CN112245406B - 一种低血栓风险的多功能止血纳米粒、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及医药技术领域，公开了一种低血栓风险的多功能止血纳米粒，由以下重量份数的组分组成：带有正电荷的多肽1～4份和抗血小板药物的前药2～4份。本发明还提供了该低血栓风险的多功能止血纳米粒的制备方法。本发明还提供了该低血栓风险的多功能止血纳米粒的应用。本发明可高效地止血、抗感染和促修复，且可以抑制机体内血液的高凝状态，降低形成血栓的风险。

Description

一种低血栓风险的多功能止血纳米粒、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体而言，涉及一种低血栓风险的多功能止血纳米粒、制备方法及其应用。
背景技术
机体出血包括外出血和内出血；当机体出现出血时，会导致失血过多、感染、伤口形成等问题；在损伤不严重情况下，如一些小血管的破坏会刺激机体产生生理性止血；但如果是较为严重的机体损伤，就必须采取一系列措施以达到快速、有效的止血。传统的院前创伤出血止血产品有医用纱布、止血带、伤口贴、止血粉等；但是，此类止血产品仅仅避免了失血过多的问题，缺少抗感染和促进伤口修复的功效，则影响急救效率。
随着材料学与纳米技术的快速发展，一系列阳离子聚合物被广泛的应用到止血策略的构建中，并诞生了以阳离子聚合物为基础的新兴纳米止血剂；该类止血剂既可以避免失血过多的问题，又可以抗感染和促进伤口修复，急救效率较高。
大部分传统止血制剂与新型纳米止血制剂，均以快速激活凝血为止血机制；在局部止血中，凝血功能的快速激活并无相关副作用；然而，对于一些内出血等需要全身给药以止血的情况，这些止血剂虽然能发挥快速止血能力，但同时因对系统凝血功能的提高，静脉给药后，容易引起血栓等高凝风险，严重限制了其临床使用。如何避免因止血制剂全身给药后引起的高凝风险，对于止血剂在临床中经静脉注射止血的应用具有十分重要的临床价值。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种低血栓风险的多功能止血纳米粒，同时具有止血、抗感染与促修复的功能，从而全面应对出血后带来的机体损伤；且可贯序调控血液凝血状态，在止血早期促进血液凝血功能，发挥止血，止血结束后抑制血液凝血功能，降低高凝风险与血栓形成。
本发明的第二个目的在于提供一种低血栓风险的多功能止血纳米粒的制备方法，用于制备该低血栓风险的多功能止血纳米粒。
本发明的第三个目的在于提供一种低血栓风险的多功能止血纳米粒的应用，可以制备涂抹式或静脉注射式止血药物。
本发明的实施例是这样实现的：
一种低血栓风险的多功能止血纳米粒，由以下重量份数的组分组成：带有正电荷的多肽1~4份和抗血小板药物的前药2~4份。
进一步地，所述带有正电荷的多肽为聚赖氨酸(PLL)、聚精氨酸或聚甘氨酸中的一种或多种。
进一步地，所述抗血小板药物的前药为环氧酶抑制剂舒林酸(SUL)。
一种低血栓风险的多功能止血纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
（1）将正电荷的多肽和舒林酸分别溶解于一定量的水溶性有机溶剂中，分别制备得到正电荷多肽预混合溶液和舒林酸预混合溶液；
（2）将制备好的正电荷多肽预混合溶液和舒林酸预混合溶液按比例转移到透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中进行透析，透析一定时间后取出透析袋中溶液，冷冻干燥即可得到多功能止血纳米粒。
进一步地，所述步骤（1）中水溶性有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃、二甲基亚砜或二甲基乙酰胺中的一种。
进一步地，所述步骤（1）中正电荷多肽预混合溶液和舒林酸预混合溶液的浓度均保持为1～20mg/ml。
进一步地，所述步骤（2）中正电荷多肽预混合溶液和舒林酸预混合溶液的比例为1:2~2:1。
进一步地，所述步骤（2）中所述透析使用的透析袋的截留分子量为1000～10000Da。
进一步地，所述步骤（2）中透析的具体工艺参数为：透析过程室温维持在4～25℃，一定时间间隔更换去离子水，直到透析结束。
一种低血栓风险的多功能止血纳米粒的应用，涂抹式或静脉注射式止血药物的应用。
有益效果：
本发明通过将聚赖氨酸和舒林酸制备得到低血栓风险的多功能止血纳米粒，不仅可以对出血伤口高效的止血，同时对出血伤口具有高效的抗感染性能与促修复能力，从而全面应对出血后带来的机体损伤；且可贯序调控血液凝血状态，在止血早期促进血液凝血功能，发挥止血，止血结束后抑制血液凝血功能，降低高凝风险与血栓形成。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例提供的低血栓风险的多功能止血纳米粒的红外谱图；
图2为本发明实施例提供的低血栓风险的多功能止血纳米粒的粒径分布图；
图3为本发明实施例提供的低血栓风险的多功能止血纳米粒的粒径图；
图4为本发明实验例1提供的结果图；
图5和图6为本发明实验例2提供的结果图；
图7为本发明实验例3提供的结果图；
图8为本发明实验例4提供的结果图；
图9为本发明实验例5提供的结果图；
图10和图11为本发明实验例6提供的结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例提供的一种低血栓风险的多功能止血纳米粒的制备及应用进行具体说明。
实施例1
本实施例提供了一种低血栓风险的多功能止血纳米粒，由以下重量份数的组分组成：聚赖氨酸1份和舒林酸2份。
一种低血栓风险的多功能止血纳米粒的制备方法，包括以下步骤：将聚赖氨酸和舒林酸分别溶解于二甲基亚砜中，分别制备得到浓度均保持为20mg/ml的聚赖氨酸预混合溶液和舒林酸预混合溶液；将制备好的聚赖氨酸预混合溶液和舒林酸预混合溶液按比例1:2转移到截留分子量为1000Da的透析袋中进行透析，制得止血纳米粒。透析的具体工艺参数为：室温维持在4℃进行透析；进行每30分钟换一次水，换水4次后，后续每小时换一次水，24小时后取出透析袋中溶液，冷冻干燥得到多功能止血纳米粒。
实施例2
本实施例提供了一种低血栓风险的多功能止血纳米粒，由以下重量份数的组分组成：聚精氨酸4份和舒林酸4份。
一种低血栓风险的多功能止血纳米粒的制备方法，包括以下步骤：将聚精氨酸和舒林酸分别溶解于甲醇中，分别制备得到浓度均保持为4mg/ml的聚精氨酸预混合溶液和舒林酸预混合溶液；将制备好的聚精氨酸预混合溶液和舒林酸预混合溶液按比例1:2转移到截留分子量为4000Da的透析袋中进行透析，制得止血纳米粒。透析的具体工艺参数为：室温维持在25℃进行透析；进行每25分钟换一次水，换水4次后，后续每小时换一次水，24小时后取出透析袋中溶液，冷冻干燥得到多功能止血纳米粒。
实施例3
本实施例提供了一种低血栓风险的多功能止血纳米粒，由以下重量份数的组分组成：聚甘氨酸4份和舒林酸2份。
一种低血栓风险的多功能止血纳米粒的制备方法，包括以下步骤：将聚甘氨酸和舒林酸分别溶解于乙醇中，分别制备得到浓度均保持为1mg/ml的聚甘氨酸预混合溶液和舒林酸预混合溶液；将制备好的聚甘氨酸预混合溶液和舒林酸预混合溶液按比例2:1转移到截留分子量为10000Da的透析袋中进行透析，制得止血纳米粒。透析的具体工艺参数为：室温维持在16℃进行透析；先进行每15分钟换一次水，再进行每30分钟换一次水，后续每小时换一次水，24小时后取出透析袋中溶液，冷冻干燥得到多功能止血纳米粒。
对比例1
本对比例提供了一种止血药剂，包括以下的组分：聚赖氨酸。
对比例2
本对比例中提供了一种止血药剂，包括以下的组分：舒林酸。
对比例3
本对比例提供了一种止血纳米粒，由以下重量份数的组分组成：聚赖氨酸1份和胆酸（CA）2份。
上述止血纳米粒的制备方法，包括以下步骤：将聚赖氨酸和胆酸分别溶解于二甲基亚砜中，分别制备得到浓度均保持为10mg/ml的聚赖氨酸预混合溶液和胆酸预混合溶液；将制备好的聚赖氨酸预混合溶液和胆酸预混合溶液按比例1:2转移到透析袋中进行透析，制得止血纳米粒。透析的具体工艺参数为：采用25℃去离子水透析；先进行每15分钟换一次水，再进行每30分钟换一次水，后续每小时换一次水，24小时后取出透析袋中溶液，冷冻干燥得到止血纳米粒。
实验前准备
（1）大鼠：SD大鼠，清洁级别，雌雄随机，6~8周龄。
（2）提取大鼠外周血全血，再将外周血加缓冲液离心15min，取上清即制得富含血小板的血清。
实验例1
将实施例1制得的多功能止血纳米粒试样、对比例1和对比例2的试样及生理盐水分别加入到相同体积的提取出的富含血小板的血清中，分别使用相差显微镜和扫描电镜观察各试样对血小板的聚合能力；结果如图4所示，从图4中可看出实施例1制得的多功能止血纳米粒试样对血小板的聚合能力最强。
实验例2
将实施例1制得的多功能止血纳米粒试样用于体外出血的治疗，取大鼠于其肝脏与股动脉处均切口5mm，将实施例1制得的多功能止血纳米粒试样、对比例1和对比例2的试样及生理盐水分别滴注50uL于肝脏或股动脉处的切口处，计录每个试样的止血时间；结果如图5和图6所示，从图5中可看出实施例1制得的多功能止血纳米粒试样与对比例1、对比例2和生理盐水相比对肝脏止血所用时间明显较短；从图6中可看出实施例1制得的多功能止血纳米粒试样与对比例1、对比例2和生理盐水相比对股动脉止血所用时间明显较短。
实验例3
将大鼠后背切口1cm，且于切口上涂满金黄色葡萄球菌，将实施例1制得的多功能止血纳米粒试样、对比例1及生理盐水分别涂覆于大鼠涂满金黄色葡萄球菌的后背伤口上，分别检测1天、3天、6天、9天和12天后切口上金黄色葡萄球菌的量；结果如图7所示，从图7中可看出实施例1制得的多功能止血纳米粒试样与对比例1和生理盐水相比对金黄色葡萄球菌的抑制能力最强。
实验例4
使用相同大小的培养皿分别培养金黄色葡萄球菌（S.aureus）、大肠杆菌（E-Coli）和绿脓杆菌（P-Aeruginosa）；将实施例1制得的多功能止血纳米粒试样、对比例1和对比例2的试样及生理盐水分别涂覆于相同大小的涂片上；每个细菌的培养皿中均放置上述4个涂片，以观察各试样对三种细菌的抑制作用；结果如图8所示，从图8中可看出实施例1制得的多功能止血纳米粒试样对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌均具有较好的抑制作用。
实验例5
将实施例1制得的多功能止血纳米粒试样、对比例1、对比例2和对比例3的试样及生理盐水分别对大鼠进行尾静脉注射，分别检测注射后第一小时、第四小时的大鼠血液中的纤维蛋白原和D-2聚体的浓度及注射后第四小时的大鼠血液中的血栓素A2的浓度；结果如图9所示，从图9中可看出实施例1制得的多功能止血纳米粒试样与对比例1、对比例2和对比例3制得的试样及生理盐水相比的血液高凝状态较低。
实验例6
将实施例1制得的多功能止血纳米粒试样、对比例1和对比例3的试样及生理盐水分别对大鼠进行尾静脉注射，将大鼠下腔静脉结扎产生血栓，查看情况并称量各血栓的重量，结果如图10和图11所示，从图10和图11中可明显看出注射实施例1制得的多功能止血纳米粒试样所形成的血栓远远小于注射对比例1和对比例3制得的试样所形成的血栓。
综上，本发明的低血栓风险的多功能止血纳米粒与血小板具有较强的聚合能力，能与血小板特异性结合并且引起血小板的聚集，止血时间较短，且可以靶向分布富集于出血部位，从而具有高效的止血性能；本发明的低血栓风险的多功能止血纳米粒对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌均有较好的抑制作用，从而对出血伤口具有较好的抗感染性能；本发明的低血栓风险的多功能止血纳米粒形成的血液高凝状态较低，且形成的血栓较小，从而在止血的同时可以抑制机体内血液的高凝状态，降低形成血栓的风险。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种低血栓风险的多功能止血纳米粒，其特征在于，由以下重量份数的组分组成：带有正电荷的多肽1~4份和抗血小板药物的前药2~4份；
所述带有正电荷的多肽为聚赖氨酸、聚精氨酸中的一种或多种；
所述抗血小板药物的前药为环氧酶抑制剂舒林酸。
2.一种低血栓风险的多功能止血纳米粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将权利要求1所述的正电荷的多肽和舒林酸分别溶解于一定量的水溶性有机溶剂中，分别制备得到正电荷多肽预混合溶液和舒林酸预混合溶液；
（2）将制备好的正电荷多肽预混合溶液和舒林酸预混合溶液按比例转移到透析袋中，磁力搅拌下在去离子水中进行透析，透析一定时间后取出透析袋中溶液，冷冻干燥即可得到多功能止血纳米粒。
3.根据权利要求2所述的低血栓风险的多功能止血纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中水溶性有机溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、四氢呋喃、二甲基亚砜或二甲基乙酰胺中的一种。
4.根据权利要求2所述的低血栓风险的多功能止血纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中正电荷多肽预混合溶液和舒林酸预混合溶液的浓度均保持为1～20mg/ml。
5.根据权利要求2所述的低血栓风险的多功能止血纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中正电荷的多肽预混合溶液和舒林酸预混合溶液的比例为1:2~2:1。
6.根据权利要求2所述的低血栓风险的多功能止血纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中所述透析使用的透析袋的截留分子量为1000～10000 Da。
7.根据权利要求2所述的低血栓风险的多功能止血纳米粒的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中透析的具体工艺参数为：透析过程室温维持在4～25℃，一定时间间隔更换去离子水，直到透析结束。
8.一种权利要求1所述的低血栓风险的多功能止血纳米粒或按权利要求2-6任一项所述制备方法制得的多功能止血纳米粒在制备涂抹式或静脉注射式止血药物中的应用。
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