CN112250733A - 一种靶向标记非小细胞肺癌的荧光分子探针及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属生物医药技术领域，为了解决目前缺少利用噬菌体展示随机肽库对NCI‑H1299细胞系的筛选，提供一种靶向标记非小细胞肺癌的荧光分子探针及其应用。所述荧光分子探针为荧光标记靶向肽，命名为FITC‑NSP1，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该探针特异性的结合非小细胞肺癌细胞系NCI‑H1299，在体外人痰液脱落细胞中检测非小细胞肺癌中的应用。为非小细胞肺癌的分子诊断和靶向治疗提供实验基础。用Ph.D.‑C7CTM环七肽库在非小细胞肺癌NCI‑H1299细胞荷瘤裸属体内进行筛选并成功得到了肺癌靶向肽NSP1，又在体外和体内初步验证了其特异性及靶向性，为肺癌早期诊断的研究奠定了基础。

Description

一种靶向标记非小细胞肺癌的荧光分子探针及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种靶向标记非小细胞肺癌的荧光分子探针及其应用，该荧光分子探针特异性的结合非小细胞肺癌细胞系NCI-H1299，在体外人痰液脱落细胞中检测非小细胞肺癌中的应用。为非小细胞肺癌的分子诊断和靶向治疗提供实验基础。
背景技术
肺癌是最常见的、病死率最高的恶性肿瘤之一，其发病率居各恶性肿瘤之首。非小细胞型肺癌包括鳞状细胞癌（鳞癌）、腺癌、大细胞癌，与小细胞癌相比其癌细胞生长分裂较慢，扩散转移相对较晚。非小细胞肺癌约占所有肺癌的80%，约75%的患者发现时已处于中晚期，5年生存率很低。由于肺癌起病隐匿，早期没有特殊的临床表现，目前仍缺乏有效的早期筛查和诊断方法，因此80%以上的肺癌在确诊时已属晚期，总体5年生存率不足15%。
若肺癌患者能够早期诊断并及时进行手术治疗，其预后较中晚期肺癌将显著改善。因此早期发现、诊断和靶向治疗是提高治愈率的有效途径。目前，肺癌的早期筛查手段有胸部X线检查、低剂量螺旋CT、经胸壁穿刺活组织和支气管镜检查等，但这些检查不能及早发现肿瘤细胞在分子水平的改变。因此，发展新型诊断技术，真正实现肿瘤的早期诊断，成为现代医学研究的热点。
肿瘤特异性多肽是目前国内外研究的重点之一，可携带荧光素特异性富集在肿瘤组织、细胞，是肿瘤光学分子靶向诊断的重要载体，已广泛用于膀胱癌、胃癌、胰腺癌等多种实体瘤，而人非小细胞肺癌少有研究。
噬菌体展示技术从1985年初建立到现在，已发展成为生命科学领域的一项重要技术，由于具有库容大、高通量、操作简便等特点，已广泛应用于各个方面，成为筛选肿瘤细胞或组织的特异性结合肽的一个强大工具，因此成为目前癌症诊疗研究中最具潜力的方法之一。利用噬菌体展示技术已经筛选得到多条针对不同肺癌细胞株的靶向肽，Liang等人利用噬菌体展示七肽库筛选得到人小细胞肺癌细胞系NCI-H446的特异性结合肽AGALHQF；Pan等人利用体内噬菌体展示技术筛选得到非小细胞肺癌细胞A549的特异性结合肽zp2，该多肽能与临床人肺癌标本特异性结合；He等利用体外噬菌体展示技术筛选了肺癌H460细胞株的环七肽CSNIDARAC，活体荧光成像实验证明CSNIDARAC能选择性地结合到肿瘤组织，在正常组织中摄取量少，有望成为肺癌靶向的肿瘤显像剂；靶向性多肽是当前普遍认为的比较理想的肿瘤诊断和靶向治疗载体，它们具有高特异性、高亲和性、良好的组织渗透性，能被肿瘤细胞所摄取，易于化学合成并有较低的免疫原性等优点，同单克隆抗体相比拥有更多的优势。近年来，国内外的研究人员利用肽库技术针对不同的靶点进行不同的肿瘤靶向肽筛选，在肿瘤的诊断、靶向治疗等方面具有潜在的临床应用价值。
目前利用噬菌体展示技术针对肿瘤细胞的筛选方法包括以下3种：体外生物筛选、体内筛选、体外/体内筛选。十几年来国内外的研究人员利用噬菌体展示技术发现的特异性多肽既可作为成像剂用于肿瘤及其微转移灶的早期诊断；也可用于连接抗癌药物进行靶向治疗，而不损伤其他健康组织。
体内噬菌体展示技术不仅具备常规噬菌体肽库高通量、快速、高效的筛选特征，还因为该筛选过程在体内进行，能充分模拟人体内环境，最大程度地保持肿瘤组织和细胞表面各种配体的天然构象。在筛选过程中，由于动物体内有各种正常组织作为背景对照，可以使噬菌体随机肽库经过层层筛选，以最大可能性获得具备较高亲和力和特异性的短肽。
未来恶性肿瘤诊治取得突破的关键在于早期诊断和靶向治疗，而特异、敏感的肿瘤标志物对此意义十分重大。目前靶向肽介导的分子影像学检测对于早期检测肿瘤病灶、提高早期诊断率具有重要价值。分子影像技术实现了基于特异性分子探针的功能成像，将肿瘤诊断时间窗由结构改变提前到了生物大分子甚至基因水平，为实现肿瘤的早期精准诊断提供了可能。其中分子探针是实现分子成像的先决条件和核心技术，分子影像技术若没有分子探针就像射击没有子弹一样。通常靶向分子探针包括抗体及片段、多肽、核酸、纳米粒子和小分子等，其中最为理想的靶向载体是靶向小分子多肽。然而目前我国的分子探针产品几乎全部依赖进口, 市场被强生、GE healthcare®、Life Technology®、Invitrogen®和Bracco等这些欧美公司所垄断。因此开发性能优良、价格便宜且具有我国自主知识产权的医学分子探针是一项十分迫切的任务。
研究表明光学分子成像技术 (Optical Molecular Imaging,OMI) 将成为未来诊疗技术发展的新方向，是继传统的分子成像方式之后又一新的影像技术，将成为临床医生的好助手。OMI诊疗策略实施的关键在于研发与肿瘤细胞及组织具有较高结合特异性和敏感性的靶向分子，进而展开分子探针及靶向化疗药物载体的开发。光学分子探针是光学分子成像技术的核心理论和方法，是进行分子影像学研究的先决条件。小分子多肽可作为理想的探针应用于光学成像，这些探针靶向性强、灵敏度高，可以在标记后用于病变组织的显像和治疗 。2006年Cai等在荷人胶质母细胞瘤小鼠中，评价了RGD标记的QD（QD705-RGD)的靶向肿瘤血管和血管成像的能力。QD705-RGD能在注射6小时后显像肿瘤，并具有良好的对比度。这是在体内第一次尝试使用RGD标记QD来进行肿瘤血管的光学显像。后来，Gao等报道了在体内利用RGD肽标记的近红外无镉量子点（QD800-RGD）进行肿瘤定位和成像。静脉注射后，QD800-RGD在肿瘤比那些未标记的量子点（QD800-PEG）有显著的积累。随着新型成像仪器的开发，光学分子探针介导内窥镜检查有望成为肿瘤早期诊断和治疗的新技术。
目前利用噬菌体展示随机环七肽库对非小细胞肺癌细胞系NCI-H1299的筛选还未见报道。
发明内容
本发明为了解决目前缺少利用噬菌体展示随机肽库对NCI-H1299细胞系的筛选，提供了一种靶向标记非小细胞肺癌的荧光分子探针及其应用。
本发明由如下技术方案实现的：一种靶向标记非小细胞肺癌的荧光分子探针，所述荧光分子探针为荧光标记靶向肽，命名为FITC-NSP1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，即CTNESIGTC（Cys-Thr-Asn-Glu-Ser-Ile-Gly-Thr-Cys）。
编码该靶向肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述荧光标记靶向肽探针的浓度为280 µmol/L。
利用所述的荧光分子探针在检测非小细胞肺癌中的应用，所述荧光分子探针特异性结合非小细胞肺癌细胞系NCI-H1299。
优选，所述荧光分子探针在体外人痰液脱落细胞中对非小细胞肺癌细胞系NCI-H1299的检测中的应用。
本发明利用噬菌体展示技术探索筛选得到的肿瘤靶向肽的生物学功能及其亲和力、特异性及其靶向性，开发肺癌早期诊断和靶向治疗的多肽分子探针。
利用噬菌体展示随机环七肽库对NCI-H1299细胞进行体内筛选，寻找与肺癌细胞具有高亲和力的多肽氨基酸序列，研制体外诊断肺癌的靶向探针，为非小细胞肺癌的分子诊断和靶向治疗提供实验基础。
本发明所述荧光探针是利用体内噬菌体展示技术筛选得到，又在体外和体内初步验证了其特异性及靶向性，为肺癌早期诊断的研究奠定了一定基础。
采用Ph.D.-C7CTM环七肽库在非小细胞肺癌NCI-H1299细胞荷瘤裸属体内进行了3轮体内筛选，得到异体移植瘤导向肽NSP1，又在体外和体内初步验证了其特异性及靶向性，为肺癌早期诊断的研究奠定了一定基础。
采用Ph.D.-C7CTM环七肽库在非小细胞肺癌NCI-H1299细胞荷瘤裸属体内进行筛选并成功得到了肺癌靶向肽NSP1，又在体外和体内初步验证了其特异性及靶向性，为肺癌早期诊断的研究奠定了一定基础。
通过验证荧光探针FITC- NSP1对肺癌患者痰液标本相关病理组织的结合情况。实现荧光探针FITC- NSP1的临床转化，使其真正应用到肺癌的早期诊断中。此外在现有抗癌药物的基础上增加特异性的靶向作用，在增加最低成本的基础上开发新型靶向药物，具有较强的市场竞争力。
附图说明
图1为NCI-H1299细胞荷瘤裸鼠模型；
图2为3轮体内筛选后噬菌体滴度实验结果；图中：A为第一轮体内筛选后的噬菌体滴度；B为、第二轮体内筛选后的噬菌体滴度；C为第三轮体内筛选后的噬菌体滴度；
图3为免疫组织化学鉴定噬菌体肽库体内分布结果；图中：（1）为三轮筛选中肿瘤组织的噬菌体含量；（2）为噬菌体肽库体内分布（×200），（2）中：从左到右分别为第三轮筛选中肿瘤组织、心脏、肺、肝脏、肾脏的染色图，第一行为HE染色，第二行为IHC染色，均为放大200倍图像；
图4为ELISA检测单克隆噬菌体特异性亲和力检测结果；
图5为MTT鉴定荧光探针的细胞毒性实验结果；图中：A为MTT检测不同浓度多肽对细胞增值的影响；B为多肽作用的细胞生长曲线图；
图6为荧光探针对NCI-H1299细胞迁移能力的影响，NCI-H1299细胞损伤修复图（×200）；
图7为细胞免疫荧光鉴定靶向肽与NCI-H1299细胞的结合实验结果图；图中：A为靶向肽FITC- NSP1与不同细胞结合的免疫荧光图（×200），图中：左列：单独FITC图像；中列：单独DAPI图像；右列：二者重叠图像；箭头所示为靶向肽FITC- NSP1结合的NCI-H1299细胞，图像均在200倍下拍摄；B为靶向肽和对照肽与NCI-H1299细胞结合成像图（×200）；
图8为FITC- NSP1浓度（C）与吸光度（A）值的关系；
图9为FITC- NSP1的灰度值24h变化（浓度为280 µmol/L）；
图10为FITC- NSP1探针注入后2.5h肿瘤区的荧光分子成像，图中：A.可见光拍摄的照片；B.灰阶图；C.荧光图；D.伪彩图；
图11为FITC- NSP1探针注入后2.5h离体器官及肿瘤组织的荧光分子成像，图中：A组可见光拍摄照片；B组灰阶图；C组伪彩图，从左到右每一列依次为肿瘤组织、肝脏（合并胆囊）、肾脏、脾脏和心脏；
图12为本发明所述靶向标记非小细胞肺癌的荧光分子探针FITC-NSP1的筛选获得的技术路线图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
结合以下具体实施例对本发明作进一步详细的说明，除另外定义，本文所用的所有科技术语一般为本发明所属领域普通技术人员所通常理解的含义。本文所用的命名和实验方法是公知的，并且在本领域中常规使用。使用标准技术进行的所有操作通常是根据仪器耗材生产商的产品说明书和常规技术要求以及本文中提供的参考资料进行的。
噬菌体展示环七肽库试剂盒（Ph.D.-C7CTM）购自New England Biolabs（北京）有限公司，包括噬菌体展示环七肽库（1×1011puf/ml）和-96gⅢ测序引物（1pmol/μl）；SPF级BALA/C(nu/nu)裸鼠（3~4周龄，体重15-18g）购自北京维通利华实验动物技术有限公司（许可证：SCXK（京）2016-0006）；人非小细胞肺癌NCI-H1299细胞株购自武汉普诺赛生命科技有限公司；
M13噬菌体单链基因组DNA快速提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司；辣根过氧化物酶标记的抗M13单克隆抗体（HRP/Anti-M13）购自美国GE Healthcare公司；Matrigel基底膜基质胶购自美国BD公司；兔抗M13噬菌体抗体、羊抗兔-HRP标记二抗均购自美国Sigma公司；多肽及荧光探针：NSP1、FITC-NSP1、FITC-svNSP1均由杭州中肽生化有限公司合成；1640培养基、DMEM培养基、澳洲特级胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶（含EDTA）、双抗（青霉素-链霉素混合液）、二甲基亚砜（DMSO）、无菌磷酸盐缓冲液（PBS）、聚乙二醇8000（PEG-8000）、牛血清白蛋白（BSA）、曲拉通X-100（TritonX-100)、异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、二甲基甲酰胺（DMF）、吐温-20（Tween-20）、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）、4%多聚甲醛、TMB显色液、TMB终止液、DAB试剂盒、Mayer氏苏木素染色液、MTT细胞毒性检测试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。
本发明具体实施例中所用到的细胞的培养方法、荷瘤裸鼠模型的制备方法与专利：201410824193.2，发明名称为膀胱癌移行细胞癌细胞系BIU87特异性结合的多肽及其应用中所记载的方法相同。
一、噬菌体肽库的体内筛选
方法：将人非小细胞肺癌NCI-H1299细胞接种于裸鼠前肢腋窝部位，制备荷瘤裸鼠模型。
（1）取10μl Ph.D.-C7CTM噬菌体展示肽库，用TBS稀释至200μl；
（3）取生长状态良好的荷瘤裸鼠一只，用4%水合氯醛麻醉；
（3）用1ml注射器抽取200μl稀释好的噬菌体肽库（约2×1010pfu），从尾静脉缓慢注入裸鼠体内，循环15min；
（4）将裸鼠固定在解剖台上，打开胸、腹腔，暴露心脏、肝脏，检查裸鼠的状态，确保无大血管破裂和大面积出血，裸鼠处于深度麻醉状态。用10ml医用注射器抽取37℃预热的生理盐水，将针头插入左心室1-3mm，轻轻推动注射器活塞，待心脏变白膨胀时，用针头在左心房处扎一个孔，使血液缓缓流出，继续匀速推动注射器活塞注入生理盐水，等到裸鼠肝脏和眼睛均变白时，停止灌注；
（5）分离肿瘤组织，将其称重后研磨，TBS冲洗3次，加入1ml 0.2M Glycine-HCl洗脱液(pH2.2)，4℃温和震荡洗脱8～10min，再加入200μl 1M Tris-HCl中和缓冲液（PH9.0），4℃、3500rpm离心5min，回收上清液，此为组织细胞表面结合的噬菌体。向沉淀物中加入1ml0.1% TritonX-100，4℃作用2小时，释放出组织细胞内化的噬菌体，二者混合为洗脱得到的全部噬菌体；
（6）取10μl上述噬菌体溶液扩增以用于下一轮筛选。取对数生长期的 E.coli ER2738菌液200μl，加入20ml的LB培养基中，为对数前期菌液；
（7）将筛选后洗脱得到的全部噬菌体液加入其中，37℃、260rpm震荡培养4.5-5h；
（8）将上述扩增液于4℃、10000rpm离心15min，将上清液转移至新的50ml离心管中，同样条件再次离心后，小心吸取上部80%的上清液至新的离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl溶液，4℃静置过夜；
（9）离心PEG/NaCl沉淀物，弃去上清液，再次同等条件离心，轻轻吸去残余液体；
（10）1ml TBS重悬上述沉淀物，转移至无菌EP管中，4℃、10000rpm离心5min，上清液转移至新的EP管中，加入1/6体积的PEG/NaCl溶液进行第二次沉淀，置于0°冰水混合物中孵育1h；
（11）孵育完毕，于4℃、10000rpm离心10min，弃去上清液，再次离心，弃掉残余液体；
（12）200μlTBS重悬沉淀物，4℃、1000rpm离心1min，弃去残余不溶物，转移上清液至新的EP管中，即为扩增得到的噬菌体液，作为下一轮筛选的噬菌体肽库。结果：注射NCI-H1299肺癌细胞2-3周后即可长出肉眼可见的瘤状肿块，逐日观察记录肿块直径，待肿块长至0.5-1cm，活动度较好，无化脓破溃即可用于体内筛选，成瘤率达90%左右。
3轮体内筛选的结果显示，如图2所示，噬菌体回收率随着每一轮的筛选不断提高，第3轮筛选结束时，噬菌体从肿瘤组织中的回收率是首轮的341.3倍，富集效果明显。
二、免疫组织化学鉴定噬菌体肽库体内分布
方法：
（1）将分离的组织用4%多聚甲醛过夜固定后，常规石蜡包埋，切成4μm薄片置于载玻片上。
（2）将切片放置在60℃恒温箱中烘烤1h。
（3）脱蜡和水化：二甲苯Ⅰ浸泡10min，二甲苯Ⅱ浸泡10min，无水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇依次浸泡切片，每次5min，用蒸馏水冲洗切片，PBS清洗切片3次，每次2min。
（4）抗原修复：将切片置于0.01M 柠檬酸钠缓冲液（pH6.0）中，煮沸修复20min，取出容器后室温冷却，PBS清洗5min×3次。
（5）滴加3%过氧化氢溶液于切片组织部位，37℃湿盒放置10min，以阻断内源性过氧化物酶活性，PBS清洗5min×3次。
（6）滴加5% BSA溶液，完全覆盖切片上的组织，湿盒室温封闭30min。
（7）去掉封闭液，滴加1:500稀释的兔抗M13噬菌体抗体，完全覆盖切片上的组织，4℃冰箱过夜。
（8）次日，用PBS清洗切片，滴加1:200稀释的羊抗兔-HRP标记二抗，37℃湿盒孵育30min后，PBS清洗5min×3次。
（9）切片上滴加DAB溶液，显微镜下连续观察，染色合适后用蒸馏水冲洗终止染色。
（10）苏木素复染，细胞核变蓝色即可终止，用蒸馏水冲洗干净。
（11）1%盐酸酒精分化数秒后，蒸馏水冲洗。
（12）脱水透明：依次用70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇、无水乙醇浸泡5min，再用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ浸泡5min。
（13）滴加适量中性树脂封片，室温静置干燥24h。
结果：免疫组织化学结果如图3所示，由图3（1）可以看出肿瘤组织中富集的噬菌体随每一轮体内筛选的进行而增加，但不结合正常组织。由图3（2）可以看出与肿瘤组织相比，由于噬菌体经肝、肾代谢，可见肝脏，肾脏结合大量非特异性噬菌体，而心肺组织只有少量非特异性吸附。
三、ELISA法鉴定阳性噬菌体克隆
方法：
（1）第三轮体内筛选后噬菌体滴度测定平板中，随机挑取30个蓝色单克隆噬菌斑，命名为R1、R2、R3...R30，将其分别加入含10ml LB培养基，100μl对数生长期的E.coli ER2738菌液的离心管中，37℃、260rpm震荡培养4.5h后，10000rpm、10min离心两次，取上清液进行滴度测试，调整每个单克隆浓度为1×1010pfu/ml，4°冷藏备用。
（2）将人非小细胞肺癌NCI-H1299细胞与人正常脐静脉内皮细胞HUVEC以密度1×104个/孔分别接种于96孔板，于37℃、5% CO2孵箱培养。
（3）待细胞贴壁、长满单层后，用无血清培养基37℃孵育1h，TBST清洗5min×3次；4%多聚甲醛固定细胞15min，TBST清洗5min×3次；滴加3%过氧化氢于37℃孵育0.5h，TBST清洗5min×3次；5% PBS-BSA封闭1h，TBST清洗5min×3次。
（4）两种细胞分别加入200μl阳性单克隆噬菌体（1×1010pfu/孔）, 每个单克隆噬菌体设3个复孔，空白对照孔加入等量PBS，37℃震荡孵育1h。
（5）TBST清洗1min×3次，加入1∶5000稀释的HRP/Anti-M13单克隆抗体，37℃孵育1h。
（6）TBST清洗1min×3次，加入适量TMB显色及HCL终止液终止，酶标仪检测450nm处OD值。
（7）将NCI-H1299的OD值设为 S、HUVEC的OD值设为 P，采用公式S/P，若比值大于2.5为阳性噬菌体克隆。结果：利用ELISA法对第3轮筛选后随机挑选的30个噬菌体克隆进行初步鉴定，结果见图4，结果显示，有20个噬菌体克隆对NCI-H1299细胞的OD450值显著高于对照HUVEC细胞，S/P比值大于2.5，分别为R1、R3、R4、R7、R8、R9、R11、R12、R14、R15、R16、R17、R20、R22、R23、R24、R25、R28、R29、R3。表明以上单克隆噬菌体与NCI-H1299细胞的亲和力高，为阳性噬菌体克隆。
四、测序及多肽合成方法：取20个阳性单克隆噬菌体悬液，提取噬菌体单链DNA，送北京擎科生物科技有限公司测序，测序引物为5'-CCCTCATAGT-TAGCGTAACG-3'。选择重复率最高的氨基酸序列，在 NCBI/BLAST 网站对其与已知蛋白质的氨基酸序列进行同源性分析，并由杭州中肽生化有限公司合成多肽。
结果：20个阳性克隆的测序结果如下：
R1：CGGCCGAACCTCCACCGCACGTCCCAATAGACTCATTCGTACAAGCAGAGTGAGAATAGAAAGGTACC
R3：CGGCCGAACCTCCACCGCACGAATACTGATACGCCTGCTCACAAGCAGAGTGAGAATAGAAAGGTACC
R4：CGGCCGAACCTCCACCGCAAAAACGCGTAGCAAGACCCGGACAAGCAGAGTGAGAATAGAAAGGTACC
R7：CGGCCGAACCTCCACCGCACGTCCCAATAGACTCATTCGTACAAGCAGAGTGAGAATAGAAAGGTACC
R8：CGGCCGAACCTCCACCGCAAGCCTGATGCGCATTACCCCAACAAGCAGAGTGAGAATAGAAAGGTACC
R9：CGGCCGAACCTCCACCGCAAAGCATATACTTATACTGCGGACAAGCAGAGTGAGAATAGAAAGGTACC
R11：CGGCCGAACCTCCACCGCACGCCTTACCAGGAACCTTCAGACAAGCAGAGTGAGAATAGAAAGGTACC
R12：CGGCCGAACCTCCACCGCACGAATACTGATACGCCTGCTCACAAGCAGAGTGAGAATAGAAAGGTACC
R14：CGGCCGAACCTCCACCGCACGTCCCAATAGACTCATTCGTACAAGCAGAGTGAGAATAGAAAGGTACC
R15：CGGCCGAACCTCCACCGCAAATCATAGTATTCGCCAGCGGACAAGCAGAGTGAGAATAGAAAGGTACC
R16：CGGCCGAACCTCCACCGCACATACTCAGCCCAGTCAGACCACAAGCAGAGTGAGAATAGAAAGGTACC
R17：CGGCCGAACCTGCACCGCAAGAAGGCCACGCCGTATTCGGACAAGCAGAGTGAGAATAGAAAGGTACC
R20：CGGCCGAACCTCCACCGCAAAGCATATACTTATACTGCGGACAAGCAGAGTGAGAATAGAAAGGTACC
R22：cggccgaacctccaccgcacgtcccaatagactcattcgtacaagcagagtgagaatagaaaggtacc
R23：CGGCCGAACCTCCACCGCACATCATATGACTCCCCTCAGGACAAGCAGAGTGAGAATAGAAAGGTACC
R24：CGGCCGAACCTCCACCGCAATACTTAGCATCATGACTCGTACAAGCAGAGTGAGAATAGAAAGGTACC
R25：CGGCCGAACCTCCACCGCACTGCTTATCATGATAACCACTACAAGCAGAGTGAGAATAGAAAGGTACC
R28：CGGCCGAACCTCCACCGCAAGAAGAATTCGACCTAATATTACAAGCAGAGTGAGAATAGAAAGGTACC
R29：CGGCCGAACCTCCACCGCAAAACGTCGAAGAAATAGGAGAACAAGCAGAGTGAGAATAGAAAGGTACC
R30：CGGCCGAACCTCCACCGCACATAGAAGGACCCGTAGCAGCACAAGCAGAGTGAGAATAGAAAGGTACC
20个阳性克隆测序翻译的氨基酸序列：
R1：C T N E S I G T C
R3：C D Q K N S P M C
R4：C P G L A T R F C
R7：C T N E S I G T C
R8：C W G N A H Q A C
R9：C P Q Y K Y M L C
R11：C L K V P G K A C
R12：C D Q K N S P M C
R14：C T N E S I G T C
R15：C P L A N T M I C
R16：C G L T G L S M C
R17：C P N T A W P S C
R20：C P Q Y K Y M L C
R22：C T N E S I G T C
R23：C P E G S H M M C
R24：C T S H D A K Y C
R25：C S G Y H D K Q C
R28：C N I R S N S S C
R29：C S P I S S T F C
R30：C A A T G P S M C
序列CXNXSIXTC重复率最高，经搜索BLAST数据库，未查到与已知氨基酸序列有相似性，提示获得的序列为新的氨基酸序列。化学合成靶向肽CTNESIGTC（命名为NSP1），荧光标记靶向肽FITC-NSP1和随机对照多肽FITC-svNSP1（CENGTISTC）进行后续验证实验，随机对照多肽与靶向肽相比，氨基酸种类相同，空间结构也是环七肽，只有氨基酸组合顺序不同。通过高效液相层析和质谱鉴定，所合成肽纯度≥98%。
五、MTT鉴定荧光探针的细胞毒性
方法：将NCI-H1299细胞悬液以1×104/ml加入96孔酶联反应板中，分别加入浓度为 25μmol/L、50μmol/L、75μmol/L、100μmol/L 的FITC- NSP1和其对照肽 FITC- svNSP1，每组设5个复孔，5% CO2、37℃培养箱分别孵育6、12、24、48小时，最后用酶标仪测量450nm处的吸光度。
结果：MTT结果显示靶向肽FITC- NSP1、对照肽FITC- svNSP1和PBS相比均未明显抑制肿瘤细胞的生长，P>0.05（图5A）；生长曲线所示，3组的NCI-H1299细胞增长速度趋势一致，P>0.05，各组间差异无统计学意义，表明靶向肽不会直接影响肿瘤细胞的生长（图5B）。
六、荧光探针对NCI-H1299细胞迁移能力的影响
方法：将NCI-H1299细胞悬液以1×105/孔的浓度接种于6孔板，分别加入浓度为100μmol/L的靶向肽FITC- NSP1、对照肽FITC- svNSP1各500μL，PBS作为空白对照，每组设2个复孔。将6孔板置于37℃、5%CO2孵箱培养，待细胞生长状态良好且贴壁生长至80%以上时，用1ml无菌枪头在各孔内快速均匀划一条直线，继续培养，动态观察并记录划痕处细胞生长情况。
结果：将靶向肽FITC- NSP1、对照肽FITC- svNSP1分别与NCI-H1299细胞孵育24小时，通过划痕试验结果显示，单位时间内各组细胞表现出相同的生长趋势，结果见图6，结果表明靶向肽及对照肽对NCI-H1299细胞的迁移能力无明显影响。
七、流式细胞术鉴定小分子多肽探针的特异性
方法：将人非小细胞肺癌细胞NCI-H1299、A549和人髓样乳腺癌细胞Bcap-37、人膀胱癌细胞EJ、人正常脐静脉内皮细胞HUVEC制成1×106个/ml的细胞悬液，每种细胞各取两管分别加入25μmol/L 靶向肽FITC- NSP1、对照肽FITC- svNSP1和等量PBS，混匀后室温下避光染色60分钟，使用流式细胞仪进行分析。
结果见表1，结果显示：流式细胞术结果显示靶向肽FITC- NSP1与NCI-H1299细胞、A549细胞结合的平均荧光强度明显高于其他对照细胞。
表1 流式细胞术检测荧光探针与NCI-H1299细胞的结合特异性
Figure 9991DEST_PATH_IMAGE001
注：* 表示与其它细胞相比，靶向肽FITC- NSP1标记NCI-H1299细胞的百分比明显高于其他细胞，P<0.05；Δ表示与对照肽FITC- svNSP1相比，靶向肽标记的NCI-H1299细胞百分比明显增高， P<0.05。
八、细胞免疫荧光鉴定靶向肽与NCI-H1299细胞的结合
方法：将生长状况良好的NCI-H1299、A549、Bcap-37、EJ细胞以1× 105个/孔的密度分别接种于6孔板中培养过夜，4%多聚甲醛固定后，每板各取3孔分别加入25μmol/L的靶向肽FITC- NSP1、对照肽FITC- svNSP1室温避光孵育1h。PBS清洗1min/3次后加入DAPI染液，室温避光孵育10min，用荧光倒置显微镜观察、拍照。
靶向肽FITC- NSP1与不同细胞结合的免疫荧光图如图7A所示，靶向肽和对照肽与NCI-H1299细胞结合成像图如图7B所示，由图可知：细胞免疫荧光结果显示靶向肽FITC-NSP1与NCI-H1299、A549细胞具有强结合力，但与对照细胞的结合力较弱，说明靶向肽FITC-NSP1可以特异性地和非小细胞肺癌细胞结合。且对照肽FITC- svNSP1未与非小细胞肺癌细胞结合。
九、荧光探针FITC- NSP1的光谱及稳定性检测
方法：用去离子水将FITC- NSP1分别稀释成浓度为50、100、150、200、250、280、310、340、 370、400μmol/L的溶液各400μL。用紫外-可见分光光度计在200～800nm范围内测定不同浓度溶液的紫外吸收光谱（高纯水作为参比溶液），每个浓度测试3次，取均值作为结果，绘制吸光度值（A）—浓度(C)曲线，以确定FITC- NSP1探针的最适浓度。
将FITC- NSP1最适浓度的溶液装进EP管中，用100W普通灯泡作光源和热源，将EP管置于灯泡正下方处，接通电源，控制EP管附近区域温度在30～37℃观察24h内不同时间点样品荧光强度的变化，并用Image-Pro Plus7.0测量各时间点图像灰度值并换算成A值。
结果如图8所示，荧光探针FITC- NSP1浓度（C）与吸光度（A）值相关性研究结果显示：在80～280 µmol/L内，A值的增长与C的增加呈线性关系。继续增大浓度至320～440 µmol/L时，探针的A值基本在0.82±0.03内发生微小变化。探针浓度为280 µmol/L时的A值（1.13±0.02）均高于其它浓度，差异有统计学意义（P<0.05）。
荧光探针FITC- NSP1稳定性研究结果如图9所示，结果显示：在最适浓度280 µmol/L时， FITC- NSP1的灰度值24h内始终在60.9±1.0附近变化，说明在同一浓度下，光照、温度对FITC- NSP1探针稳定性的影响不大。
十、光学分子成像鉴定荧光探针在荷瘤裸鼠体内的特异性和靶向性分析
方法：将FITC- NSP1用去离子水稀释成最适浓度，将FITC标记多肽探针从尾静脉注入处于麻醉状态的在体实验组荷瘤裸鼠体内。将注入探针的荷瘤裸鼠置于赛恩思0010AⅠ型小动物活体成像仪中，每隔30min对移植瘤区进行一次荧光分子成像，以确定荧光信号强度最强的时间点。
在最适时间点法处理离体实验组，处死小鼠并分离心、肝、脾、双肾及肿瘤组织并置于背景荧光低不容易反光的黑纸上，用光学分子成像仪分别检测各组织器官的荧光信号并自动输出各荧光分子图像灰度值。
结果：将荧光探针从尾静脉注入荷瘤裸鼠体内，最先观察到尾巴发出较强荧光。30min后，移植瘤隆起部位开始发出微弱的荧光。随着尾巴上荧光的减弱，移植瘤区荧光信号逐渐增强。连续监测结果如图10所示，结果显示：移植瘤区荧光信号强度在荧光探针注入后2.5h达到峰值。随后移植瘤区荧光信号不再增强，从3h开始出现不同程度的衰减。12h只能观察到移植瘤区泛着微弱的淡绿色。
根据上述结果，将离体观察荧光探针在荷瘤裸鼠模型体内分布情况的时间窗定为2.5h。荷瘤裸鼠在注入荧光探针后2.5h被处死，分离心脏、肝脏、脾脏、肾脏及肿瘤组织。荧光分子成像检测结果如图11所示，结果显示：肿瘤组织发出较强荧光信号，正常组织中只有胆囊发出强烈的荧光信号，而肝脏、肾脏、脾脏、心脏几乎观察不到荧光信号，综上说明FITC- NSP1探针能特异性富集在移植瘤组织。
十一、统计学处理：本研究采用SPSS17.0软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(
Figure 989448DEST_PATH_IMAGE002
±ｓ)表示，两组间比较采用t检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
肺癌是最常见的、病死率最高的恶性肿瘤之一，其发病率居各恶性肿瘤之首。目前，肺癌的早期筛查手段有胸部X线检查、低剂量螺旋CT、经胸壁穿刺活组织和支气管镜检查等，但这些检查不能及早发现肿瘤细胞在分子水平的改变。因此，发展新型诊断技术，真正实现肿瘤的早期诊断，成为现代医学研究的热点，将为肺癌患者带来福音。
本发明的成功实施为肺癌早期诊断的研究奠定了一定基础，此外在现有抗癌药物的基础上增加特异性的靶向作用，在增加最低成本的基础上开发新型靶向药物，具有较强的市场竞争力。
本发明将致力于研究具有我国自主知识产权的肺癌分子探针，制备稳定、灵敏、特异、安全的光学分子探针。目前利用噬菌体展示随机环七肽库对NCI-H1299细胞系的筛选还未见报道，因此本研究旨在利用噬菌体展示肽库对非小细胞肺癌NCI-H1299细胞进行体内筛选，寻找与肺癌细胞具有高亲和力的多肽氨基酸序列，制备相应的光学分子探针，通过体内外实验鉴定其结合特异性，阐明靶向荧光探针的特异性、敏感性及其最佳光学分子影像的理论和技术。为实现非小细胞肺癌的早期诊断、靶向治疗新技术提供重要的理论基础。建立肺癌早期、快速、全面的分子影像学诊断的生物技术平台，对于的精准诊断和精准治疗具有重要意义和光明前景。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 山西诺恩精准医疗器械有限责任公司
<120> 一种靶向标记非小细胞肺癌的荧光分子探针及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Cys Thr Asn Glu Ser Ile Gly Thr Cys
1 5
<210> 2
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cggccgaacc tccaccgcac gtcccaatag actcattcgt acaagcagag tgagaataga 60
aaggtacc 68

Claims (5)

1.一种靶向标记非小细胞肺癌的荧光分子探针，其特征在于：所述荧光分子探针为荧光标记靶向肽，命名为FITC-NSP1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，即CTNESIGTC。
2.根据权利要求1所述的一种靶向标记非小细胞肺癌的荧光分子探针，其特征在于：编码该靶向肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的一种靶向标记非小细胞肺癌的荧光分子探针，其特征在于：所述荧光分子探针的浓度为280 µmol/L。
4.利用权利要求1所述的荧光分子探针在检测非小细胞肺癌中的应用，其特征在于：所述荧光分子探针特异性结合非小细胞肺癌细胞系NCI-H1299。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于： 所述荧光分子探针在体外人痰液脱落细胞中对非小细胞肺癌细胞系NCI-H1299的检测中的应用。
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