20％左右，显著提高抗肿瘤药物的治疗效果。

(2)本发明的两亲性多肽和药物进行结合制备的新型抗癌药物传递系统，其稳定性高，如图8所示，药物被包裹后，在水溶液、PBS溶液、DMSO溶液、DMEM等不同种类溶剂下都呈现稳定的聚合状态，从而减少药物在递送的过程中的损失，提高药物的作用效果。

(3)本发明的药物递送系统为两亲性聚合胶束溶液，其胶束外壳的亲水段为胶束披上了一层“伪装”，不易被吞噬细胞或蛋白质识别，可避免被内状网皮系统(RES)捕获，延长了胶束在血液和组织的滞留时间，提高药物的生物利用度。

(4)本发明的两亲性多肽及新型抗癌药物传递系统的制备方法，研究优化了树脂种类、催化剂种类(HATU价格昂贵，TBTU更经济)、投料比(图10)，确定了最优条件，提高了产品的连接率，同时具有操作步骤简单、操作条件温和原料易得的优点。

附图说明

图1是两亲性多肽YIGSRHHHLLLGFLG的分子结构图；

图2是实施例1中两亲性多肽的MS图；

图3是实施例1中两亲性多肽的HPLC分析图谱；

图4是实施例1中两亲性多肽的粒径图；

图5是两亲性多肽聚合胶束装载药物的原理图；

图6是实施例1中多肽、多肽-PTX和PTX对MCF-7细胞的抑制效果图，其中a是

不同浓度P15对细胞的抑制效果；b是不同浓度下PTX与P15-PTX对细胞的抑制效果对比；

图7是实施例1中的不同倍数下多肽-PTX扫描电镜图，其中a是20倍，b是25倍，c是60倍；

图8是实施例1中的多肽-PTX各溶液中形态图，其中：a是水溶液，b是PBS溶液，c是DMSO溶液，d是DMEM培养液；

图9是实施例1中的FITC-PTX、FITC-多肽-PTX激光共聚焦图；

图10是不同条件下的两亲性多肽连接率，其中a是不同树脂种类、b是不同催化剂、c是不同投料摩尔比。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

需要说明的是，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”等用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同；本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

如本文所使用，术语“约”用于提供与给定术语、度量或值相关联的灵活性和不精确性。本领域技术人员可以容易地确定具体变量的灵活性程度。

如本文所使用，术语“......中的至少一个”旨在与“......中的一个或多个”同义。例如，“A、B和C中的至少一个”明确包括仅A、仅B、仅C以及它们各自的组合。

浓度、量和其他数值数据可以在本文中以范围格式呈现。应当理解，这样的范围格式仅是为了方便和简洁而使用，并且应当灵活地解释为不仅包括明确叙述为范围极限的数值，而且还包括涵盖在所述范围内的所有单独的数值或子范围，就如同每个数值和子范围都被明确叙述一样。例如，约1至约4.5的数值范围应当被解释为不仅包括明确叙述的1至约4.5的极限值，而且还包括单独的数字(诸如2、3、4)和子范围(诸如1至3、2至4等)。相同的原理适用于仅叙述一个数值的范围，诸如“小于约4.5”，应当将其解释为包括所有上述的值和范围。此外，无论所描述的范围或特征的广度如何，都应当适用这种解释。

任何方法或过程权利要求中所述的任何步骤可以以任何顺序执行，并且不限于权利要求中提出的顺序。

实施例1

MCF-7细胞系已用于研究抗癌活性和PTX活性的研究，利用本发明的方法制备的新型抗癌药物传递系统对MCF-7细胞系的影响研究，共分为三个步骤：

步骤(1)：制备两亲性多肽YIGSRHHHLLLGFLG

a、称量2-cl树脂1g(树脂载药量的取代度为0.5)于20mL的20℃的DCM中浸泡2min，然后用DMF、DCM各洗一次；以20mLDCM作溶剂，称量0.2g的Fmoc-Asp(Otbu)-OH，与1mL的DIEA、2-cl树脂1g在20℃下反应1.5h，然后用DMF洗涤2次；用20mLDCM+1mL甲醇+1mLDIEA在20℃下封头30min，用DMF洗涤3次；用15mL哌啶在20℃下脱保护，反应15min，然后用DMF洗涤4次，直至茚三酮检测为蓝色；

b、向体系中投0.4gY和0.5g HoBt，加1mL TBTU作为催化剂，20mLDMF作溶剂在20℃下反应1h，然后洗涤3次，直至茚三酮检测为蓝色；依次加入0.9gR，0.4gG，0.5gS，0.9gH，0.5gL，0.5gF，于20℃下，每个缩合反应45min；

c、待氨基酸序列全部接上之后，接着加入15mL哌啶于20℃下脱保护处理15min，反应结束后洗涤，茚三酮检测为蓝色即可；然后分别用20mL的DMF、DCM、甲醇依次洗涤，甲醇洗涤吹干；按质量体积比1g：10mL加切割液(含有TFA和水，并且体积比为95：5)在30℃切割2h，沉降，纯化检测得到两亲性多肽YIGSRHHHLLLGFLG。

对制得的两亲性多肽进行MS(质谱)检测，具体结果见图2；

对制得的两亲性多肽进行HPLC(高压液相色谱)检测，具体结果见图3；

对制得的两亲性多肽进行粒径大小检测，具体结果见图4。

通过上述检测可知，本发明制得的两亲性多肽YIGSRHHHLLLGFLG结构如图1所示，且通过HPLC测得其纯度为95.92％(重量)。

步骤(2)：制备新型抗癌药物传递系统(装载紫杉醇的聚合胶束)

a、1mL三乙胺和10mg盐酸紫杉醇(PTX·HCL)以用5mLDMF溶解，在磁力搅拌器中混合搅拌，20℃下避光反应4h，之后在旋转蒸发仪中加入5mL水，20℃共沸蒸馏30min，制得乳状PTX，再冷冻干燥(温度为-80℃以下，压力为1000Pa以下，干燥时间为12h)，制得疏水性紫杉醇；

b、将所述2mg疏水性紫杉醇溶于6mL水，再将加入20mg两亲性多肽，且滴加2mL甲酸(浓度为88-98mg/mL)，助两亲性多肽溶解，20℃下混合搅拌进行接触反应30h，然后将体系进行多次透析(透析袋的截留分子量为500-1000Da)，最后将透析后的体系进行离心处理去上清液以得到新型抗癌药物传递系统，即YIGSRHHHLLLGFLG/PTX两亲性聚合胶束溶液。

制得的多肽-PTX扫描电镜图如图7所示；多肽-PTX在各溶液中形态如图8所示，其中a是水溶液，b是PBS溶液，c是DMSO溶液，d是DMEM培养液。由图中可以看出，多肽-PTX在各溶液中形态均很稳定。通过检测，载药量为29.61％，包封率为34.28％。

步骤(3)：新型抗癌药物传递系统对效果研究

为了测定两亲性多肽对紫杉醇的药效的影响，使用相同浓度的PTX溶液和多肽-PTX(YIGSRHHHLLLGFLG/PTX两亲性聚合胶束溶液)进行细胞毒性研究。

首先，细胞铺板，待MCF-7细胞在培养皿涨到80％-90％时，先将培养皿中的培养基吸去，加入2-3mL的PBS清洗1-2次，除去表面死细胞。向培养皿中加入1mL胰酶，放入37℃的5％CO₂培养箱2min后，加入3mL的DMEM培养基终止消化。用枪反复吹打培养皿，将细胞悬浮液移至15mL离心管中，800rpm，5min条件下离心，去掉上清液。将收集好的MCF-7细胞，再加入3mL DMEM培养基，用枪反复吹打重悬。将细胞重悬液按一定比例稀释，吸取10μL，滴加细胞计数板上，在显微镜观察计数。计数完毕后，铺96孔板，每孔100μLDMEM培养基，含8000MCF-7细胞。放入37℃的5％CO₂恒温培养箱中，培养24h。以PTX量定浓，分别将PTX-Peptide(多肽-PTX)和PTX，用DMEM培养基配制400、200、100、50、25、12.5、0μL/mL这7个浓度梯度。取出96孔板，吸取培养基，加入100μL的不同浓度含PTX培养基，放入37℃的5％CO₂恒温培养箱中，培养24h。取出一定量cck8试剂与培养基按1：10的重量比混匀，加入cck8与培养基混合液每孔100μL，放入37℃的5％CO2恒温培养箱中，培养2h。用酶标仪在450nm，测其荧光。通过三次独立的试剂重复试验和每次一式三份进行测试来确认从两次细胞毒性测定活得的所有结果，具体结果见图6。

由图6可知，MCF-7细胞的细胞抑制率在多肽-PTX和PTX之间有明显差异，多肽-PTX对于MCF-7细胞的抑制率明显强于PTX的抑制率，进而说明本发明提供的新型抗癌药物传递系统具有优异的靶向作用；同时也发现药浓度越大，细胞抑制率越大。

将MCF-7细胞以5×10⁴/孔的密度接种于激光共聚焦小皿中，细胞贴壁后，以PTX的量定浓度，分别加入等浓度的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的P15-PTX、PTX，培养时间为30min、8h；培养结束后，用1mL 37℃PBS溶液洗涤细胞2遍，每个培养孔中加入1mL 5％(w/w)的多聚甲醛溶液，固定细胞30min；然后再加入1μg/mL的4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)溶液，细胞核染色15min；将样品置于CLSM载物台上，在荧光显微镜下确定观察区域及层面，采集荧光图像。(FITC的激发波长为488nm，DAPI的激发波长为340nm)。

过激光共聚焦扫描显微镜观察PTX和P15-PTX的内化作用，如图9所示，P15-FITC-PTX和FITC-PTX主要富集在细胞质中，且在30min、8h时，P15-FITC-PTX的荧光强度比FITC-PTX要强许多，表明在同等时间内，P15-PTX比PTX具有更强的靶向作用和内化效应，P15-PTX相比较于PTX具有更强靶向性。

实施例2

采用本发明的方法制备两亲性多肽及新型抗癌药物传递系统，共分为两个步骤：

步骤(1)：制备两亲性多肽YIGSRHHHLLLGFLG

a、称量2-cl树脂1g(树脂载药量的取代度为0.5)于20mL的20℃的DCM中浸泡2min，然后用DMF、DCM各洗一次；以20mLDCM作溶剂，称量0.3g的Fmoc-Asp(Otbu)-OH，与1mL的DIEA、2-cl树脂1g在25℃下反应2h，然后用DMF洗涤2次；用20mLDCM+1mL甲醇+1mLDIEA在20℃下封头45min，用DMF洗涤3次；用15mL哌啶在25℃下脱保护，反应15min，然后用DMF洗涤4次，直至茚三酮检测为蓝色；

b、向体系中投0.5gY和0.5g HoBt，加1mL TBTU作为催化剂，20mLDMF作溶剂在20℃下反应1h，然后洗涤3次，直至茚三酮检测为蓝色；依次加入0.9gR，0.4gG，0.5gS，0.9gH，0.5gL，0.5gF于25℃下，每个缩合反应的60min；

c、待氨基酸序列全部接上之后，接着加入15mL哌啶于25℃下脱保护处理15min，反应结束后洗涤，茚三酮检测为蓝色即可；然后分别用20mL的DMF、DCM、甲醇依次洗涤，甲醇洗涤吹干；按质量体积比1g：10mL加切割液(含有TFA和水，并且体积比为95：5)在10℃切割2.5h，沉降，纯化。

通过检测，得到两亲性多肽0.73g，纯度96.01％(重量)。

步骤(2)：制备新型抗癌药物传递系统(装载紫杉醇的聚合胶束)

a、2mL三乙胺和20mg盐酸紫杉醇(PTX·HCL)以用8mLDMF溶解，在磁力搅拌器中混合搅拌，25℃下避光反应5h，之后在旋转蒸发仪中加入5mL水，15℃共沸蒸馏50min，制得乳状PTX，再冷冻干燥(温度为-80℃以下，压力为1000Pa以下，干燥时间为24h)，以制得疏水性紫杉醇(PTX)；

b、将所述2mgPTX溶于6mL水，再将加入20mg两亲性多肽YIGSRHHHLLLGFLG，且滴加3mL甲酸(浓度为88-98mg/mL)，20℃下混合搅拌进行接触反应24h，然后将体系进行多次透析(透析袋的截留分子量为500-1000Da)，最后将透析后的体系进行离心处理去上清液以得到新型抗癌药物传递系统，即YIGSRHHHLLLGFLG/PTX两亲性聚合胶束溶液。

经检测，载药量为29.61％，包封率为34.28％。

实施例3

采用本发明的方法制备两亲性多肽及新型抗癌药物传递系统，共分为两个步骤：

步骤(1)：制备两亲性多肽YIGSRHHHLLLGFLG

a、称量2-cl树脂1g(树脂载药量的取代度为0.5)于30mL的20℃的DCM中浸泡2min，然后用DMF、DCM各洗一次；以30mLDCM作溶剂，称量0.4g的Fmoc-Asp(Otbu)-OH，与1.5mL的DIEA、2-cl树脂1g在20℃下反应2.5h，然后用DMF洗涤2次；用30mLDCM+1mL甲醇+1mLDIEA在20℃下封头30min，用DMF洗涤3次；用20mL哌啶在20℃下脱保护，反应30min，然后用DMF洗涤4次，直至茚三酮检测为蓝色；

b、向体系中投0.6gY和0.6g HoBt，加1.5mL TBTU作为催化剂，30mLDMF作溶剂在20℃下反应1.5h，然后洗涤3次，直至茚三酮检测为蓝色；依次加入0.9gR，0.4gG，0.5gS，0.9gH，0.5gL，0.5gF于20℃下，每个缩合反应的60min；

c、待氨基酸序列全部接上之后，接着加入20mL哌啶于20℃下脱保护处理30min，反应结束后洗涤，茚三酮检测为蓝色即可；然后分别用20mL的DMF、DCM、甲醇依次洗涤，甲醇洗涤吹干；按质量体积比1g：10mL加切割液(含有TFA和水，并且体积比为97：3)在20℃切割2.5h，沉降，纯化。

经检测，得到两亲性多肽0.81g，纯度97.39％(重量)。

步骤(2)：制备新型抗癌药物传递系统(装载紫杉醇的聚合胶束)

a、3mL三乙胺和20mg盐酸紫杉醇(PTX·HCL)以用10mLDMF溶解，在磁力搅拌器中混合搅拌，20℃下避光反应6h，之后在旋转蒸发仪中加入3mL水，10℃共沸蒸馏60min制得乳状PTX，再冷冻干燥(温度为-80℃以下，压力为1000Pa以下，干燥时间为18h)，以制得疏水性紫杉醇(PTX)；

b、将所述2mgPTX溶于10mL水，再将加入20mg两亲性多肽YIGSRHHHLLLGFLG，且滴加5mL甲酸(浓度为88-98mg/mL)，助两亲性多肽溶解，20℃下混合搅拌进行接触反应36h，然后将体系进行多次透析(透析袋的截留分子量为500-1000Da)，最后将透析后的体系进行离心处理去上清液以得到新型抗癌药物传递系统，即YIGSRHHHLLLGFLG/PTX两亲性聚合胶束溶液。

经检测，载药量为29.61％，包封率为34.28％。

Claims (10)

1.一种两亲性多肽，其特征在于：所述多肽的氨基酸序列为YIGSRHHHLLLGFLG。

2.权利要求1所述的两亲性多肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤(1)：在溶剂的存在下，将树脂与N-(9-芴甲氧羰基)-O-叔丁基-L-酪氨酸、N,N-二异丙基乙胺进行接触反应，然后进行洗涤；

步骤(2)：在反应体系中进行封头处理，加入哌啶进行脱保护，然后洗涤直至反应体系经过茚三酮检测为蓝色；

步骤(3)：在溶剂的存在下，将酪氨酸、1-羟基苯并三氮唑、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯加入反应体系中进行接触反应，然后洗涤直至反应体系经过茚三酮检测为蓝色；

步骤(4)：将精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、组氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸依次加入反应体系中进行接触反应，加入哌啶进行脱保护，然后洗涤直至反应体系经过茚三酮检测为蓝色，得到反应产物；

步骤(5)：将反应产物进行洗涤、干燥，然后加入切割液切割、沉降、纯化。

3.根据权利要求2所述两亲性多肽的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中，

溶剂选自二氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃中的至少一者；树脂选自2-cl树脂、Rink树脂和Wang树脂中的至少一者；树脂载药的取代度不低于0.5；

步骤(3)中，

溶剂选自二氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮、四氢呋喃中的至少一者。

4.根据权利要求3所述两亲性多肽的制备方法，其特征在于：

步骤(5)中，

依次通过二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲醇洗涤，相对于1g的树脂，二甲基甲酰胺、二氯甲烷、甲醇的用量各自独立地为15-20mL；切割液由三氟乙酸和水组成，相对于1g的树脂，切割液的用量为5-15mL；切割温度为10-30℃，切割时间为2-2.5h。

5.根据权利要求4所述两亲性多肽的制备方法，其特征在于：

步骤(4)中，

相对于1g的树脂，精氨酸、甘氨酸、丝氨酸、组氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸的用量分别为0.9-1.5g、0.4-0.6g、0.5-1.0g、0.9-1.5g、0.5-0.8g、0.5-0.8g；接触反应温度为10-30℃，每个缩合反应的时间为45-60min；脱保护温度为10-30℃，时间为15-30min；相对于1g的树脂，哌啶的用量为15-20mL。

6.一种新型抗癌药物传递系统，其特征在于：所述系统含有权利要求1所述的两亲性多肽。

7.根据权利要求6所述的一种新型抗癌药物传递系统，其特征在于：所述传递系统是由两亲性多肽与抗癌药物形成的两亲性聚合胶束溶液。

8.根据权利要求7所述的一种新型抗癌药物传递系统，其特征在于：抗癌药物为紫杉醇。

9.权利要求8所述的新型抗癌药物传递系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤(1)：将三乙胺和盐酸紫杉醇在有机溶剂中进行避光反应，然后向体系中加入水且进行共沸蒸馏制得乳状紫杉醇，然后冷冻干燥制得疏水性紫杉醇；

步骤(2)：将疏水性紫杉醇溶于水，再加入所述两亲性多肽、甲酸进行接触反应，然后将体系进行多次透析，最后将透析后的体系进行离心处理取上清液。

10.根据权利要求9所述的新型抗癌药物传递系统的制备方法，其特征在于：

步骤(1)中，

有机溶剂选自二甲基甲酰胺、二氯甲烷和二甲基亚砜中的至少一者；相对于20mg的盐酸紫杉醇，三乙胺的用量为2-3mL，有机溶剂的用量为5-10mL；避光反应温度为20-30℃，反应时间为4-6h；共沸蒸馏中体系和水的体积比为1-3：1，蒸馏温度为10-30℃，蒸馏时间为30-60min；冷冻干燥温度为-80℃以下，压力为1000Pa以下，干燥时间为12-24h；

步骤(2)中，

相对于2-5mg的疏水性紫杉醇，两亲性多肽的用量20-50mg，水的用量6-10mL，甲酸的用量为2-5mL；接触反应温度为15-35℃，反应时间为24-36h。

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