CN112237631A - 乙酰胆碱通路调节剂在治疗癌症中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及乙酰胆碱通路调节剂在治疗癌症中的用途。具体地，本发明提供了在有需要的受试者(例如，人)中治疗癌症的方法，包括向受试者给药治疗有效量的乙酰胆碱通路调节剂。该受试者此前可接受过至少一种抗癌治疗，或者对至少一种抗癌治疗有抗性，或患有在至少一种抗癌治疗后复发或进展的癌症。本发明还提供了用于在有需要的受试者中治疗癌症的组合，其包含：a)乙酰胆碱通路调节剂；和b)抗肿瘤剂。

Description

乙酰胆碱通路调节剂在治疗癌症中的用途

技术领域

本发明涉及有需要的受试者中治疗癌症的方法，且更具体地涉及乙酰胆碱通路调节剂在治疗癌症中的用途，所述受试者对至少一种抗癌治疗有抗性，或患有在接受至少一种抗癌治疗后复发或进展的癌症。

背景技术

癌症是在发达国家中造成死亡的主要原因，其中仅在美国每年诊断出超过一百万人，每年死亡人数超过50万人。总的来说，估计至少有三分之一的人会在一生中产生某种形式的癌症。有超过200种不同的组织病理学类型的癌症，其中四种(乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌和前列腺癌)占美国全部新发病例的一半以上。(Jemal等人,Cancer J.Clin.,53,5-26(2003))。

癌症的具体治疗方法除了传统的手术、放疗和化疗外，靶向治疗和免疫治疗目前也取得了巨大的进展。然而，原发耐药和继发耐药最终使靶向治疗陷入被动局面。

此前的研究认为，肿瘤耐药是癌症遗传进化导致的：由于肿瘤的异质性，肿瘤内存在一小部分细胞亚群，称为“残存细胞”或者“药物耐受细胞”，在药物的暴露下会通过非遗传机制进入休眠状态而获得生存，而后期会进化出传统的遗传突变引起肿瘤耐药和复发。

因此，目前对于适合于治疗或预防癌症的化合物存在迫切的需求，特别是对于对已知抗癌治疗产生了耐受性的癌症的治疗存在迫切的需求。

发明内容

在一方面，本发明涉及在有需要的受试者中治疗癌症的方法，其包括向所述受试者给药治疗有效量的乙酰胆碱通路调节剂。

在一些实施方案中，所述受试者此前接受过至少一种抗癌治疗。在一些实施方案中，所述受试者对至少一种抗癌治疗有抗性，或患有在接受至少一种抗癌治疗后复发或进展的癌症。

在另一方面，本发明涉及用于在有需要的受试者中治疗癌症的组合，其包含：a)乙酰胆碱通路调节剂；和b)抗肿瘤剂，其中所述抗肿瘤剂选自化疗药物和靶向药物。

在另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含：a)乙酰胆碱通路调节剂；和b)抗肿瘤剂，其中所述抗肿瘤剂选自化疗药物和靶向药物。

在另一方面，本发明涉及试剂盒，其包含：a)包含乙酰胆碱通路调节剂的第一组合物；和b)包含抗肿瘤剂的第二组合物，其中所述抗肿瘤剂选自化疗药物和靶向药物。

在另一方面，本发明涉及治疗癌症的方法，包括给药乙酰胆碱通路调节剂和抗肿瘤剂的组合。

在另一方面，本发明涉及乙酰胆碱通路调节剂，其用于治疗癌症。

在另一方面，本发明涉及乙酰胆碱通路调节剂在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

在一些实施方案中，所述癌症为对至少一种抗癌治疗有抗性，或为在至少一种抗癌治疗后复发或进展的癌症。

在另一方面，本发明涉及包含乙酰胆碱抑制剂的药物，其中所述乙酰胆碱通路调节剂用于与抗癌药组合施用。

在另一方面，本发明涉及乙酰胆碱作为生物标记物的用途，其中该生物标记物用于鉴定对抗癌疗法产生了抗性的受试者，或用于鉴定在经受抗癌疗法后产生癌症的复发或进展的受试者。

在另一方面，本发明涉及检测乙酰胆碱的试剂在制备用于鉴定对抗癌疗法产生抗性的受试者、或用于鉴定在经受抗癌疗法后产生癌症的复发或进展的受试者的试剂盒中的用途。

附图简述

图1显示了非小细胞肺癌细胞系的亲本细胞和药物耐受细胞对EGFR突变靶向药的敏感性。图1A为将非小细胞肺癌亲本细胞诱导为药物耐受细胞的方法示意图。图1B为细胞活力实验结果，在非小细胞肺癌细胞系PC9的药物耐受细胞模型中，药物耐受细胞对靶向药(吉非替尼和奥希替尼)的敏感性与亲本细胞相比显著降低。图1C为细胞活力实验结果，在非小细胞肺癌细胞系HCC827的药物耐受细胞模型中，药物耐受细胞对靶向药(吉非替尼和奥希替尼)的敏感性与亲本细胞相比显著降低。

图2显示了代谢组学分析非小细胞肺癌细胞系亲本细胞和药物耐受细胞中的乙酰胆碱含量。根据图2，乙酰胆碱在PC9药物耐受细胞中的含量显著高于亲本细胞。

图3A和图3B分别显示了PC9裸鼠模型和PDX-217645模型中乙酰胆碱的含量，表明在PC9裸鼠模型和PDX模型的药物耐受组织中的乙酰胆碱含量均显著升高。

图4显示了PC9亲本细胞和药物耐受细胞培养基中的乙酰胆碱的含量。和PC9亲本细胞相比，药物耐受细胞分泌至细胞外的乙酰胆碱含量显著升高。

图5显示了具有EGFR突变的非小细胞肺癌患者在靶向治疗前后的血浆中乙酰胆碱含量。图5A显示患者在靶向治疗前和靶向治疗后血浆中乙酰胆碱的含量的平均值。图5B显示在8例患者在靶向治疗前和靶向治疗后血浆中乙酰胆碱的含量的变化。图5A和5B的结果显示，具有EGFR突变的非小细胞肺癌患者在靶向治疗后血浆中乙酰胆碱的含量高于靶向治疗前血浆中乙酰胆碱的含量。

图6显示了乙酰胆碱代谢通路中关键因子在蛋白水平的表达变化。图6A显示胆碱乙酰转移酶(ChAT)在非小细胞肺癌细胞系的药物耐受模型中均上调。图6B显示乙酰胆碱酯酶(ACHE)在蛋白水平下调。

图7显示了药物耐受细胞中Wnt信号通路的激活。图7A为PC9亲本细胞和药物耐受细胞的RNAseq结果，可见药物耐受细胞中Wnt配体和Wnt通路靶基因著高于亲本细胞。图7B为实时荧光定量PCR结果，可见PC9药物耐受细胞中的Wnt配体和Wnt通路靶基因的表达显著高于亲本细胞。

图8显示了外源乙酰胆碱对非小细胞肺癌细胞系HCC827亲本细胞中Wnt信号通路的影响。其中用不同浓度乙酰胆碱处理HCC827亲本细胞7天，实时荧光定量PCR结果显示，Wnt配体以及Wnt通路靶基因表达显著上调，包括与转移相关的S100A4和KLF4，与抗凋亡相关的BCL2L1。提示外源乙酰胆碱可以促进非小细胞肺癌细胞系亲本细胞中Wnt通路的激活。

图9显示了外源乙酰胆碱对非小细胞肺癌细胞系PC9亲本细胞对药物敏感性的影响。图9A为细胞活力实验结果，可见外源添加乙酰胆碱显著降低PC9亲本细胞对靶向药吉非替尼的敏感性。图9B为细胞活力实验结果，可见外源添加乙酰胆碱显著降低PC9亲本细胞对靶向药奥希替尼的敏感性。

图10显示了Wnt通路抑制剂可抑制外源乙酰胆碱对PC9亲本细胞药物敏感性的影响。细胞活力检测结果表明，添加Wnt通路抑制剂LGK974可显著降低PC9细胞的活力，从而逆转乙酰胆碱对PC9亲本细胞药物敏感性的影响。

图11为细胞活力实验结果。其中图11A显示，shChAT敲低的PC9细胞对奥希替尼的敏感性显著增加。图11B显示，shChAT敲低的HCC827细胞对吉非替尼的敏感性显著增加。

图12为克隆形成实验结果。其中图12A显示，和对照组细胞相比，shM3R和shVAChT敲低的PC9细胞在2μM奥希替尼处理下，药物耐受细胞形成能力降低。图12B显示，和对照组细胞相比，shM3R和shVAChT敲低的HCC827细胞在2μM奥希替尼处理下，药物耐受细胞形成能力降低。

图13显示了乙酰胆碱M型受体抑制剂对药物耐受细胞的抑制作用。图13A显示了乙酰胆碱M型受体的抑制剂(包括达非那新、甲磺酸苯扎托品、伊索拉定和甲基东莨菪碱)对奥希替尼诱导的PC9药物耐受细胞的影响，其中可见M型受体的抑制剂显著降低了在奥希替尼存在下的细胞活力，表明其可显著抑制奥希替尼诱导的药物耐受细胞的形成，但对亲本细胞没有影响。图13B显示了乙酰胆碱M型受体的抑制剂(包括达非那新和甲磺酸苯扎托品)对不同靶向药物(包括吉非替尼、厄洛替尼和CO1686)诱导的PC9药物耐受细胞的影响，其中可见M型受体的抑制剂显著降低了在吉非替尼、厄洛替尼或CO1686存在下的细胞活力，可见M型受体的抑制剂可显著抑制由不同EGFR靶向药物诱导的药物耐受细胞的形成，但对亲本细胞没有影响。

图14显示了乙酰胆碱N型受体抑制剂对药物耐受细胞的抑制作用。具体地，图14显示了乙酰胆碱N型受体的抑制剂(MG624、美卡拉明和泮库溴铵)对不同靶向药物(包括奥希替尼、吉非替尼、厄洛替尼和CO1686)诱导的PC9药物耐受细胞的影响，其中可见N型受体的抑制剂显著降低了在不同靶向药物存在下的细胞活力，表明N型受体的抑制剂可显著抑制由不同EGFR靶向药物诱导的药物耐受细胞的形成，但对亲本细胞没有影响。

图15显示了乙酰胆碱通路不同靶点的抑制剂对药物耐受细胞的抑制作用。具体地，图15显示了乙酰胆碱转运体抑制剂Vesamicol和胆碱转运体抑制剂半胆碱基-3对不同靶向药物(包括奥希替尼和吉非替尼)诱导的PC9药物耐受细胞的影响，其中可见Vesamicol和半胆碱基-3显著降低了在不同靶向药物存在下的细胞活力，表明乙酰胆碱转运体抑制剂和胆碱转运体抑制剂可显著抑制由不同EGFR靶向药物诱导的药物耐受细胞的形成，但对亲本细胞没有影响。

图16显示了乙酰胆碱通路调节剂对PDX体外细胞模型中的作用。具体地，图16显示了乙酰胆碱M型受体抑制剂达非那新显著降低了PDX组织分离的肿瘤细胞在奥希替尼诱导下的药物耐受细胞的形成。

图17显示了乙酰胆碱通路不同靶点的抑制剂对ALK基因融合非小细胞肺癌细胞系药物耐受细胞的抑制作用。具体地，图17显示了乙酰胆碱M型受体抑制剂达非那新、乙酰胆碱转运体抑制剂Vesamicol和胆碱转运体抑制剂半胆碱基-3对不同ALK突变靶向药物(包括色瑞替尼和艾乐替尼)诱导的H2228药物耐受细胞的影响，其中可见不同的乙酰胆碱通路调节剂显著降低了在不同ALK靶向药物存在下的细胞活力，表明乙酰胆碱M型受体抑制剂、乙酰胆碱转运体抑制剂和胆碱转运体抑制剂可显著抑制由不同ALK靶向药物诱导的药物耐受细胞的形成，但对亲本细胞没有影响。

图18显示了乙酰胆碱M3型受体抑制剂达非那新对其他肿瘤(包括乳腺癌、结直肠癌和黑色素瘤)细胞系的药物(包括化疗药和靶向药)耐受细胞的抑制作用。具体地，图18显示了乙酰胆碱M型受体抑制剂达非那新可显著抑制在不同药物(包括化疗药和靶向药)存在下其他肿瘤(包括乳腺癌、结直肠癌和黑色素瘤)细胞系的药物耐受细胞的形成，但对亲本细胞无显著抑制作用。

图19显示了乙酰胆碱通路调节剂对药物耐受细胞维持阶段的作用。具体地，图19A显示了达非那新对已形成的药物耐受细胞在奥希替尼存在下的细胞活力。图19B显示了达非那新对已形成的药物耐受细胞的活力的影响。结果表明达非那新能够有效抑制药物耐受细胞的维持。

图20-22显示了乙酰胆碱M型受体抑制剂达非那新对体内肿瘤复发的抑制作用。其中选择非小细胞肺癌细胞系PC9建立裸鼠皮下移植瘤模型，待肿瘤生长到一定体积，将裸鼠随机分为4组：第1组为对照组；第2组为单加达非那新组；第3组为单加奥希替尼组；第4组为奥希替尼和达非那新联合组，其中在第9天后停止奥希替尼，后续单加达非那新；第5组中在前9天单独给药奥希替尼，并在第9天后停止奥希替尼，后续单加达非那新；第6组中在前9天联合给药奥希替尼和达非那新，在第9天后停止奥希替尼和达非那新。

图20中显示，经过9天的药物治疗，在第3组与第4组中肿瘤体积迅速缩小至稳定，形成微小残留病灶。经过20天的治疗，与第3组相比，第4组达非那新处理组的裸鼠肿瘤复发速度显著降低。图20A为肿瘤体积统计图，可见第4组奥希替尼停药后继续给予达非那新治疗能够显著抑制肿瘤的复发。图20B为肿瘤重量统计图，可见第4组继续奥希替尼停药后给予达非那新治疗的肿瘤重量显著降低。图20C为肿瘤大小示意图。

图21中显示，在单给奥希替尼9天后，肿瘤体积迅速缩小，在撤掉药物后观察约20天，可见第3组在药物撤掉后肿瘤迅速复发，但是在第5组中肿瘤复发较慢，肿瘤体积显著低于第3组。

图22中显示，在第3组与第6组中，肿瘤体积迅速缩小，在撤掉药物后观察约20天，可见第3组在药物撤掉后肿瘤迅速复发，但是第6组在撤掉奥希替尼后，肿瘤复发较慢，肿瘤体积显著低于单给奥希替尼组。

图23显示了乙酰胆碱M型受体抑制剂达非那新联合奥希替尼对小鼠药物响应和生存期的影响。具体地，图23A显示奥希替尼与达非那新联合组的肿瘤体积显著小于单给奥希替尼组。同时，图23B显示了奥希替尼与达非那新联合组的小鼠生存期显著高于单给奥希替尼组。

定义

如本文所用，当术语“约”与数字范围结合使用时，它通过扩大在所述数值之上和之下的边界来修改该范围。一般而言，术语“约”在本发明中用于将数值修改为高于和低于所述值的10％的变化。

如本文所用，术语“治疗”及其相关表述表示治疗性治疗。当涉及具体的病症时，治疗表示：(1)改善该病症或该病症的一个或多个生物学表现，(2)干扰(a)引起或造成该病症的生物学级联中的一种或多个点，或(b)该病症的一个或多个生物学表现，(3)减轻与该病症相关的一种或多种症状、作用或副作用或与该病症或其治疗相关的一种或多种症状、作用或副作用，或者(4)减缓该病症的进展，或者减缓该病症的一个或多个生物学表现。

如本文所用，“预防”是指预防性给药以基本上减少病症或其生物学表现的可能性或严重性，或者以延缓这种病症或其生物学表现的发作。本领域技术人员将理解“预防”不是绝对术语。例如，当受试者被认为处于患癌症的高风险时，例如当受试者具有强癌症家族史时或者当受试者已经暴露于致癌物质时，预防性治疗是合适的。

如本文所用，术语“有效量”表示引发例如研究者或临床医师所追求的组织、系统、动物或人的生物学或药学响应的药物或药剂的量。此外，术语“治疗有效量”表示，与没有接受该量的相应受试者相比，引起疾病、病症或副作用的改进治疗、治愈、预防或减轻的量，或者使疾病或病症的进展速率降低的量。该术语还包括在其范围内有效地增强正常生理功能的量。

如本文所用，“药学上可接受的”是指不是生物学不希望或其他方面不希望的物质，例如，可将该物质掺入给药至患者的药物组合物中而不会产生任何显著不希望的生物学效应，也不会与该组合物中所含的任何其他成分以有害方式相互作用。药学上可接受的载剂(例如，载体、佐剂和/或其他赋形剂)已优选地符合毒理学和成品试验的所需标准和/或已被包括在美国食品和药品管理局制定的非活性成分指南中。

“药学上可接受的盐”包括，例如，无机酸的盐和有机酸的盐。盐的实例可包括盐酸盐、磷酸盐、焦磷酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、亚磺酸盐、硝酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、富马酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、乳酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、2-羟乙基磺酸盐、苯甲酸盐、水杨酸盐、硬脂酸盐和烷酸盐(例如乙酸盐、HOOC-(CH₂)_n-COOH，其中n为0-4)。此外，如果以酸加成盐形式获得本文的化合物，则该游离碱可通过将所述酸盐的溶液碱化获得。相反地，如果本文的化合物是游离碱，则加成盐(特别是药学上可接受的加成盐)可通过将所述游离碱溶于合适的有机溶剂中并用酸处理该溶液进行制备，其根据由碱化合物制备酸加成盐的常规操作。本领域技术人员将理解可用于制备无毒药学上可接受的加成盐的各种合成方法。

如本文所用，“受试者”是指动物，例如哺乳动物(包括人)，其已为或将为治疗、观察或实验的对象。本文所述的方法可用于人的疗法和/或兽医应用。在一些实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在一个实施方案中，所述受试者是人。

如本文所用，术语“抑制”表示生物活性或生物过程的基线活性的降低。

发明详述

本发明人首次发现在针对抗癌药具有耐受性的药物耐受细胞中，神经递质乙酰胆碱的含量显著上调，并且外源乙酰胆碱能够显著降低癌细胞对抗癌药的敏感性。

本发明人进一步发现增加的乙酰胆碱能够激活癌细胞中的Wnt通路，且添加Wnt通路抑制剂能够逆转乙酰胆碱对癌细胞的药物敏感性的影响，进而表明乙酰胆碱通过激活癌细胞中的Wnt通路促进了药物耐受细胞的形成与维持。

在此基础上，本发明人首次证实了乙酰胆碱合成与分泌途径的相关抑制剂，即乙酰胆碱通路调节剂可有效抑制药物耐受细胞的产生，逆转癌细胞对抗肿瘤剂的耐受性，同时有效地抑制体内肿瘤的复发。

I.乙酰胆碱通路调节剂

如本文所用，“乙酰胆碱”是指由式CH₃COO(CH₂)₂N⁺(CH₃)₃表示的神经递质，其从副交感神经或运动神经末梢释放。乙酰胆碱分布在整个神经元中，但浓度在神经末梢最高。

神经递质乙酰胆碱的形成由胆碱乙酰转移酶(ChAT)催化，其在胆碱能神经元的突触前神经末梢中将乙酰基辅酶A的乙酰基转移至胆碱。通过囊泡乙酰胆碱转运体(VAChT)将乙酰胆碱包装到突触小泡中，然后以钙依赖性方式释放。乙酰胆碱特异性结合烟碱或毒蕈碱受体(AChR)以将信息传递给突触后神经元。乙酰胆碱的作用通过被乙酰胆碱酯酶水解成乙酸和胆碱而终止。然后大部分胆碱被运回到突触前末端，作为乙酰胆碱生物合成的前体之一再循环。该步骤由高亲和力胆碱转运体(CHT1)的作用介导。

如本文所用，“乙酰胆碱通路调节剂”是指直接或间接干预乙酰胆碱功能的分子，包括能够干预乙酰胆碱代谢途径、乙酰胆碱转运分泌过程、以及乙酰胆碱信号通路的分子。在一个优选实施方案中，所述乙酰胆碱通路调节剂为抑制乙酰胆碱功能的乙酰胆碱通路抑制剂。乙酰胆碱通路调节剂的实例包括但不限于乙酰胆碱受体抑制剂、乙酰胆碱转运体抑制剂、胆碱转运体抑制剂、乙酰胆碱酯酶(或编码其的核酸)、乙酰胆碱受体抗体(或编码其的核酸)、抑制乙酰胆碱受体的基因表达的试剂(例如，编码乙酰胆碱受体的基因的核酶、反义核酸和siRNA)，诱导乙酰胆碱受体的蛋白降解剂(例如，基于蛋白水解靶向嵌合体技术的蛋白降解剂)，胆碱乙酰转移酶的抑制剂，抑制胆碱乙酰转移酶基因表达的试剂(例如，基因的核酶、反义核酸和siRNA)，诱导胆碱乙酰转移酶的蛋白降解剂(例如，基于蛋白水解靶向嵌合体技术的蛋白降解剂)等。

通过测量抗胆碱作用，可以确定一种物质是否可以用作本发明组合物中乙酰胆碱通路调节剂。例如，当制备乙酰胆碱受体的抗体或抑制编码乙酰胆碱受体的基因转录的物质(例如，编码乙酰胆碱受体的基因的核酶、反义核酸或siRNA)时，可以通过测量抗胆碱作用确定是否可以将制备的物质用于本发明的组合物中。如果一种物质在测定其抗胆碱作用时也具有抗胆碱作用的话，其也可以用于本发明的组合物中。

具有抗胆碱作用的物质的初步筛选可以通过使用Biacore测量与乙酰胆碱受体的相互作用来进行。例如，可以将乙酰胆碱受体固定在流动池上，并允许样品流入流动池以筛选与乙酰胆碱受体结合的物质，其中将传感图的变化作为指标(Spurny等，Proc Natl AcadSci USA.2015May 12；112(19):E2543-52)。通过初级筛选分离的候选物质可通过测量将候选物质加入豚鼠回肠的悬浮液中后乙酰胆碱活性的降低来确定该物质是否具有抗胆碱作用(Acred等，Br J Pharmacol Chemother.1957December；12(4):447-52)。

如本文所用，“乙酰胆碱受体抑制剂”是指通过作用于乙酰胆碱受体而部分或完全抑制神经递质乙酰胆碱作用的物质。乙酰胆碱受体抑制剂的实例包括乙酰胆碱受体的拮抗剂。最终起到抑制作用的乙酰胆碱受体的激动剂(例如，部分激动剂和反向激动剂)也可以用作乙酰胆碱受体抑制剂。

如本文所用，“蛋白降解剂”包括蛋白降解靶向嵌合体(PROTAC)，即一种能够去除特定蛋白质的杂合双功能小分子化合物，其结构中含有两种不同的配体：一个是泛素连接酶E3配体，另一个是与细胞中目标靶蛋白结合配体，两个配体之间通过连接基相连。PROTAC通过将目标靶蛋白和细胞内的E3拉近，形成靶蛋白-PROTAC-E3三元聚合体，通过E3泛素连接酶给目标蛋白加上泛素化蛋白标签，启动细胞内的泛素水解过程，利用泛素-蛋白酶体途径特异性的降解靶蛋白。可用作本发明中乙酰胆碱通路调节剂的蛋白降解剂包括诱导乙酰胆碱受体降解的蛋白降解剂和/或诱导胆碱乙酰转移酶降解的蛋白降解剂。

如本文所用，“乙酰胆碱受体”是指特异性识别并结合乙酰胆碱的蛋白质。其缩写为AChR，也被称为胆碱能受体。以尼古丁作为激动剂的受体被称为烟碱型乙酰胆碱受体(N型乙酰胆碱受体)，以毒蕈碱作为激动剂的受体被称为毒蕈碱型乙酰胆碱受体(M型乙酰胆碱受体)。“烟碱型乙酰胆碱受体”也称为“烟碱受体”，缩写为nAChR。已知两种类型的烟碱型乙酰胆碱受体，即骨骼肌的烟碱型乙酰胆碱受体和神经的烟碱型乙酰胆碱受体。骨骼肌烟碱型乙酰胆碱受体存在于运动神经末梢的神经肌肉接头处，而神经的烟碱型乙酰胆碱受体存在于交感神经和副交感神经的节前纤维末端(神经节部分)。“毒蕈碱型乙酰胆碱受体”也称为“毒蕈碱受体”，缩写为mAChR。已证实存在五种亚型的毒蕈碱型乙酰胆碱受体(M1至M5)。该五种亚型的分布因器官而异。

如本文所用，“拮抗剂”是指通过作用于受体而抑制配体(例如，神经递质如乙酰胆碱、激素等)的作用的物质。拮抗剂也称为阻断剂。拮抗剂包括与受体结合以阻碍配体结合从而抑制其作用的竞争性拮抗剂，以及作用于受体以外的位点以诱导与特定配体相反的作用从而抑制配体作用的非竞争性拮抗剂。

如本文所用，“激动剂”是指通过作用于受体而表现出与配体(例如，神经递质如乙酰胆碱、激素等)的作用相同或不同的功能的物质。激动剂包括表现出与配体的原始作用类似的生理作用的激动剂和相对于原始配体作用较弱的部分激动剂(即使在高浓度施用下)。还存在反向激动剂，其通过与受体结合而表现出与原始配体的生理作用相反的作用。

如本文所用，毒蕈碱型受体抑制剂的实例包括但不限于达非那新、苯扎托品、伊索拉定、甲基东莨菪碱、苯海索、丁溴东莨菪碱、哌仑西平、异丙托溴铵、氧托溴铵、噻托溴铵、阿托品、托吡卡胺、苯海拉明、双环胺、奥昔布宁、托特罗定、索非那新、溴丙胺太林、东莨菪碱、溴甲东莨菪碱、奥芬那君、后马托品、美噻吨、溴乙哌沙酯、咪达那新、非索罗定、其药学上可接受的盐、溶剂合物、前药、代谢物及它们的组合。

如本文所用，烟碱型受体抑制剂的实例包括但不限于MG624、美卡拉明、泮库溴铵、氯化琥珀胆碱、十烃溴铵、维库溴铵、泮库溴铵、氯化筒箭毒碱、樟磺咪芬、六甲溴铵、阿曲库铵、多沙氯铵、米库氯铵、右美沙芬、甲基牛扁亭、α-银环蛇毒素、α-芋螺毒素G1、苄醌铵、bPiDDB、其药学上可接受的盐、溶剂合物、前药、代谢物及它们的组合。

如本文所用，“乙酰胆碱转运体抑制剂”是通过抑制乙酰胆碱经由囊泡乙酰胆碱转运体被摄入突触小泡并减少其释放而起作用的物质。乙酰胆碱转运体抑制剂的实例包括但不限于2-(4-苯基哌啶基)环己醇(Vesamicol)。

如本文所用，“胆碱转运体抑制剂”是一种阻断通过高亲和力胆碱转运体对胆碱的再摄取的药物。胆碱的再摄取是乙酰胆碱合成中的限速步骤，因此，胆碱转运体抑制剂下调了乙酰胆碱的合成。胆碱转运体抑制剂的实例包括但不限于半胆碱基-3。

如本文所用，“胆碱乙酰转移酶”是指催化从乙酰CoA和胆碱产生乙酰胆碱和CoA的反应的酶，并且缩写为ChAT。“胆碱乙酰转移酶抑制剂”是指抑制由胆碱乙酰转移酶催化而产生乙酰胆碱的物质。胆碱乙酰转移酶抑制剂的实例包括但不限于J.Med.Chem.,1969,vol.12,134-38中公开的化合物、可以特异性结合胆碱乙酰转移酶的抗体等。

如本文所用，“乙酰胆碱酯酶”是指将乙酰胆碱分解为胆碱和乙酸以消除乙酰胆碱作用的酶，其中该乙酰胆碱作为神经递质释放。利用这种酶活性，乙酰胆碱酯酶可以作用为乙酰胆碱抑制剂。

如本文所用，“阻断乙酰胆碱与乙酰胆碱受体结合的抗体”是指通过特异性结合与乙酰胆碱受体相关的特定部分(或其附近)来阻断乙酰胆碱与乙酰胆碱受体结合的抗体。这种抗体可以抑制乙酰胆碱的作用。或者，“阻断乙酰胆碱与乙酰胆碱受体结合的抗体”可以是抑制乙酰胆碱和乙酰胆碱受体结合的乙酰胆碱结合的抗体。所述抗体的实例包括人单克隆抗体和人源化单克隆抗体(以及F(ab)₂片段、Fv片段和单链抗体)，其阻断乙酰胆碱与乙酰胆碱受体的结合。抗体可以是嵌合的或人源化的。本文的嵌合抗体包含人抗体的恒定区和非人抗体的可变区，例如小鼠抗体。人源化抗体包含人抗体的恒定区和框架可变区(即，除高可变区之外的可变区)和非人抗体如小鼠抗体的高可变区。在另一个实施方案中，抗体可以是通过噬菌体展示系统选择的抗体，或通过任何其他方法获得的抗体，例如由Xenomouse或其抗体衍生物产生的人抗体。

如本文所用，“抑制乙酰胆碱受体基因表达的试剂”的实例包括编码乙酰胆碱受体的基因的核酶、反义核酸和siRNA，但优选siRNA。编码乙酰胆碱受体的基因的siRNA可用于敲低(抑制)该基因的表达。

在一些实施方案中，抑制乙酰胆碱受体基因表达的试剂是siRNA。siRNA是具有由15至40个碱基组成的双链RNA部分的RNA分子，其具有切割靶基因的mRNA的功能，所述靶基因具有与抑制靶基因表达的siRNA的反义链互补的序列。更具体地，本发明中的siRNA是包含双链RNA部分的RNA，所述双链RNA部分由有义RNA链和反义RNA链组成，所述有义RNA链由与编码乙酰胆碱受体等的mRNA中的连续RNA序列同源的序列组成，所述反义RNA链由与有义RNA序列互补的序列组成。

以下讨论的此类siRNA和突变体siRNA的设计和制造落入本领域技术人员的技术能力范围内。本领域技术人员可以适当地选择mRNA的任何连续RNA区域，其是乙酰胆碱受体序列的转录产物，以在正常程序内制备对应于该区域的双链RNA。本领域技术人员还可以通过已知方法从mRNA序列中适当地选择具有更有效的RNAi效应的siRNA序列，所述mRNA序列是序列的转录产物。

为了制备siRNA，可以加入如下条件：(1)缺少4个或更多个连续的G或C；(2)缺少4个或更多个连续的A或T；或(3)少于9个G或C。双链RNA部分的长度为15至40个碱基，优选15至30个碱基，更优选15至25个碱基，还更优选18至23个碱基，最优选19至21个碱基。应理解，其上限和下限不限于这些特定数字，而可以是所列数字的任何组合。siRNA的有义链或反义链的末端结构没有特别限制，可以根据目的适当选择。例如，该结构可以具有钝端或粘性末端(突出端，overhang)，并且优选具有突出3'末端的类型。在有义RNA链和反义RNA链的3'末端具有由几个碱基(优选1至3个碱基，更优选2个碱基)组成的突出端的siRNA是优选的，因为其通常具有抑制靶基因的表达的显著效果。

突出端的碱基类型没有特别限制，可以是构成RNA的碱基或构成DNA的碱基。优选的突出序列的实例包括3'末端的dTdT(2个碱基的脱氧T)等。优选的siRNA的实例包括但不限于在所有siRNA有义/反义链的3'末端具有dTdT(2个碱基的脱氧T)的siRNA。

此外，还可以使用其中在上述siRNA的有义链和/或反义链中具有一个至几个核苷酸的缺失、取代、插入和/或添加的siRNA。本文使用的一个或多个碱基没有特别限制，但优选1至4个碱基，更优选1至3个碱基，最优选1至2个碱基。此类突变的具体实例包括但不限于：在3'突出部分产生0至3个碱基的突变；将3'突出部分的碱基序列改变为另一个碱基序列的突变；由于碱基的插入、添加或缺失导致有义RNA链和反义RNA链的长度相差1至3个碱基的突变；用另一个碱基取代有义链和/或反义链中的碱基的突变等。然而，有义链和反义链必须在这种突变体siRNA中杂交，并且这些突变体siRNA具有与没有任何突变的siRNA相当的抑制基因表达的能力。

siRNA也可以是具有一端封闭的结构的分子，例如具有发夹(hairpin)结构的siRNA(短发夹RNA；shRNA)。shRNA是包含以下的RNA：靶基因的特定序列的有义链RNA，由与有义链序列互补的序列组成的反义链RNA，和用于连接两条链的接头序列，其中有义链部分与反义链部分杂交形成双链RNA部分。

为了制备根据本发明的siRNA，可以适当地使用已知方法，例如使用化学合成的方法或使用基因重组技术的方法。使用合成的方法时，可以通过使用常规方法基于序列信息合成双链RNA。利用基因重组技术的方法时，可以通过构建编码有义链序列或反义链序列的表达载体并将该载体导入宿主细胞，然后通过转录获得有义链RNA和反义链RNA中的每一个来制备siRNA。还可以通过表达形成发夹结构的shRNA来制备所需的双链RNA，所述发夹结构包含靶基因的特定序列的有义链、由与有义链序列互补的序列组成的反义链、和用于连接两条链的接头序列。

对于siRNA，构成siRNA的核酸的全部或部分可以是天然存在的或修饰的核酸，只要这种核酸具有抑制靶基因表达的活性即可。修饰的核酸是指在核苷(碱基部分、糖部分)和/或核苷间结合位点具有修饰、并且具有与天然存在的核酸不同的结构的核酸。

还可以将本发明的核酸或试剂引入磷脂内质网如脂质体(载体)中并施用内质网。可以使用脂质转染将其中保留siRNA或shRNA的内质网引入给定细胞中。然后全身性施用所得细胞，例如通过静脉内或动脉内。它也可以局部施用于皮肤上的所需部位等。虽然siRNA在体外表现出非常好的特异性转录后抑制作用，但由于血清中的核酸酶活性，siRNA在体内迅速降解，因此其持续时间受到限制。因此，需要开发更好和更有效的递送系统。例如，Ochiya，T等人，Nature Med.,5:707-710,1999,Curr.Gene Ther.,1:31-52,2001报道了，当与核酸混合形成复合物时，生物相容性去端肽胶原是一种载体，其具有保护核酸免受生物体内降解酶的作用，并且非常适合作为siRNA的载体。虽然可以使用这种形式，但是用于引入本发明的核酸或药物的方法不限于此。以这种方式，尽管存在生物体中血清中核酸酶的快速降解作用，也可以在延长的时间段内实现持续的效果。例如，Takeshita F.PNAS,(2003)102(34)12177-82,Minakuchi Y Nucleic Acids Research(2004)32(13)e109报道了源自牛皮的去端肽胶原与核酸形成复合物，其具有保护核酸免受活生物体中的降解酶的影响的作用，并且非常适合作为siRNA的载体。

通过抑制乙酰胆碱受体基因表达的试剂来乙酰胆碱受体基因表达的效果可以通过公知的方法进行验证。

在一些实施方案中，抑制乙酰胆碱受体基因表达的药剂是反义核酸。可以使用本领域技术人员熟知的技术利用反义核酸。反义核酸可以通过抑制诸如转录、剪接或翻译等各种过程来抑制靶基因的表达(Hirashima和Inoue,New Biochemical Experiment Course2,Replication and Expression of Gene of Nucleic Acid IV,日本生化学会编，TokyoKagaku Dojin,1993,319-347)。

在一些实施方案中，设计与编码乙酰胆碱受体的基因的mRNA5'末端附近的非翻译区互补的反义序列被认为能够有效抑制基因的翻译。也可以使用与3'非翻译区或编码区互补的序列。以这种方式，本发明中使用的反义核酸还包括核酸，其不仅包括编码乙酰胆碱受体的基因的翻译区序列的反义序列，还包括非翻译区序列的反义序列。待使用的反义核酸被连接在合适的启动子的下游，优选地，包含转录终止信号的序列被连接到3'侧。以这种方式制备的核酸可以通过使用已知方法转化到细胞中。反义核酸的序列优选是与编码待转化细胞的乙酰胆碱受体的基因或其部分互补的序列。然而，只要可以有效地抑制基因表达，该序列就不需要完全互补。相对于靶基因的转录物，转录的RNA优选具有90％或更高、最优选95％或更高的互补性。为了使用反义核酸有效抑制靶基因的表达，优选反义核酸的长度为至少12个碱基且小于25个碱基，但本发明的反义核酸不必限于该长度。例如，所述长度可以是11个碱基或更少、100个碱基或更多、或500个碱基或更多。反义核酸可以仅由DNA组成，也可以包含除DNA之外的核酸，例如锁核酸(LNA)。作为一个实施方案，本发明中使用的反义核酸可以是含有LNA的反义核酸，所述反义核酸在5'末端包含LNA或在3'末端包含LNA。在使用本发明中的反义核酸的实施方案中，反义序列可以使用例如Hirashima和Inoue,NewBiochemical Experiment Course 2,Replication and Expression of Gene of NucleicAcid IV,日本生化学会编，Tokyo Kagaku Dojin,1993,319-347中所述的方法设计。

在一些实施方案中，抑制乙酰胆碱受体基因表达的试剂是核酶或编码核酶的DNA。核酶是指具有催化活性的RNA分子，属于生物催化剂，可降解特异的mRNA序列。具体地，核酶可通过催化靶位点RNA链中磷酸二酯键的断裂，特异性地剪切底物RNA分子，从而阻断靶基因的表达。虽然存在具有各种活性的核酶，但是关于将核酶作为切割RNA的酶的研究使得可以设计出位点特异性切割RNA的核酶。在RNase P和第I组内含子核酶中含有的M1 RNA中存在大小为400个核苷酸或更多的核酶，但也存在具有约40个核苷酸的活性结构域的核酶，其被称为锤头或发夹核酶(Makoto Koizumi和Eiko Otsuka,Protein,Nucleic Acid andEnzyme,1990,35,2191)。

发夹核酶也可用于本发明的目的。例如，在烟草环斑病毒卫星RNA的负链中发现了这种核酶(Buzayan JΜ,Nature,1986,323,349)。已经证明，靶向特异性RNA切割核酶也可以由发夹核酶产生(Kikuchi,Υ.&Sasaki,Ν.,Nucl.Acids Res,1991,19,6751.,Chemistry and Biology,1992,30,112)。以这种方式，通过使用核酶特异性切割基因的转录物，可以抑制编码乙酰胆碱受体的基因的表达。

如本文所用，“抑制胆碱乙酰转移酶基因表达的试剂”包括编码胆碱乙酰转移酶的基因的核酶、反义核酸和siRNA，其中核酶、反义核酸和siRN如以上所定义。

在一些实施方案中，所述乙酰胆碱通路调节剂是乙酰胆碱受体抑制剂。

在一些实施方案中，所述乙酰胆碱受体抑制剂选自毒蕈碱型受体抑制剂和烟碱型受体抑制剂。

在一些实施方案中，所述毒蕈碱型受体抑制剂选自达非那新、苯扎托品、伊索拉定、甲基东莨菪碱、苯海索、丁溴东莨菪碱、哌仑西平、异丙托溴铵、氧托溴铵、噻托溴铵、阿托品、托吡卡胺、苯海拉明、双环胺、奥昔布宁、托特罗定、索非那新、溴丙胺太林、东莨菪碱、溴甲东莨菪碱、奥芬那君、后马托品、美噻吨、溴乙哌沙酯、咪达那新、非索罗定、其药学上可接受的盐、溶剂合物、前药、代谢物及它们的组合。

在一些实施方案中，所述烟碱型受体抑制剂选自MG624、美卡拉明、泮库溴铵、氯化琥珀胆碱、十烃溴铵、维库溴铵、泮库溴铵、氯化筒箭毒碱、樟磺咪芬、六甲溴铵、阿曲库铵、多沙氯铵、米库氯铵、右美沙芬、甲基牛扁亭、α-银环蛇毒素、α-芋螺毒素G1、苄醌铵、bPiDDB、其药学上可接受的盐、溶剂合物、前药、代谢物及它们的组合。

在一些实施方案中，所述乙酰胆碱通路调节剂为乙酰胆碱转运体抑制剂，例如2-(4-苯基哌啶基)环己醇(Vesamicol)。

在一些实施方案中，所述乙酰胆碱通路调节剂为胆碱转运体抑制剂，例如半胆碱基-3。

在一些实施方案中，所述乙酰胆碱通路调节剂优选选自达非那新、甲磺酸苯扎托品、伊索拉定、甲基东莨菪碱、MG624、美卡拉明、泮库溴铵、2-(4-苯基哌啶基)环己醇(Vesamicol)、半胆碱基-3及它们的组合。

II.治疗方法

本发明提供了一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，包括向所述受试者给药治疗有效量的乙酰胆碱通路调节剂。在一些实施方案中，所述受试者此前接受过至少一种抗癌治疗。在一些实施方案中，所述受试者对至少一种抗癌治疗有抗性，或患有在接受至少一种抗癌治疗后复发或进展的癌症。如本发明所用，术语“抗性”或“耐受性”是指在进行抗癌治疗后受试者的状况并未产生明显改善。

本发明还提供了一种用于提高癌细胞对抗癌治疗的敏感性的方法，包括向进行抗癌治疗的受试者给药治疗有效量的乙酰胆碱通路调节剂。

本发明还提供了一种用于预防癌症复发的方法，包括向受试者给药治疗有效量的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述受试者此前接受过至少一种抗癌治疗。

在一些实施方案中，所述抗癌治疗为手术和/或放射治疗。在一些实施方案中，所述抗癌治疗为至少一种抗肿瘤剂，其中“抗肿瘤剂”是指在组织、系统、动物、哺乳动物、人或其他受试者中产生抗肿瘤作用的物质。

在一些实施方案中，所述抗肿瘤剂可为表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂，其可以抑制EGFR所参与的信号通路，进而降低肿瘤细胞的活性。EGFR抑制剂的实例包括例如耐昔妥珠单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、Imgatuzumab(RO5083945)、西妥昔单抗、吉非替尼、厄洛替尼、帕尼单抗(panitumumab)、埃克替尼、阿法替尼、达克替尼(PF-00299804)、奥希替尼、Rociletinib(CO1686)及它们的组合。

在一些实施方案中，所述抗肿瘤剂可为渐变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂，其可以抑制ALK所参与的信号通路，进而降低肿瘤细胞的活性。ALK抑制剂的实例包括例如克唑替尼、艾乐替尼、色瑞替尼、阿来替尼(Alectinib)、布格替尼(Brigatinib)、洛拉替尼(Lorlatinib)、洛普替尼(TPX-0005)及它们的组合。

在一些实施方案中，所述抗肿瘤剂可为拉帕替尼或维莫非尼。

在一些实施方案中，所述抗肿瘤剂还可以选自：抗微管试剂如二萜类化合物和长春花生物碱；铂配合物；烷化剂如氮芥，氧氮磷环类(oxazaphosphorine)，烷基磺酸盐，亚硝基脲，和三氮烯；抗生素试剂如蒽环类抗生素，放线菌素和博来霉素；拓扑异构酶II抑制剂如表鬼臼毒素；抗代谢物如嘌呤和嘧啶类似物和抗叶酸化合物；拓扑异构酶I抑制剂如喜树碱；激素和激素类似物；信号转导途径抑制剂；非受体酪氨酸血管发生抑制剂；免疫治疗剂；促凋亡试剂；和细胞周期信号传递抑制剂。

抗微管或抗有丝分裂药物为时相特异性药物，其在细胞周期中的M期或有丝分裂期具有针对肿瘤细胞微管的活性。抗微管药物的实例包括但不限于二萜类和长春花生物碱。

源自天然的来源的二萜类化合物是时相特异性抗肿瘤剂，其作用于细胞周期的G₂/M期。认为二萜类通过与微管的β-微管蛋白亚单元结合而使之稳定。然后该蛋白的分解似乎受到抑制，同时有丝分裂停止，进而细胞死亡。二萜类的实例包括但不限于紫杉醇及其类似物多西紫杉醇。

紫杉醇，5β,20-环氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六羟基紫杉-11-烯-9-酮4,10-二乙酸酯2-苯甲酸酯13-(2R,3S)-N-苯甲酰基-3-苯基异丝氨酸酯，是一种天然的二萜产物，分离自太平洋红豆杉(Taxus brevifolia)且作为可注射溶液

市售。其为萜类的紫杉烷家族的成员。紫杉醇在美国已经批准用于治疗顽固性卵巢癌(Markman等人，YaleJournal of Biology and Medicine，64:583，1991；McGuire等人，Ann.lntem，Med.，111:273,(989))和治疗乳腺癌(Holmes等人，J.Nat.Cancer Inst.，83:1797(1991))的临床应用。紫杉醇为治疗皮肤肿瘤(Einzig等人，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.，20:46(2001))和头颈癌(Forastire等人，Sem.Oncol.，20:56，(1990))的潜在候选药。所述化合物也显示了对于多囊肾病(Woo等人，Nature，368:750.(1994))、肺癌和疟疾的治疗潜力。用紫杉醇治疗患者导致骨髓抑制(Multiple cell lineages，Ignoff等人，Cancer Chemotherapy PocketGuide，1998)，这与高于阈浓度(50nM)的给药持续时间有关(Kearns等人.，Seminars inOncology，3(6)p.16-23，(1995))。

多西紫杉醇，5β-20-环氧-1,2α,4,7β,10β,13α-六羟基紫杉-11-烯-9-酮-4-乙酸酯2-苯甲酸酯-N-叔丁酯13-(2R,3S)-N-羧基-3-苯基异丝氨酸酯三水合物；其作为可注射溶液

市售。多西紫杉醇用于治疗乳腺癌。多西紫杉醇是紫杉醇的半合成衍生物，其使用天然前体10-去乙酰基-浆果赤霉素III(提取自欧洲紫杉的针叶)制备。

长春花生物碱是时相特异性抗肿瘤药物，源自长春花植物。长春花生物碱通过特异性结合于微管蛋白作用于细胞周期的M期(有丝分裂)。因此，结合的微管蛋白分子不能聚合成微管。有丝分裂被认为终止于分裂中期，然后细胞死亡。长春花生物碱的实例包括但不限于长春碱、长春新碱和长春瑞滨。

长春碱，硫酸长春碱，作为可注射溶液

市售。尽管其可用作多种实体瘤的二线治疗，但其主要用于治疗睾丸癌和多种淋巴瘤包括霍奇金病；和淋巴细胞和组织细胞淋巴瘤。骨髓抑制是长春碱剂量限制性副作用。

长春新碱，22-氧代长春碱硫酸盐，作为可注射溶液

市售。长春新碱用于治疗急性白血病且还用于治疗霍奇金和非霍奇金恶性淋巴瘤的治疗方案。脱发和神经作用是长春新碱最常见的副作用，且会发生较低程度的骨髓抑制和胃肠道粘膜炎作用。

长春瑞滨，3’,4’-二去氢-4’-脱氧-C’-去甲长春花碱[R-(R*,R*)-2,3-二羟基丁二酸盐(1:2)(盐)]，作为酒石酸长春瑞滨可注射溶液

市售，是半合成长春花生物碱。长春瑞滨用作单一药物或与其他化疗药物，例如顺铂组合，用于治疗多种实体瘤，如非小细胞肺癌、晚期乳腺癌和激素性顽固性前列腺癌。骨髓抑制是长春瑞滨最常见的剂量限制性副作用。

铂配合物为非时相特异性抗肿瘤剂，其与DNA相互作用。铂配合物进入肿瘤细胞，进行水合并与DNA形成链内和链间交联，对肿瘤引起不利的生物作用。铂配合物的实例包括但不限于奥沙利铂、顺铂和卡铂。

顺铂，顺-二氨二氯合铂，作为可注射溶液

市售。顺铂主要用于治疗转移性睾丸癌和卵巢癌和晚期膀胱癌。

卡铂，二氨[1,1-环丁烷-二羧酸(2-)-O,O’]合铂，作为可注射溶液

市售。卡铂主要用于一线和二线治疗晚期卵巢癌。

烷基化剂为非时相特异性抗肿瘤剂和强亲电试剂。通常，烷基化剂通过烷基化经由DNA分子的亲核部分与DNA形成共价键，所述亲核部分例如磷酸基、氨基、巯基、羟基、羧基和咪唑基。所述烷基化扰乱了核酸功能，导致细胞死亡。烷基化剂的实例包括但不限于氮芥例如环磷酰胺、美法仑和苯丁酸氮芥；烷基磺酸酯例如白消安；亚硝基脲例如卡莫司汀；和三氮烯例如达卡巴嗪。

环磷酰胺，2-[双(2-氯乙基)氨基]四氢-2H-1,3,2-氧氮磷杂环己烯2-氧化物一水合物，作为可注射溶液或片剂

市售。环磷酰胺用作单一药物或与其他化疗药物组合，以治疗恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤和白血病。

美法仑，4-[双(2-氯乙基)氨基]-L-苯基丙氨酸，作为可注射溶液或片剂

市售。美法仑用于姑息治疗多发性骨髓瘤和不可切除的卵巢上皮瘤。骨髓抑制是美法仑最常见的剂量限制性副作用。

苯丁酸氮芥，4-[双(2-氯乙基)氨基]苯丁酸，作为

片剂市售。苯丁酸氮芥用于姑息治疗慢性淋巴白血病和恶性淋巴瘤，例如淋巴肉瘤、巨滤泡性淋巴瘤和霍奇金病。

白消安，1,4-丁二醇二甲磺酸酯，作为

片剂市售。白消安用于姑息治疗慢性骨髓性白血病。

卡莫司汀，1,3-[双(2-氯乙基)-1-亚硝基脲，作为

冻干产品的单一药瓶市售。卡莫司汀作为单一药物或与其他药物组合用于姑息治疗脑瘤、多发性骨髓瘤、霍奇金病和非霍奇金淋巴瘤。

达卡巴嗪，5-(3,3-二甲基-1-三氮烯基)-咪唑-4-甲酰胺，作为

产品的单一药瓶市售。达卡巴嗪用于治疗转移性恶性黑色素瘤且与其他药物组合用于霍奇金病的二线治疗。

抗生素抗肿瘤药为非时相特异性药物，其结合或嵌入DNA。通常，该作用形成稳定的DNA复合物或导致DNA链断裂，其扰乱了核酸的正常功能，导致细胞死亡。抗生素抗肿瘤药物的实例包括但不限于放线菌素例如放线菌素D、蒽环类(anthrocyclins)例如柔红霉素和多柔比星；和博来霉素。

放线菌素D(Actinomycin D)，作为可注射形式的

市售。放线菌素D用于治疗维尔姆斯肿瘤和横纹肌肉瘤。

柔红霉素，(8S-顺式)-8-乙酰基-10-[(3-氨基-2,3,6-三脱氧-α-L-来苏-吡喃己糖基)氧基]-7,8,9,10-四氢-6,8,11-三羟基-1-甲氧基-5,12-萘并萘醌盐酸盐，作为可注射形式的脂质体

或可注射形式的

市售。柔红霉素用于缓解诱导治疗急性非淋巴细胞白血病和与晚期HIV相关的卡波西肉瘤。

多柔比星，(8S，10S)-10-[(3-氨基-2,3,6-三脱氧-α-L-来苏-吡喃己糖基)氧基]-8-乙醇酰基,7,8,9,10-四氢-6,8,11-三羟基-1-甲氧基-5,12萘并萘醌盐酸盐，作为可注射形式的

或ADRIAMYCIN

市售。多柔比星主要用于治疗治疗急性成淋巴细胞白血病和急性成髓细胞白血病，但也是治疗一些实体瘤和淋巴瘤的有用成分。

博来霉素，分离自轮丝链霉菌株的细胞毒性糖肽抗生素混合物，作为

市售。博来霉素作为单一药物或与其他药物组合用于姑息治疗鳞状细胞癌、淋巴瘤和睾丸癌。

拓扑异构酶II抑制剂包括但不限于表鬼臼毒素类。

表鬼臼毒素类是时相特异性抗肿瘤药物，源自盾叶表鬼臼(mandrake)植物。表鬼臼毒素类通常在细胞周期的S和G₂期通过与拓扑异构酶II和DNA形成三元复合物引起DNA链断裂而影响细胞。DNA链断裂累积，随后细胞死亡。表鬼臼毒素类的实例包括但不限于依托泊苷和替尼泊苷。

依托泊苷，4’-去甲基-表鬼臼毒素9-[4,6-0-(R)-亚乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷]，作为可注射溶液或胶囊

市售，且通常称为VP-16。依托泊苷作为单一药物或与其他化疗药物组合治疗睾丸癌和非小细胞肺癌。

替尼泊苷，4’-去甲基-表鬼臼毒素9-[4,6-0-(R)-噻吩亚甲基-β-D-吡喃葡萄糖苷]，作为可注射溶液

市售，且通常称为VM-26。替尼泊苷作为单一药物或与其他化疗药物组合用于治疗儿童急性白血病。

抗代谢抗肿瘤药物是时相特异性抗肿瘤药物，其通过抑制DNA合成或通过抑制嘌呤或嘧啶碱基合成并因此限制DNA合成而作用于细胞周期的S期(DNA合成期)。因此，S期停止，细胞死亡。抗代谢抗肿瘤药物的实例包括但不限于氟尿嘧啶、甲氨喋呤、阿糖胞苷、巯嘌呤、硫鸟嘌呤和吉西他滨。

5-氟尿嘧啶，5-氟-2,4-(1H,3H)嘧啶二酮，作为氟尿嘧啶市售。给药5-氟尿嘧啶使得抑制胸苷酸合成，并且既可掺入RNA也可掺入DNA。结果通常是细胞死亡。5-氟尿嘧啶作为单一药物或与其他化疗药物组合用于治疗乳腺癌、结肠癌、直肠癌、胃癌和胰腺癌。其他氟嘧啶类似物包括5-氟脱氧尿苷(氟尿苷)和5-氟脱氧尿苷单磷酸盐。

阿糖胞苷，4-氨基-1-β-D-呋喃阿拉伯糖基-2(1H)-嘧啶酮，市售商品为

且通常称为Ara-C。认为阿糖胞苷通过抑制DNA链延长在S期显示出细胞时相特异性，这种作用是通过在正在生长的DNA链的末端结合阿糖胞苷而产生的。阿糖胞苷作为单一药物或与其他化疗药物组合治疗急性白血病。其他胞苷类似物包括5-氮杂胞苷和2’,2’-二氟脱氧胞苷(吉西他滨)。

巯嘌呤，1,7-二氢-6H-嘌呤-6-硫酮一水合物，作为

市售。巯嘌呤通过抑制DNA合成而在S期显示出细胞时相特异性，其机理尚不明确。巯嘌呤作为单一药物或与其他化疗药物组合用于治疗急性白血病。一种可用的巯嘌呤类似物为硫唑嘌呤。

硫鸟嘌呤，2-氨基-1,7-二氢-6H-嘌呤-6-硫酮，作为

市售。硫鸟嘌呤通过抑制DNA合成而在S期表现出细胞时相特异性，其机理尚不明确。硫鸟嘌呤作为单一药物或与其他化疗药物组合用于治疗急性白血病。其他嘌呤类似物包括喷司他丁、赤藓羟基壬基腺嘌呤、磷酸氟达拉滨和克拉屈滨。

吉西他滨，2’-脱氧-2’,2’-二氟胞苷一盐酸盐(β-异构体)，作为

市售。吉西他滨通过阻断细胞从G1期进入S期从而在S期表现出细胞时相特异性。吉西他滨与顺铂组合用于治疗局部晚期非小细胞肺癌，以及单独治疗局部晚期胰腺癌。

甲氨喋呤，N-[4[[(2,4-二氨基-6-蝶啶基)甲基]甲基氨基]苯甲酰基]-L-谷氨酸，作为甲氨喋呤钠市售。甲氨喋呤通过抑制DNA合成、修复和/或复制而在S期表现出细胞时相特异性，这种作用通过抑制二氢叶酸还原酶实现，其为嘌呤核苷酸和胸苷酸的合成所需的物质。甲氨喋呤作为单一药物或与其他化疗药物组合用于治疗绒毛膜癌、脑脊膜白血病、非霍奇金淋巴瘤和乳腺癌、头癌、颈癌、卵巢癌和膀胱癌。

拓扑异构酶I抑制剂：喜树碱类，包括喜树碱和喜树碱衍生物，可用作拓扑异构酶I抑制剂，或在这一方面的研发。喜树碱的细胞毒性被认为与其拓扑异构酶I抑制活性有关。喜树碱的实例包括但不限于伊立替康、托泊替康和下述7-(4-甲基哌嗪基-亚甲基)-10,11-亚乙基二氧基-20-喜树碱的多种光学形式。

盐酸伊立替康，(4S)-4,11-二乙基-4-羟基-9-[(4-哌啶基哌啶基)羰基氧基]-1H-吡喃并[3’,4’,6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-3,14(4H,12H)-二酮盐酸盐，作为可注射溶液

市售。伊立替康是一种喜树碱衍生物，其与其活性代谢物SN-38一起结合至拓扑异构酶I-DNA复合物。认为细胞毒性的发生是拓扑异构酶I:DNA:伊立替康或SN-38的三元复合物与复制酶的相互作用所导致的不可修复的双链断裂的结果。伊立替康用于治疗结肠或直肠的转移性癌症。

盐酸托泊替康，(S)-10-[(二甲基氨基)甲基]-4-乙基-4,9-二羟基-1H-吡喃并[3’,4’,6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-3,14-(4H,12H)-二酮一盐酸盐，作为可注射溶液

市售。托泊替康是一种喜树碱衍生物，其结合至拓扑异构酶I-DNA复合物，并防止由于DNA分子的链扭转造成的由拓扑异构酶I引起的单链断裂的重新连接。托泊替康用于转移性卵巢癌和小细胞肺癌的二线治疗。

激素和激素类似物是有效治疗癌症的化合物，所述癌症的发展和/或缺少发展与激素有关。用于癌症治疗的激素和激素类似物的实例包括但不限于肾上腺皮质类固醇类，例如泼尼松和泼尼松龙，其用于治疗恶性淋巴瘤和儿童急性白血病；氨鲁米特和其他芳香酶抑制剂例如阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑(vorazole)和依西美坦，其用于治疗肾上腺皮质瘤和含雌激素受体的激素依赖性乳腺癌；孕激素，例如醋酸甲地孕酮，用于治疗激素依赖性乳腺癌和子宫内膜癌；雌激素、雄激素和抗雄激素例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、醋酸环丙孕酮和5α-还原酶例如非那雄胺和度他雄胺，用于治疗前列腺癌和良性前列腺肥大；抗雌激素例如他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、iodoxyfene、以及美国专利号5,681,835、5,877,219和6,207,716公开的选择性雌激素受体调节剂(SERMS)，用于治疗激素依赖性乳腺癌和其他易感性癌症；且促性腺激素释放激素(GnRH)及其类似物(其刺激促黄体生成激素(LH)和/或促卵泡激素激素(FSH)的释放)用于治疗前列腺癌，例如LHRH激动剂和拮抗剂，例如醋酸戈舍瑞林和luprolide。

信号转导途径抑制剂是阻断或抑制激发细胞内变化的化学过程的那些抑制剂。本发明所用的该变化是细胞增殖或分化。用于本发明的信号转导抑制剂包括但不限于，受体酪氨酸激酶、非受体酪氨酸激酶、SH2/SH3域阻断剂、丝氨酸/苏氨酸激酶、磷脂酰肌醇-3激酶、肌醇信号转导和Ras致癌基因的抑制剂。

几种蛋白酪氨酸激酶在多种参与细胞生长调节的蛋白中催化特定酪氨酰残基的磷酸化。所述蛋白酪氨酸激酶可宽泛地分为受体或非受体激酶。

受体酪氨酸激酶是具有细胞外配体结合域、跨膜域和酪氨酸激酶域的跨膜蛋白。受体酪氨酸激酶参与细胞生长的调节且通常称为生长因子受体。许多这些激酶的不适当的或不受控制的活化，即异常的激酶生长因子受体活性，例如通过过度表达或突变引起的活性，已显示会导致不受控制的细胞生长。因此，所述激酶的异常活性与恶性组织生长相关。因此，所述激酶的抑制将提供癌症治疗方法。生长因子受体包括，例如，表皮生长因子受体(EGFr)、来自血小板的生长因子受体(PDGFr)、erbB2、erbB4、ret、血管内皮生长因子受体(VEGFr)、具有免疫球蛋白样和表皮生长因子标识域的酪氨酸激酶(TIE-2)、胰岛素生长因子-I(IGFI)受体、巨噬细胞集落刺激因子(cfms)、BTK、ckit、cmet、成纤维细胞生长因子(FGF)受体、Trk受体(TrkA、TrkB和TrkC)、ephrin(eph)受体和RET原癌基因。几种生长受体的抑制剂正在研发之中，且包括配体拮抗剂、抗体、酪氨酸激酶抑制剂和反义寡核苷酸。抑制生长因子受体功能的生长因子受体和药物公开于例如以下文献中：Kath,John C.,Exp.Opin.Ther.Patents(2000)10(6):803-818；Shawver等，DDT Vol 2,No.2February1997；和Lofts,F.J.等,“Growth factor receptors as targets”,New MolecularTargets for Cancer Chemotherapy(Workman,Paul和Kerr,David,CRC press 1994,London)。

不是生长因子受体激酶的酪氨酸激酶称为非受体酪氨酸激酶。用于本发明的非受体酪氨酸激酶(其为抗肿瘤剂的靶点或潜在靶点)，包括cSrc、Lck、Fyn、Yes、Jak、cAbl、FAK(粘着斑激酶)、布鲁顿氏酪氨酸激酶和Bcr-Abl。抑制非受体酪氨酸激酶功能的非受体激酶和药物公开于以下文献中：Sinh等人,Journal of Hematotherapy and Stem CellResearch,8(5):465–80(1999)；和Bolen等人,Annual review of Immunology,15:371-404(1997)。

SH2/SH3域阻断剂为在多种酶或衔接蛋白(包括PI3-K p85亚单位、Src家族激酶、衔接分子(Shc、Crk、Nck、Grb2)和Ras-GAP)中扰乱SH2或SH3域结合的药物。SH2/SH3域作为抗肿瘤剂的靶点于以下文献中讨论：Smithgall,T.E.,Journal of Pharmacological andToxicological Methods.34(3)125-32(1995)。

丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂包括MAP激酶级联阻断剂，其包括Raf激酶(rafk)、促分裂素或细胞外调节激酶(MEK)和细胞外信号调节激酶(ERK)的阻断剂；和蛋白激酶C家族成员阻断剂，包括PKC(α、β、γ、ε、μ、λ、ι、ζ)、IkB激酶家族(IKKa，IKKb)、PKB家族激酶、akt激酶家族成员和TGFβ受体激酶的阻断剂。所述丝氨酸/苏氨酸激酶及其抑制剂公开于以下文献中：Yamamoto等人，Journal of Biochemistry，126(5)799-803(1999)；Brodt等人，Biochemical Pharmacology，60.1101-1107(2000)；Massague等人，Cancer Surveys，27:41-64(1996)；Philip等人，Cancer Treatment and Research，78：3-27(1995)，Lackey等人，Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters，(10)223-226(2000)；美国专利号6,268,391；和Martinez-Iacaci等人，Int.J.Cancer，88(1)，44-52(2000)。

磷脂酰肌醇-3激酶家族成员的抑制剂包括PI3-激酶、ATM、DNA-PK和Ku的阻断剂，也可用于本发明中。所述激酶公开于以下文献中：Abraham,R.T.(1996),Current Opinionin Immunology.8(3)412-8；Canman,C.E.,Lim,D.S.(1998),Oncogene 17(25)3301-3308；Jackson,S.P.(1997),International Journal of Biochemistry and Cell Biology.29(7):935-8；和Zhong,H.等,Cancer Res,(2000)60(6),1541-1545。

本发明中有用的还有肌醇信号转导抑制剂，例如磷脂酶C阻断剂和肌醇类似物。这种信号抑制剂公开于以下文献中：Powis，G.和Kozikowski A.，(1994)New MolecularTargets for Cancer Chemotherapy ed.，Paul Workman和David Kerr，CRC press 1994，London。

另一类信号转导途径抑制剂是Ras致癌基因的抑制剂。所述抑制剂包括法呢基转移酶、香叶基-香叶基转移酶和CAAX蛋白酶抑制剂，以及反义寡核苷酸、核酶和免疫疗法。所述抑制剂已显示可在含野生型突变体ras的细胞中阻断ras活化，因而作用为抗增殖药物。Ras致癌基因抑制于以下文献中讨论：Scharovsky，等人(2000),Journal of BiomedicalScience.7(4)292-8；Ashby,M.N.(1998),Current Opinion in Lipidology.9(2)99–102；和BioChim.Biophys.Acta,(19899)1423(3):19-30。

如上所述，结合至受体激酶配体的抗体拮抗剂也可用作信号转导抑制剂。这类信号转导途径抑制剂包括将人源化抗体用于受体酪氨酸激酶的胞外配体结合域。例如Imclone C225 EGFR特异性抗体(参见Green等,Monoclonal Antibody Therapy for SolidTumors,Cancer Treat.Rev.,(2000),26(4),269-286)；

erbB2抗体(参见“Tyrosine Kinase Signalling in Breast cancer:erbB Family Receptor TyrosineKinases”,Breast Cancer Res.,2000,2(3),176-183)；和2CB VEGFR2特异性抗体(参见Brekken等,Selective Inhibition of VEGFR2Activity by a monoclonal Anti-VEGFantibody blocks tumor growth in mice,Cancer Res.(2000)60,5117-5124)。

抗血管生成药物，包括非受体MEK血管生成抑制剂，也是有用的。抗血管生成药物例如抑制血管内皮生长因子作用的那些药物(例如抗血管内皮细胞生长因子抗体贝伐单抗[Avastin^TM]和通过其他机理作用的化合物(例如利诺胺，整联蛋白αvβ3功能抑制剂、内皮抑制素和血管抑制素)；

用于免疫疗法方案的药物也可用于本发明。免疫疗法途径，包括例如离体和体内增加患者癌细胞的免疫原性的方法(例如用细胞因子如白介素2、白介素4或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子转染)、减少T细胞的无反应性的方法、使用转染的免疫细胞(例如细胞因子转染的树突状细胞)的方法、使用细胞因子转染的肿瘤细胞系的方法、和使用抗独特型抗体(antidiotypic antibodies)的方法。

用于凋亡前(proapoptotic)治疗方案的药物(促凋亡药物，例如，bcl-2反义寡核苷酸)也可用于本发明。

细胞周期信号传递抑制剂抑制参与细胞周期控制的分子。称为细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)的蛋白激酶家族及其与称为细胞周期蛋白的蛋白家族的相互作用，控制了整个真核细胞周期的进程。不同细胞周期蛋白/CDK复合物的配位活化和失活是整个细胞周期的正常进程所必需的。几种细胞周期信号传递抑制剂正在研发中。例如，细胞周期调节蛋白依赖性激酶的实例包括CDK2、CDK4和CDK6以及其抑制剂，例如公开于以下文献中：Rosania等,Exp.Opin.Ther.Patents(2000)10(2):215-230。

适合用本发明的乙酰胆碱通路调节剂治疗的癌症的实例包括但不限于头颈癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤癌、卵巢癌和前列腺癌的原发性和转移性形式。适当地，所述癌症选自：脑癌(神经胶质瘤)、恶性胶质瘤、星形细胞瘤、多形性恶性胶质瘤、Bannayan-Zonana综合征、考登病、Lhermitte-Duclos病、乳腺癌、炎性乳腺癌、维尔姆斯肿瘤、尤因肉瘤、横纹肌肉瘤、室管膜细胞瘤、成神经管细胞瘤、结肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、肝癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、骨肉瘤、骨巨细胞瘤、甲状腺癌、结肠直肠癌、成淋巴细胞T细胞白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、AML、慢性中性粒细胞性白血病、急性成淋巴细胞T细胞性白血病、浆细胞瘤、免疫母细胞大细胞白血病、套细胞白血病、多发性骨髓瘤巨核母细胞白血病、多发性骨髓瘤、急性巨核细胞白血病、前髓细胞性白血病、红白血病、恶性淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非-霍奇金淋巴瘤、成淋巴细胞T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、膀胱上皮癌、肺癌、外阴癌、子宫颈癌、子宫内膜癌、肾癌、间皮瘤、食管癌、唾液腺癌、肝细胞癌、胃癌、鼻咽癌、颊癌、口腔癌、GIST(胃肠道间质瘤)和睾丸癌。

此外，所治疗的癌症的实例包括Barret腺癌；胆道癌；乳腺癌；子宫颈癌；胆管癌；中枢神经系统肿瘤，包括原发性CNS肿瘤如成胶质细胞瘤，星形细胞瘤(例如，多形性成胶质细胞瘤)和室管膜瘤，和继发性CNS肿瘤(即，起源于中枢神经系统外部、转移至中枢神经系统的肿瘤)；结肠直肠癌，包括大肠结肠癌；胃癌；头颈癌，包括头与颈的鳞状上皮细胞癌；血液癌症，包括白血病和淋巴瘤如急性成淋巴细胞性白血病，急性骨髓性白血病(AML)，骨髓增生异常综合征，慢性骨髓性白血病，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，巨核母细胞白血病，多发性骨髓瘤和红白血病；肝细胞癌；肺癌，包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌；卵巢癌；子宫内膜癌；胰腺癌；垂体腺瘤；前列腺癌；肾癌；肉瘤；皮肤癌，包括黑色素瘤；和甲状腺癌。

适当地，本发明涉及治疗选自下列的癌症的方法：脑癌(神经胶质瘤)、恶性胶质瘤、星形细胞瘤、多形性恶性胶质瘤、Bannayan-Zonana综合征、考登病、Lhermitte-Duclos病、乳腺癌、结肠直肠癌、头颈癌、肾癌、肺癌、肝癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤和甲状腺癌。

在一些实施方案中，本发明涉及治疗选自下列的癌症的方法：肉瘤、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、成胶质细胞瘤、肺癌、乳腺癌、口腔癌、头颈癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胆囊癌、膀胱癌、胰腺癌、肠癌、结肠直肠癌、肾癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睾丸癌、颊癌、口咽癌、喉癌、前列腺癌、黑色素瘤、肾细胞癌(RCC)、结肠癌、肝细胞癌(HCC)、血液癌症和/或腺癌。

在一些实施方案中，本发明涉及治疗选自下列的癌症的方法：肺癌、乳腺癌、结肠直肠癌和黑色素瘤。

在一些实施方案中，本发明涉及治疗非小细胞肺癌的方法。在一些实施方案中，本发明涉及治疗存在EGFR突变和/或过表达、或者存在ALK突变和/或过表达的非小细胞肺癌的方法。

III.药物组合

本发明提供了乙酰胆碱通路调节剂与抗肿瘤剂的组合，其用于在有需要的受试者中治疗癌症。给药治疗有效量的本发明的组合(或治疗有效量的该组合的各组分)相对于仅给药单一组分是有利的，因为与单独给药治疗有效量的单一组分相比，该组合将会提供下列改进的性质中的一种或多种：i)与给药单一组分相比有更高的抗癌作用，ii)协同的或高度协同的抗癌活性，iii)提供增强的抗癌活性和减少的副作用的给药方案，或者iv)有效地抑制了癌症的复发。

在一些实施方案中，所述乙酰胆碱通路调节剂是乙酰胆碱受体抑制剂。

在一些实施方案中，所述乙酰胆碱受体抑制剂选自毒蕈碱型受体抑制剂和烟碱型受体抑制剂。

在一些实施方案中，所述毒蕈碱型受体抑制剂选自达非那新、苯扎托品、伊索拉定、甲基东莨菪碱、苯海索、丁溴东莨菪碱、哌仑西平、异丙托溴铵、氧托溴铵、噻托溴铵、阿托品、托吡卡胺、苯海拉明、双环胺、奥昔布宁、托特罗定、索非那新、溴丙胺太林、东莨菪碱、溴甲东莨菪碱、奥芬那君、后马托品、美噻吨、溴乙哌沙酯、咪达那新、非索罗定、其药学上可接受的盐、溶剂合物、前药、代谢物及它们的组合。

在一些实施方案中，所述烟碱型受体抑制剂选自MG624、美卡拉明、泮库溴铵、氯化琥珀胆碱、十烃溴铵、维库溴铵、泮库溴铵、氯化筒箭毒碱、樟磺咪芬、六甲溴铵、阿曲库铵、多沙氯铵、米库氯铵、右美沙芬、甲基牛扁亭、α-银环蛇毒素、α-芋螺毒素G1、苄醌铵、bPiDDB、其药学上可接受的盐、溶剂合物、前药、代谢物及它们的组合。

在一些实施方案中，所述乙酰胆碱通路调节剂为乙酰胆碱转运体抑制剂，例如2-(4-苯基哌啶基)环己醇(Vesamicol)。

在一些实施方案中，所述乙酰胆碱通路调节剂为胆碱转运体抑制剂，例如半胆碱基-3。

优选地，所述乙酰胆碱通路调节剂选自达非那新、甲磺酸苯扎托品、伊索拉定、甲基东莨菪碱、MG624、美卡拉明、泮库溴铵、2-(4-苯基哌啶基)环己醇(Vesamicol)、半胆碱基-3及它们的组合。

在一些实施方案中，所述抗肿瘤剂为表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂，包括例如耐昔妥珠单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、Imgatuzumab(RO5083945)、西妥昔单抗、吉非替尼、厄洛替尼、帕尼单抗(panitumumab)、埃克替尼、阿法替尼、达克替尼(PF-00299804)、奥希替尼、Rociletinib及它们的组合。

在一些实施方案中，所述抗肿瘤剂为渐变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂及它们的组合，包括例如克唑替尼、艾乐替尼、色瑞替尼、阿来替尼(Alectinib)、布格替尼(Brigatinib)、洛拉替尼(Lorlatinib)、洛普替尼(TPX-0005)及它们的组合。

在一些实施方案中，所述抗肿瘤剂为拉帕替尼或维莫非尼。

在一些实施方案中，所述抗肿瘤剂为5-氟尿嘧啶。

在一方面，本发明提供了乙酰胆碱通路调节剂与表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂的组合，其用于在有需要的受试者中治疗癌症，优选肺癌，更优选非小细胞肺癌，最优选具有EGFR突变和/或过表达的非小细胞肺癌。

在一些实施方案中，所述组合为乙酰胆碱受体抑制剂与EGFR抑制剂的组合。优选地，所述乙酰胆碱受体抑制剂选自达非那新、甲磺酸苯扎托品、伊索拉定、甲基东莨菪碱、MG624、美卡拉明、泮库溴铵、2-(4-苯基哌啶基)环己醇(Vesamicol)、半胆碱基-3及它们的组合，所述EGFR抑制剂选自奥希替尼、吉非替尼、厄洛替尼、Rociletinib(CO1686)及它们的组合。

在一方面，本发明提供了乙酰胆碱通路调节剂与渐变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂的组合，其用于在有需要的受试者中治疗癌症，优选肺癌，更优选非小细胞肺癌，最优选具有ALK突变和/或过表达的非小细胞肺癌。

在一些实施方案中，所述组合为乙酰胆碱受体抑制剂与ALK抑制剂的组合。优选地，所述乙酰胆碱受体抑制剂选自达非那新、甲磺酸苯扎托品、伊索拉定、甲基东莨菪碱、MG624、美卡拉明、泮库溴铵、2-(4-苯基哌啶基)环己醇(Vesamicol)、半胆碱基-3及它们的组合，所述ALK抑制剂选自色瑞替尼、艾乐替尼及它们的组合。

在一些实施方案中，本发明的组合可同时给药或以任何顺序独立给药。在一些实施方案中，可以先给药乙酰胆碱通路调节剂和抗肿瘤剂，然后仅给药乙酰胆碱通路调节剂。在一些实施方案中，可以先仅给药抗肿瘤剂，然后仅给药乙酰胆碱通路调节剂。在一些实施方案中，乙酰胆碱通路调节剂和抗肿瘤剂被同时给药。

在一些实施方案中，本发明的组合“在规定的期间内”给药。

如本文所使用的术语“规定的期间(specified period)”表示给药乙酰胆碱通路调节剂和抗肿瘤剂中的一种以及给药乙酰胆碱通路调节剂和抗肿瘤剂中的另一种之间的时间间隔。除非另有说明，规定的期间可以包括同时给药。除非另有说明，规定的期间是指在一天内给药乙酰胆碱通路调节剂和抗肿瘤剂。

适当地，如果在“规定的期间”内给药所述化合物而不同时给药，它们均可以在彼此相隔约24小时内给药–在该情况中，所述规定的期间将为约24小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约12小时内给药–在该情况中，所述规定的期间将为约12小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约11小时内给药–在该情况中，所述规定的期间将为约11小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约10小时内给药–在该情况中，所述规定的期间将为约10小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约9小时内给药–在该情况中，所述规定的期间将为约9小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约8小时内给药–在该情况中，所述规定的期间将为约8小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约7小时内给药–在该情况中，所述规定的期间将为约7小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约6小时内给药–在该情况中，所述规定的期间将为约6小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约5小时内给药–在该情况中，所述规定的期间将为约5小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约4小时内给药–在该情况中，所述规定的期间将为约4小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约3小时内给药–在该情况中，所述规定的期间将为约3小时；适当地，它们可以在彼此相隔约2小时内给药–在该情况中，所述规定的期间将为约2小时；适当地，它们均可以在彼此相隔约1小时内给药–在该情况中，所述规定的期间将为约1小时。如本发明所使用的，乙酰胆碱通路调节剂和抗肿瘤剂的给药相隔小于约45分钟被认为是同时给药。

适当地，当本发明的组合以一段“规定的期间”给药时，各化合物共同给药一段“持续时间”。

如本文所使用的术语“持续时间”表示本发明的两种化合物连续给药指定数目的天数。除非另有说明，连续的天数不必须是在治疗起点开始或治疗终点结束，它只需要在治疗过程中的某时间点出现连续的天数。

关于“规定的期间”给药：适当地，两种化合物在规定的期间内给药至少一天–在该情况中，所述持续时间为至少一天；适当地，在治疗过程中，两种化合物在规定的期间内给药至少连续3天–在该情况中，所述持续时间为至少3天；适当地，在治疗过程中，两种化合物在规定的期间内给药至少连续5天–在该情况中，所述持续时间为至少5天；适当地，在治疗过程中，两种化合物在规定的期间内给药至少连续7天–在该情况中，所述持续时间为至少7天；适当地，在治疗过程中，两种化合物在规定的期间内给药至少连续9天–在该情况中，所述持续时间为至少9天；适当地，在治疗过程中，两种化合物在规定的期间内给药至少连续14天–在该情况中，所述持续时间为至少14天；适当地，在治疗过程中，两种化合物在规定的期间内给药至少连续30天–在该情况中，所述持续时间为至少30天。

适当地，如果所述化合物不在“规定的期间内”给药，那么它们就是顺序给药。如本文所使用的术语“顺序给药”表示每天给药一次乙酰胆碱通路调节剂和抗肿瘤剂中的一种，持续连续两天或更多天，接着每天给药一次乙酰胆碱通路调节剂和抗肿瘤剂中的另一种，持续连续两天或更多天。同样地，本发明还包括在顺序给药乙酰胆碱通路调节剂和抗肿瘤剂中的一种以及给药乙酰胆碱通路调节剂和抗肿瘤剂中的另一种之间所使用的休药期。如本发明所使用的，休药期为在顺序给药乙酰胆碱通路调节剂和抗肿瘤剂中的一种之后和在给药乙酰胆碱通路调节剂和抗肿瘤剂中的另一种之前不给药乙酰胆碱通路调节剂也不给药抗肿瘤剂的间隔天数。休药期为选自以下的一段天数：1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天和14天。

关于顺序给药(sequential administration)：适当地，给药乙酰胆碱通路调节剂和抗肿瘤剂中的一种连续1至30天，接着是任选的休药期，接着给药乙酰胆碱通路调节剂和抗肿瘤剂中的另一种连续1至30天。适当地，给药乙酰胆碱通路调节剂和抗肿瘤剂中的一种连续1至21天，接着是任选的休药期，接着给药乙酰胆碱通路调节剂和抗肿瘤剂中的另一种连续1至21天。适当地，给药乙酰胆碱通路调节剂和抗肿瘤剂中的一种连续1至14天，接着是1至14天的休药期，接着给药乙酰胆碱通路调节剂和抗肿瘤剂中的另一种连续1至14天。适当地，给药乙酰胆碱通路调节剂和抗肿瘤剂中的一种连续1至7天，接着是1至10天的休药期，接着给药乙酰胆碱通路调节剂和抗肿瘤剂中的另一种连续1至7天。

适当地，在该顺序中抗肿瘤剂首先给药，接着是任选的休药期，接着给药乙酰胆碱通路调节剂。适当地，给药抗肿瘤剂连续3至21天，接着是任选的休药期，接着给药乙酰胆碱通路调节剂连续3至21天。适当地，给药抗肿瘤剂连续3至21天，接着是1至14天的休药期，接着给药乙酰胆碱通路调节剂连续3至21天。适当地，给药抗肿瘤剂连续3至21天，接着是3至14天的休药期，接着给药乙酰胆碱通路调节剂连续3至21天。适当地，给药抗肿瘤剂连续21天，接着是任选的休药期，接着给药乙酰胆碱通路调节剂连续14天。适当地，给药抗肿瘤剂连续14天，接着是1至14天的休药期，接着给药乙酰胆碱通路调节剂连续14天。适当地，给药抗肿瘤剂连续7天，接着是3至10天的休药期，接着给药乙酰胆碱通路调节剂连续7天。适当地，给药抗肿瘤剂连续3天，接着是3至14天的休药期，接着给药乙酰胆碱通路调节剂连续7天。适当地，给药抗肿瘤剂连续3天，接着是3至10天的休药期，接着给药乙酰胆碱通路调节剂连续3天。

应当理解，“规定的期间”给药和“顺序”给药之后可以为重复给药或者可以接着交替的给药方案，休药期可以在重复给药或交替的给药方案之前。

本发明的组合还可以与其他抗癌治疗一起使用，所述抗癌治疗如以上所定义。

本发明的乙酰胆碱通路调节剂与抗肿瘤剂可以通过任何适合的途径给药。合适的途径包括口服、经直肠、经鼻、局部(包括含服(buccal)和舌下)、瘤内、腹腔内、经阴道和肠胃外(包括皮下、肌内、静脉内、真皮内、鞘内和硬膜外)。可以理解优选途径可随着例如该组合的受试者的状况和所治疗的癌症而变化。还可以理解所施用的各个药物可以通过相同或不同的途径给药。

IV.药物组合物

乙酰胆碱通路调节剂与抗肿瘤剂可以一起配制成药物组合物。所述药物组合物包含所述乙酰胆碱通路调节剂和至少一种药学上可接受的载剂。药学上可接受的载剂可包括药学上可接受的载体、佐剂和/或其他赋形剂，并可被视为药学上可接受的其他成分，只要它们与该制剂的其他成分相容且对其接受者无害。

本文所述的乙酰胆碱通路调节剂与抗肿瘤剂的药物组合物可使用任意常规方法制备，例如，混合、溶解、制粒、制锭、研磨、乳化、包封、包埋、熔纺、喷雾干燥或冻干工艺。最佳药物制剂可由本领域技术人员根据给药途径和所需剂量进行确定。这种制剂可影响所施用的药物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除率。根据所治疗的病症，可配制这些药物组合物并全身给药或局部给药。

术语“载体”是指稀释剂、崩解剂、沉淀抑制剂、表面活性剂、助流剂、粘合剂、润滑剂以及与所述化合物一起施用的其他赋形剂和载剂。载体在本文以及在E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”中进行一般性描述。载体的实例包括，但不限于，单硬脂酸铝、硬脂酸铝、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、交聚维酮、异硬脂酸甘油酯、单硬脂酸甘油酯、羟乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、羟基二十八烷醇羟基硬脂酸酯、羟丙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、乳糖一水合物、硬脂酸镁、甘露醇、微晶纤维素、泊洛沙姆124、泊洛沙姆181、泊洛沙姆182、泊洛沙姆188、泊洛沙姆237、泊洛沙姆407、聚维酮、二氧化硅、胶体二氧化硅、硅酮、硅酮粘合剂4102和硅酮乳液。但是，应理解，该药物组合物中所选定的载体以及这种载体在所述组合物中的量可根据制剂的方法而变化(例如，干法制粒制剂、固体分散制剂)。

术语“稀释剂”通常是指在递送前用于稀释感兴趣的化合物的物质。稀释剂也可用于稳定化合物。稀释剂的实例可包括淀粉、糖、二糖、蔗糖、乳糖、多糖、纤维素、纤维素醚、羟丙基纤维素、糖醇、木糖醇、山梨糖醇、麦芽糖醇、微晶纤维素、碳酸钙或碳酸钠、乳糖、乳糖一水合物、磷酸二钙、纤维素、可压缩糖、无水磷酸氢钙、甘露醇、微晶纤维素和磷酸钙。

术语“崩解剂”通常是指这样一种物质，其一旦加至固体制剂，则在给药后促进该固体制剂的分裂或崩解并使得活性成分尽可能有效地释放以允许其快速溶出。崩解剂的实例可包括玉米淀粉、羧甲基淀粉钠、交联羧甲纤维素钠、交聚维酮、微晶纤维素、改性的玉米淀粉、羧甲基淀粉钠、聚维酮、预胶化淀粉和海藻酸。

术语“沉淀抑制剂”通常是指防止或抑制所述活性剂从过饱和溶液中沉淀的物质。沉淀抑制剂的一个实例包括羟丙基甲基纤维素(HPMC)。

术语“表面活性剂”通常是指降低液体和固体之间的表面张力的物质，其可提高所述活性剂的湿度或提高所述活性剂的溶解度。表面活性剂的实例包括泊洛沙姆和月桂基硫酸钠。

术语“助流剂”通常是指用于片剂和胶囊制剂中以提高压片过程中的流动性并产生抗结块作用的物质。助流剂的实例可包括胶体二氧化硅、滑石、烟雾硅胶、淀粉、淀粉衍生物和膨润土。

术语“粘合剂”通常是指任意可用于将所述活性成分和载体的惰性成分粘合在一起以维持粘合和分离的部分的药学上可接受的物质，其可用于将所述活性成分和载体的惰性成分粘合在一起以维持粘合和分离的部分。粘合剂的实例可包括羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚维酮、共聚维酮和乙基纤维素。

术语“润滑剂”通常是指加至粉末共混物中以防止在压片或包封过程中被压实的粉块粘到设备上的物质。润滑剂可帮助所述片剂从模具中取出并可提高粉末流动。润滑剂的实例可包括硬脂酸镁、硬脂酸、二氧化硅、脂肪、硬脂酸钙、聚乙二醇、硬脂酰富马酸钠或滑石；和增溶剂，例如脂肪酸，包括月桂酸、油酸和C₈/C₁₀脂肪酸。

V.试剂盒

本发明提供了一种试剂盒，其包含含有乙酰胆碱通路调节剂的第一组合物以及含有抗肿瘤剂的第二组合物。所述第一和第二组合物以适于顺序、分开和/或同时给药的形式提供。

本发明的试剂盒可包含：含有乙酰胆碱通路调节剂及药学上可接受载体的第一容器；含有抗肿瘤剂及药学上可接受载体的第二容器；以及用于容纳所述第一容器和第二容器的容器装置。

本发明中所述的试剂盒可包括各自单独包装或配制的单剂量或多剂量的二种或更多种药剂；或以组合形式包装或配制的单剂量或多剂量的二种或更多种药剂。因此，一种或多种药剂可存在于第一容器中，且试剂盒可任选在第二容器中包括一种或多种药剂。一个或多个容器置于包装内，且包装可任选包括给药或剂量说明书。试剂盒可包括额外组件，诸如注射器或用于给药药剂以及稀释剂的其它构件或用于配制的其它构件。因此，试剂盒可包含：a)包含本发明中所述的乙酰胆碱通路调节剂及药学上可接受的载体、媒介物或稀释剂的药物组合物；b)包含本发明中所述的抗肿瘤剂及药学上可接受的载体、媒介物或稀释剂的药物组合物；及c)容器或包装。试剂盒可任选包含说明书，其描述在本发明中所述的一种或多种方法中使用药物组合物的方法(例如，预防或治疗本发明中所述的一种或多种疾病及障碍)。试剂盒可任选包含额外的药物组合物，其包含一种或多种本发明中所述的用于辅疗法用途的额外药剂、药学上可接受的载体、媒介物或稀释剂。包含本发明中所述的化合物的药物组合物及试剂盒中容纳的第二药物组合物可任选组合在同一药物组合物中。

试剂盒包括用于容纳药物组合物的容器或包装，且也可包括分开的容器，诸如分开的瓶或分开的箔片包。容器可为例如纸或纸板盒、玻璃或塑料的瓶或罐、可再密封袋(例如，以保持向不同的容器中“再填充”片剂)或泡罩包装，该泡罩包装具有单独剂量以根据治疗时程从包装中压出。可行的是，可将多于一个容器一起用于单一包装以销售单一剂型。例如，片剂可容纳在一个瓶中，该瓶继而又被容纳在盒内。

试剂盒的实例为所谓的泡罩包装。包装工业中熟知泡罩包装且正将其广泛用于包装药物单位剂型(片剂、胶囊及类似物)。泡罩包装通常由相对硬的材料片材与覆盖其的优选透明塑料材料的箔片组成。在包装过程期间，于塑料箔片中形成凹部。该凹部具有欲包装的单独片剂或胶囊的尺寸及形状，或可具有适应欲包装的多个片剂和/或胶囊的尺寸及形状。接着，将片剂或胶囊相应地置于所述凹部中且将相对硬的材料片材密封于塑料箔片的与形成凹部的方向相对的箔片面上。因此，根据需要将片剂或胶囊分别密封或共同密封于介于塑料箔片与片材之间的凹部中。优选地，片材的强度使得片剂或胶囊可通过手动施压于凹部由此于片材中凹部的位置处形成开口从而自泡罩包装移除。接着可经由该开口移除片剂或胶囊。

可希望为医师、药剂师或受试者提供含有关于何时服用药物的信息和/或说明的书面记忆帮助物。“日剂量”可为给定日服用的单个片剂或胶囊或若干片剂或胶囊。当试剂盒含有分开的组合物时，试剂盒的一种或多种组合物的日剂量可由一个片剂或胶囊组成，而试剂盒的另一种或多种组合物的日剂量可由若干片剂或胶囊组成。试剂盒可采取分配器的形式，该分配器是设计成按其旨在使用的次序一次一个地分配日剂量。分配器可配备记忆辅助物，以便进一步促进与方案的依从性。此种记忆帮助物的实例为机械计数器，其指示已经分配的日剂量的数目。此种记忆帮助物的另一个实例为与液晶读出器耦接的电池供电微芯片内存或可听式提醒信号，该可听式提醒信号例如读出已服用上一次日剂量的日期和/或提醒何时要服用下一剂量。

实施例

以下实施例用来阐明本发明的实施方案，且所述实施例不旨在限定本发明的范围。本领域技术人员应理解，本文公开的技术表示的是用于实施本发明的技术。本领域技术人员将理解，根据本发明，在不脱离本发明的精神和范围内可对本发明的实施例进行修改。

实施例1：构建EGFR突变靶向药物的药物耐受细胞模型

选择非小细胞肺癌细胞系PC9和HCC827，使用高剂量(2μM)的EGFR突变靶向药物奥希替尼和吉非替尼(购自Selleck公司)处理PC9和HCC827细胞，每3天换一次培养基，共处理9天。药物处理过程中，大量对药物敏感的细胞死亡，只有一小部分对药物耐受的细胞存活，该细胞群体为药物耐受细胞。

图1A为诱导非小细胞肺癌药物耐受细胞示意图。

实施例2：检测亲本细胞和药物耐受细胞对靶向药的敏感性

将PC9和HCC827的亲本细胞和药物耐受细胞以3×10⁴个细胞/ml接种于96孔板，24h后加入不同浓度的吉非替尼和奥希替尼，浓度分别是0μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM，每个浓度设置5个复孔。在72h后，加入CellTiter-Glo细胞活力检测试剂(Promega公司)，每孔加入30μL。将96孔板震荡5分钟，随后在室温静置5分钟，共孵育10分钟。使用酶标仪检测发光值。

图1B为细胞活力实验结果，其中显示，在非小细胞肺癌细胞系PC9的药物耐受细胞模型中，与亲本细胞相比，药物耐受细胞对靶向药(吉非替尼和奥希替尼)的敏感性显著降低。在1μM奥希替尼处理下，PC9药物耐受细胞的存活率为100％，但是PC9亲本细胞的存活率仅为40.9％。在1μM吉非替尼处理下，PC9药物耐受细胞的存活率为78％，但是PC9亲本细胞的存活率仅为48％。

图1C为细胞活力实验结果，其中显示，在非小细胞肺癌细胞系HCC827的药物耐受细胞模型中，与亲本细胞相比，药物耐受细胞对靶向药(吉非替尼和奥希替尼)的敏感性同样显著降低。在1μM奥希替尼处理下，HCC827药物耐受细胞的存活率为87％，但是HCC827亲本细胞的存活率仅为33％。在1μM吉非替尼处理下，HCC827药物耐受细胞的存活率为82.2％，但是HCC827亲本细胞的存活率仅为42.6％。以上结果提示，药物耐受细胞对靶向药的敏感性显著低于亲本细胞。

实施例3：亲本细胞和药物耐受细胞的LC/MS分析

选择非小细胞肺癌细胞系PC9和HCC827，使用高剂量(2μM)的EGFR突变靶向药物吉非替尼和奥希替尼处理细胞，每3天换一次培养基，共处理9天，获得药物耐受细胞。

为测定药物耐受细胞与亲本细胞之间的差异代谢物，提取亲本细胞和药物耐受细胞的代谢物：将1mL含有内标的-80℃甲醇-水(80:20,V/V)溶液加入到细胞培养皿中(约150万细胞)，在-80℃放置20min，将培养皿置于干冰上操作，采用细胞刮刀收集细胞混悬体系样品，以15000rpm、4℃离心15min，取上清800μL，真空浓缩至干燥，-80℃储存。样品前处理：采用56μL流动相A溶解各样品，涡旋1min，以15000rpm、4℃离心15min，取50μL上清液，置于液相小瓶套管中。代谢物的定量分析：采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)方法进行分析，液相方法使用Waters ACQUITY UPLC HSS T3(1.8μm,2.1x 5mm)保护柱、Waters ACQUITY UPLCHSS T3(1.8μm,2.1x 150mm)色谱柱；以含0.03％甲酸的水相(A)和含0.03％甲酸的乙腈(B)为流动相，按照如下梯度进行洗脱：0-3min，1％B；3-15min，1％-99％B；15-17min，99％B；17-17.1min，99％-1％B；17.1-20min，1％B；柱温：35℃；进样室温度:4℃；流速:0.25mL/min，进样体积：20μL。质谱方法采用三重四级杆质谱仪(AB SCIEX QTRAP 6500PLUS)结合多反应监测(MRM)模式，预先通过针泵进样优化目的化合物乙酰胆碱和内标(氘代胆碱)的母离子、子离子以及碰撞能量等质谱参数，然后采用内标法对目的化合物进行定量分析。数据处理：使用数据处理软件MultiQuant 3.0.2进行色谱峰的积分、标曲的制作和浓度的计算。

图2显示，PC9亲本细胞中乙酰胆碱的含量为0.387皮摩尔/10⁵细胞，PC9药物耐受细胞中乙酰胆碱的含量为13.03皮摩尔/10⁵细胞。由此可见，药物耐受细胞中乙酰胆碱的含量显著高于亲本细胞。

实施例4：检测体内药物耐受模型的乙酰胆碱的含量

为进一步确定体内药物耐受模型中乙酰胆碱含量的变化，使用PC9细胞构建裸鼠移植瘤模型。使用胰酶消化PC9细胞，终止消化并离心后用5ml冷的1xPBS重悬。每只小鼠需注射5x10⁶个细胞。将预冷的PBS和Matrigel按照1:1的比例在冰上混匀，并将细胞重悬达到终浓度为5x10⁷个细胞/ml。将100μL肿瘤细胞悬液注射到小鼠皮下。给药方案是：使用1％的羧甲基硝酸纤维素钠溶液配制奥希替尼，采用灌胃法以5mg/kg/天的奥希替尼处理小鼠，对照组则采取1％的羧甲基纤维素钠处理小鼠。连续给药9天后收集药物耐受组和对照组的肿瘤组织。此外，我们采用上海立迪生物技术公司构建的人源性肺癌体内移植瘤(patient-derived xenografts,PDX)模型，模型编号是LD1-0006-217645，患者为女性，年龄62岁，病理诊断为肺癌-低中分化腺癌，EGFR突变类型是Exon 19deletion(T790M)。使用1％的羧甲基硝酸纤维素钠溶液配制奥希替尼，采用灌胃法以5mg/kg/天的奥希替尼处理小鼠，对照组则采取1％的羧甲基纤维素钠处理小鼠。连续给药28天后收集药物耐受组和对照组的肿瘤组织。

为测定药物耐受组与对照组的组织之间的乙酰胆碱含量，提取组织的代谢物：将新鲜的组织样品收集至冻存管中，迅速放入液氮冷冻，为了提取组织代谢物，每个组织称取20～30mg至EP管中，记录组织重量，配置一定浓度内标(氘代胆碱)的-80℃甲醇-水(80:20,V/V)溶液，按照1mg组织中加入50μL甲醇溶液比例加入含有内标的甲醇溶液，加入研磨珠，之后使用匀浆器进行组织匀浆，将匀浆液收集至新的EP管中，使用涡旋仪进行剧烈涡旋1min，以15000rpm、4℃离心15min，取上清800μL，真空浓缩至干燥，-80℃储存。样品前处理：采用水溶解各样品，涡旋1min，以15000rpm、4℃离心15min，取50μL上清液，置于液相小瓶套管中。代谢物的定量分析：采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)方法进行分析，液相方法使用Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC(2.1mm×5mm,1.7μm)保护柱、Waters ACQUITY UPLC BEHHILIC(2.1mm×100mm,1.7μm)ACQUITY UPLC色谱柱；以含5mM甲酸铵的水-乙腈(5:95)(A)和含5mM甲酸铵的水-乙腈(50:50)(B)为流动相，按照如下梯度进行洗脱：0-3min，1％B；3-15min，1％-99％B；15-17min，99％B；17-17.1min，99％-1％B；17.1-20min，1％B；柱温：35℃；进样室温度:4℃；流速:0.5mL/min，进样体积：10μL。质谱方法采用三重四级杆质谱仪(AB SCIEX QTRAP 6500PLUS)结合多反应监测(MRM)模式，预先通过针泵进样优化目的化合物乙酰胆碱和内标的母离子、子离子以及碰撞能量等质谱参数，然后采用内标法对目的化合物进行定量分析。数据处理：使用数据处理软件MultiQuant 3.0.2进行色谱峰的积分、标曲的制作和浓度的计算。

图3A显示，PC9裸鼠药物耐受组中乙酰胆碱含量为261.24pg/mg，对照组中乙酰胆碱含量为15.35pg/mg，由此可见，PC9药物耐受组的肿瘤组织中乙酰胆碱含量显著高于对照组肿瘤组织，表明PC9裸鼠模型在靶向药处理后形成的药物耐受肿瘤组织中乙酰胆碱含量显著升高。

图3B显示，PDX-217645模型药物耐受组中乙酰胆碱含量为54.69pg/mg，对照组中乙酰胆碱含量为9.73pg/mg，由此可见，PDX-217645模型药物耐受组肿瘤组织中乙酰胆碱含量显著高于对照组肿瘤组织，表明PDX模型在靶向药处理后形成的药物耐受肿瘤组织中乙酰胆碱含量显著升高。

实施例5：亲本细胞和药物耐受细胞分泌至细胞外的乙酰胆碱含量检测

为确认亲本细胞和药物耐受细胞分泌至细胞外的乙酰胆碱的含量，我们了培养亲本细胞和药物耐受细胞，并加入50μM乙酰胆碱脂酶(ACHE)的抑制剂溴新斯的明(Neostigmine Bromide)。培养9天后收集上层培养基并提取了培养基的代谢物。首先，配置一定浓度内标(氘代胆碱)的甲醇溶液，按照100μL培养基中加入400μL甲醇溶液比例加入含有内标的甲醇溶液，使用涡旋仪进行剧烈涡旋1min，以15000rpm、4℃离心15min，取上清400μL，真空浓缩至干燥，-80℃储存。样品前处理：采用水溶解各样品，涡旋1min，以15000rpm、4℃离心15min，取50μL上清液，置于液相小瓶套管中。代谢物的定量分析：采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)方法进行分析，液相方法使用Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC(2.1mm×5mm,1.7μm)保护柱、Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC(2.1mm×100mm,1.7μm)ACQUITYUPLC色谱柱；以含5mM甲酸铵的水-乙腈(5:95)(A)和含5mM甲酸铵的水-乙腈(50:50)(B)为流动相，按照如下梯度进行洗脱：0-3min，1％B；3-15min，1％-99％B；15-17min，99％B；17-17.1min，99％-1％B；17.1-20min，1％B；柱温：35℃；进样室温度:4℃；流速:0.5mL/min，进样体积：10μL。质谱方法采用三重四级杆质谱仪(AB SCIEX QTRAP 6500PLUS)结合多反应监测(MRM)模式，预先通过针泵进样优化目的化合物乙酰胆碱和内标的母离子、子离子以及碰撞能量等质谱参数，然后采用内标法对目的化合物进行定量分析。数据处理：使用数据处理软件MultiQuant 3.0.2进行色谱峰的积分、标曲的制作和浓度的计算。

图4显示PC9亲本细胞和药物耐受细胞培养基中的乙酰胆碱的含量。其中显示，和PC9亲本细胞相比，药物耐受细胞分泌至细胞外的乙酰胆碱含量显著升高。以上结果表明，靶向药诱导后的药物耐受细胞合成和分泌至细胞外的乙酰胆碱含量均显著增多。

实施例6：具有EGFR突变的非小细胞肺癌患者在靶向治疗前后的血浆中乙酰胆碱含量检测

我们从广西医科大学附属肿瘤医院以及上海肺科医院共纳入22例具有EGFR突变的非小细胞肺癌患者，收集患者在靶向药治疗前后的血浆样品，并提取血浆代谢物。首先，配置一定浓度内标(氘代胆碱)的甲醇溶液，按照100μL血浆中加入400μL甲醇溶液比例加入含有内标的甲醇溶液，使用涡旋仪进行剧烈涡旋1min，以15000rpm、4℃离心15min，取上清400μL，真空浓缩至干燥，-80℃储存。样品前处理：采用水溶解各样品，涡旋1min，以15000rpm、4℃离心15min，取50μL上清液，置于液相小瓶套管中。代谢物的定量分析：采用液相色谱-质谱联用(LC-MS)方法进行分析，液相方法使用Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC(2.1mm×5mm,1.7μm)保护柱、Waters ACQUITY UPLC BEH HILIC(2.1mm×100mm,1.7μm)ACQUITY UPLC色谱柱；以含5mM甲酸铵的水-乙腈(5:95)(A)和含5mM甲酸铵的水-乙腈(50:50)(B)为流动相，按照如下梯度进行洗脱：0-3min，1％B；3-15min，1％-99％B；15-17min，99％B；17-17.1min，99％-1％B；17.1-20min，1％B；柱温：35℃；进样室温度:4℃；流速:0.5mL/min，进样体积：10μL。质谱方法采用三重四级杆质谱仪(AB SCIEX QTRAP 6500PLUS)结合多反应监测(MRM)模式，预先通过针泵进样优化目的化合物乙酰胆碱和内标的母离子、子离子以及碰撞能量等质谱参数，然后采用内标法对目的化合物进行定量分析。数据处理：使用数据处理软件MultiQuant 3.0.2进行色谱峰的积分、标曲的制作和浓度的计算。

图5A显示8例患者在靶向治疗前血浆中乙酰胆碱的含量的平均值为1.11nM，而6例患者在靶向治疗后血浆中乙酰胆碱的含量的平均值为2.63nM。图5B显示在8例患者在靶向治疗后血浆中乙酰胆碱的含量高于该患者在靶向治疗前血浆中乙酰胆碱的含量。以上结果显示，具有EGFR突变的非小细胞肺癌患者在靶向治疗后血浆中乙酰胆碱的含量高于靶向治疗前血浆中乙酰胆碱的含量，表明非小细胞肺癌患者血浆中的乙酰胆碱水平具有预测靶向治疗药物耐受形成的潜在生物标志物功能。

实施例7：检测药物耐受细胞中乙酰胆碱通路关键酶的表达

如本发明所述，乙酰胆碱由胆碱和乙酰辅酶A在胆碱乙酰转移酶(ChAT)的作用下合成，乙酰胆碱由乙酰胆碱酯酶(ACHE)分解为胆碱和乙酸。乙酰胆碱可由乙酰胆碱转运体(VAChT)分泌至细胞外。乙酰胆碱可与细胞表面乙酰胆碱受体结合，激活细胞内信号通路，调控细胞的功能。

为确定药物耐受细胞中乙酰胆碱含量上调的原因，使用Western免疫印迹技术检测亲本细胞和药物耐受细胞中胆碱乙酰转移酶(ChAT)和乙酰胆碱酯酶(ACHE)的表达。选择非小细胞肺癌细胞系PC9，使用高剂量(2μM)的EGFR突变靶向药物处理细胞，每3天换一次培养基，共处理9天，获得药物耐受细胞。使用蛋白裂解液重悬细胞，置于冰上裂解30分钟，在4℃，14000rpm的条件下离心15分钟，离心后获得蛋白裂解液。通过SDS-PAGE分离裂解物，通过免疫印迹实验检测乙酰转移酶(ChAT)和乙酰胆碱酯酶(ACHE)的表达。ACHE抗体购自于Abcam公司，ChAT抗体购于Proteintech公司。

图6A为在PC9细胞中ChAT的免疫印迹实验结果，其中的条道从左到右分别对应于PC9亲本细胞、使用吉非替尼、厄洛替尼、奥希替尼和Rociletinib(CO1686)诱导的药物耐受细胞。其结果显示药物耐受细胞中胆碱乙酰转移酶(ChAT)表达显著上调。

图6B为在PC9和HCC827细胞中AChE的免疫印迹实验结果，其中的条道从左到右分别对应于：亲本细胞、使用吉非替尼和奥希替尼诱导的药物耐受细胞，每组一式两份。其结果显示药物耐受细胞中乙酰胆碱酯酶(AChE)无明显变化。

图6A和6B的结果显示药物耐受细胞中乙酰胆碱合成速率增加，导致其在细胞内积累。

实施例8：检测药物耐受细胞Wnt通路相关基因的表达

选择非小细胞肺癌细胞系PC9，使用高剂量(2μM)的EGFR突变靶向药物奥希替尼处理细胞，每3天换一次培养基，共处理9天，获得药物耐受细胞。使用Trizol法提取RNA：Trizol裂解液转入EP管中,在室温下放置5分钟；在EP管中，按照每1mL Trizol加0.2mL氯仿的比例加入相应体积氯仿(即为1/5体积)，盖上EP管盖子,在手中用力震荡15秒，在室温下放置2分钟后，14000rpm，4℃，离心15分钟。取上层水相与0.5mL异丙醇充分混合，静置沉淀RNA，14000rpm(4℃)离心15分钟，获取RNA。提取的亲本细胞和药物耐受细胞的RNA由诺和致源公司进行转录组测序。

图7A显示了RNAseq分析结果，其中表明，Wnt配体基因Wnt3a，Wnt10a，Wnt8b，Wnt6在药物耐受细胞中的表达是亲本细胞的4倍以上。

使用实时荧光定量PCR技术验证药物耐受细胞Wnt通路相关基因在mRNA水平的表达，包括Wnt配体：Wnt3a，Wnt10a，Wnt4，Wnt6，Wnt5b，Wnt8b，Wnt7b，Wnt9a，和Wnt通路靶基因：s100a4，sox2，KLF4，BCL2L1，CD133。实时荧光定量PCR检测试剂盒购于Biorad公司。引物由睿博兴科公司合成，引物序列为：

Wnt4-F，TCAGAGGCCCTCATGAACCT

Wnt4-R，CACCCGCATHTHTHTCAG

Wnt6-F，AGAGTGCCAGTTCCAGTTCC

Wnt6-R，AGAGTGCCAGTTCCAGTTCC

Wnt10a-F，CCCAATGACATTCTGGACCT

Wnt10a-R，TAAGCGGTGCAGCTTCCTAC

Wnt3a-F，TCAGCTGCCAGGAGTGCACG

Wnt3a-R，CGCCCTCAGGGAGCAGCCTAC

Wnt5b-F，GCTTCTGACAGACGCCAACT

Wnt5b-R，CACCGATGATAAACATCTCGGG

Wnt8b-F，CCGACACCTTTCGCTCCATC

Wnt8b-R，CAGCCCTAGCGTTTTGTTCTC

Wnt7b-F，GAAGCAGGGCTACTACAACCA

Wnt7b-R，CGGCCTCATTGTTATGCAGGT

Wnt9a-F，AGCAGCAAGTTCGTCAAGGAA

Wnt9a-R，CCTTCACACCCACGAGGTTG

S100a4-F，AACTAAAGGAGCTGCTGACCC

S100a4-R，TGTTGCTGTCCAAGTTGCTC

Sox2-F，CAAGATGCACAACTCGGAGA

Sox2-R，GCTTAGCCTCGTCGATGAAC

KLF4-F，CGAACCCACACAGGTGAGAA

KLF4-R，TACGGTAGTGCCTGGTCAGTTC

BCL2L1-F，TTGCCAGCCGGAACCTATG

BCL2L1-R，CGAAGGCGACCAGCAATGATA

CD133-F，TTACGGCACTCTTCACCT

CD133-R，TATTCCACAAGCAGCAAA

GAPDH-F，CCTGTTCGACAGTCAGCCG

GAPDH-R，CCTGTTCGACAGTCAGCCG

实时荧光定量PCR反应体系为：

使用StepOnePlus实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)检测相应mRNA的水平，反应条件如下：94℃5min；94℃10s，60℃30s，进行40个循环。根据实验结果中的Ct值，根据2-ΔΔCt法，并以GAPDH为内参基因，对样品中所测基因的mRNA水平进行相对定量分析。

图7B为实时荧光定量PCR结果，药物耐受细胞中Wnt配体Wnt3a、Wnt10a、Wnt4、Wnt6、Wnt5b、Wnt8b、Wnt7b、Wnt9a和Wnt信号通路靶基因s100a4、sox2、KLF4、BCL2L1、CD133的表达显著高于亲本细胞。该结果表明，在药物耐受细胞中Wnt通路被激活。

实施例9：检测外源乙酰胆碱对非小细胞肺癌亲本细胞中Wnt通路相关基因表达的影响

首先使用10μM和100μM的乙酰胆碱对HCC827细胞进行处理，共7天。使用Trizol法提取细胞的RNA，进行实时荧光定量PCR实验检测处理前后Wnt通路相关基因在mRNA水平的表达，包括Wnt配体：Wnt3a、Wnt10a、Wnt4、Wnt6、Wnt9a和Wnt通路靶基因：s100a4、KLF4、BCL2L1。实时荧光定量PCR检测试剂盒购于Biorad公司。引物由睿博兴科公司合成，引物序列与上述相同。

实时荧光定量PCR反应体系为：

使用StepOnePlus实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)检测相应mRNA的水平，反应条件如下：94℃5min；94℃10s，60℃30s，进行40个循环。根据实验结果中的Ct值，根据2-ΔΔCt法，并以GAPDH为内参基因，对样品中所测基因的mRNA水平进行相对定量分析。

图8为实时荧光定量PCR结果，其中显示，HCC827细胞在用10μM和100μM的乙酰胆碱处理7天后，Wnt配体Wnt3a、Wnt10a、Wnt4、Wnt6、Wnt9a的表达显著上调；HCC827细胞在用10μM和100μM的乙酰胆碱处理7天后，Wnt通路靶基因s100a4、KLF4、BCL2L1的表达显著上调。该结果表明，外源乙酰胆碱含量的增加促进了非小细胞肺癌亲本细胞中Wnt通路的激活。

实施例10：乙酰胆碱对非小细胞肺癌亲本细胞对靶向药物敏感性的影响

首先使用10μM的乙酰胆碱(购自sigma公司)对PC9亲本细胞进行预处理，处理时间为3天。随后将经过预处理的细胞(乙酰胆碱组)和未经过预处理的细胞(对照组)以2×10⁴个细胞/ml接种于96孔板，24h后细胞贴壁，加入不同浓度的吉非替尼(图9A)和奥希替尼(图9B)，浓度分别是0μM、0.001μM、0.005μM、0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、5μM、10μM，每个浓度设置5个复孔。在5天后，加入CellTiter-Glo细胞活力检测试剂，每孔加入30μL。将96孔板震荡5分钟，随后在室温静置5分钟，共孵育10分钟。使用酶标仪检测发光值。

图9A和9B为细胞活力实验结果，其中显示，外源添加乙酰胆碱可降低PC9亲本细胞对药物的敏感性。例如，根据图9A，在1μM吉非替尼处理下，未经过乙酰胆碱处理的细胞存活率为39.4％，经过乙酰胆碱处理的细胞存活率为72.2％。根据图9B，在1μM奥希替尼处理下，未经过乙酰胆碱处理的细胞存活率为37.6％，经过乙酰胆碱处理的细胞存活率为89.8％。说明PC9细胞在经乙酰胆碱处理后，对奥希替尼和吉非替尼的敏感性显著降低。

LGK974是Wnt信号通路的抑制剂，用外源乙酰胆碱和LGK974同时处理细胞，进行细胞活力检测。首先使用10μM的乙酰胆碱(购自sigma公司)对PC9亲本细胞进行预处理，处理时间为3天。随后将经过预处理的细胞(乙酰胆碱组)和未经过预处理的细胞(对照组)以2×10⁴个细胞/ml接种于96孔板，24h后细胞贴壁，加入不同浓度的奥希替尼，浓度分别是0μM、0.0005μM、0.001μM、0.005μM、0.5μM，其中，乙酰胆碱组和对照组各有一组将不同浓度的奥希替尼联合5μM LGK974共同处理细胞。图10显示，在0.001μM奥希替尼处理下，亲本细胞存活率为85.5％，经过乙酰胆碱作用的细胞存活率为103.8％，经过乙酰胆碱和LGK974同时作用的细胞存活率为77.2％。该结果表明，对Wnt通路的抑制可逆转乙酰胆碱对PC9亲本细胞药物敏感性的影响。

实施例11：敲低乙酰胆碱通路关键基因对药物敏感性和药物耐受细胞形成的影响

我们使用遗传学手段进一步验证胆碱乙酰转移酶(ChAT)，乙酰胆碱受体(M3R)和乙酰胆碱转运体(VAChT)在调节EGFR抑制剂的药物敏感性和药物耐受性中的作用。首先，我们构建了慢病毒介导的shChAT，shM3R，shVAChT敲低的PC9和HCC827细胞系。将对照组PC9细胞和shChAT敲低的PC9细胞以2×10⁴个细胞/ml接种于96孔板，24h后细胞贴壁，加入不同浓度的奥希替尼：浓度分别是0μM、0.0005μM、0.001μM、0.0025μM、0.005μM、0.01μM、0.05μM、0.5μM、1μM、5μM，每个浓度设置6个复孔。此外，将对照组HCC827细胞和shChAT敲低的HCC827细胞以2×10⁴个细胞/ml接种于96孔板，24h后细胞贴壁，加入不同浓度的吉非替尼：浓度分别是0μM、0.0005μM、0.005μM、0.05μM、0.25μM、0.75μM、1.5μM、5μM、10μM，每个浓度设置6个复孔。在5天后，加入CellTiter-Glo细胞活力检测试剂，每孔加入30μL。将96孔板震荡5分钟，随后在室温静置5分钟，共孵育10分钟。使用酶标仪检测发光值。

此外，我们通过克隆形成实验检测药物耐受细胞的形成能力。将对照组细胞，shM3R和shVAChT敲低的细胞以1.5×10⁴个细胞/ml接种于6孔板，细胞贴壁后分别加入二甲基亚砜和2μM奥希替尼培养9天，每3天换一次液。培养9天后，使用4％的多聚甲醛固定细胞，并使用0.5％的结晶紫染色，使用显微镜观察拍照。

图11A为细胞活力实验结果，其中显示，shChAT敲低的PC9细胞对奥希替尼的敏感性显著增加。例如，shChAT敲低的PC9细胞对奥希替尼的IC50值是7.26nM和8.06nM，而亲本PC9细胞对奥希替尼的IC50值15.53nM。图11B为细胞活力实验结果，其中显示，shChAT敲低的HCC827细胞对吉非替尼的敏感性显著增加。例如，shChAT敲低的HCC827细胞对奥希替尼的IC50值是7.55nM和4.87nM，而亲本细胞对奥希替尼的IC50值20.53nM。以上结果表明，催化乙酰胆碱合成的关键酶ChAT在调节肿瘤细胞对靶向药物的敏感性中具有重要作用。

图12A为克隆形成实验结果，其中显示，和对照组细胞相比，shM3R和shVAChT敲低的PC9细胞在2μM奥希替尼处理下，药物耐受细胞形成能力降低。图12B为克隆形成实验结果，其中显示，和对照组细胞相比，shM3R和shVAChT敲低的HCC827细胞在2μM奥希替尼处理下，药物耐受细胞形成能力降低。以上结果表明，乙酰胆碱受体M3R和乙酰胆碱转运体VAChT在调节靶向药诱导下的药物耐受细胞形成过程中具有重要作用。

实施例12：乙酰胆碱通路调节剂对EGFR突变非小细胞肺癌细胞系的药物耐受细胞的影响

为检测乙酰胆碱通路激活在药物耐受细胞形成中的重要性，我们检测乙酰胆碱M型受体抑制剂(包括达非那新、甲磺酸苯扎托品(Benztropine mesylate)、伊索拉定(Irsogladine)和甲基东莨菪碱(Methscopolamine))、乙酰胆碱N型受体抑制剂(包括MG624、美卡拉明(Mecamylamine)和泮库溴铵(Pancuromium dibromide))、乙酰胆碱转运体VAChT抑制剂(Vesamicol)以及胆碱转运体CHT1抑制剂(半胆碱基-3(Hemicholinium-3))对亲本细胞和药物耐受细胞的抑制作用。

其中，抑制剂的来源为清华大学药物筛选平台提供的selleck和sigma的小分子化合物库。达非那新购自selleck公司，Vesamicol和半胆碱基-3购自sigma公司。EGFR突变靶向药物奥希替尼和吉非替尼、厄洛替尼和CO1686均购自Selleck公司。

实验过程如下：将PC9细胞以2×10⁴个细胞/ml接种于96孔板，24h后进行如下的加药处理。

1)M型乙酰胆碱受体抑制剂对药物耐受细胞形成的影响

对于亲本细胞，分别向PC9细胞中加入不同浓度的达非那新(0μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、50μM)、甲磺酸苯扎托品(0μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、50μM)、伊索拉定(0μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、50μM)以及甲基东莨菪碱(0μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、50μM)来处理细胞，6天后使用CellTiter-Glo化学发光细胞活力检测试剂盒检测细胞活力。

对于药物耐受细胞形成过程的检测，首先分别在培养基中加入2μM的EGFR靶向药奥希替尼、吉非替尼、CO1686和厄洛替尼，随后对于每种靶向药，分别加入不同浓度的达非那新(0μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、50μM)、甲磺酸苯扎托品(0μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、50μM)、伊索拉定(0μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、50μM)以及甲基东莨菪碱(0μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、50μM)来处理细胞。6天后使用CellTiter-Glo化学发光细胞活力检测试剂盒检测细胞活力。

图13A显示了在存在和不存在奥希替尼的情况下，乙酰胆碱M型受体抑制剂达非那新、甲磺酸苯扎托品、伊索拉定和甲基东莨菪碱对PC9细胞的影响。其结果表明，添加乙酰胆碱M型受体抑制剂能够显著抑制针对奥希替尼的药物耐受细胞的形成。

例如，根据图13A，在2μM奥希替尼的存在下，相对于未添加任何乙酰胆碱M型受体抑制剂的情况(0μM)，经50μM达非那新处理的PC9细胞的存活率为11.8％；经50μM甲磺酸苯扎托品处理的PC9细胞的存活率为4％；经20μM伊索拉定处理的PC9细胞的存活率为7.4％；经5μM甲基东莨菪碱处理的PC9细胞的存活率为8.1％。

此外，图13A中还显示，在不存在奥希替尼的情况下，仅添加M型受体抑制剂对PC9亲本细胞的活力几乎没有影响。例如，根据图13A，仅用50μM达非那新处理的PC9亲本细胞的存活率为84.3％；仅用50μM甲磺酸苯扎托品处理的亲本细胞的存活率为95％；仅用20μM伊索拉定处理亲本细胞的存活率为108％；仅用5μM甲基东莨菪碱处理的亲本细胞的存活率为90％，其均显著高于在同时存在奥希替尼和M型受体抑制剂情况下的PC9细胞存活率。

由此可见M型受体抑制剂可显著抑制奥希替尼诱导的药物耐受细胞的存活，但对亲本细胞没有影响。

图13B显示了在存在和不存在EGFR靶向药(吉非替尼、CO1686和厄洛替尼)的情况下，乙酰胆碱M型受体抑制剂达非那新和甲磺酸苯扎托品对PC9细胞的影响。其结果表明，添加乙酰胆碱M型受体抑制剂能够显著抑制针对吉非替尼、CO1686和厄洛替尼的药物耐受细胞的形成。

例如，根据图13B左栏，相对于未添加达非那新的情况(0μM)，在50μM达非那新的作用下，经过2μM吉非替尼诱导后的药物耐受细胞的存活率为59.7％，经过2μM CO1686诱导后的药物耐受细胞的存活率为31.4％，经过2μM厄洛替尼诱导后的药物耐受细胞的存活率为58.3％。相比之下，在不存在靶向药的情况下亲本细胞的存活率为107％。

此外，根据图13B右栏，相对于未添加甲磺酸苯扎托品的情况(0μM)，在50μM甲磺酸苯扎托品的作用下，经过2μM吉非替尼诱导后的药物耐受细胞的存活率为31.7％，经过2μMCO1686诱导后的药物耐受细胞的存活率为24.4％，经过2μM厄洛替尼诱导后的药物耐受细胞的存活率为42.2％。相比之下，在不存在靶向药的情况下亲本细胞的存活率为85.4％。

可见M型受体抑制剂可显著抑制吉非替尼、CO1686和厄洛替尼诱导的药物耐受细胞的存活，但对亲本细胞没有影响。

2)N型乙酰胆碱受体抑制剂对药物耐受细胞形成的影响

对于亲本细胞，分别向PC9细胞中加入不同浓度的MG624(0μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、50μM)、美卡拉明(0μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、50μM)和泮库溴铵(0μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、50μM)来处理细胞，6天后使用CellTiter-Glo化学发光细胞活力检测试剂盒检测细胞活力。

对于药物耐受细胞形成过程的检测，首先分别在培养基中加入2μM的EGFR靶向药奥希替尼、吉非替尼、CO1686和厄洛替尼，随后对于每种靶向药，分别加入不同浓度的MG624(0μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、50μM)、美卡拉明(0μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、50μM)和泮库溴铵(0μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM、20μM、50μM)来处理细胞。6天后使用CellTiter-Glo化学发光细胞活力检测试剂盒检测细胞活力。

图14显示了在存在和不存在EGFR靶向药的情况下，乙酰胆碱N型受体抑制剂MG624、美卡拉明和泮库溴铵对PC9细胞的影响。其结果表明，添加乙酰胆碱N型受体抑制剂能够显著抑制针对奥希替尼、吉非替尼、CO1686和厄洛替尼的药物耐受细胞的形成。

例如，根据图14左栏，相对于未添加MG624的情况(0μM)，在10μM MG624的作用下，经过2μM奥希替尼诱导后的药物耐受细胞的存活率为37.9％，经过2μM吉非替尼诱导后的药物耐受细胞的存活率为37.6％，经过2μM CO1686诱导后的药物耐受细胞的存活率为40％，经过2μM厄洛替尼诱导后的药物耐受细胞的存活率为37.6％。相比之下，在不存在靶向药的情况下亲本细胞的存活率约为100％。

根据图14中栏，相对于未添加美卡拉明的情况(0μM)，在50μM美卡拉明的作用下，经过2μM奥希替尼诱导后的药物耐受细胞的存活率为32.6％，经过2μM吉非替尼诱导后的药物耐受细胞的存活率为32.4％，经过2μMCO1686诱导后的药物耐受细胞的存活率为16.2％，经过2μM厄洛替尼诱导后的药物耐受细胞的存活率为38.7％。相比之下，在不存在靶向药的情况下亲本细胞的存活率为约为100％。

根据图14右栏，相对于未添加泮库溴铵的情况(0μM)，在5μM泮库溴铵的作用下，经过2μM奥希替尼诱导后的药物耐受细胞的存活率为33.9％，经过2μM吉非替尼诱导后的药物耐受细胞的存活率为20％，经过2μM CO1686诱导后的药物耐受细胞的存活率为12.4％，经过2μM厄洛替尼诱导后的药物耐受细胞的存活率为20.8％。相比之下，在不存在靶向药的情况下亲本细胞的存活率为88％。

可见N型受体的抑制剂可显著抑制奥希替尼、吉非替尼、CO1686和厄洛替尼诱导的药物耐受细胞的存活，但对亲本细胞没有影响。

3)乙酰胆碱转运体抑制剂和胆碱转运体抑制剂对药物耐受细胞形成的影响

对于亲本细胞，分别向PC9细胞中加入不同浓度的乙酰胆碱转运体VAChT抑制剂Vesamicol(0μM、10μM、25μM、50μM、100μM)和胆碱转运体CHT1抑制剂半胆碱基-3(0μM、10μM、25μM、50μM、100μM)来处理细胞，6天后使用CellTiter-Glo化学发光细胞活力检测试剂盒检测细胞活力。

对于药物耐受细胞形成过程的检测，首先分别在培养基中加入2μM的EGFR靶向药奥希替尼和吉非替尼，随后对于每种靶向药，分别加入不同浓度的乙酰胆碱转运体VAChT抑制剂Vesamicol(0μM、10μM、25μM、50μM、100μM)和胆碱转运体CHT1抑制剂半胆碱基-3(0μM、10μM、25μM、50μM、100μM)来处理细胞。6天后使用CellTiter-Glo化学发光细胞活力检测试剂盒检测细胞活力。

图15显示了在存在和不存在EGFR靶向药的情况下，乙酰胆碱转运体VAChT抑制剂Vesamicol和胆碱转运体CHT1抑制剂半胆碱基-3对PC9细胞的影响。其结果表明，可见经过Vesamicol和半胆碱基-3处理，奥希替尼和吉非替尼诱导的药物耐受细胞的存活显著低于亲本细胞。由此可知，添加乙酰胆碱转运体VAChT抑制剂和胆碱转运体能够显著抑制针对奥希替尼和吉非替尼的药物耐受细胞的形成。

实施例13：乙酰胆碱通路调节剂对PDX体外细胞模型中的作用

我们采用上海立迪生物技术公司构建的人源性肺癌体内移植瘤(patient-derived xenografts,PDX)模型，模型编号是LD1-0006-217645，患者为女性，年龄62岁，病理诊断为肺癌-低中分化腺癌，EGFR突变类型是Exon 19deletion(T790M)。在体外将PDX肿瘤组织进行消化并获得单个细胞混悬液，进行细胞计数，配制成1.1x10⁵/mL细胞悬液。将细胞混悬液滴加在96孔板的中，每孔加135μL。依次加入不同处理组的药物，分别是：对照组；1μM奥希替尼；10μM达非那新；20μM达非那新；1μM奥希替尼+10μM达非那新；1μM奥希替尼+20μM达非那新。孵育6天后使用CellTiter-Glo化学发光细胞活力检测试剂盒检测细胞活力。

图16显示，药物孵育6天后，1μM奥希替尼组的相对细胞活力相较于对照组的相对细胞活力下降42.8％，而1μM奥希替尼+10μM达非那新组的相对细胞活力相较于对照组的相对细胞活力下降60.2％，1μM奥希替尼+20μM达非那新组的相对细胞活力相较于对照组的相对细胞活力下降79.5％。由此可见，达非那新可显著降低PDX组织分离的肿瘤细胞在奥希替尼诱导下的药物耐受细胞的形成。

实施例14：乙酰胆碱通路调节剂对ALK基因融合非小细胞肺癌细胞系的药物耐受细胞形成过程的影响

我们检测了乙酰胆碱M型受体抑制剂达非那新、乙酰胆碱转运体VAChT抑制剂(Vesamicol)以及胆碱转运体CHT1抑制剂(半胆碱基-3)对亲本细胞和药物耐受细胞形成过程的抑制作用。达非那新购自selleck公司，Vesamicol和半胆碱基-3购自sigma公司。ALK突变靶向药物色瑞替尼和艾乐替尼均购自Selleck公司。

实验过程如下：将H2228细胞以2×10⁴个细胞/ml接种于96孔板，24h后加药处理。

对于亲本细胞，分别加入不同浓度的达非那新(0μM，2μM，5μM，10μM，20μM)、Vesamicol(0μM，5μM，10μM，25μM，50μM)以及半胆碱基-3(0μM，5μM，10μM，50μM，100μM)处理细胞，6天后使用CellTiter-Glo化学发光细胞活力检测试剂盒检测细胞活力。

对于药物耐受细胞形成过程的检测，首先在培养基中加入2μM的靶向药(色瑞替尼或艾乐替尼)，随后分别加入不同浓度的达非那新(0μM，2μM，5μM，10μM，20μM)、Vesamicol(0μM，5μM，10μM，25μM，50μM)以及半胆碱基-3(0μM，5μM，10μM，50μM，100μM)处理细胞，6天后使用CellTiter-Glo化学发光细胞活力检测试剂盒检测细胞活力。

图17显示了乙酰胆碱M型受体抑制剂达非那新、乙酰胆碱转运体VAChT抑制剂Vesamicol和胆碱转运体CHT1抑制剂半胆碱基-3对色瑞替尼和艾乐替尼诱导的ALK基因融合非小细胞肺癌细胞系H2228药物耐受细胞的影响。根据图17，相对于未添加达非那新、Vesamicol和半胆碱基-3的情况(0μM)，被色瑞替尼或艾乐替尼诱导过的药物耐受细胞在经过达非那新、Vesamicol或半胆碱基-3的处理后存活率显著降低。相比之下，在不存在靶向药的情况下亲本细胞存活率接近100％。

可见本发明的乙酰胆碱受体抑制剂、乙酰胆碱转运体抑制剂和胆碱转运体抑制剂均可显著抑制色瑞替尼或艾乐替尼诱导的药物耐受细胞的存活，但对亲本细胞影响很小。

实施例15：乙酰胆碱通路调节剂对其他肿瘤(包括结直肠癌、乳腺癌和黑色素瘤)细胞系的药物(包括靶向药和化疗药)耐受细胞形成过程的影响

为了验证乙酰胆碱通路调节剂在其他肿瘤中的作用，我们选择了结直肠癌细胞HCT116，其使用36μM的化疗药5-氟尿嘧啶(5-FU)诱导9天后可获得药物耐受细胞。我们选择了乳腺癌细胞BT474，其使用1μM的靶向药物拉帕替尼诱导9天后可获得药物耐受细胞。我们选择了黑色素瘤细胞A375，其使用20μM的靶向药物维莫非尼诱导9天后可获得药物耐受细胞。

我们检测了乙酰胆碱M型受体抑制剂达非那新对结直肠癌、乳腺癌和黑色素瘤细胞系的亲本细胞和药物耐受细胞形成过程的抑制作用。乙酰胆碱M型受体抑制剂达非那新、乳腺癌靶向药物拉帕替尼(Lapatinib)和黑色素瘤的靶向药维莫非尼(Vemurafenib)均购自Selleck公司，化疗药5FU购于sigma公司。

1)乙酰胆碱通路调节剂对结直肠癌细胞系的药物耐受细胞形成过程的影响

实验过程如下：将HCT116细胞以2×10⁴个细胞/ml接种于96孔板，24h后进行如下加药处理：

对于亲本细胞，分别加入不同浓度的达非那新(0μM，5μM，10μM，20μM)处理细胞，6天后使用CellTiter-Glo化学发光细胞活力检测试剂盒检测细胞活力。

对于药物耐受细胞形成过程的检测，首先在培养基中加入30μM的化疗药5-FU，随后分别加入不同浓度的达非那新(0μM，5μM，10μM，20μM)处理细胞，6天后使用CellTiter-Glo化学发光细胞活力检测试剂盒检测细胞活力。

图18A显示了乙酰胆碱M型受体抑制剂达非那新对化疗药5-FU诱导的结直肠癌细胞系HCT116的药物耐受细胞的影响。根据图18A，相对于未添加达非那新的情况(0μM)，经5-FU诱导过的药物耐受细胞在20μM达非那新的作用下的存活率为48％。相比之下，在不存在5-FU的情况下亲本细胞的存活率为81％。

可见本发明的乙酰胆碱通路调节剂可显著抑制化疗药诱导的结直肠癌细胞系药物耐受细胞的存活，但对亲本细胞影响很小。

2)乙酰胆碱通路调节剂对乳腺癌细胞系的药物耐受细胞形成过程的影响

将BT474细胞以2×10⁴个细胞/ml接种于96孔板，24h后进行如下加药处理：

对于亲本细胞的检测，我们分别加入不同浓度的达非那新(0μM，5μM，10μM，20μM)处理细胞，6天后使用CellTiter-Glo化学发光细胞活力检测试剂盒检测细胞活力。

对于药物耐受细胞形成过程的检测，我们首先在培养基中加入1μM的拉帕替尼，随后分别加入不同浓度的达非那新(0μM，5μM，10μM，20μM)处理细胞，6天后使用CellTiter-Glo化学发光细胞活力检测试剂盒检测细胞活力。

图18B显示了乙酰胆碱M型受体抑制剂达非那新对拉帕替尼诱导的乳腺癌细胞系BT474的药物耐受细胞的影响。根据图18B，相对于未添加达非那新的情况(0μM)，被拉帕替尼诱导过的药物耐受细胞在10μM达非那新的作用下的存活率为48％。相比之下，在不存在拉帕替尼的情况下亲本细胞的存活率为73％。

可见与亲本细胞相比，本发明的乙酰胆碱通路调节剂可显著抑制靶向药诱导的乳腺癌细胞系药物耐受细胞的存活。

3)乙酰胆碱通路调节剂对黑色素瘤细胞系的药物耐受细胞形成过程的影响

将A375细胞以2×10⁴个细胞/ml接种于96孔板，24h后进行如下加药处理：

对于亲本细胞的检测，分别加入不同浓度的达非那新(0μM，5μM，10μM，20μM)处理细胞，6天后使用CellTiter-Glo化学发光细胞活力检测试剂盒检测细胞活力。

对于药物耐受细胞形成过程的检测，首先在培养基中加入20μM的维莫非尼，随后分别加入不同浓度的达非那新(0μM，5μM，10μM，20μM)处理细胞，6天后使用CellTiter-Glo化学发光细胞活力检测试剂盒检测细胞活力。

图18C显示了乙酰胆碱M型受体抑制剂达非那新对维莫非尼诱导的黑色素瘤细胞系A375的药物耐受细胞的影响。根据图18C，相对于未添加达非那新的情况(0μM)，被维莫非尼诱导过的药物耐受细胞在20μM达非那新的作用下的存活率为7％。相比之下，在不存在维莫非尼的情况下亲本细胞的存活率为接近100％。

可见本发明的乙酰胆碱通路调节剂可显著抑制靶向药诱导的黑色素瘤细胞系药物耐受细胞的存活，但对亲本细胞影响很小。

实施例16：乙酰胆碱通路调节剂对药物耐受细胞维持阶段的作用

选择非小细胞肺癌细胞系PC9，使用2μM的EGFR突变靶向药物奥希替尼处理PC9细胞，每3天换一次培养基，共处理9天，获得药物耐受细胞。将PC9亲本细胞以200个细胞/孔接种于384孔板，24h后细胞贴壁，使用清华大学药物筛选平台ECHO550进行加药处理，包括不同浓度的达非那新(0μM，2.5μM，5μM，10μM，15μM，20μM，25μM，30μM，40μM，50μM)，6天后使用CellTiter-Glo化学发光细胞活力检测试剂盒检测细胞活力；将诱导9天后的药物耐受细胞，以500个细胞/孔接种于384孔板(培养基中含有2μM的奥希替尼)，24h后细胞贴壁，使用清华大学药物筛选平台ECHO550进行加药处理，包括不同浓度的达非那新(0μM，2.5μM，5μM，10μM，15μM，20μM)，6天后使用CellTiter-Glo化学发光细胞活力检测试剂盒检测细胞活力；将诱导9天后的药物耐受细胞，以500个细胞/孔接种于384孔板(培养基中不含有奥希替尼)，24h后细胞贴壁，使用清华大学药物筛选平台ECHO550进行加药处理，包括不同浓度的达非那新(0μM，1μM，5μM，10μM，20μM，50μM)，3天后使用CellTiter-Glo化学发光细胞活力检测试剂盒检测细胞活力。

图19A显示达非那新可显著抑制已形成的并培养于含有奥希替尼培养基中的药物耐受细胞的活力。例如，在20μM达非那新的作用下，亲本细胞的存活率接近100％，而相比之下，经过2μM奥希替尼诱导9天后形成的并培养于含有奥希替尼培养基中的药物耐受细胞的存活率为26％。该结果表明达非那新可抑制药物耐受细胞的维持。

图19B显示达非那新可显著抑制已形成的药物耐受细胞的活力。例如，在不含奥希替尼的培养基中，在50μM达非那新的作用下，亲本细胞的存活率为74％，而相比之下经过2μM奥希替尼诱导9天后形成的并培养于不含有奥希替尼培养基中的药物耐受细胞的存活率为8％。该结果表明达非那新在不含有奥希替尼的条件下，也能够抑制药物耐受细胞的维持。

实施例17：乙酰胆碱通路调节剂对肿瘤复发的影响

1)裸鼠移植瘤的建立：提前复苏PC9，其状态良好，无支原体污染。接种细胞当天，用胰酶消化PC9细胞，终止消化并离心后用5ml冷的1xPBS重悬。每只小鼠需注射5x10⁶个细胞。使用取少量细胞进行计数，将预冷的PBS和Matrigel按照1:1的比例在冰上混匀，并将细胞重悬达到终浓度为5x10⁷个细胞/ml。以远端进针的方式将100μL肿瘤细胞悬液注射到小鼠皮下，约5到7天后会有绿豆大小的肿瘤形成。共接种48只裸鼠。

2)裸鼠肿瘤复发给药方案：

使用1％的羧甲基硝酸纤维素钠溶液配制奥希替尼，采用灌胃法给药。使用二甲基亚砜(DMSO)溶解达非那新，然后使用PEG400、达非那新和无菌水以(30：5：65)的比例混合配制，进行腹腔注射给药。

待肿瘤长到200-300mm³，将裸鼠进行随机分组，共分成6组，每组8只。具体给药分组如下：

第1组：使用与实验组相同体积的溶剂，即1％的羧甲基纤维素钠以灌胃法处理小鼠，并以与实验组相同体积的溶剂(5％DMSO+35％PEG400+65％H₂O)以腹腔注射的方法处理小鼠。

第2组：使用腹腔注射的方法以5mg/kg/天的达非那新处理小鼠。

第3组：使用灌胃法以5mg/kg/天的奥希替尼处理小鼠，连续给药9天，直到肿瘤体积迅速缩小至稳定，随后停止药物处理，定期测量肿瘤体积，观测肿瘤复发情况。

第4组：使用灌胃法以5mg/kg/天的奥希替尼联合腹腔注射的方法以5mg/kg/d的达非那新处理小鼠，连续给药9天，直到肿瘤体积迅速缩小至稳定，随后停止奥希替尼处理，继续使用腹腔注射的方式以5mg/kg/天的达非那新处理小鼠直到实验结束，定期测量肿瘤体积，观测肿瘤复发情况。

第5组：使用灌胃法以5mg/kg/天的奥希替尼处理小鼠，连续给药9天，直到肿瘤体积迅速缩小至稳定，随后停止奥希替尼处理，继续使用腹腔注射的方式以5mg/kg/天的达非那新处理小鼠直到实验结束，定期测量肿瘤体积，观测肿瘤复发情况。

第6组：使用灌胃法以5mg/kg/天的奥希替尼联合腹腔注射的方法以5mg/kg/天的达非那新处理小鼠，连续给药9天，直到肿瘤体积迅速缩小至稳定，随后停止奥希替尼和达非那新处理，定期测量肿瘤体积，观测肿瘤复发情况。

肿瘤体积计算公式：(L×W×W)/2,根据公式计算移植瘤生长曲线。

图20显示了单给奥希替尼组(第3组)和奥希替尼与达非那新联合组(第4组)在给药9天后，肿瘤体积迅速缩小。在撤掉药物后继续观察约20天，可见单给奥希替尼组在药物撤掉后肿瘤迅速复发，但是奥希替尼与达非那新联合组在撤掉奥希替尼后继续给达非那新处理，肿瘤复发较慢，体积和肿瘤重量显著低于单给奥希替尼组。

图21显示了单给奥希替尼9天后，肿瘤体积迅速缩小。在撤掉药物后观察约20天，可见第3组在药物撤掉后肿瘤迅速复发，但是在第5组中(在1至9天单给奥希替尼，接着在第9天后停止奥希替尼，后续单给达非那新)，肿瘤复发较慢，体积和肿瘤重量显著低于单给奥希替尼组。

图22显示了单给奥希替尼组(第3组)和奥希替尼与达非那新联合组(第6组)在给药9天后，肿瘤体积迅速缩小。在撤掉药物后继续观察约20天，可见第3组在药物撤掉后肿瘤迅速复发，但是第6组(在1至9天联合给药奥希替尼与达非那新，接着在第9天后停止奥希替尼和达非那新给药)中，肿瘤复发较慢，体积和肿瘤重量显著低于单给奥希替尼组。

图20至22的结果表明，相比于单独给药本发明的乙酰胆碱通路调节剂或EGFR抑制剂，这两种成分的组合给药能够显著地增强对癌症的治疗效果，抑制癌症复发，带来了协同效应。

实施例18：乙酰胆碱通路调节剂联合奥希替尼对小鼠药物响应和生存期的影响

首先，使用PC9细胞接种裸鼠，每只小鼠需注射5x10⁶个细胞。以远端进针的方式将100μL肿瘤细胞悬液注射到小鼠皮下。

使用1％的羧甲基硝酸纤维素钠溶液配制奥希替尼，采用灌胃法给药。使用二甲基亚砜(DMSO)溶解达非那新，然后使用PEG400、达非那新和无菌水以(30：5：65)的比例混合配制，进行腹腔注射给药。具体给药分组如下：使用灌胃法以1mg/kg/天的奥希替尼处理小鼠，连续给药9天，随后将小鼠进行随机分组，分为两组：第1组，继续使用灌胃法以1mg/kg/天的奥希替尼处理小鼠，直到实验结束。第2组，使用灌胃法以1mg/kg/天的奥希替尼联合腹腔注射的方法以5mg/kg/天的达非那新处理小鼠，直到实验结束。定期测量肿瘤体积，肿瘤体积计算公式：(L×W×W)/2,根据公式计算移植瘤生长曲线。与此同时，统计小鼠的生存时间，绘制生存曲线。

图23A显示奥希替尼与达非那新联合组的肿瘤体积显著小于单给奥希替尼组。同时，图23B显示了奥希替尼与达非那新联合组的小鼠生存期显著高于单给奥希替尼组。由此可见，奥希替尼与达非那新联合治疗可以显著增强小鼠对于药物的响应，并且有效延长小鼠的生存期。

本发明包括以下实施方案：

1.乙酰胆碱通路调节剂在制备用于在受试者中治疗癌症的药物中的用途。

2.根据实施方案1所述的用途，其中所述癌症对至少一种抗癌治疗有抗性，或为至少一种抗癌治疗后复发或进展的癌症。

3.根据实施方案1或2所述的用途，其中与所述受试者在所述抗癌治疗之前的肿瘤组织相比，在所述抗癌治疗之后的肿瘤组织中乙酰胆碱水平升高。

4.根据实施方案2或3所述的用途，其中所述抗癌治疗选自抗肿瘤剂治疗、手术、放射疗法及它们的组合。

5.根据实施方案4所述的用途，其中所述抗肿瘤剂选自表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂、渐变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂及它们的组合。

6.根据实施方案5所述的用途，其中所述EGFR抑制剂选自耐昔妥珠单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、Imgatuzumab(RO5083945)、西妥昔单抗、吉非替尼、厄洛替尼、帕尼单抗(panitumumab)、埃克替尼、阿法替尼、达克替尼(PF-00299804)、奥希替尼、Rociletinib及它们的组合。

7.根据实施方案5所述的用途，其中所述ALK抑制剂选自克唑替尼、艾乐替尼、色瑞替尼、阿来替尼(Alectinib)、布格替尼(Brigatinib)、洛拉替尼(Lorlatinib)、洛普替尼(TPX-0005)及它们的组合。

8.根据实施方案4所述的用途，其中所述抗肿瘤剂选自拉帕替尼、维莫非尼、5-氟尿嘧啶或它们的组合。

9.根据实施方案1至8中任一项所述的用途，其中所述癌症的特征为存在EGFR突变和/或过表达。

10.根据实施方案1至8中任一项所述的用途，其中所述癌症的特征为存在ALK突变和/或过表达。

11.根据实施方案1至10中任一项所述的用途，其中所述癌症选自肉瘤、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、成胶质细胞瘤、肺癌、乳腺癌、口腔癌、头颈癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胆囊癌、膀胱癌、胰腺癌、肠癌、结肠直肠癌、肾癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睾丸癌、颊癌、口咽癌、喉癌、前列腺癌、黑色素瘤、肾细胞癌(RCC)、结肠癌、肝细胞癌(HCC)、血液癌症和/或腺癌。

12.根据实施方案11所述的用途，其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌。

13.根据实施方案11所述的用途，其中所述癌症为非小细胞肺癌。

14.根据实施方案1至13中任一项所述的用途，其中所述乙酰胆碱通路调节剂选自毒蕈碱型受体抑制剂、烟碱型受体抑制剂、乙酰胆碱转运体抑制剂、胆碱转运体抑制剂及它们的组合。

15.根据实施方案14所述的用途，其中所述毒蕈碱型受体抑制剂选自达非那新、甲磺酸苯扎托品、伊索拉定、甲基东莨菪碱及它们的组合。

16.根据实施方案14所述的用途，其中所述烟碱型受体抑制剂选自MG624、美加明、泮库溴铵及它们的组合。

17.根据实施方案14所述的用途，其中所述乙酰胆碱转运体抑制剂为2-(4-苯基哌啶基)环己醇(Vesamicol)。

18.根据实施方案14所述的用途，其中所述胆碱转运体抑制剂为半胆碱基-3。

19.乙酰胆碱通路调节剂在制备用于与抗肿瘤剂组合在受试者中治疗癌症的药物中的用途。

20.根据实施方案19所述的用途，其中与所述受试者在所述抗癌治疗之前的肿瘤组织相比，在所述抗癌治疗之后的肿瘤组织中乙酰胆碱水平升高。

21.根据实施方案19或20所述的用途，其中所述抗肿瘤剂选自表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂、渐变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂及它们的组合。

22.根据实施方案21所述的用途，其中所述EGFR抑制剂选自耐昔妥珠单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、Imgatuzumab(RO5083945)、西妥昔单抗、吉非替尼、厄洛替尼、帕尼单抗(panitumumab)、埃克替尼、阿法替尼、达克替尼(PF-00299804)、奥希替尼、Rociletinib及它们的组合。

23.根据实施方案21所述的用途，其中所述ALK抑制剂选自克唑替尼、艾乐替尼、色瑞替尼、阿来替尼(Alectinib)、布格替尼(Brigatinib)、洛拉替尼(Lorlatinib)、洛普替尼(TPX-0005)及它们的组合。

24.根据实施方案19或20所述的用途，其中所述抗肿瘤剂选自拉帕替尼、维莫非尼、5-氟尿嘧啶或它们的组合。

25.根据实施方案19至24中任一项所述的用途，其中所述癌症的特征为存在EGFR突变和/或过表达。

26.根据实施方案19至24中任一项所述的用途，其中所述癌症的特征为存在ALK突变和/或过表达。

27.根据实施方案19至26中任一项所述的用途，其中所述癌症选自肉瘤、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、成胶质细胞瘤、肺癌、乳腺癌、口腔癌、头颈癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胆囊癌、膀胱癌、胰腺癌、肠癌、结肠直肠癌、肾癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睾丸癌、颊癌、口咽癌、喉癌、前列腺癌、黑色素瘤、肾细胞癌(RCC)、结肠癌、肝细胞癌(HCC)、血液癌症和/或腺癌。

28.根据实施方案27所述的用途，其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌。

29.根据实施方案27所述的用途，其中所述癌症为非小细胞肺癌。

30.根据实施方案19至29中任一项所述的用途，其中所述乙酰胆碱通路调节剂选自毒蕈碱型受体抑制剂、烟碱型受体抑制剂、乙酰胆碱转运体抑制剂、胆碱转运体抑制剂及它们的组合。

31.根据实施方案30所述的用途，其中所述毒蕈碱型受体抑制剂选自达非那新、甲磺酸苯扎托品、伊索拉定、甲基东莨菪碱及它们的组合。

32.根据实施方案30所述的用途，其中所述烟碱型受体抑制剂选自MG624、美加明、泮库溴铵及它们的组合。

33.根据实施方案30所述的用途，其中所述乙酰胆碱转运体抑制剂为2-(4-苯基哌啶基)环己醇(Vesamicol)。

34.根据实施方案30所述的用途，其中所述胆碱转运体抑制剂为半胆碱基-3。

35.抗肿瘤剂在制备用于与乙酰胆碱抑制剂组合在受试者中治疗癌症的药物中的用途。

36.根据实施方案35所述的用途，其中与所述受试者在所述抗癌治疗之前的肿瘤组织相比，在所述抗癌治疗之后的肿瘤组织中乙酰胆碱水平升高。

37.根据实施方案35或36所述的用途，其中所述抗肿瘤剂选自表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂、渐变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂及它们的组合。

38.根据实施方案37所述的用途，其中所述EGFR抑制剂选自耐昔妥珠单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、Imgatuzumab(RO5083945)、西妥昔单抗、吉非替尼、厄洛替尼、帕尼单抗(panitumumab)、埃克替尼、阿法替尼、达克替尼(PF-00299804)、奥希替尼、Rociletinib及它们的组合。

39.根据实施方案37所述的用途，其中所述ALK抑制剂选自克唑替尼、艾乐替尼、色瑞替尼、阿来替尼(Alectinib)、布格替尼(Brigatinib)、洛拉替尼(Lorlatinib)、洛普替尼(TPX-0005)及它们的组合。

40.根据实施方案35或36所述的用途，其中所述抗肿瘤剂选自拉帕替尼、维莫非尼、5-氟尿嘧啶或它们的组合。

41.根据实施方案35至40中任一项所述的用途，其中所述癌症的特征为存在EGFR突变和/或过表达。

42.根据实施方案35至40中任一项所述的用途，其中所述癌症的特征为存在ALK突变和/或过表达。

43.根据实施方案35至42中任一项所述的用途，其中所述癌症选自肉瘤、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、成胶质细胞瘤、肺癌、乳腺癌、口腔癌、头颈癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胆囊癌、膀胱癌、胰腺癌、肠癌、结肠直肠癌、肾癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睾丸癌、颊癌、口咽癌、喉癌、前列腺癌、黑色素瘤、肾细胞癌(RCC)、结肠癌、肝细胞癌(HCC)、血液癌症和/或腺癌。

44.根据实施方案43所述的用途，其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌。

45.根据实施方案43所述的用途，其中所述癌症为非小细胞肺癌。

46.根据实施方案35至45中任一项所述的用途，其中所述乙酰胆碱通路调节剂选自毒蕈碱型受体抑制剂、烟碱型受体抑制剂、乙酰胆碱转运体抑制剂、胆碱转运体抑制剂及它们的组合。

47.根据实施方案46所述的用途，其中所述毒蕈碱型受体抑制剂选自达非那新、甲磺酸苯扎托品、伊索拉定、甲基东莨菪碱及它们的组合。

48.根据实施方案46所述的用途，其中所述烟碱型受体抑制剂选自MG624、美加明、泮库溴铵及它们的组合。

49.根据实施方案46所述的用途，其中所述乙酰胆碱转运体抑制剂为2-(4-苯基哌啶基)环己醇(Vesamicol)。

50.根据实施方案46所述的用途，其中所述胆碱转运体抑制剂为半胆碱基-3。

51.一种在受试者中治疗癌症的方法，包括向所述受试者给药乙酰胆碱通路调节剂。

52.根据实施方案51所述的方法，其中所述受试者此前接受过或正在接受至少一种抗癌治疗。

53.根据实施方案51或52所述的方法，其中与所述受试者在所述抗癌治疗之前的肿瘤组织相比，在所述抗癌治疗之后的肿瘤组织中乙酰胆碱水平升高。

54.根据实施方案52或53所述的方法，其中所述抗癌治疗选自抗肿瘤剂治疗、手术、放射疗法及它们的组合。

55.根据实施方案54所述的方法，其中所述抗肿瘤剂选自EGFR抑制剂、ALK抑制剂及它们的组合。

56.根据实施方案55所述的方法，其中所述EGFR抑制剂选自耐昔妥珠单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、Imgatuzumab(RO5083945)、西妥昔单抗、吉非替尼、厄洛替尼、帕尼单抗(panitumumab)、埃克替尼、阿法替尼、达克替尼(PF-00299804)、奥希替尼、诺司替尼(rociletinib)及它们的组合。

57.根据实施方案55所述的方法，其中所述ALK抑制剂选自克唑替尼、艾乐替尼、色瑞替尼、阿来替尼(Alectinib)、布格替尼(Brigatinib)、洛拉替尼(Lorlatinib)、洛普替尼(TPX-0005)及它们的组合。

58.根据实施方案54所述的方法，其中所述抗肿瘤剂选自拉帕替尼、维莫非尼、5-氟尿嘧啶或它们的组合。

59.根据实施方案51至58中任一项所述的方法，其中所述癌症的特征为存在EGFR突变和/或过表达。

60.根据实施方案51至58中任一项所述的方法，其中所述癌症的特征为存在ALK突变和/或过表达。

61.根据实施方案51至60中任一项所述的方法，其中所述癌症选自肉瘤、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、成胶质细胞瘤、肺癌、乳腺癌、口腔癌、头颈癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胆囊癌、膀胱癌、胰腺癌、肠癌、结肠直肠癌、肾癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睾丸癌、颊癌、口咽癌、喉癌、前列腺癌、黑色素瘤、肾细胞癌(RCC)、结肠癌、肝细胞癌(HCC)、血液癌症和/或腺癌。

62.根据实施方案61所述的方法，其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌。

63.根据实施方案61所述的方法，其中所述癌症为非小细胞肺癌(NSCLC)。

64.根据实施方案51至63中任一项所述的方法，其中所述乙酰胆碱通路调节剂选自毒蕈碱型受体抑制剂、烟碱型受体抑制剂、乙酰胆碱转运体抑制剂、胆碱转运体抑制剂及它们的组合。

65.根据实施方案64所述的方法，其中所述毒蕈碱型受体抑制剂选自达非那新、甲磺酸苯扎托品、伊索拉定、甲基东莨菪碱及它们的组合。

66.根据实施方案64所述的方法，其中所述烟碱型受体抑制剂选自MG624、美加明、泮库溴铵及它们的组合。

67.根据实施方案64所述的方法，其中所述乙酰胆碱转运体抑制剂为2-(4-苯基哌啶基)环己醇(Vesamicol)。

68.根据实施方案64所述的方法，其中所述胆碱转运体抑制剂为半胆碱基-3。

69.乙酰胆碱通路调节剂，其用于在受试者中治疗癌症。

70.用于根据实施方案69所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述癌症对至少一种抗癌治疗有抗性，或为至少一种抗癌治疗后复发或进展的癌症。

71.用于根据实施方案69或70所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中与所述受试者在所述抗癌治疗之前的肿瘤组织相比，在所述抗癌治疗之后的肿瘤组织中乙酰胆碱水平升高。

72.用于根据实施方案70或71所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述抗癌治疗选自抗肿瘤剂治疗、手术、放射疗法及它们的组合。

73.用于根据实施方案72所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述抗肿瘤剂选自表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂、渐变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂及它们的组合。

74.用于根据实施方案73所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述EGFR抑制剂选自耐昔妥珠单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、Imgatuzumab(RO5083945)、西妥昔单抗、吉非替尼、厄洛替尼、帕尼单抗(panitumumab)、埃克替尼、阿法替尼、达克替尼(PF-00299804)、奥希替尼、Rociletinib及它们的组合。

75.用于根据实施方案73所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述ALK抑制剂选自克唑替尼、艾乐替尼、色瑞替尼、阿来替尼(Alectinib)、布格替尼(Brigatinib)、洛拉替尼(Lorlatinib)、洛普替尼(TPX-0005)及它们的组合。

76.用于根据实施方案72所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述抗肿瘤剂选自拉帕替尼、维莫非尼、5-氟尿嘧啶或它们的组合。

77.用于根据实施方案69至76中任一项所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述癌症的特征为存在EGFR突变和/或过表达。

78.用于根据实施方案69至76中任一项所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述癌症的特征为存在ALK突变和/或过表达。

79.用于根据实施方案69至78中任一项所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述癌症选自肉瘤、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、成胶质细胞瘤、肺癌、乳腺癌、口腔癌、头颈癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胆囊癌、膀胱癌、胰腺癌、肠癌、结肠直肠癌、肾癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睾丸癌、颊癌、口咽癌、喉癌、前列腺癌、黑色素瘤、肾细胞癌(RCC)、结肠癌、肝细胞癌(HCC)、血液癌症和/或腺癌。

80.用于根据实施方案79所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌。

81.用于根据实施方案79所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述癌症为非小细胞肺癌。

82.用于根据实施方案69至81中任一项所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述乙酰胆碱通路调节剂选自毒蕈碱型受体抑制剂、烟碱型受体抑制剂、乙酰胆碱转运体抑制剂、胆碱转运体抑制剂及它们的组合。

83.用于根据实施方案82所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述毒蕈碱型受体抑制剂选自达非那新、甲磺酸苯扎托品、伊索拉定、甲基东莨菪碱及它们的组合。

84.用于根据实施方案82所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述烟碱型受体抑制剂选自MG624、美加明、泮库溴铵及它们的组合。

85.用于根据实施方案82所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述乙酰胆碱转运体抑制剂为2-(4-苯基哌啶基)环己醇(Vesamicol)。

86.用于根据实施方案82所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述胆碱转运体抑制剂为半胆碱基-3。

87.乙酰胆碱通路调节剂，其用于与抗肿瘤剂组合在受试者中治疗癌症。

88.用于根据实施方案87所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中与所述受试者在所述抗癌治疗之前的肿瘤组织相比，在所述抗癌治疗之后的肿瘤组织中乙酰胆碱水平升高。

89.用于根据实施方案87或88所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述抗肿瘤剂选自表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂、渐变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂及它们的组合。

90.用于根据实施方案89所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述EGFR抑制剂选自耐昔妥珠单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、Imgatuzumab(RO5083945)、西妥昔单抗、吉非替尼、厄洛替尼、帕尼单抗(panitumumab)、埃克替尼、阿法替尼、达克替尼(PF-00299804)、奥希替尼、Rociletinib及它们的组合。

91.用于根据实施方案89所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述ALK抑制剂选自克唑替尼、艾乐替尼、色瑞替尼、阿来替尼(Alectinib)、布格替尼(Brigatinib)、洛拉替尼(Lorlatinib)、洛普替尼(TPX-0005)及它们的组合。

92.用于根据实施方案87或88所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述抗肿瘤剂选自拉帕替尼、维莫非尼、5-氟尿嘧啶或它们的组合。

93.用于根据实施方案87至92中任一项所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述癌症的特征为存在EGFR突变和/或过表达。

94.用于根据实施方案87至92中任一项所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述癌症的特征为存在ALK突变和/或过表达。

95.用于根据实施方案87至94中任一项所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述癌症选自肉瘤、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、成胶质细胞瘤、肺癌、乳腺癌、口腔癌、头颈癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胆囊癌、膀胱癌、胰腺癌、肠癌、结肠直肠癌、肾癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睾丸癌、颊癌、口咽癌、喉癌、前列腺癌、黑色素瘤、肾细胞癌(RCC)、结肠癌、肝细胞癌(HCC)、血液癌症和/或腺癌。

96.用于根据实施方案95所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌。

97.用于根据实施方案95所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述癌症为非小细胞肺癌。

98.用于根据实施方案87至97中任一项所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述乙酰胆碱通路调节剂选自毒蕈碱型受体抑制剂、烟碱型受体抑制剂、乙酰胆碱转运体抑制剂、胆碱转运体抑制剂及它们的组合。

99.用于根据实施方案98所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述毒蕈碱型受体抑制剂选自达非那新、甲磺酸苯扎托品、伊索拉定、甲基东莨菪碱及它们的组合。

100.用于根据实施方案98所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述烟碱型受体抑制剂选自MG624、美加明、泮库溴铵及它们的组合。

101.用于根据实施方案98所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述乙酰胆碱转运体抑制剂为2-(4-苯基哌啶基)环己醇(Vesamicol)。

102.用于根据实施方案98所述的用途中的乙酰胆碱通路调节剂，其中所述胆碱转运体抑制剂为半胆碱基-3。

103.抗肿瘤剂，其用于与乙酰胆碱通路调节剂组合在受试者中治疗癌症。

104.用于根据实施方案103所述的用途中的抗肿瘤剂，其中与所述受试者在所述抗癌治疗之前的肿瘤组织相比，在所述抗癌治疗之后的肿瘤组织中乙酰胆碱水平升高。

105.用于根据实施方案103或104所述的用途中的抗肿瘤剂，其中所述抗肿瘤剂选自表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂、渐变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂及它们的组合。

106.用于根据实施方案105所述的用途中的抗肿瘤剂，其中所述EGFR抑制剂选自耐昔妥珠单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、Imgatuzumab(RO5083945)、西妥昔单抗、吉非替尼、厄洛替尼、帕尼单抗(panitumumab)、埃克替尼、阿法替尼、达克替尼(PF-00299804)、奥希替尼、Rociletinib及它们的组合。

107.用于根据实施方案105所述的用途中的抗肿瘤剂，其中所述ALK抑制剂选自克唑替尼、艾乐替尼、色瑞替尼、阿来替尼(Alectinib)、布格替尼(Brigatinib)、洛拉替尼(Lorlatinib)、洛普替尼(TPX-0005)及它们的组合。

108.用于根据实施方案103或104所述的用途中的抗肿瘤剂，其中所述抗肿瘤剂选自拉帕替尼、维莫非尼、5-氟尿嘧啶或它们的组合。

109.用于根据实施方案103至108中任一项所述的用途中的抗肿瘤剂，其中所述癌症的特征为存在EGFR突变和/或过表达。

110.用于根据实施方案103至108中任一项所述的用途中的抗肿瘤剂，其中所述癌症的特征为存在ALK突变和/或过表达。

111.用于根据实施方案103至110中任一项所述的用途中的抗肿瘤剂，其中所述癌症选自肉瘤、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、成胶质细胞瘤、肺癌、乳腺癌、口腔癌、头颈癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胆囊癌、膀胱癌、胰腺癌、肠癌、结肠直肠癌、肾癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睾丸癌、颊癌、口咽癌、喉癌、前列腺癌、黑色素瘤、肾细胞癌(RCC)、结肠癌、肝细胞癌(HCC)、血液癌症和/或腺癌。

112.用于根据实施方案111所述的用途中的抗肿瘤剂，其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌。

113.用于根据实施方案112所述的用途中的抗肿瘤剂，其中所述癌症为非小细胞肺癌。

114.用于根据实施方案103至113中任一项所述的用途中的抗肿瘤剂，其中所述乙酰胆碱通路调节剂选自毒蕈碱型受体抑制剂、烟碱型受体抑制剂、乙酰胆碱转运体抑制剂、胆碱转运体抑制剂及它们的组合。

115.用于根据实施方案114所述的用途中的抗肿瘤剂，其中所述毒蕈碱型受体抑制剂选自达非那新、甲磺酸苯扎托品、伊索拉定、甲基东莨菪碱及它们的组合。

116.用于根据实施方案114所述的用途中的抗肿瘤剂，其中所述烟碱型受体抑制剂选自MG624、美加明、泮库溴铵及它们的组合。

117.用于根据实施方案114所述的用途中的抗肿瘤剂，其中所述乙酰胆碱转运体抑制剂为2-(4-苯基哌啶基)环己醇(Vesamicol)。

118.用于根据实施方案114所述的用途中的抗肿瘤剂，其中所述胆碱转运体抑制剂为半胆碱基-3。

119.组合，其包含：a)乙酰胆碱通路调节剂；和b)抗肿瘤剂。

120.根据实施方案119所述的组合，其中所述乙酰胆碱通路调节剂选自毒蕈碱型受体抑制剂、烟碱型受体抑制剂、乙酰胆碱转运体抑制剂、胆碱转运体抑制剂及它们的组合。

121.根据实施方案120所述的组合，其中所述毒蕈碱型受体抑制剂选自达非那新、甲磺酸苯扎托品、伊索拉定、甲基东莨菪碱及它们的组合。

122.根据实施方案120所述的组合，其中所述烟碱型受体抑制剂选自MG624、美加明、泮库溴铵及它们的组合。

123.根据实施方案120所述的组合，其中所述乙酰胆碱转运体抑制剂为2-(4-苯基哌啶基)环己醇(Vesamicol)。

124.根据实施方案120所述的组合，其中所述胆碱转运体抑制剂为半胆碱基-3。

125.根据实施方案119至124中任一项所述的组合，其中所述抗肿瘤剂选自EGFR抑制剂和ALK抑制剂。

126.根据实施方案125所述的组合，其中所述EGFR抑制剂选自耐昔妥珠单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、Imgatuzumab(RO5083945)、西妥昔单抗、吉非替尼、厄洛替尼、帕尼单抗(panitumumab)、埃克替尼、阿法替尼、达克替尼(PF-00299804)、奥希替尼、Rociletinib及它们的组合。

127.根据实施方案125所述的组合，其中所述ALK抑制剂选自克唑替尼、艾乐替尼、色瑞替尼、阿来替尼(Alectinib)、布格替尼(Brigatinib)、洛拉替尼(Lorlatinib)、洛普替尼(TPX-0005)及它们的组合。

128.根据实施方案119至124中任一项所述的组合，其中所述抗肿瘤剂选自拉帕替尼、维莫非尼、5-氟尿嘧啶或它们的组合。

129.根据实施方案119至128中任一项所述的组合，其中所述乙酰胆碱通路调节剂与抗肿瘤剂同时施用。

130.根据实施方案119至128中任一项所述的组合，其中所述乙酰胆碱通路调节剂在抗肿瘤剂之后施用。

131.药物组合物，其包含：a)乙酰胆碱通路调节剂；b)抗肿瘤剂；和c)至少一种药学上可接受的载体。

132.根据实施方案131所述的药物组合物，其中所述乙酰胆碱通路调节剂选自毒蕈碱型受体抑制剂、烟碱型受体抑制剂、乙酰胆碱转运体抑制剂、胆碱转运体抑制剂及它们的组合。

133.根据实施方案131所述的药物组合物，其中所述毒蕈碱型受体抑制剂选自达非那新、甲磺酸苯扎托品、伊索拉定、甲基东莨菪碱及它们的组合。

134.根据实施方案131所述的药物组合物，其中所述烟碱型受体抑制剂选自MG624、美加明、泮库溴铵及它们的组合。

135.根据实施方案131所述的药物组合物，其中所述乙酰胆碱转运体抑制剂为Vesamicol。

136.根据实施方案131所述的药物组合物，其中所述胆碱转运体抑制剂为半胆碱基-3。

137.根据实施方案131至136中任一项所述的药物组合物，其中所述抗肿瘤剂选自EGFR抑制剂和ALK抑制剂。

138.根据实施方案137所述的药物组合物，其中所述EGFR抑制剂选自西妥息单抗、吉非替尼、厄洛替尼、埃克替尼、阿法替尼、达克替尼、奥希替尼、Rociletinib及它们的组合。

139.根据实施方案137所述的药物组合物，其中所述ALK抑制剂选自克唑替尼、艾乐替尼、色瑞替尼、阿来替尼、布格替尼、洛拉替尼、洛普替尼及它们的组合。

140.根据实施方案131至136中任一项所述的药物组合物，其中所述抗肿瘤剂选自拉帕替尼、维莫非尼、5-氟尿嘧啶或它们的组合。

141.试剂盒，其包含：

a)第一组合物，其包含乙酰胆碱通路调节剂；和

b)第二组合物，其包含抗肿瘤剂。

142.根据实施方案141所述的试剂盒，其中所述乙酰胆碱通路调节剂选自毒蕈碱型受体抑制剂、烟碱型受体抑制剂、乙酰胆碱转运体抑制剂、胆碱转运体抑制剂及它们的组合。

143.根据实施方案142所述的试剂盒，其中所述毒蕈碱型受体抑制剂选自达非那新、甲磺酸苯扎托品、伊索拉定、甲基东莨菪碱及它们的组合。

144.根据实施方案142所述的试剂盒，其中所述烟碱型受体抑制剂选自MG624、美加明、泮库溴铵及它们的组合。

145.根据实施方案142所述的试剂盒，其中所述乙酰胆碱转运体抑制剂为2-(4-苯基哌啶基)环己醇(Vesamicol)。

146.根据实施方案142所述的试剂盒，其中所述胆碱转运体抑制剂为半胆碱基-3。

147.根据实施方案141至146中任一项所述的试剂盒，其中所述抗肿瘤剂选自EGFR抑制剂和ALK抑制剂。

148.根据实施方案147所述的试剂盒，其中所述EGFR抑制剂选自耐昔妥珠单抗、尼妥珠单抗、Imgatuzumab(RO5083945)、西妥昔单抗、吉非替尼、厄洛替尼、帕尼单抗、埃克替尼、阿法替尼、达克替尼、奥希替尼、Rociletinib及它们的组合。

149.根据实施方案147所述的试剂盒，其中所述ALK抑制剂选自克唑替尼、艾乐替尼、色瑞替尼、阿来替尼、布格替尼、洛拉替尼、洛普替尼及它们的组合。

150.根据实施方案141至149中任一项所述的试剂盒，其中所述抗肿瘤剂选自拉帕替尼、维莫非尼、5-氟尿嘧啶或它们的组合。

151.根据实施方案141至150中任一项所述的试剂盒，其进一步包含说明书，所述说明书包括使用所述试剂盒在需要的受试者中治疗癌症的说明。

152.根据实施方案119至130中任一项所述的组合、根据实施方案131至140中任一项所述的药物组合物或根据实施方案141至151中任一项所述的试剂盒在制备用于治疗癌症的药物中的用途。

153.根据实施方案152所述的用途，其中所述癌症的特征为存在EGFR突变和/或过表达。

154.根据实施方案152所述的用途，其中所述癌症的特征为存在ALK突变和/或过表达。

155.根据实施方案152至154中任一项所述的用途，其中所述癌症为难治性和/或复发性癌症。

156.根据实施方案152至155中任一项所述的用途，其中所述癌症选自肉瘤、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、成胶质细胞瘤、肺癌、乳腺癌、口腔癌、头颈癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胆囊癌、膀胱癌、胰腺癌、肠癌、结肠直肠癌、肾癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睾丸癌、颊癌、口咽癌、喉癌、前列腺癌、黑色素瘤、肾细胞癌(RCC)、结肠癌、肝细胞癌(HCC)、血液癌症和/或腺癌。

157.根据实施方案156所述的用途，其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌。

158.根据实施方案156所述的用途，其中所述癌症为非小细胞肺癌。

159.一种用于诊断对至少一种抗癌治疗具有抗性的癌症的方法，其包括以下步骤：

a)测量来自受试者的样品的乙酰胆碱水平；

b)上述乙酰胆碱水平与所述受试者在所述抗癌治疗之前相比升高表明所述受试者患有对至少一种抗癌治疗具有抗性的癌症。

160.根据实施方案159的方法，其中所述来自受试者的样品为肿瘤组织。

161.根据实施方案159或160所述的方法，其中所述抗癌治疗选自抗肿瘤剂治疗、手术、放射疗法及它们的组合。

162.根据实施方案161所述的方法，其中所述抗肿瘤剂选自表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂、渐变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂及它们的组合。

163.根据实施方案162所述的方法，其中所述EGFR抑制剂选自耐昔妥珠单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、Imgatuzumab(RO5083945)、西妥昔单抗、吉非替尼、厄洛替尼、帕尼单抗(panitumumab)、埃克替尼、阿法替尼、达克替尼(PF-00299804)、奥希替尼、Rociletinib及它们的组合。

164.根据实施方案162所述的方法，其中所述ALK抑制剂选自克唑替尼、艾乐替尼、色瑞替尼、阿来替尼(Alectinib)、布格替尼(Brigatinib)、洛拉替尼(Lorlatinib)、洛普替尼(TPX-0005)及它们的组合。

165.根据实施方案161所述的方法，其中所述抗肿瘤剂选自拉帕替尼、维莫非尼、5-氟尿嘧啶或它们的组合。

166.根据实施方案159至165中任一项所述的方法，其中所述癌症的特征为存在EGFR突变和/或过表达。

167.根据实施方案159至165中任一项所述的方法，其中所述癌症的特征为存在ALK突变和/或过表达。

168.根据实施方案159至167中任一项所述的方法，其中所述癌症选自肉瘤、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、成胶质细胞瘤、肺癌、乳腺癌、口腔癌、头颈癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胆囊癌、膀胱癌、胰腺癌、肠癌、结肠直肠癌、肾癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睾丸癌、颊癌、口咽癌、喉癌、前列腺癌、黑色素瘤、肾细胞癌(RCC)、结肠癌、肝细胞癌(HCC)、血液癌症和/或腺癌。

169.根据实施方案168所述的方法，其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌。

170.根据实施方案168所述的方法，其中所述癌症为非小细胞肺癌。

171.一种用于在受试者中治疗癌症的方法，其包括以下步骤：

a)测量来自受试者的样品的乙酰胆碱水平；

b)将所述乙酰胆碱水平与所述受试者在抗癌治疗之前相比的乙酰胆碱水平进行比较，如果上述乙酰胆碱水平升高，则对所述受试者施用乙酰胆碱通路调节剂。

172.根据实施方案171的方法，其中所述来自受试者的样品为肿瘤组织。

173.根据实施方案171或172的方法，其中所述受试者对至少一种抗癌治疗具有抗性，或者此前接受过或正在接受至少一种抗癌治疗。

174.根据实施方案171-173中任一项所述的方法，其中所述抗癌治疗选自抗肿瘤剂治疗、手术、放射疗法及它们的组合。

175.根据实施方案174所述的方法，其中所述抗肿瘤剂选自表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂、渐变性淋巴瘤激酶(ALK)抑制剂及它们的组合。

176.根据实施方案175所述的方法，其中所述EGFR抑制剂选自耐昔妥珠单抗(necitumumab)、尼妥珠单抗(nimotuzumab)、Imgatuzumab(RO5083945)、西妥昔单抗、吉非替尼、厄洛替尼、帕尼单抗(panitumumab)、埃克替尼、阿法替尼、达克替尼(PF-00299804)、奥希替尼、Rociletinib及它们的组合。

177.根据实施方案175所述的方法，其中所述ALK抑制剂选自克唑替尼、艾乐替尼、色瑞替尼、阿来替尼(Alectinib)、布格替尼(Brigatinib)、洛拉替尼(Lorlatinib)、洛普替尼(TPX-0005)及它们的组合。

178.根据实施方案174所述的方法，其中所述抗肿瘤剂选自拉帕替尼、维莫非尼、5-氟尿嘧啶或它们的组合。

179.根据实施方案171至178中任一项所述的方法，其中所述癌症的特征为存在EGFR突变和/或过表达。

180.根据实施方案171至178中任一项所述的方法，其中所述癌症的特征为存在ALK突变和/或过表达。

181.根据实施方案171至180中任一项所述的方法，其中所述癌症选自肉瘤、皮肤癌、白血病、淋巴瘤、脑癌、成胶质细胞瘤、肺癌、乳腺癌、口腔癌、头颈癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、胆管癌、胆囊癌、膀胱癌、胰腺癌、肠癌、结肠直肠癌、肾癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、睾丸癌、颊癌、口咽癌、喉癌、前列腺癌、黑色素瘤、肾细胞癌(RCC)、结肠癌、肝细胞癌(HCC)、血液癌症和/或腺癌。

182.根据实施方案181所述的方法，其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、结肠直肠癌。

183.根据实施方案181所述的方法，其中所述癌症为非小细胞肺癌。

184.根据实施方案171至183中任一项所述的方法，其中所述乙酰胆碱通路调节剂选自毒蕈碱型受体抑制剂、烟碱型受体抑制剂、乙酰胆碱转运体抑制剂、胆碱转运体抑制剂及它们的组合。

185.根据实施方案184所述的方法，其中所述毒蕈碱型受体抑制剂选自达非那新、甲磺酸苯扎托品、伊索拉定、甲基东莨菪碱及它们的组合。

186.根据实施方案184所述的方法，其中所述烟碱型受体抑制剂选自MG624、美加明、泮库溴铵及它们的组合。

187.根据实施方案184所述的方法，其中所述乙酰胆碱转运体抑制剂为2-(4-苯基哌啶基)环己醇(Vesamicol)。

188.根据实施方案184所述的方法，其中所述胆碱转运体抑制剂为半胆碱基-3。

Claims (10)

1.乙酰胆碱通路调节剂在制备用于在受试者中治疗癌症的药物中的用途。

2.乙酰胆碱通路调节剂在制备用于与抗肿瘤剂组合在受试者中治疗癌症的药物中的用途。

3.抗肿瘤剂在制备用于与乙酰胆碱抑制剂组合在受试者中治疗癌症的药物中的用途。

4.一种在受试者中治疗癌症的方法，包括向所述受试者给药乙酰胆碱通路调节剂。

5.乙酰胆碱通路调节剂，其用于在受试者中治疗癌症。

6.乙酰胆碱通路调节剂，其用于与抗肿瘤剂组合在受试者中治疗癌症。

7.抗肿瘤剂，其用于与乙酰胆碱通路调节剂组合在受试者中治疗癌症。

8.组合，其包含：a)乙酰胆碱通路调节剂；和b)抗肿瘤剂。

9.药物组合物，其包含：a)乙酰胆碱通路调节剂；b)抗肿瘤剂；和c)至少一种药学上可接受的载体。

10.试剂盒，其包含：

a)第一组合物，其包含乙酰胆碱通路调节剂；和

b)第二组合物，其包含抗肿瘤剂。

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