CN117295825A - 使用mdm2拮抗剂治疗癌症的生物标志物 - Google Patents

使用mdm2拮抗剂治疗癌症的生物标志物 Download PDF

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Abstract

本发明提供了DNA损伤反应(DDR)途径基因及其基因产物作为预测使用MDM2拮抗剂有效治疗癌症的生物标志物。鉴定癌症患者中的一种或多种DDR途径生物标志物，从而能够进行确定，患者的癌症是否可能使用MDM2拮抗剂成功治疗。因此，本发明总体上涉及用于MDM2拮抗剂治疗的伴随诊断。具体地，所述DDR途径包含来自以下的一个或多个基因：同源重组修复(HRR)途径；非同源末端连接(NHEJ)途径；错配修复(MMR)途径；范科尼贫血(FA)途径；和/或碱基切除修复(BER)途径。

Description

使用MDM2拮抗剂治疗癌症的生物标志物
技术领域
本发明涉及用于癌症治疗的生物标志物。具体而言，本发明提供了生物标志物，该标志物鉴定可能对MDM2拮抗剂敏感癌细胞。这些生物标志物可以整合到预测治疗反应的方法、系统和试剂盒中，也可以并入到癌症的个体化治疗中。
背景技术
精准医疗或个体化医疗是一种新兴的疾病治疗和预防的方法，它考虑到每个患者的基因、环境和生活方式的个体差异。这即是常说的在正确的时间施用正确剂量的正确药物。
精准医疗的一个特别关注点是需要预测一位指定患者是否会对某一特定药物产生反应。能够预测一个特定药物是否能有效治疗一个个体患者的测试通常被称为伴随诊断。有效的伴随诊断是非常可取的，因为它们能够改善患者的治疗结果，同时还可以节省提供无效治疗的巨大经济花费。新的治疗试剂的有效伴随诊断也可以增加该治疗在正确人群中试验并最终获得批准的机会。
精准医疗和伴随诊断通常依赖于能够可靠地预测患者是否可能对特定治疗产生反应的生物标志物。为每种治疗和疾病鉴定可靠的生物标志物是一项非常重大的挑战。
WO-A-2016/056673描述了复杂的基因特征，后者据说可以为临床应用提供预测性分子工具。本公开内容还涉及预测癌症或肿瘤对可影响癌症或肿瘤治疗的抗癌药物的敏感性的方法，特别是MDM2活性抑制剂和MDM2与p53蛋白相互作用的拮抗剂。
US-A-2015/0211073还描述了一种基因组合，通常包含至少四个基因，作为预测癌症对MDM2拮抗剂反应的生物标志物
Iorio等人(Cell.2016年7月28日；166(3):740-75)“A Landscape ofPharmacogenomic Interactions in Cancer”报告了来自29个组织的11,289个肿瘤中鉴定的癌症驱动的改变(整合体细胞突变、拷贝数改变、DNA甲基化和基因表达)如何映射到1,001个分子注释的人类癌细胞系，并与对265种药物的敏感性相关联。虽然此类研究提供了将基因型与细胞表型联系起来并为选定的癌症亚群鉴定治疗选择的资源，但临床相关的分子靶向癌症治疗的开发仍然是一项艰巨的挑战。
仍然需要鉴定用于精准医疗的可靠生物标志物。
发明内容
本发明基于生物标志物的鉴定，该鉴定可用于使用MDM2拮抗剂预测有效癌症治疗。鉴定癌症患者中的一种或多种这些生物标志物能够允许确定使用MDM2拮抗剂患者的癌症是否可能被治疗，或可能被成功治疗。因此，在某些方面，本发明总体上涉及用于MDM2拮抗剂治疗的伴随诊断。
本发明中鉴定的生物标志物是DNA损伤反应(DDR)途径基因和它们的基因产物。这些蛋白质和编码它们的基因都是本领域已知的。如本文所用，这些生物标志物被称为“本发明的生物标志物”和/或“DDR生物标志物”。癌细胞中降低的DDR功能指示对MDM2拮抗的敏感性。因此，一种或多种DDR基因或基因产物的耗损、丢失或功能降低指示对MDM2拮抗的敏感性。
特别地，在一个方面，本发明提供了在治疗癌症的方法中使用的MDM2拮抗剂，其中该癌症耗损一种或多种DDR基因、基因产物或活性。耗损可以是基因本身的耗损、基因产物的耗损(即表达降低)或是导致活性降低的突变(即功能丧失突变)。耗损可能是由于导致活性降低的畸变，例如拷贝数丢失或表观遗传学沉默。
存在诱导活性丧失/降低的一大类畸变，诸如因拷贝数丢失或功能丧失突变而导致的活性丧失。功能丧失突变可被视为野生型基因产物的耗损。因此，当描述生物标志物的耗损时，这包括该生物标志物中的突变，使得野生型减少或不再可检测。
在一个方面，本发明提供了一种在治疗癌症的方法中使用的MDM2拮抗剂，其中所述癌症耗损了同源重组(HR)途径(也称为同源重组修复(HRR)途径)中的一种或多种基因、基因产物或活性。这些癌细胞具有降低的HR功能，因此可以表征为HR缺陷型。在一个实施方案中，癌症是BRCA1耗损的。人BRCA1具有Entrez基因ID 672。在一个实施方案中，癌症是BRCA2耗损的。人BRCA2具有Entrez基因ID 675。在一个实施方案中，癌症是ATM耗损的。ATM是共济失调毛细血管扩张突变蛋白。人野生型ATM具有Entrez基因ID 472。本发明的一个实施方案涉及BRCA1、BRCA2和ATM中的任两种的耗损。本发明的一个实施方案涉及BRCA1、BRCA2和ATM中的全部三种的耗损。本发明的一个实施方案涉及与WT相比，BRCA1、BRCA2或ATM中的功能丧失突变。本发明的一个实施方案涉及与WT相比，BRCA1、BRCA2和ATM中的任两种中的功能丧失突变。本发明的一个实施方案涉及与WT相比，BRCA1、BRCA2和ATM中的全部三种中的功能丧失突变。本发明的一个实施方案涉及与WT相比，BRCA1、BRCA2和ATM中的1、2或3种中的拷贝数丢失或表观遗传沉默。本发明的一个实施方案涉及BRCA1和/或BRCA2中的功能丧失突变。本发明的一个实施方案涉及BRCA1和/或BRCA2中的拷贝数丢失或表观遗传沉默。在一个实施方案中，同源重组修复中的缺陷模拟BRCA1或BRCA2丢失。
在一个实施方案中，HR途径基因选自下列基因中的一种或多种：LIG1、MRE11A、NBN、PARG、PARP1、PARPBP、RAD50、TP53BP1、XRCC2、XRCC3、EXO1、PCNA、POLD1、POLD2、POLD3、POLD4、RFC1、RFC2、RFC3、RFC4、RFC5、RPA1、RPA2、RPA3、RPA4、BARD1、BLM、BRCA1、BRCA2、BRIP1、DMC1、DNA2、EID3、EME1、EME2、ERCC1、H2AFX、HELQ、HFM1、INO80、KAT5、MUS81、NFATC2IP、NSMCE1、NSMCE2、NSMCE3、NSMCE4A、PALB2、PARP2、PAXIP1、POLH、POLQ、PPP4C、PPP4R1、PPP4R2、PPP4R4、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD52、RAD54B、RAD54L、RBBP8、RDM1、RECQL、RECQL4、RECQL5、RMI1、RMI2、RTEL1、SHFM1、SLX1A、SLX1B、SLX4、SMARCAD1、SMC5、SMC6、SPO11、SWSAP1、TOP3A、TOP3B、UIMC1、WRN和/或ZSWIM7。这些HR途径基因全部是本领域已知的，例如如Knijnenburg等人Cell Rep.2018年4月3日；23(1):239-254.e6所述。
在一些实施方案中，HR缺陷型癌细胞不是ATM缺陷型的，即在癌细胞中野生型ATM以正常水平(或高水平)表达。在这些细胞中，HR缺陷由一个或多个不同的HR基因(例如BRCA1和/或BRCA2)的功能丧失提供。在一些实施方案中，这些癌细胞可包含由HR途径中不是ATM的基因、基因产物或活性组成的HR耗损。
在一些实施方案中，HR缺陷型癌细胞不是ATR缺陷型的，即在癌细胞中野生型ATR以正常水平(或高水平)表达。在这些细胞中，HR缺陷由一个或多个不同的HR基因(例如BRCA1和/或BRCA2)的功能丧失提供。在一些实施方案中，这些癌细胞可包含由HR途径中不是ATR的基因、基因产物或活性组成。ATR是“共济失调毛细血管扩张和Rad3相关蛋白”。人ATR的示例性序列可在UniProtKB数据库中以登录号Q13535(ATR-HUMAN)、在GenBank数据库中以NCBI登录号AAK26749.1获得，并且还在文献诸如Bentley等人，EMBO J.,15:6641-6651(1996)和Cimprich等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 107:18575-18480(1996)中公开。
在一些实施方案中，这些癌细胞包含由HR途径中不是ATR的基因、基因产物或活性组成的HR耗损。
在一些实施方案中，HR缺陷型癌细胞不是ATM缺陷型并且不是ATR缺陷型，即在癌细胞中野生型ATR和野生型ATM以正常水平(或高水平)表达。在这些细胞中，HR缺陷由一个或多个不同的HR基因(例如BRCA1和/或BRCA2)的功能丧失提供。
在一些实施方案中，这些癌细胞包含由HR途径中不是ATM并且不是ATR的基因、基因产物或活性组成的HR耗损。
在一些实施方案中，确定该癌症会耗损一种或多种DNA损伤修复(DDR)途径中的一种或多种基因或基因产物，或者癌症在至少一种DDR途径基因中具有至少一种功能丧失突变，其中该一种或多种DDR基因或基因产物不是由ATM和/或ATR组成。这意味着基因或基因产物可包含ATM和/或ATR以及一种或多种其他DDR途径生物标志物，或者如果存在唯一的生物标志物，则它不是ATM或ATR，并且如果存在一对生物标志物，则它们不是ATM和ATR但是可包含ATM或ATR以及另一种DDR途径生物标志物。在一些实施方案中，该癌症可以耗损一种DNA损伤修复(DDR)途径中的一种基因或基因产物，或者癌症在一种DDR途径基因中具有至少一种功能丧失突变，并且DDR途径基因或基因产物不是ATM或ATR。
因此，在一些实施方案中，当存在根据本发明的单一生物标志物时，该生物标志物不是ATM或ATR。在一些实施方案中，当存在根据本发明的单一生物标志物时，该生物标志物不是ATM。在一些实施方案中，当存在根据本发明的单一生物标志物时，该生物标志物不是ATR。
在一些实施方案中，该癌症可以耗损一种或多种DNA损伤修复(DDR)途径中的两种基因或基因产物，或者该癌症在至少两种DDR途径基因中具有至少一种功能丧失突变，并且DDR途径基因或基因产物不是ATM或ATR。
在一些实施方案中，该癌症可以耗损一种或多种DNA损伤修复(DDR)途径中的两种基因或基因产物，或者该癌症在至少两种DDR途径基因中具有至少一种功能丧失突变，并且DDR途径基因或基因产物包含ATM和/或ATR中的一种或多种，以及不是ATM和ATR的一种或多种DDR途径基因或基因产物。在另一个方面，该癌症耗损范科尼贫血(FA)途径中的一种或多种基因、基因产物或活性。该途径至少包括基因FANCA(Entrez基因ID 2175)、FANCB(基因ID2187)、FANCC(基因ID 2176)、FANCD1(也称为BRCA2，基因ID 675)、FANCD2(基因ID 2177)、FANCE(基因ID 2178)、FANCF(基因ID 2188)、FANCG(基因ID 2189)、FANCI(基因ID 55215)、FANCJ(基因ID 83990)、FANCL(基因ID 55120)、FANCM(基因ID 57697)、FANCN(基因ID79728)、FANCO(基因ID 889)、FANCP(基因ID 84464)、FANCQ(基因ID 2072)、FANCR(基因ID5888)、FANCS(也称为BRCA1，基因ID 672)、FANCT(基因ID 29089)、FANCU(基因ID 7516)、FANCV(基因ID 10459)和FANCW(基因ID 55159)。本发明的一个实施方案涉及与WT相比在一种或多种FA途径基因中的功能丧失突变。
在另一个方面，本发明提供了一种在治疗癌症的方法中使用的MDM2拮抗剂，其中该癌症耗损了非同源末端连接(NHEJ)途径中的一种或多种基因、基因产物或活性。因此这些癌细胞可表征为NHEJ缺陷型。在一个实施方案中，该癌症是ATRX耗损的。ATRX是α型地中海贫血/X连锁精神发育迟滞综合征。人野生型ATRX具有Entrez基因ID 546。本发明的一个实施方案涉及与WT相比在ATRX中的功能丧失突变。
在另一个方面，本发明提供了一种在治疗癌症的方法中使用的MDM2拮抗剂，其中该癌症耗损了错配修复(MMR)途径中的一种或多种基因、基因产物或活性。因此这些癌细胞可表征为MMR缺陷型。在一个实施方案中，该癌症耗损了MSH2(Entrez基因ID 4436)、MSH3(基因ID 4437)、MSH6(基因ID 2956)、MLH1(基因ID 4292)、PMS2(基因ID 5395)和/或MLH3(基因ID 27030)中的一种或多种。在进一步的实施方案中，该癌症耗损了POLD1(Entrez基因ID 5424)或POLE(基因ID 5426)，例如具有一个或多个POLD1和/或POLE突变。本发明的一个实施方案涉及与WT相比在一种或多种MMR途径基因中的功能丧失突变。
在一些实施方案中，该癌症包含突变特征SBS6和/或与DNA错配修复中的缺陷相关的SBS26，和/或POLD1突变特征SBS20。从《癌症体细胞突变目录》(COSMIC)，GRCh37 v91已知这些单碱基取代(SBS)特征。COSMIC SBS特征可以在cancer.sanger.ac.uk/cosmic处获得，并且如Alexandrov等人Nature，第578卷第94-101页(2020)所述那样制备。
在另一个方面，本发明提供了一种在治疗癌症的方法中使用的MDM2拮抗剂，其中该癌症耗损了碱基切除修复(BER)途径中的一种或多种基因、基因产物或活性。因此这些癌细胞可表征为BER缺陷型。本发明的一个实施方案涉及与WT相比在一种或多种BER途径基因中的功能丧失突变。
在所有方面的一个实施方案中，通过微卫星不稳定性(MSI)和/或癌症的肿瘤突变负荷(通常为“MSI-高”和/或“高肿瘤突变负荷”)指示癌症中DDR基因或功能性基因产物的丢失或耗损。
对于一些生物标志物，通常测量蛋白质。这可以使用例如免疫组织化学(IHC)来实现。在一些实施方案中，突变分析(例如，DNA测序)可用于检测生物标志物状态。
在一些实施方案中，本发明提供了一种在治疗癌症的方法中使用的MDM2拮抗剂，其中该癌症耗损了一种或多种DDR生物标志物并且任选地一种或多种干扰素特征(IFN特征)基因的表达增加。IFN特征基因包括CXCL10、CXCL11、RSAD2、MX1、BATF2、IFI44L、IFITM1、ISG15、CMPK2、IFI27、CD74、IFIH1、CCRL2、IFI44、HERC6、ISG20,1FIT3、HLA-C、OAS1、IFI35、IRF9、EPSTI1、USP18、BST2、CSF1、C1S、DHX58、TRIM14、OASL、IRF7、LGALS3BP、DDX60、LAP3、LAMP3、PARP12、PARP9、SP110、PLSCR1、WARS、STAT1、IRF3、IRF5、MSC、JUN、SPI1、IRF1、COMMD3-BMI1、STAT2、RUNX3、SREBF1和FLI1。这些生物标志物在本文中统称为“干扰素特征”。通常，IFN特征生物标志物将作为mRNA被检测到。
一种或多种核酸生物标志物(例如IFN特征生物标志物)的测量技术可以包括定量技术，诸如本领域已知的RT-PCR或Nanostring分析。也可以测量DNA。在一些实施方案中，拷贝数变异(CNV)分析和/或突变分析(例如DNA测序)可用于检测生物标志物基因状态。
在一些实施方案中，本发明提供了一种在治疗癌症的方法中使用的MDM2拮抗剂，其中该癌症耗损了一种或多种DDR生物标志物并且任选地CDKN2A、BAP1和SKP2中的一种、两种或三种的表达也降低。任选地，该癌症耗损一种或多种DDR生物标志物并且耗损CDKN2A、BAP1和SKP2中的一种、两种或三种。此类癌症还可具有增加的本文所述的一种或多种干扰素特征(IFN特征)基因的表达。在一个实施方案中，提供了一种在治疗癌症的方法中使用的MDM2拮抗剂，其中该癌症耗损了一种或多种DDR生物标志物并且任选地也是CDKN2A耗损的；是BAP1耗损的；和/或显示一种、两种、三种、四种、五种或更多种干扰素特征基因表达增加。
SKP2耗损可能意味着SKP2基因的丢失或完全丢失、SKP2基因突变和功能丧失，或者可能意味着低基因表达及低蛋白质表达和低功能水平，这是由于基因的丢失或突变或其他原因造成的。在一个实施方案中，提供了一种在治疗癌症的方法中使用的MDM2拮抗剂，其中该癌症耗损了一种或多种DDR生物标志物并且任选地还具有降低的、减少的、低的或没有SKP2表达。
CDKN2A基因编码p16(INK4A)和p14(ARF)蛋白，对基因CDKN2A的引用包括由CDKN2A编码的蛋白。CDKN2A丢失可以通过低蛋白表达产物水平来测量，即p16(INK4A)和/或p14(ARF)表达水平低于对照表达水平，即CDKN2A基因丢失的结果是p16和/或P14的丢失。
对于CDKN2A，通常测定蛋白质。这可以使用例如免疫组织化学(IHC)来实现。在一些实施方案中，突变分析(例如，DNA测序)可用于检测CDKN2A状态。
对于BAP1，通常可以测定蛋白质。这可以使用例如免疫组织化学(IHC)来实现。在一些实施方案中，也可以测定细胞位置。在一些实施方案中，突变分析(例如，DNA测序)可用于检测BAP1状态。本文鉴定为具有表达增加的生物标志物有时称为干扰素特征或IFN特征生物标志物。它们也被称为术语1型干扰素通路基因。通常，这些生物标志物作为mRNA被检测。因此，一种或多种IFN特征生物标志物的测量技术可以包括定量技术，例如本领域已知的RT-PCR或Nanostring分析。也可以测量DNA。在一些实施方案中，拷贝数变异(CNV)分析和/或突变分析(例如DNA测序)可用于检测生物标志物基因状态。
本发明的生物标志物可以直接或间接测定。间接测定通常涉及检测一个位于生物标志物功能性上游或下游的分子，其水平与生物标志物的水平相关。例如，生物标志物与之作用的底物可以用作生物标志物的间接测定。在一个实施方案中，BAP1水平可以通过检测组蛋白H2A泛素化水平来测定，H2A泛素化增加通常代表BAP1降低。在另一个实施方案中，BAP1缺失可以通过确定EZH2表达或活性增加来评估。在一个实施方案中，可以通过检测一种或多种SKP2底物来间接检测SKP2。典型的SKP2底物是p27。在本发明的一个实施方案中，通过测量p27、p21、p57、E2F-1、MEF、P130、Tobi、细胞周期蛋白D、细胞周期蛋白E、Smad4、Myc、Mcb、RASSF1A、Foxol、Orclp、Cdt1、Rag2、Brca2、CDK9、MPK1和/或UBP43中的一种或多种的水平来评估SKP2水平。
DDR生物标志物的另一间接测量是DDR缺陷的下游读出。一种此类读出是肿瘤突变负荷(TMB)。另一下游读出是微卫星不稳定性(MSI)。临床测定法已经在临床中用于基于那些特点将患者分层。例如，MSI-高(或MSI-H)是癌症的公知临床定义，可以使用包括下一代测序、荧光多重PCR和毛细管电泳、免疫组织化学或单分子的分子倒置探针在内的技术来确定。此外，可以使用NGS方法测量TMB。肿瘤突变负荷(TMB)可以用作基因组不稳定性和MSI的标志物。MSI测试方法(MSK-影响和F1CDx)包括微卫星不稳定性(MSI)和肿瘤突变负荷(TMB)测量。
以下实施例中的数据指示，一种或多种DDR生物标志物活性的耗损例如丢失(也称为整个丢失或完全丢失)可预测癌细胞对MDM2拮抗剂的敏感性。因此，低水平的一种或多种DDR生物标志物可用于鉴定适合用MDM2拮抗剂治疗的癌症。在某些实施方案中，DDR生物标志物可以来自以下途径中的一种或多种：HR、NHEJ、FA、MMR和/或BER。所测量的多种DDR生物标志物可全部是相同途径中的，或者可来自不同途径。在一个实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATM、BRCA1和/或BRCA2，通常是功能丧失性ATM、BRCA1和/或BRCA2突变。在另一个实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATRX，通常是功能丧失性ATRX突变。在另一个实施方案中，一种或多种DDR生物标志物是FA途径中的。在进一步的实施方案中，MMR生物标志物耗损通过MSI(例如MSI-高)和/或与非敏感细胞相比肿瘤突变负荷增加来鉴定。在一个实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、PMS2和/或MLH3中的一种或多种。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括POLD1和/或POLE。在一些实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包含突变特征SBS6和/或与DNA错配修复中的缺陷相关的SBS26，和/或POLD1突变特征SBS20。
在一些实施方案中，本发明的一种或多种生物标志物水平降低是相对于非癌细胞确定的。这种癌症:非癌比较可能特别有用。非癌细胞通常是与癌细胞类型相同的一种细胞。非癌细胞可以来自同一患者，或者可以来自不同的患者，或者可以是该类型非癌细胞的已知的值。这样，生物标志物水平(例如表达或活性)可以相对于在健康个体中确定的对照水平或相对于在正常非增殖组织中确定的对照水平进行比较。
在一些其他实施方案中，本发明的一种或多种生物标志物的水平(例如表达)降低，是相对于来自对MDM2抑制剂无反应的受试者人群的多个癌细胞样品，或来自一位对MDM2抑制剂无反应的受试者的一个癌细胞样品来确定的。无反应性癌细胞通常是与被测试的癌细胞具有相同癌症类型的细胞。无反应性癌细胞通常来自于与测试样品不同的一个或多个患者，或者可以是对于无反应的该癌症类型癌细胞已知的值。
在一些实施方案中，当该一种或多种DDR生物标志物的表达或活性水平相对于正常上限(ULN)较低时，可将该患者鉴定为用MDM2拮抗剂治疗的候选者。在一个实施方案中，该一种或多种DDR生物标志物来自以下途径中的一种或多种：HR、NHEJ、FA、MMR和/或BER。所测量的一种或多种DDR生物标志物可全部是相同途径中的，或者可来自不同途径。
在另一个实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATM。在一些实施方案中，与野生型相比具有功能丧失突变的ATM的存在预测对MDM2拮抗的敏感性。在另一个实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA1。在一些实施方案中，与野生型相比具有功能丧失突变的BRCA1的存在预测对MDM2拮抗的敏感性。在另一个实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA2。在一些实施方案中，与野生型相比具有功能丧失突变的BRCA2的存在预测对MDM2拮抗的敏感性。
在另一个实施方案中所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATRX。在一些实施方案中，与野生型相比具有功能丧失突变的ATRX的存在预测对MDM2拮抗的敏感性。在一个实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、PMS2和/或MLH3中的一种或多种。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括POLD1和/或POLE。在一些实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包含突变特征SBS6和/或与DNA错配修复中的缺陷相关的SBS26，和/或POLD1突变特征SBS20。
在另一个实施方案中，一种或多种DDR生物标志物是FA途径中的。
在进一步的实施方案中，DDR生物标志物(例如MMR生物标志物)耗损通过MSI(例如MSI-高)和/或增加的肿瘤突变负荷(例如高TMB，或相对于非敏感癌细胞增加)来鉴定)。
任选地，该方法可以包括向患者施用治疗有效量的MDM2拮抗剂的步骤。
在本文所述的所有方面和实施方案中，癌症通常是p53-野生型癌症。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于癌症治疗，特别是p53野生型癌症的MDM2拮抗剂，其中癌症的特征在于从患者获得的一份生物样品中一种或多种本发明的生物标志物。
根据本发明的另一个实施方案，提供了一种为一位患者治疗癌症的方法，其中所述方法包括根据本发明的一种或多种生物标志物的表达谱选择患者的步骤。在某些实施方案中，根据以下选择患者：
在从所述患者获得的生物样品中具有降低的一种或多种DDR生物标志物表达或活性；
然后任选地向所述患者施用治疗有效量的MDM2拮抗剂。在一个实施方案中，该一种或多种DDR生物标志物来自以下途径中的一种或多种：HR、NHEJ、FA、MMR和/或BER。所测量的一种或多种DDR生物标志物可全部是相同途径中的，或者可来自不同途径。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATM。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA1。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA2。在另一个实施方案中所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATRX。在一个实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、PMS2和/或MLH3中的一种或多种。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括一个或多个POLD1和/或POLE突变。在一些实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包含突变特征SBS6和/或与DNA错配修复中的缺陷相关的SBS26，和/或POLD1突变特征SBS20。在另一个实施方案中，一种或多种DDR生物标志物是FA途径中的。在进一步的实施方案中，通过增加的MSI和/或增加的肿瘤突变负荷来鉴定生物标志物耗损。
根据本发明的另一个实施方案，提供了一种在治疗患者的癌症中使用的MDM2拮抗剂，其特征在于所述患者已经因在从所述患者获得的生物样品中具有降低的或低的一种或多种DDR生物标志物表达而被选择。在一个实施方案中，该一种或多种DDR生物标志物来自以下途径中的一种或多种：HR、NHEJ、FA、MMR和/或BER。所测量的一种或多种DDR生物标志物可全部是相同途径中的，或者可来自不同途径。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATM。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA1。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA2。在另一个实施方案中所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATRX。在一个实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、PMS2和/或MLH3中的一种或多种。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括POLD1和/或POLE。在一些实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括测量突变特征SBS6和/或与DNA错配修复中的缺陷相关的SBS26，和/或POLD1突变特征SBS20。在另一个实施方案中，一种或多种DDR生物标志物是FA途径中的。在进一步的实施方案中，通过增加的MSI(例如MSI-高)和/或高肿瘤突变负荷(TMB)来鉴定生物标志物耗损。
在某些实施方案中，在治疗之前测试患者组织样品以确定癌症生物标志物表达谱。样品通常可以包括一种或多种癌细胞、癌症DNA或循环肿瘤DNA。样品可以是血液样品。样品可以是肿瘤样品，例如肿瘤活检。测试可以包括检测蛋白质、mRNA、DNA和/或ctDNA的测定。
在另一方面，本发明提供了本发明的一种或多种生物标志物在人类患者的癌细胞样品中的表达水平，作为生物标志物物用于评估癌症是否对用MDM2拮抗剂治疗敏感的用途。
在另一方面，本发明提供了一种用于预测或评估人类癌症患者对用MDM2拮抗剂治疗的反应的方法，该方法包括评估来自癌症患者的样品中本发明的一种或多种生物标志物的表达水平并确定测试的表达水平是否指示癌症应该用MDM2拮抗剂治疗。
在一些实施方案中，本发明的一种或多种生物标志物表明癌症可能被有效地凋亡。因此，在一些实施方案中，本发明能够鉴定那些治疗将会特别有效的患者。
在一些实施方案中，评估步骤包括体外测定以确定该一种或多种生物标志物的表达水平。
在一些实施方案中，评估步骤包括将表达水平与已知的与对用MDM2拮抗剂治疗的有反应或无反应相关的表达水平进行比较。在一些实施方案中，评估步骤包括将观察到的表达水平与以相同方式反映的与用MDM2拮抗剂治疗的敏感性相关的表达水平的阈值进行比较，以评估测定的表达水平是否表明癌症可以用MDM2拮抗剂治疗。
在一些实施方案中，根据生物标志物图谱将患者分类成组。这可能包括将患者分类为可能对用MDM2拮抗剂治疗反应良好(或强烈)或不好。
在另一方面，本发明提供一种确定人类癌症患者是否适合用MDM2拮抗剂治疗的方法，包括
在来自患者的癌细胞样品中检测本发明的一种或多种生物标志物的表达或活性；并且
根据样品中生物标志物的表达或活性水平，评估患者的癌症是否可能用MDM2拮抗剂治疗。任选地，该方面的方法包括使用MDM2拮抗剂治疗患者癌症的进一步步骤。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种与抗癌化合物联合用于治疗患者癌症的MDM2拮抗剂，其特征在于所述患者中的所述癌症是p53野生型癌症，该患者由于具有本发明中一种或更多生物标志物而被选择。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种治疗患者的癌症的方法，其中所述患者的所述癌症任选地是p53野生型癌症，并且其中该患者由于具有本发明的一种或多种生物标志物的水平指示MDM2拮抗剂治疗将是有效的而被选择；向所选患者施用治疗有效量的MDM2拮抗剂和任选另一种抗癌剂。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种鉴定患有适合用MDM2拮抗剂治疗的癌症的患者的方法，其中所述方法包括检测和任选地定量本发明的一种或多种生物标志物的表达水平。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种选择患者(例如，患有癌症)的方法，其中所述方法包括通过检测和任选地定量本发明的一种或多种生物标志物的表达水平来选择患者的步骤。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种确定癌症患者将对用MDM2拮抗剂治疗产生反应的可能性的方法，该方法包括：
获得来自患者的癌细胞样品中与相应的非癌细胞相比一种或多种DDR生物标志物的表达降低的测量值；
并根据该测量结果确定患者可能对用MDM2拮抗剂治疗有反应。该一种或多种DDR生物标志物任选地来自以下途径中的一种或多种：HR、NHEJ、MMR、FA和/或BER。所测量的一种或多种DDR生物标志物可全部是相同途径中的，或者可来自不同途径。任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATM。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA1。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA2。任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATRX。在一个实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、PMS2和/或MLH3中的一种或多种。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括一个或多个POLD1和/或POLE突变。在一些实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包含突变特征SBS6和/或与DNA错配修复中的缺陷相关的SBS26，和/或POLD1突变特征SBS20。任选地，一种或多种DDR生物标志物是FA途径中的。任选地，在一种或多种DDR生物标志物是MMR途径中的情况下，通过MSI和/或高肿瘤突变负荷来鉴定所述一种或多种生物标志物的耗损。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种施用方法，包括：
确定本发明的一种或多种生物标志物
向具有本发明一种或多种生物标志物的患者施用治疗有效量的MDM2拮抗剂。
在又一个方面，本发明提供了一种检测本发明的一种或多种生物标志物在患有癌症的人类患者中表达水平的方法。该方法通常包括：
(a)从人类患者获得癌细胞样品；并且
(b)通过将样品与一种或多种用于检测生物标志物表达的试剂接触来检测所述生物标志物是否在取样的癌细胞中表达。
在另一个方面，本发明提供了用于检测来自人类患者的样品中至少一种与对MDM2拮抗作用的敏感性有关生物标志物的表达水平的试剂盒或装置，所述试剂盒或装置包含用于检测本发明的一种或多种生物标志物的一种或多种检测试剂。
在另一方面，本发明在于一种用于评估一位人类癌症患者是否对用MDM2拮抗剂治疗敏感的系统，该系统包括：
能够并适于在来自人类患者的样品中检测本发明的一种或多种生物标志物的检测工具
处理器，其能够并适于从所确定的一个或多个生物标志物确定患者可用MDM2拮抗剂治疗可能性的指示。
该系统可选地包括一种与一个界面的数据连接，特别是图形用户界面，能够呈现信息，优选地还能够输入诸如受试者年龄的信息，以及可选地诸如性别和/或病史信息的其它患者信息，所述界面是一个系统或一个远程界面本身或其一部分。可选地，上述项目中的一项或多项，特别是处理器，能够“在云中”运行，即，不是在固定机器上，而是通过基于互联网的应用程序的方式。
本发明还提供了鉴定和筛选患者、药物组合和试剂盒的方法。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种筛选或鉴定用MDM2拮抗剂治疗的患者的方法，该方法包括确定所述患者是否：
在从所述患者获得的生物样品中具有降低的一种或多种DDR生物标志物表达。在一个实施方案中，该一种或多种DDR生物标志物来自以下途径中的一种或多种：HR、NHEJ、MMR、FA和/或BER。所测量的一种或多种DDR生物标志物可全部是相同途径中的，或者可来自不同途径。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATM。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA1。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA2。在另一个实施方案中所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATRX。在一个实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、PMS2和/或MLH3中的一种或多种。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括POLD1和/或POLE。在一些实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包含突变特征SBS6和/或与DNA错配修复中的缺陷相关的SBS26，和/或POLD1突变特征SBS20。在另一个实施方案中，一种或多种DDR生物标志物是FA途径中的。在进一步的实施方案中，通过MSI和/或高肿瘤突变负荷来鉴定MMR生物标志物耗损。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种鉴定有反应患者的方法，该方法包括测试患者：
在从所述患者获得的生物样品中具有降低的一种或多种DDR生物标志物表达。在一个实施方案中，该一种或多种DDR生物标志物来自以下途径中的一种或多种：HR、NHEJ、MMR、FA和/或BER。所测量的一种或多种DDR生物标志物可全部是相同途径中的，或者可来自不同途径。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATM。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA1。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA2。在另一个实施方案中所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATRX。在一个实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、PMS2和/或MLH3中的一种或多种。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括一个或多个POLD1和/或POLE突变。在一些实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包含突变特征SBS6和/或与DNA错配修复中的缺陷相关的SBS26，和/或POLD1突变特征SBS20。在另一个实施方案中，一种或多种DDR生物标志物是FA途径中的。在进一步的实施方案中，通过MSI和/或高肿瘤突变负荷来鉴定MMR生物标志物耗损。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种治疗方法，包括：
(a)鉴定需要治疗癌症(任选地p53野生型癌症诸如间皮瘤)的患者；
(b)确定患者在从所述患者获得的生物样品中具有降低的一种或多种DDR生物标志物表达；并且用治疗有效量的MDM2拮抗剂治疗患者。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种治疗方法，包括：
(a)鉴定需要治疗癌症(任选地乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌或胰腺癌)的患者；
(b)确定患者在从所述患者获得的生物样品中具有降低的一种或多种DDR生物标志物表达；并且用治疗有效量的MDM2拮抗剂治疗患者。
任选地，该一种或多种DDR生物标志物来自以下途径中的一种或多种：HR、NHEJ、MMR、FA和/或BER。所测量的一种或多种DDR生物标志物可全部是相同途径中的，或者可来自不同途径。任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATM。任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA1。任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA2。任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATRX。在一个实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、PMS2和/或MLH3中的一种或多种。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括一个或多个POLD1和/或POLE突变。在一些实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包含突变特征SBS6和/或与DNA错配修复中的缺陷相关的SBS26，和/或POLD1突变特征SBS20。任选地，一种或多种DDR生物标志物是FA途径中的。任选地，在一种或多种DDR生物标志物是MMR途径中的情况下，通过MSI和/或高肿瘤突变负荷来鉴定所述一种或多种生物标志物的耗损。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种治疗方法，包括：
(a)鉴定需要治疗癌症(任选地间皮瘤)的患者；
(b)确定患者中本发明的一种或多种生物标志物，任选地，来自HR、NHEJ、FA、MMR和/或BER途径中的一种或多种的一种或多种DDR生物标志物；
a.任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA1、BRCA2、ATM和ATRX中的1、2、3或4种；和/或
b.任选地，一种或多种DDR生物标志物是FA途径中的；和/或
c.任选地，一种或多种DDR生物标志物是MMR途径中的，例如MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、PMS2、MLH3、POLE和/或POLD1中的一种或多种、和/或突变特征SBS6、SBS26和/或SBS20，其中任选地通过MSI和/或高肿瘤突变负荷来鉴定所述一种或多种MMR途径DDR生物标志物的耗损；
(c)基于对MDM2拮抗剂在具有本发明的一种或多种生物标志物的患者中有效的认识，选择MDM2拮抗剂作为患者的治疗；
(d)用治疗有效量的MDM2拮抗剂治疗患者。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种治疗方法，包括：
(a)鉴定需要治疗癌症(任选地乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌或胰腺癌)的患者；
(b)确定患者中本发明的一种或多种生物标志物，任选地，来自HR、NHEJ、FA、MMR和/或BER途径中的一种或多种的一种或多种DDR生物标志物；
a.任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA1、BRCA2、ATM和ATRX中的1、2、3或4种或由BRCA1、BRCA2、ATM和ATRX中的1、2、3或4种组成；和/或
b.任选地，一种或多种DDR生物标志物是FA途径中的；和/或
c.任选地，一种或多种DDR生物标志物是MMR途径中的，例如MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、PMS2、MLH3、POLE和/或POLD1中的一种或多种、和/或突变特征SBS6、SBS26和/或SBS20，其中任选地通过MSI和/或高肿瘤突变负荷来鉴定所述一种或多种MMR途径DDR生物标志物的耗损；
(c)基于对MDM2拮抗剂在具有本发明的一种或多种生物标志物的患者中有效的认识，选择MDM2拮抗剂作为患者的治疗；
(d)用治疗有效量的MDM2拮抗剂治疗患者。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种为癌症患者选择一种治疗方法的方法，包括：
(a)测定一种或多种生物样品，从而确定患者体内本发明的一种或多种生物标志物；
(b)根据该确定结果选择该患者用治疗有效量的MDM2拮抗剂进行治疗。
在一个实施方案中，DDR生物标志物来自HR途径并且是选自以下的一种或多种HR基因：LIG1、MRE11A、NBN、PARG、PARP1、PARPBP、RAD50、TP53BP1、XRCC2、XRCC3、EXO1、PCNA、POLD1、POLD2、POLD3、POLD4、RFC1、RFC2、RFC3、RFC4、RFC5、RPA1、RPA2、RPA3、RPA4、BARD1、BLM、BRCA1、BRCA2、BRIP1、DMC1、DNA2、EID3、EME1、EME2、ERCC1、H2AFX、HELQ、HFM1、INO80、KAT5、MUS81、NFATC2IP、NSMCE1、NSMCE2、NSMCE3、NSMCE4A、PALB2、PARP2、PAXIP1、POLH、POLQ、PPP4C、PPP4R1、PPP4R2、PPP4R4、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD52、RAD54B、RAD54L、RBBP8、RDM1、RECQL、RECQL4、RECQL5、RMI1、RMI2、RTEL1、SHFM1、SLX1A、SLX1B、SLX4、SMARCAD1、SMC5、SMC6、SPO11、SWSAP1、TOP3A、TOP3B、UIMC1、WRN和/或ZSWIM7。
在进一步的实施方案中，本发明提供了选择一个用MDM2拮抗剂治疗的患者(例如，患有癌症)的方法，其特征在于所述患者因具有以下条件而被选择：
在从所述患者获得的生物样品中具有降低的或低的一种或多种DDR生物标志物表达。任选地，该一种或多种DDR生物标志物来自以下途径中的一种或多种：HR、NHEJ、FA、MMR和/或BER。所测量的一种或多种DDR生物标志物可全部是相同途径中的，或者可来自不同途径。任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATM。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA1。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA2。任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATRX。在一个实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、PMS2和/或MLH3中的一种或多种。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括POLD1和/或POLE。在一些实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包含突变特征SBS6和/或与DNA错配修复中的缺陷相关的SBS26，和/或POLD1突变特征SBS20。任选地，一种或多种DDR生物标志物是FA途径中的。任选地，在一种或多种DDR生物标志物是MMR途径中的情况下，通过MSI和/或高肿瘤突变负荷来鉴定所述一种或多种生物标志物的耗损。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种在治疗患者的癌症中使用的MDM2拮抗剂，其特征在于已知所述患者在从所述患者获得的生物样品中具有降低的一种或多种DDR生物标志物表达或活性。任选地，该一种或多种DDR生物标志物来自以下途径中的一种或多种：HR、NHEJ、FA、MMR和/或BER。所测量的一种或多种DDR生物标志物可全部是相同途径中的，或者可来自不同途径。任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATM。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA1。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA2。任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATRX。在一个实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、PMS2和/或MLH3中的一种或多种。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括一个或多个POLD1和/或POLE突变。在一些实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包含突变特征SBS6和/或与DNA错配修复中的缺陷相关的SBS26，和/或POLD1突变特征SBS20。任选地，一种或多种DDR生物标志物是FA途径中的。任选地，在一种或多种DDR生物标志物是MMR途径中的情况下，通过MSI和/或高肿瘤突变负荷来鉴定所述一种或多种生物标志物的耗损。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种用于治疗患者的癌症的试剂盒，其中所述试剂盒包含用于检测和/或定量本发明的一种或多种生物标志物的生物传感器，和/或用于检测本发明的一种或多种生物标志物的试剂，任选地连同与本文定义的方法一致的试剂盒的使用说明。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种确定患有癌症的个体对用MDM2拮抗剂治疗的反应的方法，该方法包括检测从所述患者获得的生物样品中降低的一种或多种DDR生物标志物表达或活性。任选地，该一种或多种DDR生物标志物来自以下途径中的一种或多种：HR、NHEJ、FA、MMR和/或BER。所测量的一种或多种DDR生物标志物可全部是相同途径中的，或者可来自不同途径。任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATM。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA1。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA2。任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATRX。在一个实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、PMS2和/或MLH3中的一种或多种。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括一个或多个POLD1和/或POLE突变。在一些实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包含突变特征SBS6和/或与DNA错配修复中的缺陷相关的SBS26，和/或POLD1突变特征SBS20。任选地，一种或多种DDR生物标志物是FA途径中的。任选地，在一种或多种DDR生物标志物是MMR途径中的情况下，通过MSI和/或高肿瘤突变负荷来鉴定所述一种或多种生物标志物的耗损。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种确定患有癌症的个体对用MDM2拮抗剂治疗的反应的方法，包括鉴定患者：
在从所述患者获得的生物样品中具有降低的一种或多种DDR生物标志物表达或活性；然后
向所述患者施用治疗有效量的MDM2拮抗剂。
所述一种或多种DDR生物标志物任选地来自以下途径中的一种或多种：HR、NHEJ、MMR、FA和/或BER。所测量的一种或多种DDR生物标志物可全部是相同途径中的，或者可来自不同途径。任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATM。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA1。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA2。任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATRX。在一个实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、PMS2和/或MLH3中的一种或多种。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括POLD1和/或POLE。在一些实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包含突变特征SBS6和/或与DNA错配修复中的缺陷相关的SBS26，和/或POLD1突变特征SBS20。任选地，一种或多种DDR生物标志物是FA途径中的。任选地，在一种或多种DDR生物标志物是MMR途径中的情况下，通过MSI和/或高肿瘤突变负荷来鉴定所述一种或多种生物标志物的耗损。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种治疗患者的癌症的方法，其中所述方法包括选择在从所述患者获得的生物样品中具有降低的一种或多种DDR生物标志物表达或活性的患者的步骤。任选地，该一种或多种DDR生物标志物来自以下途径中的一种或多种：HR、NHEJ、MMR和/或BER。所测量的一种或多种DDR生物标志物可全部是相同途径中的，或者可来自不同途径。任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATM。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA1。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA2。任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATRX。在一个实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、PMS2和/或MLH3中的一种或多种。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括多个POLD1和/或POLE突变。在一些实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包含突变特征SBS6和/或与DNA错配修复中的缺陷相关的SBS26，和/或POLD1突变特征SBS20。任选地，一种或多种DDR生物标志物是FA途径中的。任选地，在一种或多种DDR生物标志物是MMR途径中的情况下，通过MSI和/或高肿瘤突变负荷来鉴定所述一种或多种生物标志物的耗损。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种药物施用过程，包括：
(i)对一种或多种DDR生物标志物的表达或活性的确定进行排序；
a.任选地，该一种或多种DDR生物标志物来自以下途径中的一种或多种：HR、NHEJ、FA、MMR和/或BER；
并且
(ii)向一种或多种DDR生物标志物水平降低的患者施用治疗有效量的MDM2拮抗剂。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种被包装的药品，包括：
(i)MDM2拮抗剂；
(ii)详细说明在使用本文描述的生物标志物谱鉴定的患者的治疗中使用MDM2拮抗剂的患者插页。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种治疗患者癌症的方法，其中所述方法包括：
(i)将来自患者的样品与引物、抗体、底物或探针接触，以确定一种或多种DDR生物标志物的表达或活性水平；
a.任选地该一种或多种DDR生物标志物来自以下途径中的一种或多种：HR、FA、NHEJ、MMR和/或BER；
b.任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATM、BRCA1、BRCA2和/或ATRX；
c.任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、MLH3、PMS2、POLE和/或POLD1突变，任选地其中该癌症包含突变特征SBS6、SBS26和/或SBS20；
d.任选地，一种或多种DDR生物标志物是FA途径中的；和/或
e.任选地，其中所述一种或多种生物标志物的耗损可以通过MSI和/或高肿瘤突变负荷来鉴定。
(ii)选择从所述患者获得的生物样品中一种或多种DDR生物标志物的水平降低的患者；
(iii)随后向在步骤(ii)中选择的所述患者施用治疗有效量的MDM2拮抗剂。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种用于鉴定可使用MDM2拮抗剂治疗的患者的方法，该方法包括：
(a)将来自患者的样品与多个寡核苷酸引物接触，所述多个引物包括至少一对用于任何一种或多种DDR生物标志物的寡核苷酸引物；
(b)对所述样品进行PCR以扩增样品中的基因表达产物/转录产物；
(c)确定至少一种所述基因的表达产物的水平；并且
(d)当所述至少一种基因的表达水平相对于正常上限(ULN)较低时，
将该患者鉴定为用MDM2拮抗剂治疗的候选者。
当多种DDR生物标志物中的一种的表达水平相对于正常上限(ULN)较低(例如低于正常上限)时，可任选地将患者鉴定为用MDM2拮抗剂治疗的候选者。任选地，该一种或多种DDR生物标志物来自以下途径中的一种或多种：HR、NHEJ、FA、MMR和/或BER。所测量的一种或多种DDR生物标志物可全部是相同途径中的，或者可来自不同途径。任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATM。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA1。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA2。任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATRX。在一个实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、PMS2和/或MLH3中的一种或多种。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括一个或多个POLD1和/或POLE突变。在一些实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包含突变特征SBS6和/或与DNA错配修复中的缺陷相关的SBS26，和/或POLD1突变特征SBS20。任选地，一种或多种DDR生物标志物是FA途径中的。任选地，在一种或多种DDR生物标志物是MMR途径中的情况下，通过MSI和/或高肿瘤突变负荷来鉴定所述一种或多种生物标志物的耗损。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种用于鉴定可使用MDM2拮抗剂治疗的患者的方法，该方法包括：
(a)将来自患者的样品与本发明的一种或多种生物标志物的抗体接触；
(b)对所述样品进行测定；
(c)确定本发明的一种或多种生物标志物的水平；并且
(d)当本发明的一种或多种生物标志物的水平相对于正常上限(ULN)升高或降低时，将该患者鉴定为用MDM2拮抗剂治疗的候选者。
(b)部分中的测定可以是或包括免疫组织化学测定。在一些实施方案中，该测定可以是或包括ELISA。当将来自患者的样品与一种或多种DDR生物标志物的抗体接触时，通常对所述样品进行免疫组织化学测定，并且当一种或多种DDR生物标志物的水平相对于正常上限(ULN)低(或不存在)时，将患者鉴定为用MDM2拮抗剂治疗的候选者。
一旦鉴定了治疗的患者，本文所述的方法就还可以包括用MDM2拮抗剂治疗患者的癌症。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种选择接受MDM2拮抗剂治疗癌症的癌症患者的方法，该方法包括：
(a)确定在来自患者的生物样品中的一种或多种DDR生物标志物的水平；
该一种或多种DDR生物标志物任选地来自HR、FA、NHEJ、MMR和/或BER途径中的一种或多种；和/或
所测量的一种或多种DDR生物标志物任选地包括ATM、BRCA1、BRCA2和/或ATRX；和/或
所测量的一种或多种DDR生物标志物任选地包括MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、PMS2、MLH3、POLE和/或POLD1，任选地其中该癌症包含突变特征SBS6、SBS26和/或SBS20；和/或
一种或多种DDR生物标志物任选地是FA途径中的；和/或在一种或多种DDR生物标志物是MMR途径中的情况下，任选地通过MSI和/或高肿瘤突变负荷来鉴定所述一种或多种生物标志物的耗损；
并且
(b)选择在来自患者的生物样品中一种或多种DDR生物标志物的水平低于来自等于或大于预定值的患者的生物样品中的预定值的患者。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种用于预测针对癌症的MDM2拮抗剂在患者中的功效或用于预测癌症患者对针对癌症的MDM2拮抗剂的反应的方法，该方法包括确定来自患者的生物样品中一种或多种DDR生物标志物的水平，其中该一种或多种DDR生物标志物的生物样品水平等于或通常小于预定值，预测了在患者中的功效。任选地，该一种或多种DDR生物标志物来自以下途径中的一种或多种：HR、NHEJ、MMR和/或BER。所测量的一种或多种DDR生物标志物可全部是相同途径中的，或者可来自不同途径。任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATM。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA1。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA2。任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATRX。在一个实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、PMS2和/或MLH3中的一种或多种。在进一步的实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括POLD1和/或POLE。在一些实施方案中，所测量的一种或多种DDR生物标志物包含突变特征SBS6和/或与DNA错配修复中的缺陷相关的SBS26，和/或POLD1突变特征SBS20。任选地，一种或多种DDR生物标志物是FA途径中的。任选地，在一种或多种DDR生物标志物是MMR途径中的情况下，通过MSI和/或高肿瘤突变负荷来鉴定所述一种或多种生物标志物的耗损。
在一个实施方案中，基于测量选自以下的一种或多种HR途径生物标志物来选择患者进行MDM2拮抗剂治疗：LIG1、MRE11A、NBN、PARG、PARP1、PARPBP、RAD50、TP53BP1、XRCC2、XRCC3、EXO1、PCNA、POLD1、POLD2、POLD3、POLD4、RFC1、RFC2、RFC3、RFC4、RFC5、RPA1、RPA2、RPA3、RPA4、BARD1、BLM、BRCA1、BRCA2、BRIP1、DMC1、DNA2、EID3、EME1、EME2、ERCC1、H2AFX、HELQ、HFM1、INO80、KAT5、MUS81、NFATC2IP、NSMCE1、NSMCE2、NSMCE3、NSMCE4A、PALB2、PARP2、PAXIP1、POLH、POLO、PPP4C、PPP4R1、PPP4R2、PPP4R4、RAD51、RAD51B、RAD51C、RAD51D、RAD52、RAD54B、RAD54L、RBBP8、RDM1、RECQL、RECQL4、RECQL5、RMI1、RMI2、RTEL1、SHFM1、SLX1A、SLX1B、SLX4、SMARCAD1、SMC5、SMC6、SPO11、SWSAP1、TOP3A、TOP3B、UIMC1、WRN和/或ZSWIM7。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种选择患有需要用MDM2拮抗剂治疗的癌症的患者的方法，该方法包括测试从患者获得的肿瘤样品的低水平的一种或多种DDR生物标志物。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括(i)测试从患有或可能患癌症的患者获得的肿瘤样品中一种或多种DDR生物标志物的丢失，并且(ii)将向采集样品的患者施用MDM2拮抗剂。任选地，(i)中该一种或多种DDR生物标志物来自HR、NHEJ、MMR和/或BER途径中的一种或多种。任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATM、BRCA1、BRCA2和/或ATRX。任选地，一种或多种DDR生物标志物是FA途径中的。任选地，在一种或多种DDR生物标志物是MMR途径中的情况下，通过MSI和/或高肿瘤突变负荷来鉴定所述一种或多种生物标志物的耗损。任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、PMS2 MLH3、POLD1和/或POLE中的一种或多种。任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包含突变特征SBS6和/或与DNA错配修复中的缺陷相关的SBS26，和/或POLD1突变特征SBS20。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种鉴定患有最有可能受益于MDM2拮抗剂治疗的癌症的患者的方法，该方法包括测量从患者获得的肿瘤样品中本发明的一种或多种生物标志物的水平并根据存在的水平鉴定该患者是否可能受益于MDM2拮抗剂治疗。
本发明的一些实施方案包括检测一种或多种DDR生物标志物的突变的存在，突变的存在指示所述一种或多种DDR生物标志物的丢失。这些突变可与在正常非增殖组织中或不存在突变的情况下确定的对照水平进行比较。
本发明不同地提供了：一种确定癌症患者是否适合用MDM2拮抗剂治疗的方法；一种预测肿瘤细胞生长对MDM2拮抗剂的抑制的敏感性的方法；一种预测受试者的癌症对包括MDM2拮抗剂的癌症治疗的反应的方法；一种开发用于患有癌症的受试者的治疗计划的方法；一种鉴定对MDM2拮抗剂方案的治疗有反应或敏感的患者的体外方法。该方法通常包括将样品(通常是肿瘤样品)中本发明的一种或多种生物标志物的水平与参考水平进行比较，并预测癌症对包括MDM2拮抗剂的癌症治疗的反应。在一个实施方案中，这些方法包括分析一种或多种，例如，两种或更多种，或三种或更多种，或四种或更多种，或五种或更多种，或六种或更多种，或七种或更多种，或八种或更多种，或九种或更多种，或十种或更多种，或十五种或更多种本文所述的生物标志物。在一个实施方案中，该一种或多种生物标志物包括ATM。在一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不包括ATM。在一个实施方案中，该一种或多种生物标志物不包括ATR。在一个实施方案中，该一种或多种生物标志物包括BRCA1或BRAC2。在一个实施方案中，该两种或更多种生物标志物包括BRCA1和BRAC2。在一个实施方案中，该两种或更多种生物标志物包括BAP1和CDKN2A。在一个实施方案中，该两种或更多种生物标志物包括ATM。在一个实施方案中，该两种或更多种生物标志物包括ATR。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种用于预测是用MDM2拮抗剂治疗的候选者的患有肿瘤的患者将会对用该化合物治疗有反应的可能性，该方法包括以下步骤：(a)确定取自患者的一个或多个组织样品中一种或多种DDR生物标志物的水平，其中(i)一种或多种DDR生物标志物丢失(例如与至少一个正常非增殖组织的参考值相比)指示患者可能对治疗有反应，并且/或者(ii)正常或高水平的一种或多种DDR生物标志物指示患者不太可能对治疗有反应。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种测定法，该测定法包括：(a)测量或定量一种或多种DDR生物标志物的水平；(b)比较所述一种或多种DDR生物标志物的水平(例如相对于在健康个体中确定的对照水平)(例如相对于在正常非增殖组织中确定的对照水平)，并且如果存在一种或多种DDR生物标志物丢失(例如相对于在正常非增殖组织中确定的对照水平)，则鉴定患者适合用MDM2拮抗剂治疗。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种测定，包括：
(i)将从患者获得的生物样品与抗体(例如针对一种或多种DDR生物标志物有特异性的抗体)接触；
(ii)洗涤样品以去除未结合的抗体；
(iii)测量来自结合的抗体的信号强度；
(iv)将测量的信号强度与参考值进行比较，并且如果测量的强度相对于参考值增加；
(v)将从患者获得的生物样品与以下接触：
a.引物(例如任何一种或多种DDR标志物的至少一种寡核苷酸引物对)，
b.抗体(例如针对一种或多种DDR生物标志物有特异性的抗体)，和/或
c.指示一种或多种DDR生物标志物丢失的基因或突变体的引物；
(vi)对所述样品进行PCR、RT-PCR或下一代测序以扩增样品中的基因表达产物/转录产物；
(vii)确定所述基因中的至少一种基因的表达产物的水平；并且(viii)鉴定受试者适合用MDM2拮抗剂治疗的可能性增加。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括向通过测序或免疫测定法确定的肿瘤样品中一种或多种DDR生物标志物丢失的受试者施用MDM2拮抗剂。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种向有需要的患者施用MDM2拮抗剂的方法，该方法包括：
(1)确定一种或多种DDR生物标志物的患者水平；
(2)根据以上所列基因的水平和(1)中确定的肿瘤基因型为患者分配表型，其中表型选自差(P)、中等(I)和敏感(S)，并且所述表型是根据肿瘤中的基因水平分配的；并且
(3)向表型S的患者施用MDM2拮抗剂。
在一个实施方案中，通过观察BRCA1和BRCA2变体并使用三种生物标志物来评估基因组不稳定性：杂合性丢失、端粒等位基因失衡和大规模状态转变，使用来自MyriadMyChoice CDx的同源重组缺陷(HRD)评分(来自Myriad Genetics Inc.,Salt Lake City,Utah,USA的FDA批准的肿瘤测试)来确定同源重组缺陷状态。HRD阳性定义为HRD评分>＝42并且HRD阴性<42。
基于大量myChoice CDx下一代测序的体外诊断测试评估对BRCA1和BRCA2基因的蛋白质编码区和内含子/外显子边界中的单核苷酸变体、插入和缺失以及大重排变体的定性检测和分类，以及基因组不稳定性评分(GIS)的确定，GIS是使用从福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)肿瘤组织标本中分离的DNA进行的杂合性丢失(LOH)、端粒等位基因失衡(TAI)和大规模状态转变(LST)的算法测量。
测试结果可用于帮助鉴定具有阳性同源重组缺陷(HRD)状态的癌症患者，这些癌患者由于BRCA1或BRCA2基因中的有害或疑似有害突变的阳性测试结果而合格，或者可能由于BRCA1或BRCA2基因中的有害或疑似有害突变的阳性测试结果或阳性基因组不稳定性评分而变得合格，用于用MDM2拮抗剂治疗(一旦根据批准的治疗产品标记得到批准)。
在一个实施方案中，进行MSI测试。MSI测试可对新鲜、冷冻或石蜡包埋的肿瘤组织使用用于检测不稳定性的基于PCR的测定法来进行。
国家癌症研究所研讨会同意确定MSI所必需的五种微卫星标志物，包括两种单核苷酸-BAT25/26和三种二核苷酸标志物-D2S123、D5S346和D17S250。图谱的解释需要与来自每个患者的正常DNA进行比较。开发了专门基于近似单态单核苷酸标志物的替代分子方法，以避免分析匹配的正常DNA。已证实该方法比原始NCI组更具特异性和敏感性(J ClinOncol.2006年1月10日；24(2):241-51.)。
基于MSI状态，可将癌症例如CRC分类为三组：MSI-H，如果五种微卫星标志物中的两种或更多种显示出不稳定性；MSI-L(低频MSI)，如果五种标志物中仅一种标志物显示出不稳定性；以及微卫星稳定(MSS)，如果没有标志物显示出不稳定性(Cancer Res.1998年11月15日；58(22):5248-57.)。
IHC是广泛可用的替代性测试，其优点是不需要分子实验室，并且能够通过检测其蛋白质产物的丢失来鉴定受影响的基因。IHC测试的另一个优点是特定错配基因产物(MLH1、MSH2、MSH6和PMS2)的丢失可以指导对该特定基因的种系测试，并且帮助鉴定患者。缺陷错配修复(dMMR)与高频微卫星不稳定性(H-MSI)相关；dMMR测试也可经由IHC进行。
Cancer Cell Int 20,16(2020)包含微卫星不稳定性检测方法的概述，这些方法包括NGS(下一代测序)、PCR(聚合酶链式反应)、CE(毛细管电泳)、IHC(免疫组织化学)、smMIP(单分子的分子倒置探针)。
在进一步的实施方案中，本发明提供了MDM2拮抗剂在制造用于治疗患者癌症的药物中的用途，其中癌症肿瘤具有一种或多种DDR生物标志物丢失。
在进一步的实施方案中，本发明提供了MDM2拮抗剂在制造用于治疗患者癌症的药物中的用途，该患者根据本文所述的方法鉴定为可能对用MDM2拮抗剂治疗有反应。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种制品，该制品包含包装在一起的在药学上可接受的载体中的MDM2拮抗剂药物和包装插页，该包装插页指示正如通过测量一种或多种生物标志物的水平的测定方法确定，基于本文鉴定的一种或多种生物标志物的水平，癌症(例如间皮瘤、肾或胶质母细胞瘤)药物用于治疗癌症患者。
在进一步的实施方案中，本发明提供了一种为MDM2拮抗剂药物打广告的方法，该方法包括向目标受众宣传MDM2拮抗剂药物用于治疗一种或多种DDR生物标志物丢失的癌症患者的用途。
在进一步的实施方案中，本发明提供了配置为鉴定癌症患者的肿瘤(例如间皮瘤)可能受益于用靶向MDM2的治疗剂或治疗剂的组合治疗或不可能受益于用该治疗剂或治疗剂的组合治疗的装置。该装置可包括存储装置，其存储来自肿瘤或基于血液的样品的测序数据或免疫测定数据以检测一种或多种DDR生物标志物基因的水平和/或一种或多种DDR生物标志物的丢失，以将患者鉴定为可能或不可能受益于靶向MDM2的治疗剂或治疗剂的组合。
在这里描述的方法的一个实施方案中，当一种或多种DDR生物标志物的水平低或不存在(例如丢失)时，则向患者施用MDM2拮抗剂。
在这里描述的方法的另一个实施方案中，当一种或多种DDR生物标志物的水平高(或存在)时，则不向患者施用MDM2拮抗剂。
在某些实施方案中，可以将MDM2拮抗剂与不是MDM2拮抗剂的附加癌症治疗组合施用于患者。在一个实施方案中，本发明的该至少一种生物标志物可用于选择患者用MDM2拮抗剂与下文(i)-(xlix)中描述的试剂组合进行治疗。
在某些实施方案中，MDM2拮抗剂可与诱导对MDM2拮抗剂的敏感性的试剂组合施用于患者，例如以降低DNA损伤修复(DDR)途径中的一种或多种基因或基因产物的水平。
在某些实施方案中，治疗患者癌症的方法包括选择患者的步骤：
(a)在从所述患者获得的生物样品中具有正常或高水平的DDR途径基因或基因产物；并且
(b)向步骤(a)中选择的所述患者施用治疗有效量的MDM2拮抗剂，和通过降低DNA损伤修复(DDR)途径中的一种或多种基因或基因产物的水平来诱导对MDM2拮抗剂的敏感性的试剂。
在一个实施方案中，降低一种或多种DDR途径基因产物的水平的试剂是DDR途径基因或基因产物的抑制剂。
在一个实施方案中，降低一种或多种DDR途径基因产物的水平的试剂是BRCA1、BRCA2、ATM和/或ATRX的抑制剂。
附图说明
图1：双重功能丧失CRISPR筛选将DDR鉴定为对化合物1的最高敏化途径。(A)水平CRISPR数据：对CRISPR命中物的网络分析显示范科尼贫血途径的富集(Horizon生物信息学分析)。(B)基因集富集分析(GSEA)显示其他DDR途径的富集(内部生物信息学分析)。(C)间皮瘤凋亡细胞系中的复制应激基因表达特征。
图2：ATM突变与对化合物1的敏感性增加有联系。(A)与基于公共DepMAP RNAi数据(版本20Q4)的ATM野生细胞系相比，ATM突变癌细胞系显著依赖于MDM2。(B)凋亡和非凋亡间皮瘤细胞系中的ATM突变状态。(C)ATM突变细胞系增殖的减少。(D)ATM突变细胞系中的细胞凋亡诱导。(E)ATM突变细胞系中DDR信号传导的调节。(F)汇总了BRCA1、BRCA2和ATM突变体患者来源的类器官中增殖的减少的表格。(G)与BRCA2野生型患者来源的类器官相比，乳腺癌来源的BRCA2突变体中增殖的减少。
图3：ATRX是来自细胞组分析的另一命中物。对细胞组数据的生物信息学分析，仅考虑P53野生细胞系，一起使用所有适应症。ANOVA方法用于寻找化合物1敏感性的基因组特点的关联。ATRX丢失被预测为与敏感性显著相关。(A)火山图(敏感性/抗性的预测性生物标志物的ANOVA结果)。(B)ATRX丢失和ATRX野生细胞系的活性区域的箱形图。
图4：微卫星不稳定性(MSI)状态和敏感性。(A)列出了细胞组中MSI-H癌细胞系的活性区域和肿瘤突变负荷的表格。(B)来自各种适应症的MSI-H癌细胞系中增殖的减少。(C)六个MSI-H结直肠癌患者来源的类器官中增殖的减少。(D)体内功效实验，显示在结直肠癌的MSI-H异种移植模型中肿瘤生长降低。
图5：从Razqallah Hakem,EMBO J(2008)27:589-605修改的主要DDR途径的概述。方框中突出显示的是DNA修复途径，其中特异性生物标志物已被发明人鉴定为MDM2拮抗的敏感性标志物。
图6：(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸的X射线粉末衍射图。
图7：(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸的DSC扫描。
定义
术语“MDM2抑制剂”和“MDM2拮抗剂”用作同义词，并定义如本文所述的MDM2化合物或MDM2化合物的类似物，包括离子、盐、溶剂化物、异构体、互变异构体、N-氧化物、酯、前药、同位素和其保护形式(优选其盐或互变异构体或异构体或N-氧化物或溶剂化物，更优选其盐或互变异构体或N-氧化物或溶剂化物)，如本文和以上所述。
“MDM2拮抗剂”是指一种或多种MDM2家族成员特别是MDM2和MDM4(也称为MDMx)的拮抗剂。术语“拮抗剂”是指阻断或抑制激动剂介导的生物反应的一种受体配体或药物。拮抗剂对其同源受体具有亲和力但没有激动效力，且结合后会破坏相互作用并抑制受体上的任何配体(例如内源性配体或底物，激动剂或反向激动剂)的功能。拮抗作用可以直接或间接产生，并且可以通过任何机制和在任何生理水平介导。因此，配体的拮抗作用可能在不同的环境下以功能不同的方式表现。拮抗剂通过与受体上的活性位点或变构位点结合来介导它们的作用，或者它们可以在通常不参与生物调节受体活性的独特结合位点处相互作用。拮抗剂活性可以是可逆的或不可逆的，这取决于拮抗剂-受体复合物的寿命，这进而取决于拮抗剂受体结合的特性。
“效力”是药物活性的度量，用产生给定强度效果所需的量来表示。高效药物会在低浓度下诱发较大应答。效力与亲和力和功效成比例。亲和力是药物与受体结合的能力。疗效是受体占用与在分子、细胞、组织或系统水平启动反应的能力之间的关系。
如本文所用，术语“介导的”，例如与如本文所述的MDM2/p53结合使用(并且应用于例如各种生理过程、疾病、状态、病状、治疗、治疗或干预)，旨在限制性地操作，使得所述术语所应用于的各种过程、疾病、状态、病状、治疗和干预中，为有蛋白质发挥生物作用。在该术语应用于疾病、状态或病状的情况下，蛋白质所发挥的生物作用可以是直接的或间接的，并且对于疾病、状态或病状的症状(或疾病、状态或病状的病因或进展)的表现来说可以是必要的和/或充分的。因此，蛋白质功能(并且具体地，功能的异常水平，例如过表达或表达不足)不一定是疾病、状态或病状的近端病因：而是，经考虑，介导的疾病、状态或病状包括具有多因素病因和复杂进展的那些疾病、状态或病状，所讨论的蛋白质仅部分参与其中。在所述术语应用于治疗、预防或干预的情况下，蛋白质所发挥的作用可以是直接的或间接的，并且对于治疗、预防或干预结果的操作来说可以是必要的和/或充分的。因此，由蛋白质介导的疾病状态或病状包括对任何特定癌症药物或治疗的抗性的发展。
如本文在治疗病状，即状态、病症或疾病的上下文中所使用的术语“治疗”通常涉及无论是针对人还是针对动物(例如，在兽医应用中)的治疗和治疗，其中一些期望的治疗效果是例如对病状的进展的抑制得以实现并且包括进展速率降低、进展速率停止、病状改善、正在治疗的至少一种与病状相关或由病状引起的症状减轻或缓解以及病状治愈。例如，治疗可以是减轻一种疾病的一种或若干种症状或完全根除疾病。
如本文在治疗病状，即状态、病症或疾病的上下文中所使用的术语“预防”(即，使用化合物作为预防措施)通常涉及无论是针对人还是针对动物(例如，兽医应用)的预防(prophylaxis或prevention)，其中一些期望的预防效果得以实现，例如预防一种疾病的发生或抵御一种疾病。预防包括完全和绝对阻断病症的所有症状持续无限的时间段、仅仅减缓疾病的一种或若干种症状的发作或降低疾病发生的可能性。
对如癌症等疾病状态或病状的预防或治疗的提及包括在其范围内缓解或降低例如癌症的发病率。
相对于单个的化合物/试剂在单独施用时的治疗效果，本发明的组合可以产生治疗有效的效果。
术语“有效”包括有利效果，如累加性、协同作用、副作用减少、毒性降低、疾病进展时间增加、存活时间增加、一种试剂对另一种试剂的敏化或复敏或应答率提高。有利地，有效的效果可以允许向患者施用较低剂量的每种或任一种组分，由此降低化学治疗的毒性，同时产生和/或维持相同的治疗效果。本发明上下文中的“协同”效应是指由组合产生的治疗效果大于组合中的试剂在单独提供时的治疗效果的总和。本发明的上下文中的“累加”效应是指由组合产生的治疗效果大于组合中的试剂中的任何试剂在单独提供时的治疗效果。如本文所用，术语“应答率”在实体瘤的情况下是指在给定时间点，例如12周时，肿瘤的大小减小的程度。因此，例如，50％的应答率意指肿瘤大小减小50％。本文对“临床应答”的提及是指50％或更高的应答率。“部分响应”在本文中被定义为小于50％的应答率。
如本文所用，术语“组合”，如应用于两种或更多种化合物和/或试剂，旨在定义其中两种或更多种试剂结合的材料。此上下文中的术语“组合(combined)”和“组合(combining)”应相应地进行解释。
组合中的两种或更多种化合物/试剂的结合可以是物理的或非物理的。物理结合的组合的化合物/试剂的实施例包括：
·包括混合(例如在相同单位剂量内)的两种或更多种化合物/试剂的组合物(例如，单一配方)；
·包括其中两种或更多种化合物/试剂化学/物理化学地连接(例如，通过交联、分子团聚或与共同媒剂部分结合)的材料的组合物；
·包括其中两种或更多种化合物/试剂化学/物理化学地共包装(例如，安置在脂质囊泡、颗粒(例如，微粒或纳米颗粒)或乳液液滴之上或之内)的材料的组合物；
·其中两种或多种化合物/试剂共包装或共存在(例如，作为单位剂量阵列的一部分)的药物试剂盒、药物包或患者包；
非物理结合的组合的化合物/试剂的实施例包括：
·包括两种或更多种化合物/试剂中的至少一种化合物/试剂以及针对该至少一种化合物临时结合以形成两种或更多种化合物/试剂的物理结合的说明的材料(例如，非单一配方)；
·包括两种或更多种化合物/试剂中的至少一种化合物/试剂以及针对与该两种或更多种化合物/试剂的组合治疗的说明的材料(例如，非单一配方)；
·包括两种或多种化合物/试剂中的至少一种化合物/试剂以及针对向患者群体施用的说明的材料，其中该两种或多种化合物/试剂中的其他化合物/试剂已经(或正在)施用；
·包括两种或更多种化合物/试剂中的至少一种化合物/试剂的材料，该至少一种化合物/试剂的量或形式特别适用于与该两种或多种化合物/试剂中的其他化合物/试剂组合使用。
如本文所用，术语“组合治疗”旨在定义包括使用两种或更多种化合物/试剂的组合(如上文所定义)的治疗。因此，在本申请中对“组合治疗”、“组合”和化合物/试剂“组合”使用的提及可以指化合物/试剂作为同一总体治疗方案的一部分施用。因此，两种或更多种化合物/药剂中的每种化合物/药剂的剂量学可以不同：每种化合物/药剂可以同时或在不同时间施用。因此，应当了解，组合中的化合物/试剂可以在同一试剂配方中(即，一起)或在不同的试剂配方中(即，单独)依次施用(例如，之前或之后)或同时施用。同时在同一配方是作为单一配方，而同时在不同的药物配方中是非单一的。关于施用途径，组合治疗中的两种或更多种化合物/试剂中的每种化合物/试剂的剂量学也可以有所不同。
如本文所用，术语“药物试剂盒”定义了药物组合物的一个或多个单位剂量的阵列以及给药工具(例如，测量装置)和/或递送工具(例如，吸入器或注射器)，所述药物组合物和所述给药工具和/或递送工具任选地全部容纳在共同的外部包装内。在包括两种或更多种化合物/试剂的组合的试剂试剂盒中，单个的化合物/试剂可以是单一或非单一的配方。泡罩包内可以含有单位剂量。药物试剂盒可以任选地进一步包括使用说明。
如本文所用，术语“药物包”定义了一个或多个单位剂量的阵列的药物组合物，任选地包括在共同的外部包装内。在包括两种或更多种化合物/试剂的组合的试剂包中，单个的化合物/试剂可以是单一或非单一的配方。泡罩包内可以含有单位剂量。药物包可以任选地进一步包括使用说明。
如本文所用，术语“任选地经取代的”是指可以是未经取代的或可以被如本文所定义的取代基取代的基团。
具体实施方式
本发明基于允许确定癌症患者对MDM2拮抗剂疗法的可能反应的生物标志物的鉴定。这提供了使用MDM2拮抗剂对癌症的精确治疗。
在某些实施方案中，本发明提供了一种使用MDM2拮抗剂治疗癌症的伴随诊断。如本文所用，术语伴随诊断用于指鉴定患者是否会对药物产生反应所需的测试(即必要的伴随诊断)和旨在确定患者是否会反应良好或最佳(有时称为补充诊断)。在某些实施方案中，生物标志物识别会反应的患者，并因此区分反应者和非反应者。在另一个实施方案中，生物标志物识别会有最佳反应的患者，从而医生可以为该患者选择最佳治疗。
在一些实施方案中，本发明提供了用于确定本文鉴定的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、25种或更多种生物标志物的表达或活性水平的测定法。如上所述，这可以直接或间接确定。该测定法可能包括也可能不包括推断预后结果的步骤。该测定法通常是对患者样品(诸如癌症活检或血液样品)进行的体外测定法(无论癌症是否为血癌)。
有效癌症治疗的生物标志物
本公开提供了指示癌细胞对用MDM2拮抗剂治疗的敏感性增加的生物标志物。因此，一种或多种已鉴定生物标志物的确定使人们能够选择癌症患者进行MDM2拮抗剂治疗。
生物标志物是DNA损伤反应(DDR)途径基因。任选地，该一种或多种DDR生物标志物基因来自以下途径中的一种或多种：HR、NHEJ、MMR、FA和/或BER。任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA1。任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括BRCA2。任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATM。任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括ATRX。任选地，一种或多种DDR生物标志物是FA途径中的。任选地，在一种或多种DDR生物标志物是MMR途径中的情况下，通过MSI(通常MSI-高)和/或高肿瘤突变负荷来鉴定所述一种或多种生物标志物的耗损。任选地，所测量的一种或多种DDR生物标志物包括MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、PMS2 MLH3、POLE和/或POLD1。任选地，该癌症包含突变特征SBS6和/或与DNA错配修复中的缺陷相关的SBS26，和/或POLD1突变特征SBS20。
DNA损伤反应(DDR)
细胞持续受到多种基因毒性攻击的激发，并且可经由几种DNA修复机制(其中许多涉及p53)逆转多种DNA病变。DNA的错误修复可导致突变和染色体畸变，这些突变和染色体畸变可改变肿瘤阻遏基因或致癌基因的功能，从而导致癌症发展。
作为中心肿瘤阻遏因子，p53通过协调多种DNA损失反应(DDR)机制来保护基因组(如Williams和Schumacher，p53 in the DNA-Damage-Repair Process,Cold SpringHarbor Perspectives in Medicine,2016,1-15中所覆盖的)。重要的是，p53反应是确定DNA损伤后细胞是否会经历凋亡或细胞周期停滞的关键。
核苷酸切除修复(NER)去除通常由UV辐射诱导的多种螺旋扭曲病变，而碱基切除修复(BER)靶向氧化碱基修饰。错配修复(MMR)校正复制期间错误插入的核苷酸。通常由辐射诱导的DNA双链断裂反而通过非同源末端连接(NHEJ)或通过同源重组(HR)得以解决。
Brown等人Targeting DNA repair in cancer:beyond PARP inhibitors,CancerDiscovery,2017,20-37，综述了DDR途径。NER途径从DNA中去除螺旋扭曲病变，尤其是UV诱导的光病变(Brown等人2017)。其牵涉使用结构特异性核酸内切酶去除短的寡核苷酸，包括受损病变，随后通过DNA聚合酶恢复DNA序列。NER途径中牵涉的基因包括XPC、DDB2、CSA、XPA、RPA、XPG、ERCC1、POLE、POLD1、LIG1和LIG3。
BER途径中的DNA糖基化酶识别并去除受损碱基，产生被APE1加工的碱基位点。BER途径导致单链断裂(SSB)，该单链断裂使用SSB修复途径来修复。PARP1是SSB修复途径中DNA链断裂的DNA损伤传感蛋白。PARP1定位到DNA损伤位点，生成大量聚ADP核糖链。核糖基化的PARP1促进SSB修复蛋白募集到DNA损伤位点。BER和SSB修复途径中牵涉的基因包括DNA糖基化酶、APE1、PARP、XRCC1、PNKP、POLp、FEN1、TDP1、Aprataxin、LIG1和LIG3A。
MSH2、MSH3和MSH6识别碱基-碱基错配和插入/缺失环(Brown等人2017)。MSH2、MSH3和MSH6将MLH1和PMS2募集到受损位点。MMR蛋白的协同作用接合EXO1以去除错配，然后接合POLD和LIG1以分别填充空位和密封切口。MMR中牵涉的基因包括MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、PMS2、EXO1、POLD和LIG1。缺陷错配修复(dMMR)与高频微卫星不稳定性(H-MSI)相关；dMMR测试可经由IHC进行。
经典NHEJ(c-NHEJ)是人细胞中占优势的DNA DSB修复途径，在整个细胞周期中发挥作用(Brown等人2017)。其牵涉由核心NHEJ复合物(包括DNA-PK、XRCC4、LIG4、XLF和PAXX)介导的断裂的DNA末端相对快速的连接。在可以进行连接之前可能需要DNA末端加工和DNA聚合酶作用，使得NHEJ固有地易于出错。在重组发生事件可能会导致总体染色体重排的情况下，诸如在非循环或G1细胞中，NHEJ通过快速修复DSB来维持基因组稳定性。NHEJ中牵涉的基因包括Ku70/Ku80、DNA-PK、XRCC4、XLF、LIG4、APLF、Artemis、PAXX、WRN和ATRX。
替代性NHEJ(Alt-NHEJ或MMEJ)是当c-NHEJ受遗传破坏时DSB的连接途径(Brown等人2017)。它发生在有限的DNA末端切除之后，并且促成在肿瘤中看到的过量基因组缺失和染色体易位。它还可以在HR缺陷型细胞中提供后备修复途径。Alt-NHEJ中牵涉的基因包括PARP、XRCC1、LIG3、LIG1、CtIP和POLQ。
HR相对较慢且限于S晚期/G2，因为它通常依赖于同源姐妹染色单体DNA链进行修复(Brown等人2017)。通过解旋酶和核酸外切酶(诸如DNA2、BLM、WRN和EXO1)进行的大量DNA末端切除产生3’-ssDNA突出，从而使断裂通过HR修复。在BRCA1和PALB2的帮助下，复制蛋白A(RPA)将RAD51负载到RPA包被的ssDNA上，导致链侵入，有许多因子负向调控该过程以防止过度重组，诸如POLQ、PARI、RECQL5、FANCJ和BLM。HR中牵涉的基因包括MRN、ATM、ATR、MK2、CtIP、BRCA1、BARD1、BRCA2、PALB2、RPA、RAD51、MUS81/EME1、SLX1/SLX4、RTEL1、BLM、TOPOIII、POLQ、PARI、RECQL5、FANCJ、BLM。
范科尼贫血(FA)途径牵涉修复DNA链间交联。FA途径的分子详情在Niraj等人TheFanconi anemia pathway in cancer,Annu.Rev.Cancer Biol.2019.3:457-78)中有描述。FA核心复合物包括FANCA、FANCG、FANCB、FANCL、UBE2T(FANCT)FANCF、FANCC、FANCE、FANCM、REV1、REV7和REV3。它还包括许多范科尼贫血相关蛋白(FAAP)。核心复合物基因或FAAP中的突变或缺失在本发明的范围内。
在所有癌症的～13％中发现DDR缺陷，在某些肿瘤类型中发生率更高，这些肿瘤类型包括胰腺癌(>35％)、膀胱癌(35％)、前列腺癌(33％)、卵巢癌(24％)和三阴性乳腺癌(16％)。
功能丧失CRISPR筛选将DDR鉴定为对MDM2拮抗剂的最高敏感化途径。
下文实施例描述了在存在或不存在化合物1的情况下，在一组三个P53-野生肺癌细胞系中的双重CRISPR筛选，以鉴定MDM2拮抗剂敏感性的新型预测性生物标志物。
几种DNA损伤反应(DDR)相关基因被鉴定为最高命中物(图1A-图1B)。有趣的是，这些基因牵涉于几种DDR途径，诸如同源重组途径、范科尼贫血(FA)途径、碱基切除修复途径和复制应激途径。值得注意的是，复制应激途径是基因组不稳定性的读出，并且由DDR途径中的多个缺陷引起，导致高水平的DNA损伤(转而影响DNA复制过程)。这些数据表明在其DDR机制中具有缺陷的肿瘤通常可能对MDM2拮抗剂治疗更敏感。
为了证实该结果，将先前表征其对化合物1的敏感性的早期传代人间皮瘤细胞系用于鉴定凋亡样品和非凋亡样品之间差异性表达的转录组学特征。“复制应激”特征在间皮瘤凋亡细胞系中强烈富集，证实化合物1敏感性与活化的DDR途径之间的联系(图1C)。
通过双重CRISPR筛选鉴定了MDM2拮抗剂与多种DDR途径中的缺陷之间的联系。在CRISPR筛选后，对多个系统的生物信息学和湿实验室分析已经促进了DDR内特定生物标志物的鉴定。这种对结果的额外验证证实了指示对MDM2拮抗剂治疗的敏感性的DDR缺陷。
作为视觉汇总，图5列出了主要的DDR途径。方框中突出显示的是DNA修复途径，其中特异性生物标志物已被发明人鉴定为对MDM2拮抗剂处理的敏感性标志物。
HR途径：BRCA1、BRCA2和ATM改变
在CRISPR筛选中鉴定了牵涉同源重组途径的基因。同源重组(HR)是无错误的DSB修复途径，其在很大程度上限于细胞周期的S期和G2期。通过鉴定多种癌症中BRCA1、BRCA2、ATM、CHEK2、RAD50、RAD51C中的几种癌症失能突变，证实了HR途径对于基因组维持的巨大重要性。
HR的中心组分之一是丝氨酸-苏氨酸激酶共济失调毛细血管扩张突变蛋白(ATM)，使DDR各分支中的许多关键参与者磷酸化。通常在淋巴恶性肿瘤以及几种实体瘤中发现体细胞ATM突变或缺失，导致蛋白质表达的丢失和基因组中DNA双链断裂修复的损害。
对MDM2的公开可用的DepMAP RNAi数据(版本20Q4)的生物信息学分析预测，与ATM野生细胞系相比，ATM突变细胞系显著更依赖于MDM2(图2A)。此外，与全部为ATM野生型的非凋亡细胞系(6/6)相比，在患者来源的凋亡性间皮瘤细胞系(6/9)中检测到ATM突变的强烈富集(图2B)。
进一步地，对来自不同适应症的四种ATM突变细胞系(HCC1500-乳腺、LNCap-前列腺、HT-144-黑素瘤、HepG2-肝脏)的体外验证显示对化合物1的敏感性，正如通过细胞增殖的减少所测量的(图2C)，同时关于LNCap-前列腺和HepG2-肝脏的数据显示对化合物1的敏感性，正如通过增加的细胞凋亡所测量的(图2D)。此外，蛋白质印迹(western blot)分析显示在化合物1处理后DDR信号传导途径的明显调节(图2E)。
与鉴定ATM突变为MDM2拮抗剂敏感性的生物标志物一起，额外的生物信息学分析指示其他HR途径基因的丢失或突变可充当MDM2拮抗剂敏感性的生物标志物。可充当MDM2拮抗剂治疗的生物标志物的HR途径基因包括但不限于BRCA1和/或BRCA2。
在一个实施方案中，同源重组修复中的缺陷包括BRCA1或BRCA2丢失。在一个实施方案中，癌症展示出BRCA特征(BRCAness)。除了BRCA1/2丢失外，典型HRR丢失的肿瘤展示出BRCA性(Trends in Cell Biology，2019年9月，第29卷，第9期，第740页)。
为了证实ATM、BRCA1和/或BRCA2突变(或表达的丢失)是否可能与MDM2拮抗剂敏感性有联系，对患者来源的类器官(PDO)进行了进一步的体外验证。在ATM、BRCA1和/或BRCA2中有改变的各种适应症的4个PDO显示出对化合物1的敏感性，正如通过细胞增殖的减少所测量的(图2F-图2G)。值得注意的是，来自相同适应症但在ATM、BRCA1和/或BRCA2中没有改变的4个另外的PDO对化合物1有抗性。
FA途径
还提供FA途径基因作为MDM2拮抗剂治疗的生物标志物。
双重CRISPR筛选(CRISPR敲除和CRISPRi)鉴定的基因牵涉于范科尼贫血(FA)途径。图1A显示CRISPR命中物中范科尼贫血途径的富集。
CRISPR筛选数据指示在FA途径中具有缺陷的肿瘤通常对化合物1治疗敏感。
因此这些数据证明了MDM2拮抗剂敏感性和范科尼贫血途径缺陷之间的联系。因此FA途径中的功能丧失是MDM2拮抗剂敏感性的生物标志物。
NHEJ途径：ATRX丢失
另外，对细胞组数据的生物信息学分析预测ATRX的丢失是对MDM2化合物1的敏感性的显著生物标志物(图3)。ATRX还通过非同源末端连接(NHEJ)和同源重组修复(HRR)参与DDR的调控。
鉴定ATRX丢失为MDM2拮抗治疗的生物标志物及生物信息学分析证明其他NHEJ或HRR途径基因的丢失或突变可充当MDM2拮抗剂敏感性的生物标志物。
MMR途径：微卫星不稳定性(MSI)
微卫星是含有1至5个碱基对基序的多个重复的区域，其广泛地分散在整个人类基因组中。在正常细胞中，在细胞分裂期间通过错配修复(MMR)验证并维持微卫星的重复计数。MMR系统的损害可致使细胞在细胞分裂期间不能调控其微卫星的长度，称为MSI(微卫星不稳定性)。已经在几种类型的癌症(结直肠癌、子宫内膜癌和胃腺癌)中经常地观察到MSI，并且已经证实MSI-高的结直肠肿瘤对免疫增强疗法更敏感。
从Sanger Cell Models Passport数据库获得关于微卫星稳定性和肿瘤细胞突变负荷的信息。我们发现MSI-H细胞系表现出高的肿瘤突变负荷(突变/Mb)并且富含与DNA错配修复途径(例如MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、MLH3、PMS2)相关的突变。进一步地，MSI-H细胞系显示与DNA错配修复中的缺陷及POLD1和/或POLE突变相关的突变特征的强烈富集(图4A)。总之，这些发现是一致的并且表明MSI肿瘤诸如结直肠肿瘤、子宫内膜样肿瘤和胃部肿瘤对MDM2拮抗剂敏感。进一步地，对来自不同适应症的八种MSI-H细胞系的体外验证显示对化合物1的敏感性，正如通过细胞增殖的减少所测量的(图4B)。为了证实MSI-H状态是否可能与MDM2拮抗剂敏感性有联系，对患者来源的类器官(PDO)进行了进一步的体外验证。6种MSI-H结直肠癌PDO显示出对化合物1的敏感性，正如通过细胞增殖的减少所测量的(图4C)。体内功效数据证实化合物1在MSI-H结直肠癌(HCT-116)的异种移植模型中显著抑制肿瘤生长(图4D)。
碱基切除修复(BER)途径
CRISPR筛选分析鉴定了BER途径和MDM2拮抗剂敏感性之间的强相关性(图1)。DDR生物标志物可包含一种或多种BER途径基因。
生物标志物和组合
为了便于参考，本公开的生物标志物可以表征为五个组：
a.HR途径，例如BRCA1、BRCA2和/或ATM耗损。
b.NHEJ途径，例如ATRX丢失。
c.MMR途径，例如MSI-H(微卫星不稳定肿瘤且特征在于高肿瘤突变负荷)。
d.FA途径。
e.BER途径。
在一些实施方案中，确定了一种生物标志物。这可以来自a)、b)、c)、d)或e)组中的任何一组。
在一些实施方案中，确定了多个生物标志物，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个生物标志物。这些可以包含或由来自单一组(即组b或组c)的多个生物标志物组成，或者可以包含或由来自不同组的一个或多个生物标志物组成，例如：
-来自a组中的0、1、2个或更多个；和来自b)组中的0、1、2个或更多个；和来自c)组中的0、1、2个或更多个；并且含d)组或e)组；或
-来自b)组中的0、1、2个或更多个；和来自c)组中的0、1、2个或更多个；并且含d组；或
-来自b)组中的2个或更多个；来自c)组中的2个或更多个；含或不含d组；或
-来自a)组中的0、1、2个或更多个；来自b)组中的0、1、2个或更多个；来自c)组中的0、1、2个或更多个；来自d)组中的0、1、2个或更多个；和来自e)组中的0、1、2个或更多个。
当确定多个生物标志物时，生物标志物的组合可称为一个生物标志物组合。生物标志物组合可以包括或由鉴定的生物标志物组成。
除了本发明的生物标志物之外，其他生物标志物和/或数据，例如人口统计数据(例如，年龄、性别)可以被包括在一组数据中，用以确定MDM2抑制的适用性。当任选地包括其他生物标志物时，生物标志物(即本发明的生物标志物组合加上其他生物标志物)的总数可以是3个、4个、5个、6个或更多个。在一些实施方案中，具有较少成分的预测性生物标志物组合可以简化所需的测试。
如本文所用，术语“丢失”和“降低”将被赋予其通常的含义。如本文所用的术语“增加”和“增强”将被赋予它们通常的含义。
可以通过对本领域技术人员来说显而易见的适当技术来确定生物标志物。生物标志物可以通过直接或间接技术确定。基因表达可以通过检测mRNA转录产物来测定。可以用免疫组织化学检测蛋白质生物标志物。
在一些实施方案中，本发明的一种或多种生物标志物的缺失可以通过评估一种或多种生物标志物的功能来确定。生物标志物表达水平可以与功能水平成正比。可以直接或间接确定一种或多种生物标志物的功能。
在一些实施方案中，可以将表达或活性水平与以相同方式反映已知与对治疗的敏感性相关的表达或活性水平的阈值进行比较，以评估测试值是否指示患者对MDM2抑制治疗的敏感性。
根据本公开评估的患者已知或怀疑患有癌症。测试的样品可能已知或怀疑包括癌细胞。在典型的实施方案中，被测试的样品将是癌组织活检。活检可以是液体活检或实体组织(例如，实体瘤)活检。
生物标志物水平
本发明提供了一种或多种水平降低的生物标志物。通常，将相对于正常健康个体进行比较，更通常是相对于癌细胞相同类型的非癌细胞。
生物标志物水平降低可以是基因本身的耗损，例如因导致癌细胞基因组中DDR途径基因丢失的总体染色体重排或其他遗传异常引起。当然，这也会耗损基因产物和活性。
生物标志物水平降低可以是基因产物表达降低。
生物标志物水平降低还可以是活性降低，例如由功能丧失突变引起。功能丧失突变可被视为野生型基因产物的耗损。
在一些实施方案中，确定生物标志物水平增加或降低，是相对于同一个体的非癌细胞，通常是同一个体的相同类型的非癌细胞。
在进一步的实施方案中，确定生物标志物水平的增加或降低，是相对于与实验室标准和根据已知正常群体值确定的数值。通常，已知水平取自非癌细胞。
在其他实施方案中，生物标志物水平增加或减少是相对于正常(非癌的)个体中的已知值。例如，GTEx是一个从44个不同组织获得的正常健康个体基因表达的数据资源，如本文其他地方所述。
在一些其他实施方案中，评估生物标志物水平增加或降低，是相对于来自MDM2抑制剂无反应受试者的癌症样品或来自MDM2抑制剂无反应受试者的癌症样品中确定的水平。这对于一种或多种IFN特征生物标志物可能特别有用。
在一个实施方案中，相对于从未患癌症的正常受试者获得的对照样品中所述RNA的量，一种或多种DDR生物标志物的RNA水平降低。
在另选的实施方案中，相对于该患者未患癌症时从同一患者获得的早期样品中所述RNA的量，一种或多种DDR生物标志物的RNA水平降低。
在一个实施方案中，其相对于正常水平(例如“正常上限”或ULN)降低。
在一个实施方案中，至少一种生物标志物的水平在癌症与对照样品中的曲线下面积(AUC)大于(针对增加的生物标志物)或小于(对于耗损的生物标志物)0.5，是相对于(a)未患癌症的组织或人的样品中至少一种生物标志物的水平，或(b)受试者的样品中一种或多种对照蛋白的水平。任选地，AUC小于或大于0.6、0.7、0.8、0.9、0.95、0.975或0.99。
在一些实施方案中，至少一种生物标志物的水平是对照的至少一个标准偏差，是相对于(a)未患有癌症的组织或人的样品中的一种或多种生物标志物的水平，或(b)癌症受试者的样品中一种或多种对照蛋白的水平。
在一些实施方案中，用于比较的对照是从健康患者获得的样品或从诊断患有癌症的患者获得的非癌性组织样品，诸如肿瘤所在的同一器官的非癌性组织样品(例如，非癌性结肠组织可以作为结肠癌的对照)。在一些实施方案中，对照是历史对照或标准值(即，先前测试的对照样品或代表基线或正常值的样品组)。
用于与样品比较以测定差异表达的对照或标准品，包括被认为正常的样品(因为它们没有因所需特征发生改变，例如未患有结肠癌的受试者的样品)及实验室值，即使可能是任意设置的。实验室标准和值可以根据已知或确定的人群值来设置，并且可以用图形或表格的形式提供，后者方便对测量的、实验确定的值进行比较。
在这样的实施方案中，一个或多个生物标志物的参考分数基于正常健康个体。
癌症
呈现一种或多种已鉴定生物标志物的癌症，使用MDM2拮抗剂成功治疗的可能性增加。待治疗的癌症没有特别限制，只要它呈现一种或多种生物标志物即可。
这种癌症通常是p53野生型。如本领域所公认的，p53野生型癌细胞表达的肿瘤抑制基因p53处于野生型水平，并具有野生型功能。野生型p53细胞不包括导致p53肿瘤抑制功能降低的p53基因突变。
实施例中提供的数据是从包括结肠、血液、乳房、肺、前列腺、肝脏、皮肤、卵巢和胰腺在内的一系列癌性组织中生成的。在一个实施方案中，癌症是肺癌。在一个实施方案中，癌症是结肠癌.。在另一个实施方案中，癌症是血癌。在进一步的实施方案中，癌症是乳腺癌。在另一个实施方案中，癌症是肺癌。在又一个实施方案中，癌症是皮肤癌，例如黑素瘤或癌。在另一个实施方案中，癌症是卵巢癌。在一个不同的实施方案中，癌症是胰腺癌。在某些实施方案中，癌症是脑癌、透明细胞肾细胞癌(ccRCC)、食管癌或黑素瘤。
特定癌症的治疗可以根据本发明进行评估，包括但不限于间皮瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、成胶质细胞瘤(例如，GBM)和肾癌(例如，KIRC)。
可根据本发明评估治疗的特定癌症包括但不限于急性骨髓性白血病(AML)、鳞状细胞癌或头、颈、皮肤、胃肠系统或生殖道的肿瘤。
可根据本发明评估治疗的特定癌症包括但不限于前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌和妇科癌症。
可根据本发明评估治疗的特定癌症包括但不限于结直肠癌、胃癌和妇科癌症。
可根据本发明评估治疗的特定癌症包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和胰腺癌，尤其是DDR缺陷型乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和胰腺癌。
在某些实施方案中，癌细胞的增殖受MDM2拮抗剂抑制，IC50值在纳摩尔范围内。在某些实施方案中，IC50值小于500nM、小于400nM、小于300nM或小于200nM。在一些实施方案中，IC50值小于100nM。IC50值可以例如使用实施例所示的GraphPad Prism软件计算。
在某些实施方案中，MDM2拮抗剂诱导癌细胞凋亡。细胞凋亡通常可以由活化的半胱天冬酶-3介导。细胞凋亡的诱导可以通过检测在用1μM的MDM2拮抗剂处理72小时后对活化的半胱天冬酶-3呈阳性的细胞来确定。如对技术人员显而易见的，可以使用其他测定浓度和/或处理时长，例如用1μM MDM2拮抗剂处理48小时或用5μM MDM2拮抗剂处理48小时。在某些实施方案中，至少10％、至少20％或至少30％的细胞对活化caspase-3染色呈阳性，是诱导细胞凋亡的一个指标。在某些实施方案中，40％是鉴定细胞凋亡的强诱导的可靠水平，其中一个群体中>40％的细胞对活化caspase-3染色呈阳性，可被认为是凋亡的。如对技术人员显而易见的，可以对细胞和测定使用其他水平，例如10％、20％、30％、50％、60％、70％、75％或更多。活性半胱天冬酶-3染色试剂盒是可商购的，例如可从Abcam(Cambridge,UK)以目录号ab65617获得“裂解的半胱天冬酶-3染色试剂盒(红色)”。也可以使用Invitrogen Cell Event染料(C10423)。
Annexin V染料也可用于检测细胞凋亡。这在实施例中使用，并且在本领域中作为用于检测细胞凋亡的有用染料是众所周知的。
MDM2拮抗剂
转化相关蛋白53(TP53)基因编码一种53KDa的蛋白-p53。肿瘤抑制蛋白p53通过许多翻译后修饰(包括磷酸化、乙酰化和甲基化)对细胞应激(例如缺氧、DNA损伤和癌基因激活)作出反应，并在被激活的多种通路中充当信号节点。p53在其他生理过程中具有额外的作用，包括自噬、细胞粘附、细胞代谢、生育能力以及干细胞衰老和发育。p53的磷酸化是由激活包括ATM、CHK1和2，以及DNA-PK在内的激酶引起的，其使蛋白具有稳定和具有转录活性形式，从而产生一系列基因产物。对p53激活的反应包括细胞凋亡、存活、细胞周期停滞、DNA修复、血管生成、侵袭和自动调节。其特定组合同细胞的遗传背景一道，会造成观察到的细胞效应，即细胞凋亡、细胞周期停滞或衰老。对于肿瘤细胞，由于肿瘤抑制蛋白和相关的细胞周期检查点控制的丢失，再加上肿瘤胁迫，可能会倾向于凋亡通路。
众所周知，在缺氧和DNA损伤等应激状态下，蛋白质p53的细胞水平会增加。已知p53启动许多基因的转录，这些基因控制细胞周期的进展、DNA修复的启动和程序性细胞死亡。这为基因研究证实的p53的肿瘤抑制作用提供了一种机制。
p53的活性通过与MDM2蛋白的结合相互作用进行负向紧密调控，MDM2蛋白的转录本身受到p53直接调控。当p53的反式激活结构域与MDM2蛋白结合时，它就会失活。一旦失活，p53的功能就会被抑制，p53-MDM2复合物就会成为泛素化的靶标。
在正常细胞中，活性p53和与MDM2结合的非活性p53之间的平衡在自动调节负反馈回路中得到维持。也就是说p53可以激活MDM2的表达，后者反过来导致p53的抑制。
已经发现，在大约一半的所有常见成人散发性癌症中，p53由突变导致的失活很常见。此外，在大约10％的肿瘤中，MDM2的基因扩增和过度表达导致功能性p53丢失，从而导致恶性转化和肿瘤生长失控。
p53失活通过一系列机制成为常见的导致癌症发展和进展原因事件。这些包括突变导致的失活、致癌病毒靶向，以及在相当大比例的情况下，MDM2基因的扩增和/或转录率升高导致MDM2蛋白表达过量或活化增加。已在常见散发性癌症的肿瘤样品中观察到MDM2的基因扩增导致MDM2蛋白表达过量。总体而言，大约10％的肿瘤有MDM2扩增，在肝细胞癌(44％)、肺(15％)、肉瘤和骨肉瘤(28％)以及霍奇金病(67％)中发现最高的发生率(Danovi等人，Mol.Cell.Biol.2004,24,5835-5843，Toledo等人，Nat Rev Cancer 2006,6,909-923,Gembarska等人，Nat Med 2012,18,1239-1247)。通常，激活的p53对MDM2的转录激活会导致MDM2蛋白水平增加，从而形成负反馈回路。基因敲除小鼠模型表明了MDM2和MDMX对p53调节的基本特性。MDM2-/-基因敲除小鼠在植入时是胚胎致死的。致死性可通过MDM2和TP53的双重敲除中得以挽救。MDM2通过与p53反式激活结构域结合并封闭，并通过其E3-泛素连接酶活性促进蛋白酶体破坏该复合物，从而直接抑制p53的活性。此外，MDM2是p53的转录靶标，因此这两种蛋白质在自动调节反馈回路中被连接，确保p53激活是短暂的。
尽管MDMX显示出与MDM2的氨基酸序列和结构强同源性，但两种蛋白都不能替代另一种蛋白的丢失；MDMX无效小鼠在子宫内死亡，而MDM2敲除在早期胚胎发生期间是致命的，然而两者都可以通过p53敲除拯救，证明了致死性的p53依赖性。MDMX可与p53结合并抑制p53依赖的转录，但与MDM2不同，它不被p53转录激活，因此不会形成相同的自动调节回路。此外，MDMX既没有E3泛素连接酶活性也没有核定位信号，但人们相信它通过与MDM2形成异二聚体从而帮助MDM2稳定来促进p53降解。
MDM2-p53抑制的治疗原理是蛋白质-蛋白质相互作用的有效拮抗剂将p53从MDM2的抑制控制中解放出来并在肿瘤细胞中激活p53介导的细胞死亡。在肿瘤中，选择性设想是由p53感知先前存在的DNA损伤或致癌激活信号而产生的，这些信号先前已被正常或过表达水平的MDM2作用所阻断。在正常细胞中，p53激活预计会导致非凋亡通路的激活，如果有的话，还会导致保护性生长抑制反应。而且，由于MDM2-p53拮抗剂的非基因毒性作用机制，它们适用于治疗癌症，特别是在儿科人群中。MDM4也是p53的重要负调节因子。
约50％的癌症隐匿其中编码p53的基因TP53突变，导致该蛋白质的肿瘤阻遏功能丧失并且有时甚至产生获得新型致癌功能的p53蛋白质型式的细胞。
MDM2扩增水平高的癌症包括脂肪肉瘤(88％)、软组织肉瘤(20％)、骨肉瘤(16％)、食管癌(13％)和某些儿科恶性肿瘤，包括(B)细胞恶性肿瘤。
MDM2拮抗剂的实例
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是调节MDM2的试剂，例如抑制MDM2表达的小分子、反义核酸、抗体或核酸。在一个实施方案中，MDM2试剂是小分子。在一个实施方案中，MDM2试剂是如本文详述的小分子。
据报道，来自Roche公司的MDM2小分子拮抗剂依达奴林(Idasanutlin)(RG-7388)正处于实体瘤和血液肿瘤、AML、弥漫性大(B)细胞淋巴瘤、原发性血小板增多症、真性红细胞增多症和滤泡性淋巴瘤的I-III期临床试验中。依达奴林(RG-7388)的结构如下：
依达奴林(RG-7388)是可商购的或可以例如如PCT专利申请WO 2014/128094中所述或通过与其类似的方法制备。
HDM-201(NVP-HDM201，思瑞德林(Siremadlin))正由Novartis公司开发，处于以野生型TP53为特征的晚期/转移性实体瘤、血液肿瘤，包括ALL、AML、MS、转移性葡萄膜黑色素瘤、去分化脂肪肉瘤和分化良好的脂肪肉瘤的I/II期临床试验中。拮抗剂HDM-201(NVP-HDM201)的化学结构如下：
HDM-201(NVP-HDM201)是可商购的或者可以例如如PCT专利申请WO 2013/111105中所述或通过与其类似的方法制备。
KRT-232(AMG-232，那特德林(navtemadlin))，一种MDM2小分子拮抗剂，正由NCI/Amgen/GSK开发，处于实体瘤、软组织肉瘤(诸如脂肪肉瘤)、复发或新诊断的胶质母细胞瘤、转移性乳腺癌、难治性MM、转移性皮肤黑素瘤和复发/难治性AML的I-I/II期临床试验中。KRT-232(AMG-232)的化学结构如下：
KRT-232(AMG-232)是可商购的或者可以例如如PCT专利申请WO 2011/153509中所述或通过与其类似的方法制备。
Aileron Therapeutics公司和罗氏正开发ALRN-6924(SP-315)，一种MDM2和MDM4的肽双重拮抗剂，处于II期临床试验，用于静脉治疗实体瘤、小细胞肺癌和包括淋巴瘤、急性髓系白血病在内的儿科肿瘤急性淋巴细胞白血病、视网膜母细胞瘤、肝母细胞瘤、脑肿瘤、脂肪肉瘤和转移性乳腺癌。ALRN-6924(SP-315)是一种合成肽，它的开发基于钉合肽技术，该技术可将肽锁定为特定的折叠形状(生物活性形状)，对蛋白酶具有抗性。ALRN-6924(SP-315)的结构如下：
ALRN-6924(SP-315)是可商购的或者可以例如如PCT专利申请WO2017205786中所述或通过与其类似的方法制备。
诺华正开发的CGM-097(NVP-CGM-097)是一种MDM2的小分子拮抗剂，处于I期临床研究，用于治疗晚期实体瘤和急性淋巴细胞白血病(B-ALL)。CGM-097(NVP-CGM-097)的结构如下：
CGM-097(NVP-CGM-097)是可商购的或者可以例如如PCT专利申请WO2011076786中所述或通过与其类似的方法制备。
甲苯磺酸米拉德美坦(DS-3032)，授权给Rain Therapeutics公司并以研究代码RAIN-32重命名，是一种MDM2的小分子拮抗剂，正由Daiichi Sankyo公司开发，处于晚期实体瘤、淋巴瘤、黑素瘤、难治性或复发性AML、ALL、多发性骨髓瘤、急变期CML或高危MDS和弥漫性大B细胞淋巴瘤的I期临床试验中。甲苯磺酸米拉德美坦(DS-3032)的化学结构如下：
甲苯磺酸米拉德美坦(DS-3032)是可商购的或可以例如如PCT专利申请WO 2015/033974中所述或通过与其类似的方法制备。
APG-115(AAA-115；阿瑞唑德林(alrizomadlin)；NCT-02935907)，是一种MDM2的小分子拮抗剂，正由Ascentage Pharma公司开发，处于实体瘤和淋巴瘤、AML、腺样囊性癌(ACC)的I期临床试验中。APG-115(AAA-115；NCT-02935907)的化学结构如下
APG-115(AAA-115；NCT-02935907)是可商购的或者可以例如如PCT专利申请WO2015/161032中所述或通过与其类似的方法制备。
BI-907828，是一种MDM2拮抗剂，正由BI公司开发，处于GBM、转移性脑肿瘤、NSCLC、软组织肉瘤和移行细胞癌(尿路上皮细胞癌)的I期临床试验中。
BI-907828是可商购的或者可以例如如PCT专利申请WO 2015/161032中所述或通过与其类似的方法制备。
密歇根大学正开发LE-004，一种MI-1061和沙利度胺偶联物的PROTAC，已证实它可通过诱导MDM2降解在人白血病的小鼠模型中有效抑制生长。该结构如下所示并且可以例如如PCT专利申请WO 2017/176957或WO 2017/176958中所述或通过与其类似的方法制备。LE-004的化学结构如下
MI-773(SAR405838)是一种高效的选择性MDM2抑制剂，与MDM2结合的特异性高于其他蛋白质，并在癌细胞系中有效抑制细胞生长。SAR405838有效诱导细胞凋亡并有效抑制细胞生长并诱导剂量依赖性细胞凋亡，目前正在进行临床试验。其结构是：
/>
SAR405838可以例如如WO-A-2011/060049中所述制备。
DS-5272是一种MDM2拮抗剂，正由Daiichi Sankyo开发用于口服给药。其结构是：
DS-5272可以例如如PCT专利申请WO 2015/033974中所述或通过与其类似的方法制备。
SJ-0211是一种MDM2拮抗剂，正由田纳西大学、肯塔基大学和圣裘德儿童研究医院开发，用于视网膜的治疗。该结构是Nutlin-3类似物。
BI-0252是一种MDM2拮抗剂，正由BI开发用于口服给药。BI-0252抑制MDM2和p53相互作用。其结构是：
AM-7209是一种MDM2拮抗剂，正由Amgen开发作为AMG-232备用。其结构是：
AM-7209可以例如如PCT专利申请WO 2014/200937中所述或通过与其类似的方法制备。
SP-141(JapA)是一种MDM2直接拮抗剂，正由德克萨斯理工大学开发。其结构是：
SCH-1450206是一种MDM2拮抗剂，正由Schering-Plough&Merck公司开发用于口服给药。一个示例性结构是：
阿糖胞苷，也称为MK-8242和SCH-900242，是一种具有修饰糖部分(阿拉伯糖而不是核糖)的胞苷的抗代谢类似物。一种具有潜在抗肿瘤活性的人类双微粒体2同源物(HDM2)的口服生物可利用抑制剂，经口服施用后，HDM2抑制剂MK-8242可抑制HDM2蛋白与肿瘤抑制蛋白p53的转录激活结构域的结合。通过阻止这种HDM2-p53相互作用，p53降解被抑制，这可能导致p53信号的恢复。这诱导了p53介导的肿瘤细胞凋亡。
Nutlin-3a是MDM2(鼠双分钟2的人类同源物)的拮抗剂或抑制剂，可破坏其与p53的相互作用，导致p53的稳定和活化。其结构是：
NXN-6(NXN-7；NXN-552；NXN-561；NXN-11)是一种MDM2拮抗剂，正由Nexus、Priaxon和BI公司开发用于口服给药。一个示例性结构是：
ADO-21是一种MDM2拮抗剂，正由Adamed Group开发。
CTX-50-CTX-1是一种小分子MDM2拮抗剂，正由MiRx Pharmaceuticals,CRC开发。
ISA-27是一种小分子MDM2拮抗剂，正由那不勒斯大学和萨勒诺大学开发。其结构是：
RG-7112(RO5045337)是一种有效的、选择性的、首个临床、口服活性和可通过血脑屏障的
MDM2-p53抑制剂。其结构是：
RO-8994是一种小分子MDM2拮抗剂，正由Roche公司开发。RO-8994已显示可抑制诱导p53线粒体效应的肿瘤生长。其结构是：
RO-8994是可商购的或者可以例如如PCT专利申请WO 2011/067185中所述或通过与其类似的方法制备。
RO-6839921(RG-7775)是一种小分子MDM2拮抗剂，正由Roche公司开发用于IV施用。其结构是：
RO-6839921(RG-7775)可以例如如PCT专利申请WO 2014/206866中所述或通过与其类似的方法制备。
JNJ 26854165(谢尔德梅坦(Serdemetan))具有以下结构，它是一种口服HDM2抑制剂(或拮抗剂)，在体外和离体对多发性骨髓瘤(MM)细胞显示出有效的活性；是可恢复p53功能并可能影响其他HDM2依赖性途径的潜在试剂。
ATSP-7041(SP-154)是一种MDM2和MDM4的钉合合成肽双重拮抗剂，由AileronTherapeutics和Roche开发，并处于临床前开发阶段。ATSP-7041(SP-154)的结构如下：
SAH-p53-8是MDM4、Hdm2和Caspase3的钉合合成肽拮抗剂，由哈佛学院和Dana-Faber开发，现处于临床前开发阶段。SAH-p53-8的结构如下：
PM-2(sMTide-02)是MDM4、Hdm2和Caspase3的钉合合成肽拮抗剂，由哈佛大学和Dana-Faber开发，并处于临床前开发阶段。PM-2(sMTide-02)具有以下结构：
K-178是MDM4小分子拮抗剂，由关西医科大学开发，处于临床前开发阶段。K-178的化学结构如下：
MMRi-64是一种MDM2和MDM4的小分子拮抗剂，正由Roswell Park CancerInstitute开发并且处于发现阶段。MMRi-64的化学结构如下：
雅盖隆大学和第二军医大学也在开发MDM2和MDM4的小分子拮抗剂。例如，化学结构如下：
埃默里和乔治亚州立大学正在开发MDM2和MDM4的小分子拮抗剂，正处于临床前开发阶段，用于治疗急性淋巴细胞白血病。
Adamed正在开发MDM2和MDM4的小分子拮抗剂，正处于发现阶段。
在本发明的一个实施方案中，MDM2拮抗剂选自由以下组成的组：依达奴林、HDM-201、KRT-232、ALRN-6924、ALRN-6924、CGM-097、甲苯磺酸米拉德美坦、APG-115、BI-907828、LE-004、DS-5272、SJ-0211、BI-0252、AM-7209、SP-141、SCH-1450206、NXN-6、ADO-21、CTX-50-CTX-1、ISA-27、RO-8994、RO-6839921、ATSP-7041、SAH-p53-8、PM-2、K-178、MMRi-64和或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐。
在本发明的一个实施方案中，MDM2拮抗剂选自由以下组成的组：依达奴林、HDM-201、KRT-232(AMG-232)、ALRN-6924、CGM-097、甲苯磺酸米拉德美坦(DS-3032b)、APG-115、BI-907828、LE-004、DS-5272、SJ-0211、APG-155、RG-7112、RG7388(依达奴林)、SAR405939、阿糖胞苷(也称为MK-8242和SCH-900242)、BI-0252、AM-7209、SP-141、SCH-1450206、NXN-6、ADO-21、CTX-50-CTX-1、ISA-27、RO-8994、RO-6839921、ATSP-7041、SAH-p53-8、PM-2、K-178、MMRi-64和或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐。
在本发明的一个实施方案中，MDM2拮抗剂选自由以下组成的组：依达奴林、HDM-201、KRT-232(AMG-232)、ALRN-6924、CGM-097、甲苯磺酸米拉德美坦(DS-3032b)、APG-115、BI-907828、LE-004、DS-5272、SJ-0211、BI-0252、AM-7209、SP-141、SCH-1450206、NXN-6、ADO-21、CTX-50-CTX-1、ISA-27、RO-8994、RO-6839921、ATSP-7041、SAH-p53-8、PM-2、K-178、MMRi-64和或其互变异构体或其溶剂化物或药学上可接受的盐。
在本发明的一个实施方案中，MDM2拮抗剂选自由以下组成的组：依达奴林(RG-7388)、HDM-201、KRT-232(AMG-232)、ALRN-6924、MI-773(SAR405838)、米拉德美坦(DS-3032b)、APG-115、BI-907828，或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐。
在本发明的一个实施方案中，MDM2拮抗剂选自由以下组成的组：依达奴林(RG-7388)、HDM-201、KRT-232(AMG-232)、ALRN-6924、MI-773(SAR405838)、米拉德美坦(DS-3032b)、APG-115、BI-907828，或式I°的化合物，或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐。
式I°的化合物
特定的MDM2拮抗剂是我们在2016年9月29日提交的较早的国际专利申请PCT/GB2016/053042和PCT/GB2016/053041中披露的异二氢吲哚化合物，要求2015年9月29日提交的英国专利申请号1517216.6和1517217.4的优先权，其内容均并入在此全文引用。特别地，化合物(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸(“化合物1”)在我们早期的国际专利申请PCT/GB2016/053042中公开。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是式I°的化合物：
或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐，其中：
其中cyc为苯基或杂环基团Het，其为吡啶基、嘧啶基、吡嗪基或哒嗪基，或其N-氧化物；
R1独立地选自羟基、卤素、硝基、腈、C1-4烷基、卤代C1-4烷基、羟基C1-4烷基、C2-6烯基、C1-4烷氧基、卤代C1-4烷氧基、C2-4炔基、-O0,1-(CRxRy)v-CO2H、-(CRxRy)v-CO2C1-4烷基、-(CRxRy)v-CON(C1-4烷基)2、-P(＝O)(RX)2、-S(O)d-Rx、具有3至6个环成员的-S(O)d-杂环基团和-S(O)d-N(R8)2，其中当cyc为Het时，则R1与碳原子附接；
R2选自氢、C1-4烷基、C2-6烯基、羟基C1-4烷基、-(CRxRy)u-CO2H、-(CRxRy)u-CO2C1-4烷基和-(CRxRy)u-CONRxRy；
s选自0和1；
R3是氢或-(A)t-(CRxRy)q-X；
t选自0和1；
q选自0、1和2。
其中当R3为-(A)t-(CRxRy)q-X时，则(i)s、t和q中的至少一个不为0且(ii)当t为0时，s为1且q不为0；
A为C3-6环烷基或具有3至6个环成员的杂环基，其中所述杂环基包括一个或多个(例如1、2或3)个选自N、O、S及其氧化形式的杂原子；
X选自氢、卤素、-CN、-OR9、-(CH2)v-CO2H、-(CH2)v-CO2C1-4烷基、-S(O)d-Rx、-C(＝O)-C1-4烷基、-S(O)d-N(H)e(C1-4烷基)2-e、-NRxRy、-NHSO2Rx、-NRxCORy和-C(＝O)NRxRy；
R4和R5独立地选自卤素、腈、C1-4烷基、卤代C1-4烷基、C1-4烷氧基和卤代C1-4烷氧基；
R6和R7独立地选自氢、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、羟基、羟基C1-6烷基、-COOC1-6烷基、-(CH2)j-O-C1-6烷基、(CH2)j-O-(羟基C1-6烷基)、-C1-6烷基-NRxRy、-(CRxRy)P-CONRxRy、-(CRxRy)P-NRxCORy、-(CRxRy)P-O-CH2-CONRxRy，具有3至7个环成员的杂环基团、具有3至7个环成员的-CH2-杂环基团、具有3至7个环成员的-CH2-O-杂环基团、具有3至7个环成员的-CH2-NH-杂环基团、具有3至7个环成员的-CH2-N(C1-6烷基)-杂环基团、具有3至7个环成员的-C(＝O)NH-杂环基团、C3-8环烷基、-CH2-C3-8环烷基、-CH2-O-C3-8环烷基和C3-8环烯基，其中所述环烷基、环烯基或杂环基团可以任选地被一个或多个Rz基团取代，并且其中在每种情况下所述杂环基团包含一个或多个(例如，1、2或3个)选自N、O、S及其氧化形式的杂原子；
或者R6和R7基团与它们所附接的碳原子一起可以连接形成具有3至6个环成员的C3-6环烷基或杂环基团，其中所述杂环基团包含一个或多个(例如1、2或3个)选自N、O、S及其氧化形式的杂原子，并且其中所述C3-6环烷基和杂环基团可以任选地被一个或多个Rz基团取代；
R8和R9独立地选自氢、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、羟基C1-6烷基、-(CH2)k-O-C1-6烷基、-(CH2)k-O-(羟基C1-6烷基)、羟基C1-6烷氧基、-(CH2)k-CO2C1-6烷基、-(CH2)k-CO2H、-C1-6烷基-N(H)e(C1-4烷基)2-e、-(CH2)j-C3-8环烷基和-(CH2)j-C3-8环烯基；
Rx和Ry独立地选自氢、卤素、硝基、腈、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、羟基、羟基C1-6烷基、C1-6烷氧基、-(CH2)k-O-C1-6烷基、羟基C1-6烷氧基、-COOC1-6烷基、-N(H)e(C1-4烷基)2-e、-C1-6烷基-N(H)e(C1-4烷基)2-e、-(CH2)k-C(＝O)N(H)e(C1-4烷基)2-e、C3-8环烷基和C3-8环烯基；
或Rx和Ry基团，连同它们所附接的碳或氮原子，可以连接形成具有3至6个环成员的C3-6环烷基或饱和杂环基，其可以任选地稠合到具有3至5个环成员的芳族杂环基；
或者当在碳原子上，Rx和Ry基团可以连接在一起形成＝CH2基团；
Rz独立地选自卤素、硝基、腈、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、＝O、羟基、羟基C1-6烷基、C1-6烷氧基、-(CH2)k-O-C1-6烷基、羟基C1-6烷氧基、-C(＝O)C1-6烷基、-C(＝O)C1-6烷基-OH、-C(＝O)C1-6烷基-N(H)e(C1-4烷基)2-e、-C(＝O)N(H)e(C1-4烷基)2-e、-(CH2)r-CO2C1-6烷基、-(CH2)r-CO2H、-N(H)e(C1-4烷基)2-e、-C1-6烷基-N(H)e(C1-4烷基)2-e、具有3至6个环成员的杂环基、被-C(＝O)C1-4烷基取代的具有3至6个环成员的杂环基、被-C(＝O)OC1-4烷基取代具有3至6个环成员的杂环基、被-C(＝O)N(H)e(C1-4烷基)2-e取代的具有3至6个环成员的杂环基、具有3至6个环成员的-C(＝O)杂环基、C3-8环烷基和C3-8环烯基，其中如果R7是吡啶，则Rz不是-NH2；
a、j、d、e、n、r和p独立地选自0、1和2；
k和m独立地选自1和2；
u选自0.1、2和3；并且
v独立地选自0和1
式(I°)的化合物：具有手性中心，下面用“*”标记：
式(I°)的化合物包括一个在所示位置(本文称为(3))的立体中心，并且是手性非外消旋的。式(I°)的化合物具有由散列和实心楔形键示出的立体化学，并且这种立体异构体占优势。
通常，至少55％(例如至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％)的式(I°)的化合物以所示立体异构体的形式存在。在一个一般实施方案中，式(I°)的化合物的总量的97％(例如99％)或更多(例如，基本上全部)可以单一立体异构体的形式存在。
化合物还可以包括一个或多个其他手性中心(例如在-CR6R7OH基团中和/或在R3基团中和/或在-CHR2基团中)。
通常，式(I°)的化合物具有至少10％的对映体过量(例如至少20％、40％、60％、80％、85％、90％或95％)。在一个一般实施方案中，式(I°)的化合物具有97％(例如99％)或更多的对映体过量。
就本节而言，异吲哚啉-1-酮环编号如下：
根据化学命名软件包使用的协议命名化合物。
其中cyc是苯基的式(I°)的化合物
其中cyc为苯基的式(I°)的化合物公开于我们早期的国际专利申请PCT/GB2016/053042，该申请于2017年4月06日以WO 2017/055860公布。对WO 2017/055860中公开的化合物、子式和取代基进行交叉参考(例如式(I)、I(e)、I(f)、I(g)、I(g')、I(h)、I(i)、I(j)、I(k)、I(L)、I(m)、I(m')、I(n)、I(o)、I(o')、I(o”)、I(p)、I(p')、I(q)、I(q')、I(q”)、I(q”')、I(q””)、I(r)、I(s)、I(t)、I(u)、I(v)、I(v')、I(w)、I(x)、I(x')、I(y)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIIa)、(IIIb)、(IVa)、(IVb)、(V)、(VI)、(Via)、(VII)、(VIIa)、(VIIb)、(VIIc)、(VIId)、(VIId')、(VIIe)、(VIIe')、(a)、(b)、(ba)、(bb)、(bc)或(c))。因此，凭借该交叉引用，WO2017/055860的化合物、子式和取代基被本申请直接且明确地公开。
式(I°)的具体子式、实施方案和化合物(其中cyc是苯基)包括以下：
在一个实施方案中，R1是氯或腈，特别是氯。
当R2不是氢时，式(I°)的化合物可以作为至少两种非对映异构体存在：
为免生疑问，通式(I°)和所有子式都涵盖两种单独的非对映异构体和非对映异构体的混合物，它们作为-CHR2-基团处的差向异构体相关。在一个实施方案中，式(I°)的化合物为非对映异构体1A或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐。在一个实施方案中，式(I°)的化合物为非对映异构体1B或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，R2选自氢和-(CRxRy)u-CO2H(例如，-COOH、-CH2COOH、-CH2CH2-CO2H、-(CH(CH3))-CO2H和-(C(CH3)2)-CO2H)，
在一个实施方案中，a为1且取代基R4位于异吲哚啉-1-酮的4-位，并且式(I°)的化合物是式(Ir)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
R4独立地选自卤素、腈、C1-4烷基、卤代C1-4烷基、C1-4烷氧基和卤代C1-4烷氧基。
在一个实施方案中，R4是卤素。在一个实施方案中，R4是氟或氯。在另一个实施方案中，R4是氟。
在一个实施方案中，a为1，取代基R4位于异吲哚啉-1-酮的4-位，并且R4为F，并且式(I°)的化合物为式(Is)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
当R6和R7不同时，式(I°)的化合物可以作为至少两种非对映异构体存在：
为免生疑问，通式(I°)和所有子式都涵盖两种单独的非对映异构体和非对映异构体的混合物，它们作为-CR6R7OH基团处的差向异构体相关。
在一个实施方案中，R6是C1-6烷基(诸如甲基或乙基，例如甲基)并且R7是氧杂环己烷基，并且式(I°)的化合物是式(Iw)的化合物：
在式(Iw)的一个实施方案中，Rz是氢或氟。
子式
在一个实施方案中，R6是甲基或乙基，并且式(I°)的化合物是式(IIIb)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
其中R1、R2、R3、R4、R5、R7、a、m和s如本文所定义。
在一个实施方案中，s为0并且式(I°)的化合物是式(IVb)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
其中R1、R2、R3、R4、R5、R7、a、m和s如本文所定义。
在一个实施方案中，m为1并且取代基R4处于苯基的4-位，并且式(I°)的化合物是式(VI)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
在一个实施方案中，R5是氯并且式(VI)的化合物是式(VIa)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
在一个实施方案中，R3是甲基，并且式(VI)的化合物是式(VIIf)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
在式(VIIf)的一个实施方案中，R6是乙基。
在式(VIIf)的化合物的一个实施方案中，R7选自甲基、氧杂环己烷基、吡唑基、咪唑基、哌啶基和环己基，其中所述环烷基和杂环基任选地被一个或多个Rz基团(例如甲基、氟或羟基)取代。
在式(VIIf)的化合物的一个实施方案中，R7选自氧杂环己烷基和甲基。
在式(VIIf)的化合物的一个实施方案中，R7选自任选地被一个或多个Rz基团(例如甲基、氟或羟基)取代的哌啶基。
在上述子式的另一个实施方案中，R2选自-(CH(CH3))-CO2H和-(C(CH3)2-CO2H)。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是式(I°)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐，其中：
R1是卤素(例如，Cl)、腈、O0,1(CRxRy)vCOOH(例如-COOH、-CH2COOH、-OCH2COOH或-C(CH3)2COOH；
n为1或2；
R2选自氢和-(CRxRy)u-CO2H(例如，-COOH、-CH2COOH、-CH2CH2-CO2H、-(CH(CH3))-CO2H和-(C(CH3)2)-CO2H)。
R3是氢，s是1；
R4是卤素(例如，F)；
R5是卤素(例如，Cl)；
m为1；
R6是氢或C1-6烷基(例如-CH3或-CH2CH3)；
R7是C1-4烷基(例如，甲基)、羟基C1-4烷基(例如，羟甲基)、甲氧基C1-4烷基(例如，甲氧基甲基)、具有5或6个环成员的杂环基团(例如，哌啶基、氧杂环己烷基、咪唑基或吡唑基))；
其中具有5或6个环成员的所述杂环基团可以任选地被一个或两个独立地选自C1-4烷基(例如，甲基)的Rz基团取代。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是式(I°)的化合物，其为实例1-137之一或选自实例1-137或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，其在本文定义的第一组实例中描述，即其中cyc是苯基的化合物，也如WO 2017/055860中所述)
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是式(I°)的化合物，其为实例1-97之一(其中cyc为苯基的实例)或选自实例1-97(其中cyc为苯基的实例)或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，其在本文定义的第一组实例中描述，即其中cyc是苯基的化合物，也如WO 2017/055860中所述)
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是式(I°)的化合物，其选自以下化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物：
4-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[1-羟基-1-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)丙基]-1-{[1-(羟甲基)环丙基]甲氧基}-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}苄腈
例如以及
(3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)乙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]丙酸
例如，
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是式(I°)的化合物，其选自以下化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物：
4-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[1-羟基-1-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)丙基]-1-{[1-(羟甲基)环丙基]甲氧基}-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}苄腈；以及
(3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)乙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]丙酸。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是式(I°)的化合物，其是非对映异构体2B，并且选自以下化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物：
4-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[1-羟基-1-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)丙基]-1-{[1-(羟甲基)环丙基]甲氧基}-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}苄腈；以及
(3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)乙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]丙酸。
在一个实施方案中，式(I°)的化合物是2-(5-氯-2-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}苯基)-2-甲基丙酸，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物
例如，
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是式(I°)的化合物，其是(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸，(“化合物1”)或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物
例如，
为免生疑问，应当理解，一个取代基的每个一般和具体实施方案和实施例可以与一个或多个，具体地所有如本文所定义的其它取代基的每个一般和具体实施方案和实施例组合，并且本申请涵盖所有此类实施方案。
其中cyc是杂环基团的式(I°)化合物
其中cyc是杂环基团的式(I°)化合物公开于我们早期的国际专利申请PCT/GB2016/053041中，该申请于2017年4月06日以WO 2017/055859公布。对WO 2017/055859中公开的化合物、子式和取代基(例如，式(I)、I(a)、I(a’)、I(b)、I(c)、I(d)、I(e)、I(f)、I(g)、I(g’)、I(h)、I(i)、I(j)、I(k)、I(L)、I(m)、I(m’)、I(n)、I(o)、I(o’)、I(o”)、I(p)、I(p’)、I(q)、I(q’)、I(q”)、I(q”’)、I(q””)、I(r)、I(s)、I(t)、I(u)、I(v)、I(v’)、I(w)、I(x)、I(x’)、I(y)、(II)、(IIa)、(IIb)、(IIIa)、(IIIIb)、(Iva)、(IVb)、(V)、(VI)、(VIa)、(VII)、(VIIa)、(VIIb)、(VIIc)、(VIId)、(VIId’)、(VIIe)、(VIIe’)、(a)、(b)、(ba)、(bb)、(bc)或(c))及其如本文所定义的实例进行交叉引用。因此，由于该交叉引用，本申请直接且明确地公开了WO 2017/055859的化合物、子式和取代基。
其中cyc是杂环基团的式(I°)化合物的特定子式、实施方案和化合物包括以下：
在另一个实施方案中，R2为氢，并且式(I°)的化合物是式(Ie)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
/>
当R2不是氢时，式(I°)的化合物可以作为至少两种非对映异构体存在：
为免生疑问，通式(I°)和所有子式都涵盖两种单独的非对映异构体和非对映异构体的混合物，它们作为-CHR2-基团处的差向异构体相关。在一个实施方案中，式I的化合物为非对映异构体1A或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐。在一个实施方案中，式I的化合物为非对映异构体1B或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，A为C3-6环烷基(即g为1、2或3)且t为1且s为0或1，且式(I°)的化合物是式(If)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
在一个实施方案中，A为C3-6环烷基(即g为1、2或3)且t为1且s为1，且式(I°)的化合物是式(Ig)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
在一个实施方案中，A为C3-6环烷基(即，g为1、2或3)且t是1且s是1，并且该环烷基是偕二取代的(即基团-(CRxRy)q-X和-CH2-0-异吲哚啉酮基团
都附接至环烷基的同一原子)，并且式(I°)的化合物是式(Ih)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
在一个实施方案中，A是环丙基(即，g是1)，t是1并且s是1。因此，环烷基是环丙基，并且式(I°)的化合物是式(Ii)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
在一个实施方案中，A是C3-6环烷基基团(即，g是1、2或3)，t是1，s是1并且X是-CN，并且式(I°)的化合物是式(Ik')的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
在另一个实施方案中，A是C3-6环烷基(即g是1、2或3)，t是1，s是1并且Rx和Ry是氢(包括1H和2H)并且式(I°)的化合物是式(IL)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
在一个实施方案中，A是C3-环烷基(即g是1)，t是1，s是1并且X是-CN，并且式(I°)的化合物是式(In')的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
其中q是0或1。在化合物(In)的一个实施方案中，q为0。
在一个实施方案中，R3是-(CRxRy)q-X并且s是1，t是0并且q是1或2，并且式的式(I°)的化合物是式(Ip)的化合物：
在一个实施方案中，A为具有3至6个环成员的C3-6环烷基或饱和杂环基，其中t为1，且s为1，Y独立地选自-CH2-、O或SO2，i是0或1，g是1、2、3或4，并且i+g是1、2、3或4，并且式(I°)的化合物是式(Iq)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
在一个实施方案中，i是1并且Y是O或SO2，特别是O。在一个实施方案中，式(Iq)的化合物是式(Iq””)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
在一个实施方案中，s为0，t为1，A为四氢呋喃基，q为0且X为氢。在一个实施方案中，R3是四氢呋喃基并且s是0。
在一个实施方案中，a为1且取代基R4位于异吲哚啉-1-酮的4-位，并且式(I°)的化合物是式(Ir)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
R4独立地选自卤素、腈、C1-4烷基、卤代C1-4烷基、C1-4烷氧基和卤代C1-4烷氧基。
在一个实施方案中，R4是卤素。在一个实施方案中，R4是氟或氯。在另一个实施方案中，R4是氟。
在一个实施方案中，a为1，取代基R4位于异吲哚啉-1-酮的4-位，并且R4为F，并且式(I°)的化合物为式(Is)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
当R6和R7不同时，式(I°)的化合物可以作为至少两种非对映异构体存在：
非对映异构体2A
非对映异构体2B
为免生疑问，通式(I°)和所有子式都涵盖两种单独的非对映异构体和非对映异构体的混合物，它们作为-CR6R7OH基团处的差向异构体相关。
在一个实施方案中，R7是4-氟-1-甲基哌啶-4-基并且式(I°)的化合物是式(Ix”)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
子式
在一个实施方案中，式(I°)的化合物是式(II)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
其中L是CR1、CH或N，并且R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、a、m和s如本文所定义。在一个实施方案中，L是CH。在一个实施方案中，L是N。在一个实施方案中，L是CR1诸如C-OH或C-羟基C1-4烷基(例如C-OH或C-CH2OH)。
在进一步的实施方案中，R1是氯或腈并且式(II)的化合物是式(IIa)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
其中R1、R2、R3、R4、R5、R7、m和s如本文所定义。
在一个实施方案中，R6是乙基，并且式(II)的化合物是式(IIIb)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
其中R1、R2、R3、R4、R5、R7、a、m和s如本文所定义。
在一个实施方案中，s为0并且式(II)的化合物是式(IVb)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
其中R1、R2、R3、R4、R5、R7、m和s如本文所定义。
在一个实施方案中，R4为F并且式(I°)的化合物是式(V)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
其中R1、R2、R3、R5、R7、m和s如本文所定义。
在一个实施方案中，m为1且取代基R4处于苯基的4-位，式(II)的化合物是式(VI)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
在一个实施方案中，R5是氯并且式(VI)的化合物是式(VIa)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
在一个实施方案中，A为C3-6环烷基(g为1、2或3)且t为1，且分子式(VI)化合物为分子式(VII)化合物或互变异构体或溶剂化物或其药学上可接受的盐：
在一个实施方案中，A是C3-6环烷基(g是1、2或3)并且t是1，并且环烷基是偕二取代的(即基团-(CRxRy)-X和CH2基团(其中s为1)或氧原子(其中s为0)都附接到环烷基的同一原子上，并且式(VII)的化合物是式(VIIa)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
在一个实施方案中，g是1，因此环烷基为环丙基，并且式(VIIa)的化合物是式(VIIb)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
在一个实施方案中，s为1，并且式(VIIb)的化合物是式(VIIc)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
在一个实施方案中，X是-CN并且式(VIId)的化合物是式(VIIe”)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
其中q为0或1，特别是q为0。
在一个实施方案中，R3是甲基，并且式(VI)的化合物是式(VIIf)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
在式(a)的化合物的一个实施方案中，R7是哌啶基或哌嗪基，任选被C1-6烷基(例如，甲基)和/或卤素(例如，氟)取代。
在分子式(a')化合物的一个实施方案中，R7是哌啶基，任选被C1-6烷基(例如，甲基)和/或卤素(例如，氟代)取代。
在一个实施方案中，A是具有3至6个环成员的杂环基，其中该杂环基包含一个或多个(例如1、2或3个)选自N、O、S及其氧化形式的杂原子(t为1；g是1、2、3或4；Z表示N、O、S及其氧化形式；i是1、2或3；并且i+g＝2、3、4或5)，并且式(VI)的化合物是式(b)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
在一个实施方案中，s为0，g为2，q为0且X为氢，且分子式(b)的化合物为分子式(bb)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
在另一个实施方案中，式(I°)的化合物是式(c)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
其中R1为氯或腈，s为1且X为羟基或s为0且X为-C(＝O)NH2。
在另一个实施方案中，式(I°)的化合物是式(c’)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐：
其中R1为氯或腈，s为1且X为羟基或s为0且X为-CN。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是式(I°)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐，其中：
Het是吡啶基或嘧啶基
R1与碳原子相连并且独立地选自羟基、卤素、硝基、腈和C1-4烷基；
R2选自氢、C1-4烷基、C2-6烯基、羟基C1-4烷基和-CH2CO2H；
R3为氢或-(A)t-(CRxRy)q-X；
s和t独立地选自0和1；
q选自0、1和2。
其中当R3为-(A)t-(CRxRy)q-X时，则(i)s、t和q中的至少一个不为0且(ii)当t为0时，s为1且q不为0；
A为具有3至6个环成员的杂环基，其中该杂环基包含一个或多个(例如1、2或3个)选自N、O、S及其氧化形式的杂原子；
X选自氢、卤素、-CN和-OR9；
R4和R5独立地选自卤素、腈和C1-4烷基；
R6选自氢和C1-6烷基；
R7选自具有3至7个环成员的杂环基、具有3至7个环成员的-CH2-杂环基、C3-8环烷基和-CH2-C3-8环烷基，其中所述环烷基或杂环基可以任选地被一个或多个Rz基团取代，并且其中在每种情况下，杂环基包含一个或多个(例如1、2或3个)选自N、O、S及其氧化形式的杂原子；
R9选自氢和C1-6烷基；
Rx和Ry独立地选自氢和C1-6烷基；
Rz独立地选自卤素、硝基、腈、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C2-6烯基、羟基、羟基C1-6烷基、C1-6烷氧基、-C(＝O)C1-6烷基和-N(H)e(C1-4烷基)2-e；
n和e独立地选自0、1和2；
m选自1和2；并且
a选自0和1。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是式(I°)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐，其中：
Het是吡啶基或嘧啶基
R1与碳原子连接并且独立地选自卤素、羟基和腈；
R2选自氢、C1-4烷基和-CH2CO2H；
R3为氢或-(A)t-(CRxRy)q-X；
A为具有3至6个环成员的杂环基，其中该杂环基包含一个或多个(例如1、2或3个)选自N、O、S及其氧化形式的杂原子；
s和t独立地选自0和1；
q选自0、1和2。
其中当R3为-(A)t-(CRxRy)q-X时，则(i)s、t和q中的至少一个不为0且(ii)当t为0时，s为1且q不为0；
X选自氢、卤素或-OR9；
R4和R5独立地选自卤素；
R6选自氢和C1-6烷基；
R7选自具有3至7个环成员的杂环基、具有3至7个环成员的-CH2-杂环基、C3-6环烷基和-CH2-C3-8环烷基，其中所述环烷基、环烯基或杂环基可以任选地被一个或多个Rz基团取代，并且其中在每种情况下，杂环基包含一个或多个(例如1、2或3个)选自N、O、S及其氧化形式的杂原子；
R9选自氢和C1-6烷基；
Rx和Ry独立地选自氢和C1-6烷基；
Rz独立地选自卤素、硝基、腈和C1-6烷基；
n为1并且m为1；并且
a选自0和1。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是式(I°)的化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐，其中：
Het是吡啶基或嘧啶基
R1与碳原子连接并且独立地选自卤素、羟基和腈；
R2选自氢、C1-4烷基和-CH2CO2H；
R3为-(A)t-(CRxRv)q-X；
A为具有3至6个环成员的杂环基，其中该杂环基包含一个或多个(例如1、2或3个)选自N、O、S及其氧化形式的杂原子；
s和t独立地选自0和1；
q选自0、1和2。
其中(i)s、t和q中的至少一个不为0，并且(ii)当t为0时，s为1且q不为0；
X选自氢、卤素和-OR9；
R4和R5独立地选自卤素；
R6选自氢和C1-6烷基；
R7是具有3至7个环成员的杂环基团，任选地被一个或多个Rz基团取代；
R9选自氢和C1-6烷基；
Rx和Ry独立地选自氢和C1-6烷基；
Rz独立地选自卤素和C1-6烷基；
n为1且m为1且
a为1。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是式(I°)的化合物，其为实例1-580之一(其中cyc是杂环基的实例)或选自实例1-580或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物(在本文定义的第二组实例中描述的式I的化合物，即其中cyc是Het的化合物，也如WO2017/055859中所述)。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是式(I°)的化合物，其为实例1-460之一或选自实例1-460或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物(在本文定义的第二组实例中描述的式I的化合物，即其中cyc是Het的化合物，也如WO 2017/055859中所述)。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是式(I°)的化合物，其为实例1-459之一或选自实例1-459或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐
或溶剂化物(本文定义的第二组实例中描述的式I°的化合物，即其中cyc是Het的化合物，也如WO 2017/055859中所述)。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是式(I°)的化合物，其选自以下化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物：
(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-{1-羟基-1-[反式-4-羟基环己基]乙基}-3-{[1-(羟甲基)环丙基]甲氧基}-2,3-二氢-1H-异吲哚-1-酮；
例如，/>
2-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[1-羟基-1-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)丙基]-3-氧代-1-[(3S)-氧杂环戊烷-3-基氧基]-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}嘧啶-5-甲腈；
例如，
(3R)-2-[(5-氯-3-羟基吡啶-2-基)甲基]-3-(4-氯苯基)-4-氟-6-[1-羟基-1-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)丙基]-3-(2-羟基乙氧基)-2,3-二氢-1H-异吲哚-1-酮；
例如，
6-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[1-(4-氟氧杂环己烷-4-基)-1-羟丙基]-3-氧代-1-[(3S)-氧杂环戊烷-3-基氧基]-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}吡啶-3-甲腈；
例如，
6-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-1-[(3-氟氧杂环丁烷-3-基)甲氧基]-5-[1-羟基-1-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)丙基]-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}吡啶-3-甲腈；
例如，
6-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-1-({1-[羟基(2H2)甲基]环丙基}(2H2)甲氧基)-5-[1-羟基-1-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)丙基]-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}吡啶-3-腈；
例如，和
(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-[1-羟基-1-(1-甲基哌啶-4-基)丙基]-3-[(3S)-氧杂环戊烷-3-基氧基]-2,3-羟基-1H-异吲哚-1-酮
例如，
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是式(I°)的化合物，其是非对映异构体2A，并且选自以下化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物：
(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-{1-羟基-1-[反式-4-羟基环己基]乙基}-3-{[1-(羟甲基)环丙基]甲氧基}-2,3-二氢-1H-异吲哚啉-1-酮；2-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[1-羟基-1-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)丙基]-3-氧代-1-[(3S)-氧杂环戊烷-3-基氧基]-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}嘧啶-5-甲腈；
(3R)-2-[(5-氯-3-羟基吡啶-2-基)甲基]-3-(4-氯苯基)-4-氟-6-[1-羟基-1-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)丙基]-3-(2-羟基乙氧基)-2,3-二氢-1H-异吲哚-1-酮；
6-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[1-(4-氟氧杂环己烷-4-基)-1-羟丙基]-3-氧代-1-[(3S)-氧杂环戊烷-3-基氧基]-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}吡啶-3-甲腈；
6-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-1-[(3-氟氧杂环丁烷-3-基)甲氧基]-5-[1-羟基-1-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)丙基]-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}吡啶-3-甲腈；
6-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-1-({1-[羟基(2H2)甲基]环丙基}(2H2)甲氧基)-5-[1-羟基-1-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)丙基]-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}吡啶-3-甲腈；以及
(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-[1-羟基-1-(1-甲基哌啶-4-基)丙基]-3-[(3S)-氧杂环戊烷-3-基氧基]-2,3-羟基-1H-异吲哚-1-酮。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是式(I°)的化合物，其是非对映异构体2B，并且选自以下化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物：
(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-{1-羟基-1-[反式-4-羟基环己基]乙基}-3-{[1-(羟甲基)环丙基]甲氧基}-2,3-二氢-1H-异吲哚-1-酮；
2-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[1-羟基-1-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)丙基]-3-氧代-1-[(3S)-氧杂环戊烷-3-基氧基]-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}嘧啶-5-甲腈；
(3R)-2-[(5-氯-3-羟基吡啶-2-基)甲基]-3-(4-氯苯基)-4-氟-6-[1-羟基-1-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)丙基]-3-(2-羟基乙氧基)-2,3-二氢-1H-异吲哚-1-酮；
6-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[1-(4-氟氧杂环己烷-4-基)-1-羟丙基]-3-氧代-1-[(3S)-氧杂环戊烷-3-基氧基]-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}吡啶-3-甲腈；
6-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-1-[(3-氟氧杂环丁烷-3-基)甲氧基]-5-[1-羟基-1-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)丙基]-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}吡啶-3-甲腈；
6-{[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-1-({1-[羟基(2H2)甲基]环丙基}(2H2)甲氧基)-5-[1-羟基-1-(1-甲基-1H-咪唑-4-基)丙基]-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]甲基}吡啶-3-甲腈；以及
(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-[1-羟基-1-(1-甲基哌啶-4-基)丙基]-3-[(3S)-氧杂环戊烷-3-基氧基]-2,3-羟基-1H-异吲哚-1-酮。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是式(I°)的化合物，其选自以下化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物：
(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-[2-羟基-1-(4-甲基哌嗪-1-基)丁烷-2-基]-3-[(3S)-氧杂环戊烷-3-基氧基]-2,3-二氢-1H-异吲哚-1-酮；
例如，
(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-[1-(4-氟-1-甲基哌啶-4-基)-1-羟丙基]-3-甲氧基-2,3-二氢-1H-异吲哚-1-酮；
例如，
1-({[(1R)-1-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-7-氟-5-[1-(4-氟-1-甲基哌啶4-基)-1-羟丙基]-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-1-基]氧基}甲基)环丙烷-1-甲腈；
例如，
(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-[1-(4-氟-1-甲基哌啶-4-基)-1-羟丙基]-3-[顺式-3-羟基环丁氧基]-2,3-二氢-1H-异吲哚-1-酮；
例如，和
(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-[1-(4-氟-1-甲基哌啶-4-基)-1-羟丙基]-3-[(2R)-2-羟丙氧基]-2,3-二氢-1H-异吲哚-1-酮
例如，
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是式(I°)的化合物，其是1-({[(1R)-1-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-7-氟-5-[1-(4-氟-1-甲基哌啶-4-基)-1-羟丙基]-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-1-基]氧基}甲基)环丙烷-1-甲腈，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是式(I°)的化合物，其是(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-[1-(4-氟-1-甲基哌啶-4-基))-1-羟丙基]-3-甲氧基-2,3-二氢-1H-异吲哚-1-酮，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是式(I°)的化合物，其是非对映异构体2A并且是1-({[(1R)-1-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-7-氟-5-[1-(4-氟-1-甲基哌啶-4-基)-1-羟丙基]-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-1-基]氧基}甲基)环丙烷-1-甲腈，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是式(I°)的化合物，其是非对映异构体2A并且是(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-[1-(4-氟-1-甲基哌啶)-4-基)-1-羟丙基]-3-甲氧基-2,3-二氢-1H-异吲哚-1-酮，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是式(I°)的化合物，其是非对映异构体2B并且是1-({[(1R)-1-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-7-氟-5-[1-(4-氟-1-甲基哌啶-4-基)-1-羟丙基]-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-1-基]氧基}甲基)环丙烷-1-甲腈，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是式(I°)的化合物，其是非对映异构体2B并且是(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-[1-(4-氟-1-甲基哌啶)-4-基)-1-羟丙基]-3-甲氧基-2,3-二氢-1H-异吲哚-1-酮，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-[(1S)-1-(4-氟-1-甲基哌啶-4-基)-1-羟丙基]-3-甲氧基-2,3-二氢-1H-异吲哚-1-酮或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是(3R)-3-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-4-氟-6-[(1R)-1-(4-氟-1-甲基哌啶-4-基)-1-羟丙基]-3-甲氧基-2,3-二氢-1H-异吲哚-1-酮，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是1-({[(1R)-1-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-7-氟-5-[(1S)-1-(4-氟-1-甲基哌啶-4-基)-1-羟丙基]-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-1-基]氧基}甲基)环丙烷-1-甲腈，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是1-({[(1R)-1-(4-氯苯基)-2-[(5-氯嘧啶-2-基)甲基]-7-氟-5-[(1R)-1-(4-氟-1-甲基哌啶-4-基)-1-羟丙基]-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-1-基]氧基}甲基)环丙烷-1-甲腈，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
为免生疑问，应当理解，一个取代基的每个一般和具体实施方案和实施例可以与一个或多个，具体地所有如本文所定义的其它取代基的每个一般和具体实施方案和实施例组合，并且本申请涵盖所有此类实施方案。
特定化合物
本发明的用途和方法适用于本文所述的所有式I°化合物，即MDM2拮抗剂可以是式I°化合物、其任何子式或本文所述的任何特定化合物，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是式I°的化合物，选自如本文所定义的第一组实例中所述的实例1至134(即其中cyc是苯基的化合物，也如WO 2017/055860中所述)。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是式I°的化合物，选自如本文所定义的第二组实例中所述的实例1至580(即其中cyc是Het的化合物，也如WO 2017/055859中所述)。
在本发明的一个特定实施方案中，MDM2拮抗剂是本文定义的式(I°)的化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，其为(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸。
(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸在本文中称为“化合物1”
例如，
(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸在国际专利申请号PCT/GB2016/053042中作为实例124公开，该申请于2017年4月6日以WO 2017/055860公布。
化合物1的制备方法可见于2018年10月4日公布为WO 2018/178691的国际专利申请PCT/GB2018/050845。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是游离酸形式的化合物1。在另一个实施方案中，MDM2拮抗剂是化合物1的药学上可接受的盐。
概述
其他MDM2拮抗剂可以以常规方式制备，例如通过与所述那些类似的方法。
MDM2拮抗剂的剂量学是本领域技术人员已知的。应当理解，每种MDM2拮抗剂的优选施用方法及剂量和方案将取决于正在治疗的特定肿瘤和正在治疗的特定宿主。最佳方法、施用方案、剂量和方案可由本领域技术人员使用常规方法并鉴于本文列出的信息而容易地确定。
盐、溶剂化物、互变异构体、异构体、N-氧化物、酯、前药和同位素
本文对任何化合物的提及还包括其离子形式、盐、溶剂化物、异构体(除非另有说明，否则包括几何异构体和立体化学异构体)、互变异构体、N-氧化物、酯、前药、同位素和受保护形式，例如，如下文所讨论的；尤其是，其盐或互变异构体或异构体或N-氧化物或溶剂化物；并且更特别地是其盐或互变异构体或N-氧化物或溶剂化物。在一个实施方案中，提及化合物还包括其盐或互变异构体或溶剂化物。
盐
所述化合物可以以盐，例如加酸的盐的形式存在，或者在某些情况下以有机和无机碱的盐，如羧酸盐、磺酸盐和磷酸盐的形式存在。所有此类盐都在本发明的范围内，并且对式(I°)化合物的提及包括这些化合物的盐形式。
N-氧化物
含有胺官能团的化合物也可以形成N-氧化物。本文对含有胺官能团的化合物的提及还包括N-氧化物。
几何异构体和互变异构体
这些化合物可以以多种不同的几何异构体和互变异构形式存在，并且对式(I°)化合物的提及包括所有此类形式。为免生疑问，在化合物可以几种异构或互变异构形式中的一种形式存在，并且只有一种形式被具体描述或显示的情况，仍然涵盖所有其他形式用于本发明。
例如，某些杂芳基环可以两种互变异构体形式存在，如下文所示的A和B。为简洁起见，一个分子式可以展示一种形式，但所述分子式将被视为涵盖两种互变异构体形式。
立体异构体
除非另外提及或指明，否则化合物的化学名称表示所有可能的立体化学异构体形式的混合物。
式(I°)的化合物
立体中心以通常的方式展示，例如使用“虚”或“实”楔线。
在化合物被描述为两种非对映异构体/差向异构体的混合物的情况下，立体中心的构型未被指定并用直线表示。
在化合物含有一个或多个手性中心并且可以以两种或更多种光学异构体的形式存在的情况下，除非上下文另有要求，否则对化合物的提及包括其所有光学异构体形式(例如，对映异构体、差向异构体和非对映异构体)，无论呈单个的光学异构体还是混合物(例如，外消旋或非外消旋混合物)或两种或更多种光学异构体的形式。
特别关注的是那些立体化学纯的化合物。当化合物例如被指定为R时，这意指所述化合物基本上不含S异构体。如果化合物例如被指定为E时，这这意指所述化合物基本上不含Z异构体。术语顺式、反式、R、S、E和Z是本领域技术人员众所周知的。
同位素变化
本发明包括所有药学上可接受的同位素标记化合物的用途，即化合物，其中一个或多个原子被具有相同原子序数但原子质量或质量数不同于通常在自然界中发现的原子质量或质量数的原子所取代。
溶剂化物和结晶形式
所述化合物还涵盖该化合物的任何多晶形式，和溶剂化物如水合物、醇化物等。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸的游离酸的结晶形式。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂是(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸的结晶形式，其具有：
(a)以衍射角15.1、15.5、15.8和22.3度2θ(±0.2度2θ)处存在的峰为特征的X射线粉末衍射图；或
(b)为3.99、5.62、5.71和的晶面间距。
尤其是(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸的结晶形式具有：
(a)以衍射角11.3、15.1、15.5、15.8、17.2、20.8、22.3和28.6度2θ(±0.2度2θ)处存在的峰为特征的X射线粉末衍射图；或
(b)为3.12、3.99、4.27、5.17、5.62、5.71、5.87和的晶面间距。/>
尤其是(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸的结晶形式具有以衍射角(2θ)处存在主峰为特征的X射线粉末衍射图，晶面间距(d)和本文表6中阐述的强度。
尤其是(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸的结晶形式具有在与图6所示的X射线粉末衍射图的那些相同的衍射角处显示出峰的X射线粉末衍射图，并且优选地其中这些峰具有与图6中的峰相同的相对强度。
尤其是(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸的结晶形式具有基本上如图6所示的X射线粉末衍射图。
在一个实施方案中，(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸的结晶形式当进行DSC时，在266℃-267℃(例如，266.61℃)处显示出放热峰。
结晶形式可以是基本上结晶的，这意味着一种单一的结晶形式可能占优势，尽管其他结晶形式可能以少量且优选可忽略的量存在。
例如，结晶形式可以包括不超过重量5％的任何其他结晶形式。
复合物
化合物在其范围内还包括化合物的复合物(例如，与化合物的包合物或笼形包合物诸如环糊精，或与金属的复合物)。包合物、笼形包合物和金属复合物可以通过技术人员众所周知的方法形成。
前药
化合物还包括化合物的任何前药。例如，“前药”意指例如在体内转化为有生物活性化合物的任何化合物。
本发明中使用的化合物的制备方法
式(I°)的化合物
在本部分中，除非上下文另有说明，否则与在本申请的所有其他部分中一样，除非上下文另有说明，否则对式I°的提及还包括如本文所定义的所有其他子式及其实例。
式(I°)的化合物可以根据技术人员众所周知的合成方法制备。
所需的中间体或者是可商购的、文献中已知的、通过类似于文献中的方法制备的或者通过类似于以下示例性实验程序中描述的方法制备的。可以使用本领域众所周知的方法通过基团的官能团相互转化来制备其他化合物。
制备、分离和纯化其中cyc为苯基的化合物的一般方法可在国际专利申请号PCT/GB2016/053042中找到，该申请于2017年04月06日以WO 2017/055860公布：
制备、分离和纯化其中cyc为Het的化合物的一般方法可在国际专利申请PCT/GB2016/053041中找到，该申请于2017年04月06日以WO 2017/055859公布。
生物标志物检测
在一些实施方案中，测试患者组织样品。所述组织可包括一种或多种癌细胞，或可包括癌细胞的核酸，通常是DNA，例如血液中获得的循环肿瘤DNA(ctDNA)。
在一些实施方案中，将样品加入体外诊断装置中，该装置测量感兴趣的一种或多种生物标志物的相关表达或活性。
当实施本发明以确认治疗是否可能会有效时，患者通常可能已知或怀疑患有癌症。因此，在某些实施方案中，该方法用于评估已知或怀疑患有癌症的人类患者是否可以使用MDM2拮抗剂进行治疗。
本发明的方法通常包括通过使用一种或多种检测试剂和/或检测技术来检测一种或多种被确定的生物标志物，以及任选地进一步的生物标志物。检测通常离体对患者样品进行，例如在体外。在一个实施方案中，直接测定生物标志物。在另一个实施方案中，可以测定生物标志物底物以间接测定生物标志物水平。
“检测”意指对生物标志物的表达或活性水平进行测量、定量、评分或测定。评估生物化合物，包括生物标志物蛋白、基因或mRNA转录物的方法是本领域已知的。检测生物标志物的方法包括直接和间接测量，这是公认的。本领域技术人员将能够选择测定特定生物标志物的适当方法。
“检测试剂”是特异性(或选择性)结合、相互作用或检测感兴趣的生物标志物的试剂或化合物。此类检测试剂可包括但不限于优先结合蛋白质生物标志物的抗体、多克隆抗体或单克隆抗体，或与mRNA或DNA生物标志物互补并选择性结合的寡核苷酸，通常在严格杂交条件下。
当提及检测试剂时，短语“特异性地(或选择性地)结合”或“特异性地(或选择性地)与之免疫反应”是指在生物分子的异质群体中确定生物标志物存在的结合反应。例如，在指明的免疫测定条件下，指定的检测试剂(例如抗体)与特定蛋白质的结合至少是背景的两倍，并且基本上不与样品中存在的其他蛋白质大量结合。在这种条件下的特异性结合可能需要根据其对特定蛋白质的特异性而选择的抗体。多种免疫测定形式可用于选择与特定蛋白质特异性免疫反应的抗体。例如，固相ELISA免疫测定(酶联免疫吸附测定)通常用于选择与蛋白质特异性免疫反应的抗体(参见例如Harlow&Lane,Antibodies,(A)LaboratoryManual(1988)，关于免疫测定形式和可用于确定特定免疫反应的条件的描述)。通常，特异性或选择性反应将是背景信号或噪声的至少两倍，更通常地是背景的10至100倍以上。
原位杂交(ISH)、定量实时聚合酶链反应(qRT PCR)和免疫组织化学(IHC)等技术传统上用于诊断或检测疾病生物标志物。然而，高通量、灵敏的方法(如下一代测序、单分子实时测序、数字病理学和定量组织病理学)的出现已经为伴随诊断或CDx的支持技术平台带来了转变。定量组织病理学和数字病理学都是基于医学成像的诊断方法；它们提供组织样品中蛋白质生物标志物的定位和测量。使用基于荧光的自动化成像平台鉴定和量化组织标志物。
当要检测的生物标志物是蛋白质时，检测方法包括基于抗体的测定、蛋白质阵列测定、基于质谱(MS)的测定和基于(近)红外光谱的测定。例如，免疫测定包括但不限于使用诸如蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀反应、凝胶扩散沉淀反应、免疫扩散测定、荧光免疫测定等技术的竞争性和非竞争性测定系统之类的。这样的测定是常规的并且在本领域中是众所周知的。
“分析”包括通过测量样品中的标志物(诸如，是否存在标志物或成分表达水平或活性水平)来确定与样品相关的一组值，并将测量值与同一受试者或其他对照受试者的样品或样品集合中的测量值进行比较。本教导的标志物可以通过本领域已知的各种常规方法中的任何一种来分析。“分析”可以包括进行统计分析以例如确定受试者是对治疗(例如本文所述的MDM2拮抗剂治疗)的反应者还是无反应者。
在本教导的上下文中，“样品”是指从受试者分离的任何生物样品，例如血液样品或活检。样品可以包括但不限于单个细胞或多个细胞、细胞片段、体液等分试样、全血、血小板、血清、血浆、红细胞、白细胞或白细胞、内皮细胞、组织活检、滑液、淋巴液、腹水、间质或细胞外液。术语“样品”还包括细胞间隙中的液体，包括龈沟液、骨髓、脑脊液(CSF)、唾液、粘液、痰液、精液、汗液、尿液或任何其他体液。“血样”可以指全血或其任何部分，包括血细胞、红细胞、白细胞或白细胞、血小板、血清和血浆。可以通过包括但不限于静脉穿刺、排泄、射精、按摩、活检、针吸、灌洗、刮擦、手术切口或介入或本领域已知的其他方式的方式从受试者获得样品。
分析技术
在施用MDM2拮抗剂之前，可对患者进行筛选，以确定患者所患或可能患的疾病或病症是否易受抑制MDM2/p53的化合物治疗。术语“患者”包括人类和兽医学受试者，如灵长类动物，具体地人类患者。
例如，可以对取自患者的生物样品进行分析，以确定患者正患有或可能患有的病状或疾病诸如癌症，是否是特征在于遗传异常或蛋白质表达异常的病状或疾病，这些异常导致MDM2水平的上调或MDM2/p53下游的生物化学途径的上调。此外，可以对取自患者的生物样品进行分析，以确定患者正患有或可能患有的病状或疾病诸如癌症是否是以本发明的生物标志物为特征的病状或疾病。
此类异常的实施例；该异常导致MDM2活化或敏化，影响MDM2表达的调节通路的丢失或抑制，受体或其配体的上调，细胞遗传畸变，或受体或配体的突变体的存在。MDM2/p53上调的肿瘤，特别是MDM2表达过量或表现出野生型p53的肿瘤可能对MDM2/p53抑制剂特别敏感。例如，如本文所讨论，已在一系列癌症中鉴定出MDM2的扩增和/或其负调节物如p14ARF的缺失。
术语“升高”和“增加”包括表达上调或过表达，包括基因扩增(即，多个基因拷贝)、细胞遗传畸变和转录效应或翻译后效应所致的表达增加。因此，可以对患者进行诊断测试以检测本发明的生物标志物中具有上调特征的合适蛋白或标志物。术语诊断包括筛选。
术语“标志物”或“生物标志物”包括遗传标志物，包括例如测量DNA组成以鉴定p53中突变的存在或扩增MDM2或p14ARF的缺失(丢失)，或通常本文广泛讨论的本发明的生物标志物。术语标志物还包括具有上调MDM2/p53或下调本文概述的生物标志物的特性的标志物，包括上述蛋白质的蛋白质水平、蛋白质状态和mRNA水平。基因扩增包括大于7个拷贝以及介于2个拷贝与7个拷贝之间的增益。
术语“减少的”、“缺失的”或“降低的”包括表达降低或降低的表达，包括下调(即基因拷贝减少)、细胞遗传学异常和转录效应引起的表达降低。因此，可以对患者进行诊断测试以检测较低水平的本发明生物标志物。
诊断测试和筛选通常对选自以下的生物样品(即身体组织或体液)进行：肿瘤活检样品、血液样品(脱落肿瘤细胞的分离物和富集物，或循环肿瘤DNA的分离物)、脑脊液、血浆、血清、唾液、粪便活检、痰、染色体分析物、胸膜液、腹膜液、口腔涂片、皮肤活检或尿液。
此外，还可以使用液体活检，例如基于血液的(系统)循环肿瘤DNA(ctDNA)测试或基于NGS的液体活检测试，特别是用于检测癌症或鉴定突变。液体活检涉及下一代测序(NGS)，补充了传统的PCR和肿瘤活检检测方法进行了补充，例如通过对循环肿瘤细胞(CTCs)进行全基因组测序或对循环肿瘤DNA(ctDNA)进行大规模并行测序。
在一个实施方案中，获得的样品是血液样品，例如血浆或血清样品，尤其是血清样品。在一个实施方案中，获得的样品是肿瘤活检样品。
在一个实施方案中，通常将血液收集在血清分离管中，在医学实验室或在护理点进行分析。在第二个实施方案中，通过活检分析肿瘤并在医学实验室进行分析。
筛选方法可以包括但不限于标准方法，例如逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质分析或原位杂交，例如荧光原位杂交(FISH)。
鉴定和分析蛋白质的细胞遗传畸变、基因扩增、缺失、下调、突变和上调的方法是本领域技术人员已知的。筛选方法可以包括但不限于标准方法，诸如通过常规的桑格尔(Sanger)或下一代测序方法进行DNA序列分析、逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)、RNA测序(RNAseq)、Nanostring杂交接近度RNA nCounter测定或原位杂交(诸如荧光原位杂交(FISH))或等位基因特异性聚合酶链反应(PCR)。此外，评估蛋白质水平的方法包括免疫组织化学或其他免疫测定。因此，在一个实施方案中，分析患者样品中的蛋白质表达。在进一步的实施方案中，使用诸如FISH的技术分析患者样品中的基因表达，例如基因畸变。用于评估基因拷贝变化的方法包括细胞遗传实验室中常用的技术，诸如MLPA(多重连接依赖性探针扩增)、检测异常拷贝数的多重PCR方法或其他可以检测基因扩增、获得和缺失的PCR技术。
在通过RT-PCR进行筛选时，通过创建mRNA的cDNA拷贝、然后通过PCR扩增cDNA来评估肿瘤中的mRNA水平。PCR扩增的方法、引物的选择和用于扩增的条件是本领域技术人员已知的。核酸操纵和PCR采用标准方法来进行，如在例如以下文献中所描述：Ausubel,F.M.等人,eds.(2004)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons Inc.，或Innis,M.A.等人编辑，(1990)《PCR方案：方法和应用指南(PCR Protocols:a guide tomethodsand applications)》，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥。涉及核酸技术的反应和操纵还在Sambrook等人,(2001)，第3版，《分子克隆：实验室手册(MolecularCloning:(A)Laboratory Manual)》，冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)中进行了描述。可替代地，可以使用可商购获得的RT-PCR试剂盒(例如Roche Molecular Biochemicals)或如以下美国专利中所阐述的方法：4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659、5,272,057、5,882,864和6,218,529并且所有专利通过引用并入本文。例如本文概述的基因中的突变可以通过PCR确定。在一个实施方案中，特异性引物对是可商购的或如文献中所述。
用于评估mRNA表达的原位杂交技术的实例是荧光原位杂交(FISH)(参见Angerer(1987)Meth.Enzymol.,152:649)。
可以进行下一代测序(NGS)、DNA测序或Nanostring技术。
通常，原位杂交包括以下主要步骤：(1)待分析组织的固定；(2)对样品进行杂交前处理以增加靶核酸的可及性并减少非特异性结合；(3)核酸混合物与生物结构或组织中的核酸杂交；(4)杂交后洗涤以去除杂交中未结合的核酸片段，以及(5)检测杂交的核酸片段。此类应用中使用的探针通常用例如放射性同位素或荧光报告基因标记。某些探针足够长，例如从约50个、100个或200个核苷酸到约1000个或更多个核苷酸，以能够在严格条件下与靶核酸特异性杂交。用于执行FISH的标准方法在以下文献中进行了描述：Ausubel,F.M.等人编辑(2004)Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons Inc andFluorescence In Situ Hybridization:Technical Overview by John M.S.Bartlett inMolecular Diagnosis of Cancer,Methods and Protocols，第2版；ISBN:1-59259-760-2；2004年3月，第077-088页；Series:Methods in Molecular Medicine。
用于基因表达谱分析的方法由(DePrimo等人(2003),BMC Cancer,3:3)进行了描述。简而言之，方案如下：从总RNA合成双链cDNA时，用(dT)24寡聚物引导第一链cDNA合成、然后用随机六聚体引物进行第二链cDNA合成。双链cDNA作为模板使用生物素化核糖核苷酸在体外转录cRNA。根据由Affymetrix(Santa Clara,CA,USA)描述的方案对cRNA进行化学片段化，然后在人类基因组阵列上杂交过夜。可替代地，单核苷酸多态性(SNP)阵列是一种DNA微阵列，其可以用于检测群体内的多态性。
此外，检测试剂盒可能使用Nanostring技术或ddPCR。
可替代地，由mRNA表达的蛋白质产物可以通过以下进行测定：肿瘤样品的免疫组织化学(或其他的免疫测定)、用微量滴定板进行固相免疫测定、蛋白质印迹、2维SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、ELISA、流式细胞术和本领域已知的用于检测特异性蛋白质的其他方法，例如毛细管电泳。检测方法将包括使用位点特异性抗体。技术人员将会认识到，所有此类众所周知的用于检测MDM2和p53上调，检测MDM2或p53变体或突变体，或MDM2的负调控因子的丢失(例如，p14ARF)或本文所述基因的技术都可以适用于本发明案例中。具体而言，本文所述基因的水平可以使用免疫组织化学来测量。细胞质中的表达可以通过肿瘤细胞染色来评估。在一些实施方案中，使用这些技术测定本发明的一种或两种蛋白质生物标志物。在一些实施方案中，使用这些技术测定一种或多种生物标志物底物。
可以使用标准蛋白质测定法测量蛋白质水平，特别是增加、降低或异常水平的蛋白质。也可以通过使用诸如来自Chemicon International的测定法测量蛋白质水平来检测组织样品，例如肿瘤组织中升高或降低的水平，或低表达或过表达。将从样品裂解物中免疫沉淀所关注的蛋白质并对其水平进行测量。
在基因为DDR生物标志物的实施方案中，应当理解有各种分析方法可用于测定，诸如ELISA、免疫比浊法、快速免疫扩散和视觉凝集。
在测试基因表达的实施方案中，例如对于IFN特征生物标志物，应当理解有各种分析方法可用于测定。
在包括检测一种或多种DDR生物标志物的丢失的一个实施方案中，此类检测通常可以通过使用对活检的临床验证测定在DNA(即DNA测序)、RNA(即qPCR、基因阵列、外显子组测序等)或蛋白质(即免疫组织化学)水平上进行。在一个替代实施方案中，对一种或多种DDR生物标志物的丢失的检测包括以下一项或多项：反相蛋白质阵列、蛋白质印迹、半定量或定量IHC。
免疫组织化学(IHC)是生物标志物检测的重要技术。首先，它允许在检查的癌症组织的组织学相关区域中直接观察生物标志物的表达。其次，IHC在通过标准方法在处理过的FFPE组织切片上运行，确保生物标志物测定可以在临床可用的标本上运行。第三，经过验证的IHC测定可以很容易地应用于临床实践。例如，有多种经过验证的临床上使用的IHC测定法，诸如检测PD-L1、HER2和ALK的测定法(https://www.fda.gov/medical-devices/vitro-diagnostics/list-cleared-or-approved-companion-diagnostic-devices-vitro-and-imaging-tools)。传统上，病理学家用视觉评分作为IHC数据。例如，在HSCORE的计算中，生成每个强度水平染色的面积百分比乘以加权染色强度(例如，1、2或3；其中0是无染色，1是弱染色，2是中等染色且3是强染色)的总和[McCarty等人：Cancer Res 1986,46:4244s-4248s]。为了测定验证目的，经常对排列在染色的TMA切片上的标本进行这些分析，允许表示足够大数目的标本用于统计学上严格的测试。组织标本由极少数载玻片上组织核心充分的代表，最大限度地减少IHC成本和组织使用，并方便观察者内、观察者间和实验室间的研究。对感兴趣的图像区域(例如，组织标本的癌变区域)进行分类，并且量化这些区域内的IHC染色强度的计算机辅助方法也可用于生成数据。
这样的技术将在本文所述的其他基因的检测中发现同样的适用性。在一些实施方案中，本文所述基因水平增加的检测包括聚合酶链式反应(PCR)测定，或直接核酸测序或与对所述基因特异的核酸探针杂交。
因此，所有这些技术也可用于鉴定特别适合用MDM2拮抗剂治疗的肿瘤。
在适当的情况下，也可以利用离体功能测定，例如测量癌症患者的循环白血病细胞，来评估对MDM2/p53抑制剂激发产生的反应。
因此，本发明的另外的方面包括使用MDM2拮抗剂来制备用于治疗或预防已经进行过筛选并且已经确定患有或有风险患有将易感于用MDM2/p53抑制剂治疗的疾病或病状的患者的疾病状态或病状的药物。
本发明的另一方面包括在患者癌症的预防或治疗中使用的MDM2拮抗剂，该患者选自具有一种或多种DDR生物标志物丢失的亚群。
本发明的另一方面包括在患者癌症的预防或治疗中使用的MDM2拮抗剂，该患者选自具有p53野生型和一种或多种DDR生物标志物丢失的亚群。
本发明的另一方面包括在患者癌症的预防或治疗中使用的MDM2拮抗剂，该患者具有MDM2负向调控因子诸如p14ARF丢失及一种或多种DDR生物标志物丢失。
对血管正常化进行的MRI确定(例如，使用MRI梯度回波、自旋回波和对比度增强来测量血容量、相对血管大小和血管通透性)与循环生物标志物组合也可以用于鉴定适于用式(I°)的化合物治疗的患者。
因此，本发明的再一个方面是一种用于诊断和治疗由MDM2/p53介导的疾病状态或病状的方法，该方法包括(i)筛选患者以确定该患者正患有或可能患有的疾病或病状是否是对MDM2/p53抑制剂治疗敏感的疾病或病状；并且(ii)在指示该患者的疾病或病状因此敏感的情况下，随后向该患者施用如本文所定义的MDM2拮抗剂及其亚组或实例。
在一个实施方案中，本发明的方法另外包括筛选具有一种或多种MDM家族成员(例如，MDM2和/或MDMx)过表达的患者的步骤。
在一个实施方案中，本发明的方法另外包括筛选具有导致MDM2过表达的细胞遗传畸变的患者，例如，被选为负向调控因子p14ARF丢失的患者的步骤。
在一个实施方案中，将从患者获得的样品与引物、抗体、底物或探针接触以确定本文所述基因的水平。
在一个实施方案中，该方法包括：(i)将患者样品与引物、抗体、底物或探针接触，和(ii)确定本文所述基因的水平。
可以用抗体(例如与荧光探针偶联的抗体)对未处理的细胞进行细胞内染色来分析基础水平。本文所述的生物标志物的抗体可从一系列供应商商购获得。特别地，待使用的抗体可以是FDA批准的体外诊断试剂盒(IVD)的一部分。
在一个实施方案中，该方法包括：(i)将患者样品与抗体接触，和(ii)确定本文所述的一种或多种生物标志物的水平。在一个替代实施方案中，该方法的步骤(i)包括将患者样品与一种或多种生物标志物底物的一种或多种PCR引物接触。
在一个实施方案中，该方法包括：(i)将患者样品与抗体接触，和(ii)确定核定位水平以评估本文所述的一种或多种生物标志物的水平。在一个替代实施方案中，该方法的步骤(i)包括将患者样品与生物标志物底物抗体接触。
在适当的情况下，可以使用免疫组织化学或使用抗体的免疫荧光来确定核定位水平。
可使用反相蛋白质阵列、蛋白质印迹、半定量或定量IHC或DNA测序检测导致DDR生物标志物丢失的突变。在一个实施方案中，该方法包括：(i)将患者样品与抗突变抗体接触，并且(ii)确定患者肿瘤丢失其DDR生物标志物。在一个实施方案中，该方法包括：(i)将患者样品与抗突变抗体接触，并且(ii)确定一种或多种DDR生物标志物的水平(或其丢失)。
对DDR生物标志物缺失和突变的检测可以通过从患者样品(例如肿瘤活检)中提取DNA、PCR扩增和使用合适引物的DNA测序来进行。PCR引物可以设计或可商购获得。突变阵列试剂盒也可商购获得。
在一个实施方案中，该方法包括：(i)将患者样品与一种或多种DDR生物标志物PCR引物接触，并且(ii)确定是否存在DDR生物标志物突变或缺失。在一个替代实施方案中，该方法的步骤(i)包括将患者样品与一种或多种生物标志物底物的一种或多种PCR引物接触。
在一个实施方案中，该方法包括：(i)将患者样品与DDR生物标志物抗体接触，并且(ii)确定是否存在DDR生物标志物突变或缺失。在一个替代实施方案中，该方法的步骤(i)包括将患者样品与生物标志物底物抗体接触。
可以使用ELISA试剂盒确定蛋白质水平。用于患者样品的ELISA试剂盒可在临床环境中用于评估血液化学。这些使用了对蛋白质具有特异性的抗体，例如抗生物标志物抗体，诸如抗ATM或抗ATRX，或偶联抗体。特别是，要使用的抗体是FDA批准的体外诊断试剂盒的一部分。在一个实施方案中，使用符合临床生物化学协会(ACB)定义的标准的测试来确定该水平。
在一个实施方案中，该方法包括：(i)将患者样品与抗体接触，并且(ii)确定来自本文所述基因的蛋白质水平。
尤其是，在定量该水平的条件下接触样品。
例如，在上述接触步骤中，样品通常在缓冲液的存在下与引物、探针、底物或抗体接触。底物可以是例如荧光探针。
患者选择
应当理解，根据本发明选择用MDM2拮抗剂治疗的患者将根据前一部分中描述的方法测试或测量一种或多种DDR生物标志物。
例如，这样一个选定的患者将具有：
降低的或低的一种或多种DDR生物标志物表达或活性。
在一个实施方案中，选定的患者表现出或呈现出至少一种癌症症状，特别是TP53野生型肿瘤。
在一个实施方案中，选定的癌症患者以前没有用MDM2拮抗剂治疗过。在一个实施方案中，选定的患者以前没有对MDM2拮抗剂的治疗产生反应。
在一些实施方案中，核酸表达谱(例如，IFN基因特征)通过PCR、HTG EdgeSeq或定量基因表达测定法(诸如NanoString nCounter)来确定。在一些实施方案中，蛋白质表达谱(例如DDR途径基因产物，或例如BAP1和/或CDKN2A)通过免疫测定法确定。
任选的干扰素基因特征(IFN)
增加的DNA损伤可诱导干扰素反应。这可以通过“干扰素特征”来鉴定。这些蛋白质的表达通常通过测量mRNA转录产物来确定。
在一个实施方案中，患者或样品将具有：
降低的或低的一种或多种DDR生物标志物表达或活性；以及
增加的一种、两种、三种、四种、五种或更多种干扰素特征基因表达。
在一个实施方案中，增加的一种、两种、三种、四种、五种或更多种干扰素特征基因表达是以下的一种、两种、三种、四种、五种或更多种基因增加的或高的表达：CXCL10、CXCL11、RSAD2、MX1、BATF2、IFI44L、IFITM1、ISG15、CMPK2、IFI27、CD74、IFIH1、CCRL2、IFI44、HERC6、ISG20、IFIT3、HLA-C、OAS1、IFI35、IRF9、EPSTI1、USP18、BST2、CSF1、C1S、DHX58、TRIM14、OASL、IRF7、LGALS3BP、DDX60、LAP3、LAMP3、PARP12、PARP9、SP110、PLSCR1、WARS、STAT1、IRF3、IRF5、MSC、JUN、SPI1、IRF1、COMMD3-BMI1、STAT2、RUNX3、SREBF1和/或FLI1。
在一个实施方案中，以下一种或多种的RNA水平：CXCL10、CXCL11、RSAD2、MX1、BATF2、IFI44L、IFITM1、ISG15、CMPK2、IFI27、CD74、IFIH1、CCRL2、IFI44、HERC6、ISG20、IFIT3、HLA-C、OAS1、IFI35、IRF9、EPSTI1、USP18、BST2、CSF1、C1S、DHX58、TRIM14、OASL、IRF7、LGALS3BP、DDX60、LAP3、LAMP3、PARP12、PARP9、SP110、PLSCR1、WARS、STAT1、IRF3、IRF5、MSC、JUN、SPI1、IRF1、COMMD3-BMI1、STAT2、RUNX3、SREBF1和/或FLI1，相对于从未患癌症的正常受试者获得的对照样品中的所述RNA的量升高。
在一个替代实施方案中，CXCL10、CXCL11、RSAD2、MX1、BATF2、IFI44L、IFITM1、ISG15、CMPK2、IFI27、CD74、IFIH1、CCRL2、IFI44、HERC6、ISG20、IFIT3、HLA-C、OAS1、IFI35、IRF9、EPSTI1、USP18、BST2、CSF1、C1S、DHX58、TRIM14、OASL、IRF7、LGALS3BP、DDX60、LAP3、LAMP3、PARP12、PARP9、SP110、PLSCR1、WARS、STAT1、IRF3、IRF5、MSC、JUN、SPI1、IRF1、COMMD3-BMI1、STAT2、RUNX3、SREBF1和/或FLI1在肿瘤中的RNA水平相对于从同一患者获得的非肿瘤样品中的所述RNA的量升高。
在一个实施方案中，癌症显示CXCL10或CXCL11表达增加。
在另一个实施方案中，癌症显示IRF7、IFITM1、IRF9、MX1或IFI35的表达增加。在另一个实施方案中，癌症显示以下的一种或多种，例如两种或更多种的表达增加：IRF7、IFITM1、IRF9、MX1、IFI35、CXCL10或CXCL11。
在一个实施方案中，癌症显示以下的一种、两种、三种、四种、五种或更多种的表达增加：CXCL10、CXCL11、RSAD2、MX1、BATF2、IFI44L、IFITM1、ISG15、CMPK2、IFI27、CD74、IFIH1、CCRL2、IFI44、HERC6、ISG20、IFIT3、HLA-C、OAS1、IFI35、IRF9、EPSTI1、USP18、BST2、CSF1、C1S、DHX58、TRIM14、OASL、IRF7、LGALS3BP、DDX60、LAP3、LAMP3、PARP12、PARP9、SP110、PLSCR1和WARS。
在一个实施方案中，癌症显示以下的一种、两种、三种、四种、五种或更多种的表达增加：IRF7、STAT1、IRF3、IRF5、MSC、JUN、SPI1、IRF1、COMMD3-BMI1、STAT2、RUNX3、SREBF1、IRF9和FLU。
在另一个实施方案中，癌症显示IRF7、IFITM1、IRF9、MX1或IFI35的表达增加。
在另一个实施方案中，癌症显示以下的一种或多种，例如两种或更多种的表达增加：IRF7、IFITM1、IRF9、MX1、IFI35、CXCL10或CXCL11。
在一些实施方案中，升高的水平是相对于MDM2抑制剂无反应受试者的样品中测定的RNA量。
在一个实施方案中，它相对于正常水平升高或增加。
正常上限(ULN)是指处于整个范围95％的水平。它是一组值，正常人群中95％落在其中(即，95％的预测区间)。
在一个实施方案中，升高的水平相对于对照样品、正常上限(ULN)或取自所述患者的样品相差>1倍，诸如相差1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100倍，或其间任何范围。在一个实施方案中，升高的水平相对于对照样品或ULN相差1倍至50倍。在一个实施方案中，升高的水平非常高，例如相对于对照样品、ULN或取自所述患者的样品相差>10倍，诸如相差10、10.5、11、11.5、12、12.5、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、1000倍，或其间任何范围。在一个实施方案中，升高的水平相对于对照样品或ULN相差10倍至1000倍。在一个实施方案中，升高的水平相对于对照样品相差2至10倍之间(例如，5倍)。
可以确定疾病个体和正常个体(参考值或对照样品)之间的倍数差异。该参考值可以从正常个体或基于不包括要测试的样品类型(例如，TP53野生和DDR生物标志物丢失)的样品池计算。在一个实施方案中，干扰素基因在正常组织中的表达(来源：GTEx；NatBiotechnol.2017年4月11日；35(4):314-316)相对于患者间皮瘤样品的表达(来源：TCGA)相差超过5倍至0.05倍(log2标度)，尤其是一组基因平均增加1.5倍(log2标度)。
在一个实施方案中，RNA的浓度通过RT-PCR和/或微阵列和/或纳米串来确定。每种测定通常具有与特定测定方法相关的“正常上限”(ULN)值。此类ULN通常使用特定测定方法从足够样品量的正常健康受试者中确定，以测量RNA浓度。然后通常将仍被认为在正常范围内(例如，在平均值的两个标准偏差内)的最高RNA浓度确定为ULN。由于此类ULN值将随着测量浓度的特定测定方法而变化，因此每个特定测定方法将具有与该测定方法相关的独特的ULN值。
如本文所示，浓度可用于预测癌症患者是否可能受益于MDM2拮抗剂治疗。
DDR生物标志物测定
在一个实施方案中，一种或多种DDR生物标志物的蛋白质水平相对于从未患癌症的正常受试者获得的对照样品中的所述蛋白质的量降低。
在替代实施方案中，一种或多种DDR生物标志物的蛋白质水平相对于从同一患者获得的早期样品中的所述蛋白质的量降低。
在一个实施方案中，它相对于正常水平减少或降低。
正常上限(ULN)是指处于整个范围95％的水平。它是一组值，正常人群中95％落在其中(即，95％的预测区间)。
在一个实施方案中，降低的水平相对于对照样品、正常上限(ULN)或取自所述患者的样品相差<1倍，诸如相差0.75、0.5、0.4、0.3、0.2、0.15、0.1、0.09、0.08、0.07、0.06、0.05、0.04、0.03、0.02或0.01倍或其间任何范围。在一个实施方案中，降低的水平相对于对照样品或ULN，相差1倍至0.01倍。在一个实施方案中，降低的水平非常低，例如相对于对照样品、ULN或取自所述患者的样品相差>0.01倍，诸如相差0.001倍或其间任何范围。在一个实施方案中，水平降低是0，即完全没有。
在另一个实施方案中，通过免疫组织化学确定一种或多种DDR生物标志物的水平。
蛋白质、蛋白质复合物或蛋白质组标志物可以通过本领域已知的多种方法特异性地鉴定和/或定量，并且可以单独或组合使用。基于免疫学或抗体的技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、蛋白质印迹、免疫荧光、微阵列、一些色谱技术(即免疫亲和色谱)、流式细胞术、免疫沉淀等。此类方法基于对与感兴趣的蛋白质或蛋白质复合物相关的一种特定表位或多种表位组合具有特异性的一个或多个抗体。非免疫学方法包括那些基于蛋白质或蛋白质复合物本身的物理特性的方法。此类方法的实施例包括电泳、一些色谱技术(例如高效液相色谱(HPLC)、快速蛋白质液相色谱(FPLC)、亲和色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱等)、质谱、测序、蛋白酶消化，等等。此类方法基于质量、电荷、疏水性或亲水性，其来源于所述蛋白质或蛋白质复合物的氨基酸组成，以及氨基酸的特定序列。
在一个实施方案中，不存在一种或多种DDR生物标志物的表达。具有低水平的一种或多种DDR生物标志物的样品可被鉴定为DDR生物标志物阴性，例如DDR生物标志物丢失。
在一个实施方案中，一种或多种DDR生物标志物的丢失通过例如DNA测序的突变分析来评估。
也可以确定一种或多种DDR生物标志物的细胞质以及核表达水平。蛋白质的核定位是细胞中的标志。核表达水平可以使用组织学分数(范围，0-100)来评分，该分数表示用抗体(例如针对生物标志物的单克隆抗人抗体)处理后获得的阳性细胞百分比。可以进行免疫染色表达评分。
细胞质中一种或多种DDR生物标志物的水平也可以使用免疫组织化学或免疫荧光测量。
在一个实施方案中，一种或多种DDR生物标志物的水平相对于从未患癌症的正常受试者获得的对照样品中的所述蛋白质的量降低。
在一个实施方案中，一种或多种DDR生物标志物的水平相对于从同一患者获得的非肿瘤样品中的所述蛋白质的量降低。
在一个实施方案中，一种或多种DDR生物标志物的表达水平降低50％、60％、70％、80％、90％、95％、96、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％。100％的表达降低是完全降低，即完全丢失。在一些实施方案中，提供至少50％的降低。在一些实施方案中，提供至少75％的降低。
在一些实施方案中，提供至少80％的降低。
在一些实施方案中，提供至少95％的降低，例如至少99％。
定量方法
本发明涉及鉴定可使用MDM2拮抗剂进行治疗的患者。在一些实施方案中，所述方法至少包括以下步骤：
(a)将来自患者的样品与针对一种或多种DDR生物标志物的抗体(或者一种或多种DDR生物标志物底物)接触；
(b)对所述样品进行ELISA或免疫组织化学测定；
(c)确定一种或多种DDR生物标志物的水平；并且
(d)在以下情况时将患者鉴定为MDM2拮抗剂治疗的候选者：(i)一种或多种DDR生物标志物的水平相对于正常上限(ULN)降低时；或(ii)一种或多种DDR生物标志物不存在时；或(iii)一种或多种DDR生物标志物的水平相对于正常上限(ULN)较低时。
在其他实施方案中，用于鉴定用MDM2拮抗剂治疗的患者的方法包括：
(a)将来自患者的样品与针对一种或多种DDR生物标志物的抗体(和/或一种或多种DDR生物标志物底物)接触以确定蛋白质表达的水平；和/或
(b)将来自患者的样品与针对一种或多种不同于(a)的DDR生物标志物的抗体(和/或一种或多种DDR生物标志物底物)接触以确定蛋白质表达水平；
(c)当该一种或多种DDR生物标志物的水平相对于正常上限(ULN)降低时，用MDM2拮抗剂治疗患者
还描述了一种用于鉴定或选择用MDM2拮抗剂治疗的患者的方法，该方法包括：
(a)将来自患者的样品与针对一种或多种DDR生物标志物的抗体接触以确定蛋白质表达的水平；和/或
(b)将来自患者的样品与针对一种或多种DDR生物标志物的抗体接触以确定蛋白质表达的水平；和/或
(c)将来自患者的样品与多个寡核苷酸引物接触，所述多个引物包括至少一对用于任何一种或多种DDR生物标志物的寡核苷酸引物；
(d)当一种或多种DDR生物标志物的水平相对于正常上限(ULN)降低时，用MDM2拮抗剂治疗患者。
所选患者通常是癌症患者。当患者在来自患者的生物样品中的一种或多种DDR生物标志物的水平低于预定值(或不存在)时，通常选择该患者。
一种用于预测MDM2拮抗剂对患者癌症的功效的方法，包括确定来自患者的生物样品中一种或多种DDR生物标志物的水平，其中一种或多种DDR生物标志物的生物样品水平低于预定值可预测在患者中的功效。
实施这些方法的系统
本文所述的方法可以利用系统来辅助患者的评估或预后。该系统可以是具有各种装置组件(单元)集成在其中的单个装置。该系统还可以具有其各种组件，或这些组件中的一些，作为单独的装置。组件可以包括测量装置、图形用户界面和计算机处理单元。
该系统通常包括与界面的数据连接，由此界面本身可以是系统的一部分或者可以是远程界面。后者指的是用不同的装置来提供实际界面的可能性，该装置最好是手持装置，例如智能手机或平板电脑，。在这种情况下，数据连接将优选涉及无线数据传输，例如通过Wi-Fi或蓝牙，或通过其他技术或标准。
在某些实施方案中，测量装置被配置为接收组织样品，例如通过将一个或多个癌细胞或一滴血置于可插入装置中的药筒上。该装置可以是能够从相同样品确定生物标志物或多个生物标志物水平的现有装置。处理单元可以从测量装置接收蛋白质浓度的数值。处理单元通常配备有软件(通常是嵌入式软件)，允许它根据输入数据计算一个分值。
在另一个实施方案中，用于评估人类癌症患者是否适合用MDM2拮抗剂治疗的系统包括：
(a)能够并且适于在来自人类患者的样品中检测本发明的一种或多种生物标志物的检测工具。此类工具是已知的，并且对于技术人员而言是容易获得的。通常，提供了用于在其中接收受试者样品的容器，该容器设置有检测工具；
(b)能够并且适于根据所确定的所述蛋白质的浓度来确定患者用MDM2拮抗剂治疗的可能性的适应症的处理器。
任选地，该系统包括能够呈现信息的用户界面(或到远程界面的数据连接)，特别是图形用户界面(GUI)；GUI是一种允许用户通过图形图标和视觉指示符(诸如二级符号)与电子设备进行交互的用户界面，而不是基于文本的用户界面、键入命令标签或文本导航(在本发明中不排除此类界面类型中的任一者)；GUI是公知的，并且通常用于手持移动设备中，诸如MP3播放器、便携式媒体播放器、游戏设备、智能电话以及小型家用、办公室和工业控制；如所述，该界面任选地还可以选择为能够输入信息，诸如关于患者的信息。
在一个实施方案中，一种用于确定人类癌症患者对于用MDM2拮抗剂治疗的适合性的系统包括：用于存储与来自患者的样品相关的数据的存储存储器，所述数据包括与生物标志物组相关的指示来自受试者的样品中的生物标志物表达水平的数据，该生物标志物组包含本发明的一种或多种生物标志物；以及
以能够通信的方式耦合到所述存储存储器，用于对所述患者进行分类的处理器。
试剂盒
本发明还单独地或作为上述系统的一部分提供了用于检测本发明的一种或多种生物标志物的试剂盒，以评估患者对MDM2抑制反应的癌症治疗反应的可能性。该试剂盒通常包括用于检测本发明的一种或多种生物标志物的一种或多种检测试剂。这些试剂可以用于直接检测或间接检测生物标志物，例如检测相关底物。
通常，该试剂盒包括两种或更多种，或三种或更多种检测试剂，每种试剂针对本发明的不同生物标志物。
如上文参考本发明的方法所讨论的，试剂盒可包括更多检测试剂，例如用于其他蛋白质的检测试剂。在优选的实施方案中，试剂盒中可用的检测试剂由用于检测构成本发明的生物标志物组的两种、三种或四种蛋白质的检测试剂组成，如上所述。
所述试剂盒可以包括固体支持物，例如芯片、微量滴定板或珠子或包括所述检测试剂的树脂。在一些实施方案中，试剂盒包括质谱探针。
该试剂盒还可以提供对未结合的检测试剂或所述生物标志物(夹心型测定)特异的洗涤溶液和/或检测试剂。
此类试剂盒将适当地包含用于检测和/或量化本发明的一种或多种生物标志物的生物传感器，任选地连同与本文所述方法一致的试剂盒使用说明。
有成熟的遗传和生化手段来显示本发明的一种或多种生物标志物的状态特性。也有成熟的生化方法来显示血液中蛋白质量的特性，例如血清样品。
在一个实施方案中，本发明包括被包装的癌症治疗。被包装的治疗包括与说明书包装在一起的组合物，该说明书关于在被选定使用本发明的患者中为预期使用目的，使用有效量的本发明的组合物。在其他实施方案中，本发明提供了将本发明的任何组合物用于制造治疗受试者癌症的药物的用途。
在一个实施方案中，本发明提供了用于确定单个患者样品中本发明的一种或多种生物标志物的水平的一个试剂盒或一个组或一个阵列。
生物效应
本文所述的化合物、亚组及其实施例已显示能够抑制p53与MDM2的相互作用。这种抑制导致细胞增殖停滞和细胞死亡(通常是细胞凋亡)，这可用于预防或治疗本文所述的疾病状态或病症，例如下面讨论的疾病和病症，以及上面所描述的其中p53和MDM2起作用的疾病和病症。因此，例如，设想用于本发明的化合物可用于减轻或降低癌症的发生率。
本文所述的化合物可用于治疗成年人群。本发明的化合物可以可用于治疗小儿群体。
已经证实本文所述的化合物是形成MDM2-p53复合物的良好拮抗剂。本文所述的化合物能够与MDM2结合并且对MDM2表现出效力。本发明的化合物对MDM2/p53的疗效，已用本文所描述的测定方案和本领域已知的其它方法确定。更特别地，式(I°)化合物及其亚组对MDM2/p53具有亲和力。
在本发明中使用的某些化合物是IC50值小于0.1μM，尤其小于0.01μM或0.001μM的那些化合物。
MDM2/p53功能与许多疾病有关，因为它在多种过程中发挥作用，例如血管重塑和抗血管生成过程以及代谢通路的调节，以及肿瘤发生。由于它们对MDM2具有亲和力，因此预期这些化合物可以证明对治疗或预防一系列疾病或病状有用，这些疾病或病状包括自身免疫病状；糖尿病；慢性炎性疾病，例如狼疮肾炎、系统性红斑狼疮(SLE)、自身免疫介导的肾小球肾炎、类风湿性关节炎、银屑病、炎症性肠病、自身免疫性糖尿病、湿疹过敏反应、哮喘、COPD、鼻炎和上呼吸道疾病；角化性疾病诸如常染色体隐性先天性鱼鳞癣(ARCI)；肾病，包括肾小球疾病、慢性肾病(CKD)、肾脏炎症、足细胞丢失、肾小球硬化症、蛋白尿和进行性肾病；心血管疾病，例如心脏肥大、再狭窄、心律失常、动脉粥样硬化；缺血性损伤相关的心肌梗塞、血管损伤、中风和再灌注损伤；血管增生性疾病；眼病，诸如年龄相关性黄斑变性(尤其是湿型年龄相关性黄斑变性)、缺血性增生性视网膜病变(诸如早产儿视网膜病(ROP)和糖尿病性视网膜病)以及血管瘤。
由于他们对MDM2具有亲和力，因此预期所述化合物可以可用于治疗或预防增殖性病症，如癌症。
可以治疗(或抑制)的癌症(及其良性对应疾病)的实例包括但不限于上皮起源的肿瘤(腺瘤和各种类型的癌，包括腺癌、鳞状细胞癌、移行细胞癌和其他癌)，诸如膀胱癌和尿路癌、乳腺癌、胃肠道癌(包括食管癌、胃部(胃)癌、小肠癌、结肠癌、肠癌、结直肠癌、直肠癌和肛门癌)、肝癌(肝细胞癌)、胆囊癌和胆道系统癌、外分泌胰腺癌、肾癌(例如肾细胞癌)、肺癌(例如腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、细支气管肺泡癌和间皮瘤)、头颈癌(例如舌癌、口腔癌、喉癌、咽癌、鼻咽癌、扁桃体癌、唾液腺癌、鼻腔癌和副鼻窦癌)、卵巢癌、输卵管癌、腹膜癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、睾丸癌、宫颈癌、子宫肌层癌、子宫内膜癌、甲状腺癌(例如甲状腺滤泡癌)、脑癌、肾上腺癌、前列腺癌、皮肤和附件癌(例如黑素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、角化棘皮瘤、发育不良痣)；血液恶性肿瘤(即白血病、淋巴瘤)和癌前血液疾病和临界恶性肿瘤疾病，包括血液恶性肿瘤和淋巴谱系的相关病症(例如急性淋巴细胞白血病)[ALL]、慢性淋巴细胞白血病[CLL]、B细胞淋巴瘤例如弥漫性大(B)细胞淋巴瘤[DLBCL]、滤泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和白血病、自然杀伤[NK]细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、意义不明的单克隆丙种球蛋白病、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤和移植后淋巴组织增生性疾病)，以及血液系统恶性肿瘤和髓系相关疾病(例如急性髓性白血病[AML]、慢性髓性白血病[CML]、慢性粒单核细胞白血病[CMML]、嗜酸性粒细胞增多症、骨髓增殖性疾病，例如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化、骨髓增生综合征、骨髓增生异常综合征和早幼粒细胞白血病)；间充质来源的肿瘤，例如软组织、骨或软骨的肉瘤，诸如骨肉瘤、纤维肉瘤、软骨肉瘤、横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、血管肉瘤、卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、尤因肉瘤(Ewing’s sarcoma)、滑膜肉瘤、上皮样肉瘤、胃肠基质肿瘤、良性和恶性组织细胞瘤和隆凸性皮肤纤维肉瘤；中枢或外周神经系统的肿瘤(例如星形细胞瘤(例如神经胶质瘤)、神经瘤和成胶质细胞瘤、脑膜瘤、室管膜瘤、松果体瘤和神经鞘瘤)；内分泌肿瘤(例如垂体肿瘤、肾上腺肿瘤、胰岛细胞肿瘤、甲状旁腺肿瘤、类癌瘤和甲状腺髓样癌)；眼肿瘤和附件肿瘤(例如成视网膜细胞瘤)；生殖细胞和滋养细胞肿瘤(例如畸胎瘤、精原细胞瘤、无性细胞瘤、葡萄胎和绒毛膜癌)；儿科和胚胎肿瘤(例如髓母细胞瘤、成神经细胞瘤、维尔姆氏肿瘤(Wilms tumour)和原始神经外胚层肿瘤)；或使患者对恶性肿瘤敏感的先天性综合征或其他综合征(例如着色性干皮病(Xeroderma Pigmentosum))。
细胞的生长是一种严密控制的功能。癌症是异常细胞生长的一种状况，当细胞以不受控制的方式复制(数量增加)、不受控制地生长(变大)和/或通过细胞凋亡(程序性细胞死亡)、坏死或失巢凋亡而经历减少的细胞死亡时会产生癌症。在一个实施方案中，异常细胞生长选自不受控制的细胞增殖、过度的细胞生长或减少的程序性细胞死亡。具体地，异常细胞生长的病状或疾病是癌症。
因此，在本发明用于治疗包括异常细胞生长(即，不受控制和/或快速的细胞生长)的疾病或病状的药物组合物、用途或方法中，在一个实施方案中，包括异常细胞生长的疾病或病状是癌症。
许多疾病的特征在于持续的和不受调节的血管生成。慢性增殖性疾病通常伴随着严重的血管生成，这可能有助于或维持炎症和/或增殖状态，或其通过血管的侵入性增殖导致组织破坏。已发现肿瘤生长和转移是血管生成依赖性的。因此，用于本发明的化合物可用于预防和破坏肿瘤血管生成的起始。
血管生成通常用于描述新血管生成或血管替代，或新血管形成。这是在胚胎中建立脉管系统必要和生理正常的过程。通常，大多数正常成人组织中不会发生血管生成，除非是在排卵、月经和伤口愈合部位。然而，许多疾病的特征在于持续的和不受调节的血管生成。例如，在关节炎中，新的毛细血管侵入关节并破坏软骨。在糖尿病(以及许多不同的眼病)中，新血管侵入黄斑或视网膜或其他眼部结构，并可能导致失明。动脉粥样硬化的过程与血管生成有关。已发现肿瘤生长和转移是血管生成依赖性的。这些化合物可能有益于治疗诸如癌症和转移、眼部疾病、关节炎和血管瘤等疾病。
因此，本发明的化合物可用于治疗转移和转移性癌。转移或转移性疾病是疾病从一个器官或部分扩散到另一个非相邻器官或部分。可由本发明的化合物治疗的癌症包括原发性肿瘤(即起源部位的癌细胞)、局部侵袭性肿瘤(在局部区域穿透和浸润周围正常组织的癌细胞)和转移性(或继发性)肿瘤，即由恶性细胞形成的肿瘤，恶性细胞通过血流(血液扩散)或经由淋巴管或穿过体腔(经体腔)循环到体内的其他部位和组织。具体地，本发明的化合物可用于治疗转移和转移癌。
在一个实施方案中，血液系统恶性肿瘤是白血病。在另一个实施方案中，血液系统恶性肿瘤是淋巴瘤。在一个实施方案中，癌症是AML。在另一个实施方案中，癌症是CLL。
在一个实施方案中，本发明的化合物用于预防或治疗白血病，如急性或慢性白血病，具体地急性髓系白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)或慢性骨髓性白血病(CML)。在一个实施方案中，本发明的化合物用于预防或治疗淋巴瘤，如急性或慢性淋巴瘤，具体地伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤或弥漫性大B细胞淋巴瘤。
在一个实施方案中，本发明的化合物用于预防或治疗急性骨髓性白血病(AML)或急性淋巴细胞性白血病(ALL)。
在一个实施方案中，本发明使用的化合物用于预防或治疗血液恶性肿瘤(即白血病、淋巴瘤)和恶性前血液疾病和临界恶性肿瘤疾病，包括淋巴谱系的血液恶性肿瘤和相关病状(例如急性淋巴细胞白血病)[ALL]、慢性淋巴细胞白血病[CLL]、B细胞淋巴瘤诸如弥漫性大(B)细胞淋巴瘤[DLBCL]、滤泡性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤和白血病、自然杀伤[NK]细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、意义不明的单克隆丙种球蛋白病、浆细胞瘤、多发性骨髓瘤和移植后淋巴组织增生性病症)，以及髓系血液恶性肿瘤和相关病状(例如急性髓性白血病[AML]、慢性髓性白血病[CML]、慢性骨髓单核细胞性白血病[CMML]、嗜酸性粒细胞增多综合征、骨髓增生性病症(诸如真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和原发性骨髓纤维化)、骨髓增生综合征、骨髓增生异常综合征和早幼粒细胞白血病。
一个实施方案包括本发明的化合物用于预防或治疗选自具有p53野生型或具有MDM2扩增的癌症的亚群的患者的癌症
癌症可以是对用MDM2拮抗剂治疗敏感的癌症。癌症可以是MDM2表达过量的癌症。癌症可以是p53野生型的癌症。
具体的癌症包括具有MDM2扩增和/或MDM2表达过量的那些癌症，例如肝细胞癌、肺癌、肉瘤、骨肉瘤和霍奇金病。
特定的癌症包括具有野生型p53癌症。具体癌症包括具有野生型p53的那些癌细胞，特别是但不绝对的，如果MDM2高表达。
在一个实施方案中，癌症是一种p53功能性肿瘤。在一个实施方案中，这种待治疗的疾病是p53功能性实体和血液恶性肿瘤。在另一个实施方案中，待治疗的患者患有p53突变肿瘤，例如有p53突变肿瘤的AML患者。
在一个实施方案中，癌症是脑肿瘤，例如神经胶质瘤或神经母细胞瘤。
在一个实施方案中，癌症是皮肤癌，例如黑素瘤。
在一个实施方案中，癌症是肺癌，例如NSCLC或间皮瘤。在一个实施方案中，癌症是肺癌，例如间皮瘤。在一个实施方案中，间皮瘤是恶性腹膜间皮瘤或恶性胸膜间皮瘤。
在一个实施方案中，癌症是胃肠道的癌症，例如GIST、胃、结直肠或肠道的癌症。
在一个实施方案中，癌症是骨肉瘤。
在一个实施方案中，癌症是脂肪肉瘤。
在一个实施方案中，癌症是尤因肉瘤。
在一个实施方案中，癌症是脂肪肉瘤、软组织肉瘤、骨肉瘤、食道癌和某些儿科恶性肿瘤，包括B细胞恶性肿瘤。
在一个实施方案中，癌症是结肠直肠、乳腺、肺和脑。
在一个实施方案中，癌症是小儿癌症。
在一个实施方案中，癌症是为p53野生型。
在一个实施方案中，癌症是肺癌，例如NSCLC或间皮瘤、肾癌，例如KIRC或脑癌，例如胶质母细胞瘤。
特定的癌症是否是对MDM2拮抗剂敏感的癌症可以通过题为“诊断方法”的部分中所阐述的方法来确定。
另外的方面提供了化合物用于制备用于治疗如本文所描述的疾病或病状，具体地癌症的药物的用途。
患有范科尼贫血的个体具有增加的发展以下疾病的风险：急性骨髓性白血病(AML)、鳞状细胞癌或头、颈、皮肤、胃肠系统或生殖道的肿瘤。
同源重组缺陷(HRD)在前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌和妇科癌症中增强。因此在一个实施方案中，癌症是前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌或妇科癌症。在一个实施方案中，HRR途径缺陷型(HRD)癌症是前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌或妇科癌症。
MSI-H在结直肠癌、胃癌和妇科癌症中富集。因此在一个实施方案中，癌症是结直肠癌、胃癌和妇科癌症。
某些癌症对用特定药物治疗具有抗性。这可能是由于肿瘤的类型(最常见的上皮恶性肿瘤固有地具有化学抗性，而前列腺对当前可用的化学治疗或放射治疗方案具有相对抗性)，或者随着疾病的进展或作为治疗的结果，抗性可能会自发产生。在这方面，对前列腺的提及包括对抗雄激素治疗，具体地阿比特龙(abiraterone)或恩杂鲁胺(enzalutamide)具有抗性的前列腺或去势抗性前列腺。类似地，对多发性骨髓瘤的提及包括硼替佐米(bortezomib)不敏感的多发性骨髓瘤或难治性多发性骨髓瘤，并且对慢性骨髓性白血病的提及包括伊米替尼(imitanib)不敏感的慢性骨髓性白血病和难治性慢性骨髓性白血病。在这方面，对间皮瘤的提及包括对拓扑异构酶毒剂、烷化剂、抗微管蛋白剂、抗叶酸剂、铂化合物和放射治疗具有抗性的间皮瘤，特别是对顺铂(cisplatin)具有抗性的间皮瘤。
化合物还可以通过使细胞对化学治疗敏感并作为抗转移剂而可用于治疗肿瘤生长、发病原、对化学治疗和放射治疗的抗性。
所有类型的治疗性抗癌干预必然会增加施加在靶肿瘤细胞上的压力。MDM2/p53的拮抗剂代表一类具有以下潜力的化学治疗剂:(i)使恶性细胞对抗癌药物和/或治疗敏感；(ii)减轻或降低对抗癌药物和/或治疗的抗性的发生率；(iii)逆转对抗癌药物和/或治疗的抗性；(iv)加强抗癌药物和/或治疗的活性；(v)延迟或预防对抗癌药物和/或治疗的抗性的发作。
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗由MDM2介导的疾病或病状的化合物。在进一步的实施方案中，由MDM2介导的疾病或病状是以MDM2表达过量和/或活性增加，或MDM2高拷贝数和/或野生型p53为特征的癌症。
另外的方面提供了化合物用于制备用于治疗如本文所描述的疾病或病状，具体地癌症的药物的用途。
在一个实施方案中，提供了一种用于预防或治疗由MDM2/p53介导的疾病或病状的化合物。在一个实施方案中，提供了一种用于抑制MDM2蛋白与p53之间的相互作用的化合物。
在一个实施方案中，提供了包括有效量的至少一种如所定义的化合物的药物组合物。
在一个实施方案中，提供了一种用于预防或治疗癌症的方法，所述方法包括向哺乳动物施用包括至少一种如所定义的化合物的药物的步骤。
药物配方
虽然单独施用活性化合物是可能的，但活性化合物通常以药物组合物(例如，配方)的形式存在。
因此，本发明进一步提供了如上文所定义的药物组合物以及制备药物组合物的方法，所述药物组合物包含(例如，混合)至少一种MDM2拮抗剂，包括一种式(I°)化合物(和如本文所定义的其亚组)，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂和任选地如本文所述的其他治疗剂或预防试剂。
药学上可接受的赋形剂可以选自例如载体(例如，固体、液体或半固体载体)、佐剂、稀释剂、填充剂或膨胀剂、造粒剂、包衣剂、释放控制剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、防腐剂、抗氧化剂、缓冲剂、悬浮剂、增稠剂、调味剂、甜味剂、掩味剂、稳定剂或试剂组合物中常规使用的任何其它赋形剂。下面更详细地阐述了用于各种类型的药物组合物的赋形剂的实施例。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在合理医学判断的范围内适用于与受试者(例如，人类受试者)的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏应答或其它问题或并发症、与合理的益处/风险比相称的化合物、材料、组合物和/或剂型。在与配方的其它成分相容的意义上，每种赋形剂也必须是“可接受的”。
可以根据已知技术调配含有MDM2拮抗剂(包括式(I°)化合物)的药物组合物，参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA,USA。
药物组合物可以呈适于口服、肠胃外、局部、鼻内、支气管内、舌下、眼、耳、直肠、阴道内或经皮施用的任何形式。在组合物旨在用于肠胃外施用时，可以将所述组合物调配用于静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下施用或通过注射、输注或其它递送方式直接递送到靶器官或组织中。可以通过团注、短期输注或长期输注并且可以通过被动递送或通过使用合适的输注泵或注射器驱动器进行递送。
适合肠胃外施用的试剂配方包括水性和非水性无菌注射溶液，所述溶液可以含有抗氧化剂、缓冲剂、杀菌剂、共溶剂、表面活性剂、有机溶剂混合物、环糊精复合剂、乳化剂(用于形成和稳定乳液配方)、用于形成脂质体的脂质体组分、用于形成聚合凝胶的可胶凝聚合物、冻干保护剂以及用于尤其使活性成分以可溶形式稳定并使配方与预期接受者的血液等渗的试剂组合。肠胃外施用的试剂配方也可以采用水性和非水性无菌悬浮液的形式，所述悬浮液可以包括悬浮剂和增稠剂(R.G.Strickly，口服和可注射配方中的增溶赋形剂(Solubilizing Excipientsin oral and injectable formulations)，《试剂研究(Pharmaceutical Research)》,2004年第21(2)卷，第201-230页)。
配方可以存在于单位剂量或多剂量容器，例如密封的安瓿、小瓶和预填充注射器中，并且可以在仅需要在使用前一刻添加无菌液体载体，例如注射用水的冷冻干燥(冻干)条件下储存。在一个实施方案中，配方作为活性药物成分提供在瓶中，以便随后使用适当的稀释剂进行重构。
药物配方可以通过冻干MDM2拮抗剂(包括式(I°)的化合物或其亚组)来进行制备。冻干是指使组合物冷冻干燥的程序。因此，冷冻干燥和冻干在本文中用作同义词。
临时注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒剂和片剂制备。
用于肠胃外注射的本发明药物组合物还可以包括药学上可接受的无菌水性或非水性溶液、分散体、悬浮液或乳液以及用于在使用前重构成无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。合适的水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或媒剂的实施例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、羧甲基纤维素和其合适的混合物、植物油(如葵花籽油、红花油、玉米油或橄榄油)和可注射有机酯，如油酸乙酯。可以例如通过使用如卵磷脂等增稠材料、通过在分散液的情况下维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。
本发明的组合物还可以含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂和分散剂。可以通过包括各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保防止微生物的作用。还可以令人期望的是包括调节张度的试剂，如糖、氯化钠等。通过包括延迟吸收的如单硬脂酸铝和明胶等试剂可以实现可注射试剂形式的延长的吸收。
在本发明的一个典型实施方案中，药物组合物呈适于例如通过注射或输注静脉内施用的形式。对于静脉内施用，溶液可以按原样给药，或可以在施用前注射到输注袋(含有药学上可接受的赋形剂，如0.9％盐水或5％右旋糖)中。
在另一个典型实施方案中，药物组合物呈适于皮下(s.c.)施用的形式。
适于口服施用的药物剂型包括片剂(包衣或未包衣)、胶囊(硬壳或软壳)、囊片、丸剂、锭剂、糖浆、溶液、粉剂、颗粒剂、酏剂和悬浮剂、舌下片剂、薄片或贴剂，如口腔贴片。
因此，片剂组合物可以含有单位剂量的活性化合物以及惰性稀释剂或载体诸如糖或糖醇，例如：乳糖、蔗糖、山梨糖醇或甘露糖醇；非糖来源的稀释剂诸如碳酸钠、磷酸钙、碳酸钙或纤维素或其衍生物诸如微晶纤维素(MCC)、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素和淀粉诸如玉米淀粉。片剂还可以含有标准成分，如粘合剂和造粒剂，如聚乙烯吡咯烷酮、崩解剂(例如，可溶胀交联聚合物，如交联羧甲基纤维素)、润滑剂(例如，硬脂酸盐)、防腐剂(例如，对羟基苯甲酸酯)、抗氧化剂(例如，BHT)、缓冲剂(例如，磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)和泡腾剂，如柠檬酸盐/碳酸氢盐混合物。此类赋形剂是众所周知的，并且无需在此详细讨论。
片剂可以被设计为在与胃液接触时释放药物(速释片剂)或在延长的时间段内或在GI道的特定区域以受控方式释放(控释片剂)。
胶囊配方可以属于硬明胶或软明胶种类，并且可以含有呈固体、半固体或液体形式的活性组分。明胶胶囊可以由动物明胶或其合成的或植物衍生的等同物形成。
固体剂型(例如：片剂、胶囊等)可以是有包衣的或未包衣的。包衣既可以作为保护膜(例如，聚合物、蜡或清漆)，也可以作为用于控制药物释放或用于美学或鉴定目的的机制。包衣(例如，EudragitTM型聚合物)可以被设计为在胃肠道内的期望位置处释放活性组分。因此，包衣可以被选择成以在胃肠道内在某些pH条件下降解，由此在胃中或在回肠、十二指肠、空肠或结肠中选择性地释放化合物。
作为包衣的替代或除包衣之外，试剂可以存在于包括可以适于以受控方式在胃肠道中释放化合物的释放控制剂，例如释放延迟剂的固体基质中。可替代地，药物可以存在于可以适于在胃肠道中在不同酸度或碱度的条件下选择性地释放化合物的聚合物包衣，例如聚甲基丙烯酸酯聚合物包衣中。可替代地，基质材料或缓释包衣可以采用可侵蚀聚合物(例如，马来酸酐聚合物)的形式，在剂型穿过胃肠道时，所述可侵蚀聚合物基本上连续受到侵蚀。在另一个替代方案中，包衣可以设计成在肠道中在微生物作用下崩解。作为进一步的替代方案，活性化合物可以调配在提供对化合物的释放的渗透性控制的递送系统中。渗透性释放和其它延迟释放或持续释放配方(例如，基于离子交换树脂的配方)可以根据本领域技术人员众所周知的方法来制备。
可以将MDM2拮抗剂，包括式(I°)化合物调配成具有载体并以纳米颗粒的形式施用，所述纳米颗粒的增加的表面积有助于所述化合物的吸收。另外，纳米颗粒提供了直接渗透到细胞中的可能性。纳米颗粒药物递送系统在Ram B Gupta和Uday B.Kompella编辑的“用于药物递送的纳米颗粒技术(Nanoparticle Technology for Drug Delivery)”，英富曼卫生保健出版社(Informa Healthcare),ISBN 9781574448573,2006年3月13日出版中进行了描述。用于药物递送的纳米颗粒还在J.Control.Release,2003,91(1-2),167-172以及Sinha等人，Mol.Cancer Ther.8月1日，(2006)5,1909中进行了描述。
药物组合物通常包括大约1％(w/w)到大约95％的活性成分和99％(w/w)到5％(w/w)的药学上可接受的赋形剂或赋形剂的组合。通常，药物组合物包括大约20％(w/w)到大约90％的活性成分和80％(w/w)到10％(w/w)的药学上可接受的赋形剂或赋形剂的组合。药物组合物包含大约1％至大约95％，通常大约20％至大约90％的活性成分。根据本发明的药物组合物可以是例如呈单位剂量形式，诸如呈安瓿、小瓶、栓剂、预填充注射器、糖衣丸、片剂或胶囊的形式。
药学上可接受的赋形剂可以根据配方的期望物理形式来选择，并且可以例如选自稀释剂(例如固体稀释剂，诸如填充剂或膨胀剂；和液体稀释剂，诸如溶剂和共溶剂)、崩解剂、缓冲剂、润滑剂、助流剂、释放控制剂(例如延缓或延迟的聚合物或蜡)、粘合剂、成粒剂、颜料、增塑剂、抗氧化剂、防腐剂、调味剂、掩味剂、张力调节剂和包衣剂。
技术人员将具有选择适当量的成分用于配方的专业知识。例如，片剂和胶囊通常含有0-20％崩解剂、0-5％润滑剂、0-5％助流剂和/或0-99％(w/w)填充剂/或膨胀剂(这取决于试剂剂量)。所述片剂和所述胶囊还可以含有0-10％(w/w)聚合物粘合剂、0-5％(w/w)抗氧化剂、0-5％(w/w)颜料。缓释片剂将另外含有0-99％(w/w)聚合物(这取决于剂量)。片剂或胶囊的薄膜包衣通常含有0-10％(w/w)控释(例如，延迟)聚合物、0-3％(w/w)颜料和/或0-2％(w/w)增塑剂。
肠胃外配方通常含有0-20％(w/w)缓冲剂、0-50％(w/w)助溶剂和/或0-99％(w/w)注射用水(WFI)(这取决于剂量和是否冻干)。用于肌肉内贮库的配方也可以含有0-99％(w/w)油。
用于口服施用的药物组合物可以通过以下来获得：将活性成分与固体载体组合；如果需要的话，将所产生的混合物制粒；并且如果需要或必要的话，在加入适当的赋形剂后将混合物加工成片剂、糖衣丸芯或胶囊。所述药物组合物也可以并入允许活性成分以测得量扩散或释放的聚合物或蜡质基质中。
本发明用于化合物也可以被调配为固体分散体。固体分散体是两种或更多种固体的均匀极细分散相。固溶体(分子分散系统)是一种固体分散体，众所周知其用于制药技术(参见Chiou和Riegelman，《药物科学杂志(J.Pharm.Sci.,60,1281-1300(1971))并且可用于提高溶解速率和提高水溶性差的药物的生物利用度。
本发明还提供了包括本文所描述的固溶体的固体剂型。固体剂型包括片剂、胶囊、咀嚼片和可分散或泡腾片。已知的赋形剂可以与固溶体共混以提供期望的剂型。例如，胶囊可以含有与(a)崩解剂和润滑剂或(b)崩解剂、润滑剂和表面活性剂共混的固溶体。另外，胶囊可以含有膨胀剂，如乳糖或微晶纤维素。片剂可以含有与至少一种崩解剂、润滑剂、表面活性剂、膨胀剂和助滑剂共混的固溶体。咀嚼片可以含有与膨胀剂、润滑剂和如果需要的话，另外的甜味剂(如人造甜味剂)和合适的调味剂共混的固溶体。固溶体也可以通过将药物和合适的聚合物的溶液喷洒到惰性载体，如糖珠(“非粉末(non-pareil)”)的表面上来形成。随后可以将这些珠填充到胶囊中或压制成片剂。
药物配方可以以在单个包装，通常是泡罩包中含有整个治疗过程的“患者包”的形式呈递给患者。与传统处方相比，患者包具有优点，在所述传统处方中，试剂师将患者的药物供应与散装供应分开，因为患者始终可以获得患者包中所含有的包装说明书，而所述包装说明书通常在患者处方中缺失。已经示出包括包装说明书可提高患者对医师的指示的依从性。
用于局部使用和鼻腔递送的组合物包括软膏、乳膏、喷雾剂、贴剂、凝胶、液滴和插入物(例如，眼内插入物)。此类组合物可以根据已知方法调配。
用于直肠或阴道内施用的配方的实施例包括子宫托和栓剂，它们可以例如由含有活性化合物的成型的可模压或蜡型材料形成。活性化合物的溶液也可以用于直肠施用。
用于通过吸入施用的组合物可以采用可吸入粉末组合物或液体或粉末喷雾剂的形式，并且可以使用粉末吸入器装置或气雾剂分配装置以标准形式施用。此类装置是众所周知的。对于通过吸入施用，粉末配方通常包括活性化合物以及惰性固体粉末稀释剂，如乳糖。
MDM2拮抗剂，包括式(I°)的化合物将通常以单位剂型呈现，并且因此通常会含有足够的化合物以提供期望水平的生物活性。例如，配方可以含有1纳克到2克活性成分，例如，1纳克到2毫克活性成分。在这些范围内，化合物的特定子范围是0.1毫克到2克活性成分(更通常的是10毫克到1克，例如50毫克到500毫克)，或1微克到20毫克(例如1微克到10毫克，例如0.1毫克到2毫克活性成分)。
对于口服组合物，单位剂型可以含有1毫克到2克，更通常地10毫克到1克，例如50毫克到1克，例如100毫克到1克活性化合物。
活性化合物将以足以实现期望治疗效果的量施用于有需要的患者(例如，人类或动物患者)。
与其他抗癌剂的组合
如本文所定义的MDM2拮抗剂可用于预防或治疗由MDM2/p53介导的一系列疾病状态或病状。此类疾病状态和病状的实施例在上文中进行了阐述。
化合物通常施用于需要此种施用的受试者，例如人类或动物患者，通常是人类。
化合物将通常以治疗或预防有用且通常无毒的量施用。然而，在某些情形下(例如在危及生命的疾病的情况下)，施用本发明使用的化合物(例如式(I°)化合物)的益处可能超过任何毒性作用或副作用的缺点，在这种情况下，可认为施用带有一定程度毒性量的化合物是可取的。
化合物可以在延长的时期内施用以维持有益的治疗效果，或者可以仅施用持续较短时间段。可替代地，所述化合物可以以连续方式或以提供间歇给药的方式(例如，脉动方式)施用。
MDM2拮抗剂的典型日剂量可以在每千克体重100皮克至100毫克的范围内，更典型地为每千克体重5纳克到25毫克，且更通常地为每千克体重10纳克到15毫克(例如每千克10纳克至10毫克，且更典型地为每千克1微克至每千克20毫克，例如每千克1微克至10毫克)，但是在需要时可以施用更高或更低的剂量。式(I°)的化合物可以每天施用或例如每2、或3、或4、或5、或6、或7、或10或14、或21、或28天重复施用。
剂量也可以表示为相对于患者体表面积施用的药物量(mg/m2)。MDM2拮抗剂的典型日剂量可以在3700pg/m2至3700mg/m2的范围内，更典型地为185ng/m2至925mg/m2，且更通常地为370ng/m2至555mg/m2(例如，370ng/m2至370mg/m2，更典型地37mg/m2至740mg/m2，例如37mg/m2至370mg/m2)，但是在需要时可以施用更高或更低的剂量。式(I°)的化合物可以每天施用或例如每2、或3、或4、或5、或6、或7、或10或14、或21、或28天重复施用。
本发明的化合物可以按一系列剂量口服施用，例如，0.1mg至5000mg，或1mg至1500mg、2mg至800mg或5mg至500mg，例如，2mg至200mg或10mg至1000mg，剂量的具体实例包括10mg、20mg、50mg和80mg。该化合物可以每天施用一次或多于一次。该化合物可以连续给药(即在治疗方案的持续期间每天服用不间断)。或者，化合物可以间歇给药(在连续服用一段给定时间如一周，然后停药一段时间如一周，然后再连续服用一段时间如一周，在整个治疗期间方案如此类推)。牵涉间歇性施用的治疗方案的实例包括以下述周期施用的方案：一周施用、一周不施用或两周施用、一周不施用；或三周施用、一周不施用；或两周施用、两周不施用；或四周施用、两周不施用；或一周施用、三周不施用—持续一个或多个周期，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个周期。这种不连续的治疗也可以基于天数而不是一整周。例如，治疗可以包括每日给药持续1至6天，不给药持续1至6天，在治疗方案期间重复这种模式。未给药本发明所用化合物的天数(或周数)不一定必须等于给药本发明所用化合物的天数(或周数)。
在一个实施方案中，本发明使用的化合物可以每天3mg/m2至125mg/m2的量施用。治疗可以采用连续的每日给药或更通常由治疗中断隔开的多个治疗周期组成。单个治疗周期的一个实施例是连续5次每日给药，随后3周不进行治疗。
一种特定的给药方案是每天一次(例如口服)，持续一周(例如治疗5天)，然后有1、2或3周的治疗中断。一种替代给药方案是每周一次(例如口服)，持续1、2、3或4周。
在一个特定的给药方案中，将向患者输注式(I°)的化合物，每天一小时，持续最多十天，尤其是一周最多五天，并且治疗以期望的间隔(诸如两到四周)重复，尤其是每三周一次。
更具体地，患者可以每天输注式(I°)化合物一小时，持续5天，并且每三周重复一次治疗。
在另一个特定的给药方案中，给予患者输注30分钟至1小时的，随后进行维持输注，输注时间可变，例如1至5小时，例如3小时。
本发明中使用的化合物也可以通过推注或连续输注给药。在治疗周期中，本发明中使用的化合物可以每日给药至每周一次、或每两周一次、或每三周一次、或每四周一次给予。如果在治疗周期期间每天施用，则这种每日给药可以在治疗周期中的数周内中断：例如，一周给药(或数天)，然后一周(或数天)不给药，该模式在治疗周期期间重复。
在进一步的具体的给药方案中，给予患者12小时至5天的连续输注，特别地24小时至72小时的连续输注。
最后，然而所施用的化合物的量和所使用的组合物的类型要与所治疗的疾病或生理条件的性质相称，并且由医师判断。
将本发明的化合物作为单用试剂，或将本发明的化合物组合通过不同机制起作用以调节细胞生长的另一种试剂，来治疗癌症发展的两个特性特征，可能是可获益的。可以进行组合实验，例如，如Chou TC,Talalay P.Quantitative analysis of dose-effectrelationships:the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors.AdvEnzyme Regulat 1984；22:27-55中所述。
如本文所定义的化合物可以作为唯一的治疗剂施用，或者所述化合物可以以与用于治疗特定的疾病状态，例如肿瘤性疾病，如上文所定义的癌症的一种或多种其它化合物(或治疗)的组合治疗施用。为了治疗上述病状，在癌症治疗中本发明的化合物可以有利地与一种或多种其它试剂组合，更具体地与其它抗癌试剂或辅助试剂(治疗中的支持性试剂)。可以与MDM2拮抗剂一起(无论是否同时施用或以不同的时间间隔施用)施用的其它治疗试剂或治疗的实施例，包括但不限于：
·拓扑异构酶I抑制剂
·抗代谢物
·微管蛋白靶向试剂
·DNA结合剂和拓扑异构酶II抑制剂
·烷化剂
·单克隆抗体
·抗激素
·信号转导抑制剂
·蛋白酶体抑制剂
·DNA甲基转移酶抑制剂
·细胞因子和维甲酸
·染色质靶向治疗
·放射治疗，和
·其他治疗剂或预防剂
抗癌试剂或辅助试剂(或其盐)的具体实施例包括但不限于选自以下组(i)-(xlviii)任选地组(xlix)中的任何试剂：
(i)铂化合物，例如顺铂(任选与氨磷汀组合)、卡铂或奥沙利铂；
(ii)紫杉烷化合物，例如紫杉醇、紫杉醇蛋白结合颗粒(AbraxaneTM)、多西他赛、卡巴他赛或拉罗他赛；
(iii)拓扑异构酶I抑制剂，例如喜树碱化合物，例如喜树碱、伊立替康(CPT11)、SN-38或拓扑替康；
(iv)拓扑异构酶II抑制剂，例如抗肿瘤表鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物，例如依托泊苷或替尼泊苷；
(v)长春花生物碱，例如长春碱、长春新碱、脂质体长春新碱(Onco-TCS)、长春瑞滨、长春地辛、长春氟宁或vinvesir；
(vi)核苷衍生物，例如5-氟尿嘧啶(5-FU，任选与亚叶酸组合)、吉西他滨、卡培他滨、替加氟、UFT、S1、克拉屈滨、阿糖胞苷(Ara-C，阿糖胞苷)、氟达拉滨、氯法拉滨或奈拉滨；
(vii)抗代谢物，例如氯法拉滨、氨基蝶呤(aminopterin)或甲氨蝶呤(methotrexate)、阿扎胞苷(azacitidine)、阿糖胞苷、氟尿苷(floxuridine)、喷司他丁(pentostatin)、硫鸟嘌呤、硫嘌呤、6-巯基嘌呤或羟基脲(羟基尿素)；
(viii)烷化剂，诸如氮芥或亚硝基脲，例如环磷酰胺、苯丁酸氮芥、卡莫司汀(BCNU)、苯达莫司汀、噻替帕、美法仑、曲硫丹、洛莫司汀(CCNU)、阿曲他明、白消安、达卡巴嗪、雌莫司汀、氟莫司汀、异环磷酰胺(任选与美司钠组合)、哌泊溴曼、丙卡巴肼、链脲佐菌素、替莫唑胺、尿嘧啶、甲氯乙胺、甲基环己基氯乙基亚硝基脲或尼莫司汀(ACNU)；
(ix)蒽环类、蒽二酮类和相关药物，例如柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)(任选地与右雷佐生(dexraz氧杂e)组合)、多柔比星的脂质体配方(例如，CaelyxTM、MyocetTM、DoxilTM)、伊达比星(idarubicin)、米托蒽醌(mit氧杂trone)、表柔比星(epirubicin)、安吖啶(amsacrine)或戊柔比星(valrubicin)；
(x)埃坡霉素，例如伊沙匹隆(ixabepilone)、帕土匹龙(patupilone)、BMS-310705、KOS-862和ZK-EPO，埃坡霉素A、埃坡霉素B、脱氧埃坡霉素B(也被称为埃坡霉素D或KOS-862)、氮杂埃坡霉素B(也被称为BMS-247550)、奥立马利(aulimalide)、异奥立马利(isolaulimalide)或吕瑟罗宾(luetherobin)；
(xi)DNA甲基转移酶抑制剂，例如替莫唑胺、氮杂胞苷或地西他滨；(xii)抗叶酸剂，例如甲氨蝶呤、培美曲塞二钠或雷替曲塞；
(xiii)细胞毒性抗生素，例如抗霉素D、博来霉素、丝裂霉素C、放线菌素、胭脂红霉素、道诺霉素、左旋咪唑、普卡霉素或光神霉素；
(xiv)微管蛋白结合剂，例如考布他汀(combrestatin)、秋水仙碱(colchicine)或诺考达唑(nocodazole)；
(xv)信号转导抑制剂，诸如激酶抑制剂，例如受体酪氨酸激酶抑制剂(例如EGFR(上皮生长因子受体)抑制剂、VEGFR(血管内皮生长因子受体)抑制剂、PDGFR(血小板源性生长因子受体)抑制剂、Axl抑制剂、MTKI(多靶点激酶抑制剂)、Raf抑制剂、ROCK抑制剂、mTOR抑制剂、MEK抑制剂或PI3K抑制剂)，例如甲磺酸伊马替尼、厄洛替尼、吉非替尼、达沙替尼、拉帕替尼、多沃替尼、阿西替尼、尼罗替尼、凡德他尼、瓦他利尼、帕唑帕尼、索拉非尼、舒尼替尼、西罗莫司、依维莫司(RAD 001)、威罗非尼(PLX4032或RG7204)、达拉非尼、恩科拉非尼、司美替尼(AZD6244)、曲美替尼(GSK121120212)、达托利塞(dactolisib)(BEZ235)、布帕尼西(buparlisib)(BKM-120；NVP-BKM-120)、BYL719、库潘利塞(copanlisib)(BAY-80-6946)、ZSTK-474、CUDC-907、阿哌利塞(apitolisib)(GDC-0980；RG-7422)、皮克利塞(pictilisib)(皮克特昔布(pictrelisib)，GDC-0941，RG-7321)、GDC-0032、GDC-0068、GSK-2636771、艾代拉里斯(idelalisib)(原名CAL-101、GS1101、GS-1101)、MLN1117(INK1117)、MLN0128(INK128)、IPI-145(INK1197)、LY-3023414、帕他色替(ipatasertib)、阿氟色替(afuresertib)、MK-2206、MK-8156、LY-3023414、LY294002、SF1126或PI-103、索诺利塞(sonolisib)(PX-866)或AT13148。
(xvi)极光激酶抑制剂，例如AT9283、巴拉塞替(barasertib)(AZD1152)、TAK-901、MK0457(VX680)、申尼塞替(cenisertib)(R-763)、达努塞替(danusertib)(PHA-739358)、阿立塞替(alisertib)(MLN-8237)或MP-470；
(xvii)CDK抑制剂，例如AT7519、劳斯考文汀(roscovitine)、塞利西利(seliciclib)、阿洛西迪布(alvocidib)(夫拉平度(flavopiridol))、地那昔利布(dinaciclib)(SCH-727965)、7-羟基星形孢菌素(UCN-01)、JNJ-7706621、BMS-387032(又名SNS-032)、PHA533533、ZK-304709或AZD-5438，包括CDK4抑制剂，如帕博西尼(palbociclib)(PD332991)和瑞博西利布(ribociclib)(LEE-011)；
(xviii)PKA/B抑制剂和PKB(akt)途径抑制剂，例如AT13148、AZ-5363、Semaphore、SF1126和MTOR抑制剂，例如雷帕霉素类似物、AP23841和AP23573、钙调蛋白抑制剂(叉头易位抑制剂)、API-2/TCN(曲克立宾)、RX-0201、恩扎妥林HCl(LY317615)、NL-71-101、SR-13668、PX-316或KRX-0401(哌立福新/NSC 639966)；
(xix)Hsp90抑制剂，例如欧娜莱斯布(onalespib)(AT13387)、除莠霉素(herbimycin)、格尔德霉素(herbimycin)(GA)、17-烯丙氨基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-AAG)，例如NSC-330507、Kos-953和CNF-1010、17-二甲氨基乙基氢氯化物-17-去甲氧基格尔德霉素盐酸盐(17-DMAG)，例如NSC-707545和Kos-1022、NVP-AUY922(VER-52296)、NVP-BEP800、CNF-2024(BIIB-021，口服嘌呤)、甘乃特斯皮布(ganetespib)(STA-9090)、SNX-5422(SC-102112)或IPI-504；
(xx)单克隆抗体(未偶联或偶联放射性同位素、毒素或其他试剂)、抗体衍生物和相关试剂，例如抗CD、抗VEGFR、抗HER2或抗EGFR抗体，例如利妥昔单抗(CD20)、奥法木单抗(CD20)、替伊莫单抗(CD20)、GA101(CD20)、托西莫单抗(CD20)、依帕珠单抗(CD22)、林妥珠单抗(CD33)、吉妥单抗(CD33)、阿仑单抗(CD52)、加利昔单抗(CD80)、曲妥珠单抗(HER2抗体)、帕妥珠单抗(HER2)、曲妥珠单抗-DM1(HER2)、厄妥索单抗(HER2和CD3)、西妥昔单抗(EGFR)、帕尼单抗(EGFR)、耐昔妥珠单抗(EGFR)、尼妥珠单抗(EGFR)、贝伐珠单抗(VEGF)、卡妥索单抗(EpCAM和CD3)、阿巴伏单抗(CA125)、法妥组单抗(叶酸受体)、依托珠单抗(CS1)、地诺单抗(RANK配体)、芬妥木单抗(IGF1R)、CP751、871(IGF1R)、马帕木单抗(TRAIL受体)、metMAB(met)、米妥莫单抗(GD3神经节苷脂))、萘妥昔单抗(埃托-那普妥莫单抗)(5T4)或西妥昔单抗(IL6)或免疫调节剂，例如CTLA-4阻断抗体和/或针对PD-1和PD-L1和/或PD-L2的抗体，例如，伊匹木单抗(CTLA4)、MK-3475(派姆单抗，以前称为Lambrolizumab，抗-PD-1)、纳武单抗(一种抗-PD-1)、BMS-936559(抗-PD-L1)、MPDL320A、AMP-514或MEDI4736(抗-PD-L1)、或曲美木单抗(tremelimumab)(原名替西木单抗(ticilimumab)、CP-675,206、抗-CTLA-4)；
(xxi)雌激素受体拮抗剂或选择性雌激素受体调节剂(SERM)或雌激素合成抑制剂，例如他莫昔芬(tamoxifen)、氟维司群(fulvestrant)、托瑞米芬(toremifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、法洛德(faslodex)或雷洛昔芬(raloxifene)；
(xxii)芳香酶抑制剂及相关药物，如依西美坦、阿那曲唑、来曲唑、睾内酯氨基谷氨酰胺、米托坦或伏罗唑；
(xxiii)抗雄激素(即，雄激素受体拮抗剂)和相关试剂，例如比卡鲁胺(bicalutamide)、尼鲁他胺(nilutamide)、氟他胺(flutamide)、环丙孕酮(cyproterone)或酮康唑(ketoconazole)；
(xxiv)激素和其类似物，如甲羟孕酮(medroxyprogesterone)、己烯雌酚(diethylstilbestrol)(又名乙芪酚)或奥曲肽(octreotide)；
(xxv)类固醇，例如丙酸屈莫他酮(dromostanolone propionate)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)、诺龙(nandrolone)(癸酸酯、苯丙酸酯)、氟甲雌酮(fluoxymestrone)或棉酚(gossypol)；
(xxvi)甾体细胞色素P450 17α-羟化酶-17,20-裂解酶抑制剂(CYP17)，例如阿比特龙(abiraterone)；
(xxvii)促性腺激素释放激素激动剂或拮抗剂(GnRA)，例如阿巴瑞克(abarelix)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸组瑞林(histrelin acetate)、醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)、曲普瑞林(triptorelin)、布舍瑞林(buserelin)或地洛瑞林(deslorelin)；
(xxviii)糖皮质激素，例如泼尼松(prednisone)、泼尼松龙(prednisolone)或地塞米松(dexamethasone)；
(xxix)分化剂，诸如类视黄醇(retinoids)、类维甲酸(rexinoids)、维生素D(vitamin D)或视黄酸(retinoic acid)和视黄酸代谢阻断剂(RAMBA)，例如维甲酸(accutane)、阿利维甲酸(alitretinoin)、贝沙罗汀(bexarotene)或维甲酸(tretinoin)；
(xxx)法呢基转移酶抑制剂，例如替比法尼(tipifarnib)；
(xxxi)染色质靶向治疗，如组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂，例如丁酸钠、辛二酰苯胺异羟酰胺酸(SAHA)、缩酚酸肽(FR 901228)、达西司他(dacinostat)(NVP-LAQ824)、R306465/JNJ-16241199、JNJ-26481585、曲古菌素A(trichostatin A)、伏立诺他(vorinostat)、衣原体(Chlamydocin)、A-173、JNJ-MGCD-0103、PXD-101或制蚜菌素(apicidin)；
(xxxii)靶向泛素-蛋白酶体途径的药物，包括蛋白酶体抑制剂，例如硼替佐米(bortezomib)、卡非佐米(carfilzomib)、CEP-18770、MLN-9708或ONX-0912；NEDD8抑制剂；HDM2拮抗剂和去泛素化酶(DUB)；
(xxxiii)光动力学药物，例如卟啉钠(porfimer sodium)或替莫泊芬(temoporfin)；
(xxxiv)海洋生物衍生的抗癌剂，诸如曲布替丁(trabectidin)；
(xxxv)用于放射免疫疗法的放射性特征药物，例如使用β粒子发射同位素(例如，碘-131、钇-90)或α粒子发射同位素(例如，铋-213或锕-225)，例如替伊莫单抗(ibritumomab)或碘托西莫单抗(Iodine tositumomab)或α镭223；
(xxxvi)端粒酶抑制剂，例如端粒抑素；
(xxxvii)基质金属蛋白酶抑制剂，例如巴蒂马斯塔(batimastat)、马里马司他(marimastat)、百武斯德他(prinostat)或酶特斯他(metastat)；
(xxxviii)重组干扰素(如干扰素-γ和干扰素α)和白介素(例如，白介素2)，例如阿地白介素(aldesleukin)、地尼白介素(denileukin diftitox)、干扰素α2a、干扰素α2b或聚乙二醇干扰素α2b；
(xxxix)选择性免疫反应调节剂，例如里多巴胺(thalidomide)或来那多胺(lenalidomide)；
(xl)治疗性疫苗，诸如sipuleucel-T(Provenge)或OncoVex；
(xli)细胞因子激活剂，包括哌替巴尼(picibanil)、罗默肽(romurtide)、西佐非仑(sizofiran)、病毒素(virulizin)或胸腺素(thymosin)；
(xlii)三氧化二砷；
(xliii)G-蛋白偶联受体(GPCR)抑制剂，例如阿曲生坦(atrasentan)；
(xliv)酶，诸如L-天冬酰胺酶、培门冬酶、拉布立酶或培加酶；
(xlv)DNA修复抑制剂，诸如PARP抑制剂，例如奥拉帕尼(olaparib)、维拉帕尼(velaparib)、伊尼帕尼(iniparib)、INO-1001、AG-014699或ONO-2231；
(xlvi)死亡受体激动剂(例如，TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)受体)，如马帕姆单抗(mapatumumab)(原名HGS-ETR1)、康珠单抗(conatumumab)(原名AMG 655)、PRO95780、来沙木单抗(lexatumumab)、度拉纳明(dulanermin)、CS-1008、阿陂马单抗(apomab)或重组TRAIL配体，如重组人TRAIL/Apo2配体；
(xlvii)免疫疗法，诸如免疫检查点抑制剂；癌症疫苗和CAR-T细胞疗法；
(xlviii)细胞死亡(凋亡)调节剂，包括Bcl-2(B细胞淋巴瘤2)拮抗剂，诸如维奈托克试剂(venetoclax)(ABT-199或GDC-0199)、ABT-737、ABT-263、TW-37、沙布托克(sabutoclax)、奥布托克(obatoclax)及MIM1和IAP拮抗剂，包括LCL-161(Novartis)、Debio-1143(Debiopharma/Ascenta)、AZD5582、比瑞 那 帕 (Birinapant)/TL-32711(TetraLogic) 、CUDC-427/GDC-0917/RG-7459(Genentech) 、 JP1201(Joyant) 、T-3256336(Takeda) 、 GDC-0152(Genentech) 或HGS-1029/AEG-40826(HGS/Aegera)；
(xlix)预防剂(辅助剂)；即减少或缓解与化学治疗剂相关的一些副作用的试剂，例如
-止吐剂；
-防止或缩短化学治疗相关的中性粒细胞减少症持续时间并防止因血小板、红细胞或白细胞水平降低而引起的并发症的试剂，例如白介素-11(例如奥普瑞白介素)、促红细胞生成素(EPO)及其类似物(如达贝泊汀α)、集落刺激因子类似物，诸如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)(例如，沙格司亭(sargramostim))和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)及其类似物(例如，斐格司汀(filgrastim)、聚乙二醇斐格司汀(pegfilgrastim))，
-抑制骨吸收的试剂，诸如狄诺塞麦(denosumab)或双膦酸盐，例如唑来膦酸盐(zoledronate)、唑来膦酸(zoledronic acid)、帕米膦酸盐(pamidronate)或伊班膦酸盐(ibandronate)；
-抑制炎性反应的试剂，诸如地塞米松、泼尼松或泼尼松龙；
-用于降低患有肢端肥大症或其他罕见激素产生肿瘤的患者的生长激素和IGF-I(和其他激素)的血液水平的试剂，诸如激素生长抑素激素的合成形式，例如醋酸奥曲肽(octreotide acetate)；
-降低叶酸水平的药物的解毒剂，诸如甲酰四氢叶酸(leucovorin)或亚叶酸(folinic acid)；
-止痛剂，例如阿片类，如吗啡(morphine)、二吗啡(diamorphine)和芬太尼(fentanyl)；
-非甾体抗炎药(NSAID)，如COX-2抑制剂，例如塞来昔布(celecoxib)、依托考昔(etoricoxib)和罗美昔布(lumiracoxib)；
-用于粘膜炎的试剂，例如帕利夫明(palifermin)；
-用于治疗副作用，包括厌食、恶病质、水肿或血栓栓塞发作的试剂，如醋酸甲地孕酮。
在一个实施方案中，本发明的生物标志物可用于选择用MDM2拮抗剂与上述(i)-(xlix)组合治疗的患者。在一个实施方案中，本发明的生物标志物可用于选择用MDM2拮抗剂与以下组合治疗的患者：重组干扰素；DNA修复抑制剂诸如PARP抑制剂；IAP拮抗剂；铂化合物；烷化剂；和/或放射治疗。
在一个实施方案中，由于存在正常或高水平的DDR途径基因或基因产物，确定患者的肿瘤不适合用单一试剂MDM2抑制剂治疗，因此患者可以用MDM2抑制剂与可用于引起肿瘤对MDM2拮抗剂敏感性的附加试剂组合治疗。在一个实施方案中，确定患者的肿瘤为ATM、ATRX、BRCA1和/或BRCA2正常或高和/或MSI正常或低，并且用MDM2拮抗剂与附加抗癌剂组合治疗。在一个实施方案中，确定患者的肿瘤具有野生型ATM、ATRX、BRCA1和/或BRCA2和/或正常水平或高水平的ATM、ATRX、BRCA1和/或BRCA2基因表达，并用MDM2拮抗剂与上述(i)-(xlix)中所列的一种或多种试剂组合治疗。
在一个实施方案中，本发明的生物标志物可用于选择用MDM2拮抗剂与上述(i)-(xlix)中列出的一种或多种试剂组合治疗的患者。
在一个实施方案中，本发明的生物标志物可用于选择用MDM2拮抗剂与DNA损伤剂诸如化学治疗和放射治疗组合治疗的患者。
在一个实施方案中，本发明的生物标志物可用于选择用MDM2拮抗剂与免疫检查点抑制剂组合治疗MSI-H肿瘤的患者。
在一个实施方案中，本发明的生物标志物可用于选择患者用MDM2拮抗剂与重组干扰素(诸如干扰素-γ和干扰素α)和白介素(例如白介素2)，例如阿地白介素、地尼白介素、干扰素α2a、干扰素α2b或聚乙二醇干扰素α2b组合进行治疗。在一个实施方案中，确定患者的肿瘤具有正常或高水平的DDR途径基因或基因产物，并用MDM2拮抗剂与一种或多种重组干扰素组合治疗。
在一个实施方案中，本发明的生物标志物可用于选择用MDM2拮抗剂与DNA修复抑制剂(诸如PARP抑制剂)，例如奥拉帕尼、维拉帕尼、伊尼帕尼、INO-1001、AG-014699或ONO-2231组合治疗的患者。在一个实施方案中，PARP抑制剂选自PARP抑制剂例如奥拉帕尼、卢卡帕尼(rucaparib)、维利帕尼(veliparib)、伊尼帕尼、INO-1001、AG-014699、ONO-2231；或他拉唑帕尼(talazoparib)。在一个实施方案中，确定患者的肿瘤具有正常或高水平的DDR途径基因或基因产物，并用MDM2拮抗剂与PARP抑制剂组合治疗。在一个实施方案中，PARPi是尼拉帕尼(niraparib)、奥拉帕尼、卢卡帕尼、维利帕尼、伊尼帕尼、INO-1001、AG-014699、ONO-2231；或他拉唑帕尼。在一个实施方案中，PARPi是尼拉帕尼、奥拉帕尼、卢卡帕尼或他拉唑帕尼。在一个实施方案中，PARPi是奥拉帕尼。在一个实施方案中，PARPi是他拉唑帕尼。在一个实施方案中，PARPi是斯坦帕尼(stenoparib)或帕米帕尼(pamiparib)。
在一个实施方案中，本发明的生物标志物可用于选择用MDM2拮抗剂与IAP拮抗剂组合治疗的患者，所述IAP拮抗剂包括LCL-161(Novartis)、Debio-1143(塞维那帕(xevinapant))(Debiopharma/Ascenta)、AZD5582、比瑞那帕/TL-32711(TetraLogic)、CUDC-427/GDC-0917/RG-7459(Genentech)、JP1201(Joyant)、T-3256336(Takeda)、GDC-0152(Genenteh)或HGS-1029/AEG-40826(HGS/Aegera)。在一个实施方案中，IAP拮抗剂例如选自LCL-161(Novartis)、Debio-1143(Debiopharma/Ascenta)(xevinapant)、AZD5582、比瑞那帕/TL-32711(TetraLogic)、CUDC-427/GDC-0917/RG-7459(Genentech)、JP1201(Joyant)、T-3256336(Takeda)、GDC-0152(Genentech)、ASTX660(托林那帕(tolinapant))和HGS-1029/AEG-40826(HGS/Aegera)、Debio-4028和Ascentage IAP抑制剂APG-1387。在一个实施方案中，确定患者的肿瘤具有正常或高水平的DDR途径基因或基因产物，并用MDM2拮抗剂与IAP拮抗剂组合治疗。
在一个实施方案中，本发明的生物标志物可用于选择用MDM2拮抗剂与以下组合治疗的患者：铂化合物，例如顺铂(任选地与氨磷汀组合)、卡铂或奥沙利铂；烷化剂，例如氮芥或亚硝基脲，例如环磷酰胺、苯丁酸氮芥、卡莫司汀(BCNU)、苯达莫司汀、噻替帕、美法仑、曲硫丹、洛莫司汀(CCNU)、阿曲他明、白消安、达卡巴嗪、雌莫司汀、氟莫司汀、异环磷酰胺(任选与美司钠组合)、哌泊溴曼、丙卡巴肼、链脲佐菌素、替莫唑胺、尿嘧啶、甲氯乙胺、甲基环己基氯乙基亚硝基脲或尼莫司汀(ACNU)；和/或放射治疗。在一个实施方案中，铂化合物选自，例如顺铂(任选地与氨磷汀(amifostine)组合)、卡铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、双环铂(dicycloplatin)、七铂(heptaplatin)、洛铂(lobaplatin)、奈达铂(nedaplatin)、沙铂(satraplatin)或四硝酸三铂(triplatin tetranitrate)，具体地顺铂、卡铂或奥沙利铂；在一个实施方案中，烷化剂，例如氮芥或亚硝基脲，选自例如环磷酰胺、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、卡莫司汀(chlorambucil)(BCNU)、氨莫司汀(ambamustine)、苯达莫司汀(bendamustine)、噻替哌(thiotepa)、美法仑(melphalan)、苏消安(treosulfan)、洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、白消安(busulfan)、达卡巴嗪(dacarbazine)、雌莫司汀(estramustine)、福莫司汀(fotemustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)(任选地与美司钠(mesna)组合)、哌柏溴烷(pipobroman)、丙卡巴肼(procarbazine)、链脲佐菌素(streptozocin)、替莫唑胺(temozolomide)、尿嘧啶(uracil)、甲氯乙胺(mechlorethamine)、盐酸甲氯乙胺(mechlorethamine oxidehydrochloride)、甲基环己基氯乙基亚硝基脲(methylcyclothexylchloroethylnitrosurea)、尼莫司汀(nimustine)(ACNU)、泼尼莫司汀(prednimustine)、甲氯乙胺(metclorethamine)、依托糖苷(etoglucid)；链脲佐菌素(streptozotocin)、伊洛福芬(irofulven)、二溴卫矛醇(mitolactol)、葡磷酰胺(glufosfamide)、依磷环磷酰胺(evofosfamide)、乙烯亚胺或甲基三聚氰胺(triethylenemelamine)，包括六甲三聚氰胺(altretamine)、三亚乙基三聚氰胺(triethylenemelamine)、三羟甲基三聚氰胺(trimethylolomelamine)、三亚乙基磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)或三羟甲基三聚氰胺(trimemylolomelamine)。在一个实施方案中，确定患者的肿瘤具有正常或高水平的DDR途径基因或基因产物，并用MDM2拮抗剂与放射治疗组合治疗。
在一个实施方案中，确定患者的肿瘤具有正常或高水平的DDR途径基因或基因产物，并用MDM2拮抗剂与DNA损伤剂诸如化学治疗和/或放射治疗组合治疗。
在一个实施方案中，确定患者的肿瘤具有正常或高水平的DDR途径基因或基因产物，并用MDM2拮抗剂与免疫检查点抑制剂组合治疗，所述免疫检查点抑制剂诸如CTLA-4阻断抗体和/或针对PD-1和PD-L1和/或PDL2的抗体，例如易普利姆玛(CTLA4)、MK-3475(派姆单抗(pembrolizumab)，原名兰伯利珠单抗(lambrolizumab)，抗PD-1)、纳武单抗(nivolumab)(抗PD-1)、BMS-936559(抗PD-L1)、MPDL320A、AMP-514或MEDI4736(抗PD-L1)或曲美木单抗(原名替西木单抗、CP-675,206、抗CTLA-4)；-任选地用于治疗MSI-H肿瘤，该肿瘤可通过微卫星不稳定性(MSI)测试鉴定。
在另一个实施方案中，提供了一种治疗患者癌症的方法，其中所述方法包括选定一个患者的步骤：
(a)在从所述患者获得的生物样品中具有正常或高水平的DDR生物标志物；并且并且
(b)向步骤(a)中选择的所述患者施用治疗有效量的MDM2拮抗剂和例如通过降低DDR生物标志物的水平来诱导对MDM2拮抗剂的敏感性的试剂。
在一个实施方案中，降低DDR生物标志物水平的试剂或治疗是抗癌剂或抗癌治疗。在一个实施方案中，降低DDR生物标志物水平的试剂或治疗是重组干扰素(诸如干扰素-γ和干扰素α)和白介素(例如白介素2)，例如阿地白介素、地尼白介素、干扰素α2a、干扰素α2b或聚乙二醇干扰素α2b，或DNA修复抑制剂，诸如PARP抑制剂，或IAP拮抗剂或铂化合物，例如顺铂(任选地与氨磷汀组合)、卡铂或奥沙利铂；烷化剂，例如氮芥或亚硝基脲，例如环磷酰胺、苯丁酸氮芥、卡莫司汀(BCNU)、苯达莫司汀、噻替帕、美法仑、曲硫丹、洛莫司汀(CCNU)、阿曲他明、白消安、达卡巴嗪、雌莫司汀、氟莫司汀、异环磷酰胺(任选与美司钠组合)、哌泊溴曼、丙卡巴肼、链脲佐菌素、替莫唑胺、尿嘧啶、甲氯乙胺、甲基环己基氯乙基亚硝基脲或尼莫司汀(ACNU)；和/或放射治疗。
在一个实施方案中，诱导敏感性的试剂或治疗是重组干扰素和白介素、DNA修复抑制剂、IAP拮抗剂或铂化合物。在一个实施方案中，诱导敏感性的试剂或治疗是IAP拮抗剂。
在一个实施方案中，引发细胞凋亡的试剂或治疗是一种IAP拮抗剂。在一个实施方案中，IAP拮抗剂是LCL-161(Novartis)、Debio-1143(Debiopharma/Ascenta)、AZD5582、比瑞那帕/TL-32711(TetraLogic)、CUDC-427/GDC-0917/RG-7459(Genentech)、JP1201(Joyant)、T-3256336(Takeda)、GDC-0152(Genentech)或HGS-1029/AEG-40826(HGS/Aegera)。
在一个实施方案中，IAP拮抗剂是ASTX660、LCL-161(Novartis)、Debio-1143(Debiopharma/Ascenta)、AZD5582、Birinapant/TL-32711(TetraLogic)、CUDC-427/GDC-0917/RG-7459(Genentech)、JP1201(Joyant)、T-3256336(Takeda)、GDC-0152(Genentech)或HGS-1029/AEG-40826(HGS/Aegera)、Debio-4028和Ascentage IAP抑制剂APG-1387。在一个实施方案中，IAP拮抗剂是ASTX660(托林那帕)。在一个实施方案中，本发明涉及MDM2拮抗剂例如(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸和ASTX660的组合。
一方面，本发明提供了以下的组合：
(i)(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸(“异吲哚-1-酮化合物”)或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐；和
(ii)1-{6-[(4-氟苯基)甲基]-5-(羟甲基)-3,3-二甲基-1H,2H,3H-吡咯并[3,2-b]吡啶-1-基}-2-[(2R,5R)-5-甲基-2-{[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基}哌嗪-1-基]乙-1-酮(“ASTX660”)或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐。
特别地，本发明的这个方面提供：
一种组合，该组合包含如本文公开的组合(例如异吲哚啉-1-酮化合物的或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和ASTX660或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐的组合)和任选地一种或多种(例如1种或2种)其他治疗剂(例如抗癌剂)。
一种如本文公开的组合，该组合包含异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和附加治疗剂，例如ASTX660或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐，其中异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和该附加治疗剂，例如ASTX660或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐，是物理缔合的。
一种组合，该组合包含异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和附加治疗剂，例如如本文所公开的ASTX660或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐，其中异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和附加治疗剂，例如ASTX660或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐是：(a)混合的；(b)化学/物理化学连接的；(c)化学/物理化学共同包装的；或(d)未混合但共同包装或共同存在的。
一种组合，该组合包含异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和附加治疗剂，例如如本文所公开的ASTX660或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐，其中异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和治疗剂，例如ASTX660或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐不是物理缔合的。
一种组合，该组合包含异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和附加治疗剂，例如如本文所公开的ASTX660或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐，其中该组合包含：(a)该两种或更多种化合物中的至少一种以及针对该至少一种化合物临时缔合以形成该两种或更多种化合物的物理缔合的说明书；或(b)该两种或更多种化合物中的至少一种化合物以及针对与该两种或更多种化合物的组合治疗的说明书；或(c)该两种或更多种化合物中的至少一种化合物以及针对向患者群体施用的说明书，其中该两种或更多种化合物中的其它化合物已经(或正在)施用；或(d)该两种或更多种化合物中的量或形式特别适用于与该两种或更多种化合物中的其他化合物组合使用的至少一种化合物。
一种组合，该组合包含异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和附加治疗剂，例如如本文所公开的ASTX660或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐，采用药物试剂盒或患者包的形式。
一种药物组合物，该药物组合物包含一种组合，该组合包含异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和附加治疗剂，例如如本文所公开的ASTX660或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐。
一种组合，该组合包含异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和附加治疗剂，例如ASTX660或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐；或一种包含如本文所公开的组合的药物组合物，该药物组合物在治疗中使用。
一种组合，该组合包含异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和附加治疗剂，例如ASTX660或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐；或一种包含如本文所公开的组合的药物组合物，该药物组合物在预防或治疗如本文所述的疾病状态或病状中使用。
一种组合或包含如本文所公开的组合的药物组合物用于制造在预防或治疗如本文所述的疾病状态或病状中使用的药物的用途，该组合包含异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和附加治疗剂，例如ASTX660或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐。
一种用于预防或治疗如本文所述的疾病或病状的方法，该方法包括向患者施用包含以下的组合：异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和附加治疗剂，例如ASTX660或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐，或包含如本文所公开的组合的药物组合物。
一种用于预防或治疗如本文所述的疾病或病状的方法，该方法包括向有需要的患者施用(i)附加治疗剂，例如ASTX660，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物和(ii)如本文所定义的异吲哚啉-1-酮化合物，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
一种组合，该组合包含异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和附加治疗剂，例如ASTX660或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐；或一种包含该组合的药物组合物，如本文所公开的那样使用，尤其是在如本文所公开的预防或治疗方法中使用，其中该疾病状态或病状是由MDM2-p53介导的。
一种组合，该组合包含异吲哚-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和附加治疗剂，例如ASTX660或其互变构体或溶剂化物或药学上可以接受的盐；或一种包含该组合的药物组合物，该药物组合物如本文所公开的那样使用；或一种使用如本文所公开的组合的预防或治疗方法，其中根据本文所述的生物标志物选择患者。
一种组合，该组合包含异吲哚-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和附加治疗剂，例如ASTX660或其互变构体或溶剂化物或药学上可以接受的盐；或一种包含该组合的药物组合物，该药物组合物如本文所公开的那样使用；或一种使用如本文所公开的组合的预防或治疗方法，其中患者被选择为具有DDR正常或高的肿瘤。
一种组合，该组合包含异吲哚-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和附加治疗剂，例如ASTX660或其互变构体或溶剂化物或药学上可以接受的盐；或一种包含该组合的药物组合物，该药物组合物如本文所公开的那样使用；或一种使用如本文所公开的组合的预防或治疗方法，其中该疾病状态或病状是癌症。
一种组合，该组合包含异吲哚-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和附加治疗剂，例如ASTX660或其互变构体或溶剂化物或药学上可以接受的盐；或一种包含该组合的药物组合物，该药物组合物如本文所公开的那样使用；或一种使用如本文所公开的组合的预防或治疗方法，其中该疾病状态或病状是癌症，该癌症是急性髓系白血病。
一种组合，该组合包含异吲哚-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和附加治疗剂，例如ASTX660或其互变构体或溶剂化物或药学上可以接受的盐，该组合如本文所公开的那样用于预防或治疗急性髓系白血病。
在预防或治疗如本文所述的疾病状态或病状中使用的异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，其中该异吲哚啉-1-酮化合物与附加治疗剂，例如ASTX660，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物组合使用。
在预防或治疗如本文所述的癌症中使用的异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，其中该异吲哚啉-1-酮化合物与附加治疗剂，例如ASTX660，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物组合使用。
在预防或治疗如本文所述的疾病状态或病状中使用的ASTX660或互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，其中该治疗剂与异吲哚啉-1-酮化合物，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物组合使用。
异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，在预防、治疗或控制有需要的患者中的癌症中使用，与附加治疗试剂，例如ASTX660或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐，并且任选地与一种或多种其他治疗试剂的组合治疗。
异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物用于制造用于治疗癌症的药物的用途，其中患者正在用另一种治疗剂，例如ASTX660，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物治疗。
治疗剂，例如ASTX660或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物用于制造用于治疗癌症的药物的用途，其中患者正在用如本文所公开的异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物治疗。
异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物用于制造在增强或加强患有癌症的患者的反应率的药物的用途，其中患者正在用另一种治疗剂，例如ASTX660，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物治疗。
异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，在治疗哺乳动物中包括细胞生长异常或由细胞生长异常引起的疾病或病状中使用，其中哺乳动物正在接受用另一种治疗剂，例如ASTX660或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物进行治疗。
异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，在缓解或降低哺乳动物中包括细胞生长异常或由细胞生长异常引起的疾病或病状的发生率中使用，其中哺乳动物正在接受用另一种治疗剂，例如ASTX660，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物治疗。
如本文所公开的组合(例如，包含异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐和附加治疗剂，例如ASTX660或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐的组合)在制造用于抑制肿瘤细胞生长的药物组合物中的用途。
一种产品，该产品含有异吲哚啉-1-酮化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物作为第一活性成分，以及附加治疗剂，例如ASTX660，或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物作为另一活性成分，呈组合制剂的形式在癌症的治疗中同时、单独或依次使用。
在一个实施方案中，组合使用的附加治疗剂是降低一种或多种DDR途径基因产物的水平的试剂或治疗。在一个实施方案中，降低一种或多种DDR途径基因产物水平的试剂或治疗是重组干扰素(诸如干扰素-γ和干扰素α)和白介素(例如白介素2)，例如阿地白介素、地尼白介素、干扰素α2a、干扰素α2b或聚乙二醇干扰素α2b，或DNA修复抑制剂，诸如PARP抑制剂，或IAP拮抗剂或铂化合物，例如顺铂(任选地与氨磷汀组合)、卡铂或奥沙利铂；烷化剂，例如氮芥或亚硝基脲，例如环磷酰胺、苯丁酸氮芥、卡莫司汀(BCNU)、苯达莫司汀、噻替帕、美法仑、曲硫丹、洛莫司汀(CCNU)、阿曲他明、白消安、达卡巴嗪、雌莫司汀、氟莫司汀、异环磷酰胺(任选与美司钠组合)、哌泊溴曼、丙卡巴肼、链脲佐菌素、替莫唑胺、尿嘧啶、甲氯乙胺、甲基环己基氯乙基亚硝基脲或尼莫司汀(ACNU)；和/或放射治疗。
在一个实施方案中，降低一种或多种DDR途径基因产物的水平的试剂是BRCA1、BRCA2、ATM和/或ATRX的抑制剂。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂与ATM抑制剂，例如选自AZD-1390、M-4076(来自Merck KGaA)或IMP-08(来自IMPACT Therapeutics)的ATM抑制剂组合使用。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂与ATRX调节剂组合使用。
在一个实施方案中，MDM2拮抗剂与伊马替尼、尼洛替尼、达沙替尼、氟马替尼(flumatinib)、阿西米尼(asciminib)、博舒替尼、帕纳替尼或雷度替尼(radotinib)组合使用。
一种制备、分离和纯化1-{6-[(4-氟苯基)甲基]-5-(羟甲基)-3,3-二甲基-1H,2H,3H-吡咯并[3,2-b]吡啶-1-基}-2-[(2R,5R)-5-甲基-2-{[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基}哌嗪-1-基]乙-1-酮(ASTX660)及其药学上可接受的盐(包括乳酸盐)的特定方法可以在2015年06月25日作为WO 2015/092420公开的国际专利申请号PCT/GB2014/053778的实施例2处找到。在一个实施方案中，药学上可接受的盐是1-{6-[(4-氟苯基)甲基]-5-(羟甲基)-3,3-二甲基-1H,2H,3H-吡咯并[3,2-b]吡啶-1-基}-2-[(2R,5R)-5-甲基-2-{[(3R)-3-甲基吗啉-4-基]甲基}哌嗪-1-基]乙-1-酮的乳酸盐。
本发明的组合中存在的每种化合物可以以单独不同的剂量方案和通过不同的途径给予。因此，两种或更多种试剂中的每种试剂的剂量学可以不同：每种试剂可以同时或在不同时间施用。本领域技术人员将通过他或她的公知常识了解要使用的给药方案和组合治疗。例如，式(I°)的化合物可以与根据其现有组合方案施用的一种或多种其他试剂组合使用。下面提供了标准组合方案的实施例。
紫杉烷化合物的有利施用为，每平方米体表面积50至400mg(mg/m2)的剂量给药，例如75至250mg/m2，特别是每疗程中紫杉醇以约175至250mg/m2的剂量给药，多西他赛给药约75至150mg/m2。
喜树碱化合物有利施用为，每平方米体表面积0.1至400mg(mg/m2)的剂量给药，例如1至300mg/m2，特别是每疗程中伊立替康以约100至350mg/m2的剂量给药，拓扑替康给药约1至2mg/m2。
抗肿瘤鬼臼毒素衍生物有利施用为，每平方米体表面积30至300mg(mg/m2)的剂量给药，例如50至250mg/m2，特别是每疗程中依托泊苷以约35至100mg/m2的剂量给药，替尼泊苷给药约50至250mg/m2。
抗肿瘤长春花生物碱有利地以每个疗程2至30mg/平方米(mg/m2)体表面积的剂量施用，特别是长春花碱剂量为约3mg/m2至12mg/m2，长春新碱剂量为约1mg/m2至2mg/m2，且长春瑞滨的剂量为约10mg/m2至30mg/m2。
抗肿瘤核苷衍生物有利地以每个疗程200至2500mg/平方米(mg/m2)体表面积，例如700mg/m2至1500mg/m2的剂量施用，特别是5-FU的剂量为200mg/m2至500mg/m2，吉西他滨的剂量为约800mg/m2至1200mg/m2，且卡培他滨的剂量为约1000mg/m2至2500mg/m2。
烷化剂诸如氮芥或亚硝基脲有利地以每个疗程100至500mg/平方米(mg/m2)体表面积，例如120mg/m2至200mg/m2的剂量施用，特别是环磷酰胺的剂量为约100mg/m2至500mg/m2，苯丁酸氮芥的剂量为约0.1mg/kg至0.2mg/kg，卡莫司汀的剂量为约150mg/m2至200mg/m2，且洛莫司汀的剂量为约100mg/m2至150mg/m2。
抗肿瘤蒽环类衍生物有利地以每个疗程10至75mg/平方米(mg/m2)体表面积，例如15mg/m2至60mg/m2的剂量施用，特别是多柔比星的剂量为约40mg/m2至75mg/m2，柔红霉素的剂量为约25mg/m2至45mg/m2，且伊达比星的剂量为约10mg/m2至15mg/m2。
抗雌激素试剂有利的施用为，每天约1至100mg的剂量，取决于具体的试剂和所治疗的病症。他莫昔芬有利的施用为，5至50mg的剂量通常地10至20mg口服一天两次，持续足够时间的治疗以实现和维持治疗效果。托瑞米芬有利施用为，约60mg的剂量口服，每日一次，持续足够时间的治疗以实现和维持治疗效果。阿那曲唑有利施用为，约1mg的剂量口服，每日一次。屈洛昔芬有利的施用为，约20mg-100mg的剂量口，每日一次。雷洛昔芬有利的施用为，约60mg的剂量口服，每日一次。依西美坦有利施用为，约25mg的剂量口服，每日一次。
抗体的有利施用为，以每平方米体表面积约1至5mg(mg/m2)的剂量给药，或者如果不同的话如本领域已知的。曲妥珠单抗的有利施用为，每平方米体表面积1至5mg(mg/m2)的剂量给药，特别是每疗程2至4mg/m2。
在式(I°)的化合物以与一种、两种、三种、四种或更多种其他治疗剂(通常一种或两种治疗剂，更通常一种治疗剂)的组合疗法施用时，所述化合物可以同时或依次施用。在后一种情况下，两种或多种化合物将在一段时间内以足以确保实现有利或协同效应的量和方式施用。当依次施用时，它们可以紧密间隔施用(例如间隔5-10分钟)或以更长的间隔施用(例如间隔1、2、3、4小时或更多个小时，或者在需要时间隔更长时间施用)，精确的剂量方案与治疗剂的性质相称。这些剂量可以例如在每个疗程施用一次、两次或更多次，例如可以每7、14、21或28天重复一次。
应当理解，组合中每种成分的典型的施用方法和顺序，以及相应剂量和方案将取决于所施用的本发明的特定其他药剂和化合物、其施用途径、治疗的特定肿瘤和治疗的特定宿主。本领域技术人员可以使用常规方法并鉴于本文中列出的信息可容易地确定最佳给药方法和顺序以及给试剂量和方案。
本领域技术人员可以确定根据本发明的化合物和一种或多种其它抗癌剂作为组合给予时的重量比。所述比率以及确切的施用剂量和频率取决于根据本发明的特定化合物和所使用的其它抗癌剂、所治疗的特定病状、所治疗病状的严重程度、年龄、体重、性别、饮食、施用时间和特定患者的一般身体状况、施用方式以及个体可能服用的其它试剂，如本领域技术人员众所周知的。此外，很明显，可以降低或增加有效日剂量，这取决于所治疗的受试者的应答和/或取决于开出本发明化合物的医生的评价。本发明的MDM2拮抗剂和另一种抗癌试剂的特定重量比可以为1/10至10/1，更特别地1/5至5/1，甚至更特别地1/3至3/1。
本发明的化合物也可以连同非化学治疗，诸如放射治疗、光动力学治疗、基因治疗、外科手术和饮食控制一起施用。放射治疗可以用于根治性、姑息性、辅助性、新辅助性或预防性目的。
本发明中使用的化合物还具有用于放射治疗和化学治疗的致敏肿瘤细胞的治疗应用。因此，本发明的化合物可以用作“放射增敏剂”和/或“化学增敏剂”或可以与另一种“放射增敏剂”和/或“化学增敏剂”组合给予。在一个实施方案中，式(I°)的化合物用作化学增敏剂。
术语“放射增敏剂”被定义为以治疗有效量施用于患者以增加细胞对电离辐射的敏感性和/或促进可用电离辐射治疗的疾病的治疗的分子。
术语“化学增敏剂”被定义为以治疗有效量施用于患者以增加细胞对化学治疗的敏感性和/或促进可用化学治疗治疗的疾病的治疗的分子。
许多癌症治疗方案目前使用放射增敏剂连同x射线辐射。x射线活化的放射增敏剂的实例包括但不限于以下：甲硝唑、米索硝唑、去甲基米索硝唑、哌莫硝唑、依他硝唑、尼莫唑、丝裂霉素C、RSU 1069、SR 4233、EO9、RB 6145、烟酰胺、5-溴脱氧尿苷(BUdR)、5-碘脱氧尿苷(IUdR)、溴脱氧胞苷、氟脱氧尿苷(FudR)、羟基脲、顺铂及其治疗有效的类似物和衍生物。
癌症的光动力治疗(PDT)使用可见光作为增感剂的放射活化剂。光动力放射增敏剂的实施例包括但不限于以下：血卟啉衍生物、光敏蛋白、苯并卟啉衍生物、锡卟啉、脱镁硼化物-a、细菌叶绿素-a、萘酞菁、酞菁、锌酞菁和其治疗有效的类似物和衍生物。
放射增敏剂可以连同治疗有效量的一种或多种其他化合物施用，这些其他化合物包括但不限于：促进放射增敏剂掺入到靶细胞中的化合物；控制治疗剂、营养物和/或氧气流向至靶细胞的化合物；在有或没有额外辐射的情况下作用于肿瘤的化学治疗剂；或用于治疗癌症或其他疾病的其他治疗有效的化合物。
化学增敏剂可以连同治疗有效量的一种或多种其他化合物施用，这些其他化合物包括但不限于：促进化学增敏剂掺入到靶细胞中的化合物；控制治疗剂、营养物和/或氧气流向至靶细胞的化合物；作用于肿瘤的化学治疗剂或用于治疗癌症或其他疾病的其他治疗有效的化合物。钙拮抗剂，例如维拉帕米，被发现可与抗肿瘤试剂组合使用，以在对所接受的化学治疗试剂有抗性的肿瘤细胞中建立化学敏感性并增强此类化合物在试剂敏感性恶性肿瘤中的疗效。
为了在与另一种化学治疗剂的组合疗法中使用，式(I°)化合物和一种、两种、三种、四种或更多种其他治疗剂可以例如一起调配成含有两种、三种、四种或更多种治疗剂的剂型，即含有所有组分的单一药物组合物。可替代地，单独的治疗剂可以单独调配并以试剂盒的形式一起存在，任选地附有所述试剂盒的使用说明。
在一个实施方案中，药物组合物包含式(I°)化合物以及药学上可接受的载体和任选地一种或多种治疗剂。
在另一个实施方案中，本发明涉及根据本发明的组合在制备用于抑制肿瘤细胞生长的药物组合物中的用途。
在进一步的实施方案中，本发明涉及一种产品，该产品含有式(I°)化合物和一种或多种抗癌剂，呈组合制剂的形式在患有癌症的患者的治疗中同时、单独或依次使用。
编号的实施方案
本发明至少包括以下编号的实施方案：
1.一种在治疗癌症的方法中使用的MDM2拮抗剂，其中所述癌症耗损一种或多种DNA损伤修复(DDR)途径中的一种或多种基因或基因产物，或者其中所述癌症在至少一种DDR途径基因中具有至少一种功能丧失突变。
2.根据实施方案1所述的在方法中使用的MDM2拮抗剂，其中所述DDR途径是：
a.同源重组修复(HRR)途径；
b.所述非同源末端连接(NHEJ)途径；
c.所述错配修复(MMR)途径；
d.所述范科尼贫血(FA)途径；和/或
e.所述碱基切除修复(BER)途径。
3.根据实施方案1或实施方案2所述的在方法中使用的MDM2拮抗剂，其中：
所述一种或多种基因或基因产物包含除ATM以外的HRR途径基因或基因产物或由除ATM以外的HRR途径基因或基因产物组成；或
所述一种或多种基因或基因产物包含BRCA1、BRCA2和/或ATM或由BRCA1、BRCA2和/或ATM组成。
4.根据实施方案1至3中任一项所述的在方法中使用的MDM2拮抗物，其中所述一种或多种基因或基因产物包含ATRX或由ATRX组成。
5.根据实施方案1至4中任一项所述的在方法中使用的MDM2拮抗剂，其中：
所述一种或多种基因或基因产物包含MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、MLH3、PMS2、POLE和/或POLD1或由这些组成；或
所述癌症包含突变特征SBS6或与DNA错配修复中的缺陷相关的SBS26，和/或POLD1突变特征SBS20。
6.根据实施方案1至5中任一项所述的在方法中使用的MDM2拮抗物，其中所述一种或多种基因或基因产物包含FANCA、FANCB、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCJ、FANCL、FANCM、FANCN、FANCO、FANCP、FANCQ、FANCR、FANCS、FANCT、FANCU、FANCV和/或FANCW或由这些组成。
7.根据任一前述实施方案所述的在方法中使用的MDM2拮抗剂，其中
通过评估所述癌症的微卫星不稳定状态和/或肿瘤突变负荷来检测DDR基因的耗损或突变，任选地其中所述癌症是MSI高的。
8.根据实施方案1至7中任一项所述的所用MDM2拮抗剂，其中在治疗前测试患者组织样品以确定所述癌症表达谱。
9.根据实施方案8所述的所用MDM2拮抗剂，其中所述样品包含癌症DNA、ctDNA或癌细胞。
10.根据实施方案8或实施方案9所述的所用MDM2拮抗剂，其中所述测试包括检测蛋白质、mRNA和/或ctDNA的测定法。
11.根据实施方案10所述的所用MDM2拮抗剂，其中(i)使用免疫测定法、蛋白质结合测定法、基于抗体的测定法、基于抗原结合蛋白的测定法、基于蛋白质的阵列、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、流式细胞术、蛋白质阵列、印迹、蛋白质印迹、浊度测定法、比浊法、色谱法、质谱法、酶活性、放射免疫测定法、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫电化学发光法、免疫电泳法、竞争性免疫测定法或免疫沉淀检测蛋白质；并且/或者(ii)其中使用RT-PCR或定量基因表达测定法检测mRNA。
12.根据实施方案8至11中任一项所述的所用MDM2拮抗剂，其中基于所确定的表达谱选择所述患者进行治疗。
13.根据任一前述实施方案所述的所用MDM2拮抗剂，其中所述癌症是：
非小细胞肺癌、间皮瘤、成胶质细胞瘤或肾透明细胞癌；或
子宫癌、子宫内膜癌、膀胱癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌或DLBCL；或脑癌、透明细胞肾细胞癌(ccRCC)、食管癌或黑素瘤。
14.根据任一前述实施方案所述的所用MDM2拮抗剂，其中所述癌症是P53野生型。
15.根据任一前述实施方案所述的所用MDM2拮抗剂，其中癌细胞在治疗步骤后经历细胞凋亡。
16.根据任一前述实施方案所述的所用MDM2拮抗剂，其中在至少一部分癌细胞中活化的caspase-3由MDM2拮抗剂诱导。
17.根据实施方案16所述的所用MDM2拮抗剂，其中在至少40％的癌细胞或至少60％的癌细胞中所述MDM2拮抗剂诱导活化的半胱天冬酶-3。
18.根据任一前述实施方案所述的所用MDM2拮抗剂，其中所述癌症显示出：
相对于对照，CDKN2A、BAP1和SKP2中的一种、两种或三种的表达降低；和/或
相对于对照，干扰素特征基因中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种的表达增加。
19.根据实施方案18所述的所用MDM2拮抗剂，其中：
所述干扰素特征基因是CXCL10、CXCL11、RSAD2、MX1、BATF2、IFI44L、IFITM1、ISG15、CMPK2、IFI27、CD74、IFIH1、CCRL2、IFI44、HERC6、ISG20、IFIT3、HLA-C、OAS1、IFI35、IRF9、EPSTI1、USP18、BST2、CSF1、C1S、DHX58、TRIM14、OASL、IRF7、LGALS3BP、DDX60、LAP3、LAMP3、PARP12、PARP9、SP110、PLSCR1、WARS、STAT1、IRF3、IRF5、MSC、JUN、SPI1、IRF1、COMMD3-BMI1、STAT2、RUNX3、SREBF1和FLI1；或
所述癌症显示CXCL10或CXCL11的表达增加。
20.根据任一前述实施方案所述的所用MDM2拮抗剂，其中所述癌症显示以下中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种的表达增加：IRF7、STAT1、IRF3、IRF5、MSC、JUN、SPI1、IRF1、COMMD3-BMI1、STAT2、RUNX3、SREBF1、IRF9和FLI1。
21.根据任一前述实施方案所述的所用MDM2拮抗剂，其中所述MDM2拮抗剂是式(I°)的化合物或如本文所定义的其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，例如(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
22.根据任一项前述实施方案所述的所用MDM2拮抗剂，其中所述MDM2拮抗剂选自由以下组成的组：依达奴林(RG-7388)、HDM-201、KRT-232(AMG-232)、ALRN-6924、MI-773(SAR405838)、CGM-097、甲苯磺酸米拉德美坦、APG-115、BI-907828、LE-004、DS-5272、SJ-0211、BI-0252、AM-7209、SP-141、SCH-1450206、NXN-6、ADO-21、CTX-50-CTX-1、ISA-27、RO-8994、RO-6839921、ATSP-7041、SAH-p53-8、PM-2、K-178、MMRi-64和或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐。
23.在人类患者的癌细胞样品中一种或多种DDR途径基因或基因产物中的一种或多种的表达或活性水平作为一种或多种生物标志物用于评估癌症是否对用MDM2拮抗剂治疗敏感的用途，例如其中所述MDM2拮抗剂是式(I°)的化合物或如本文所定义的其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，例如(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
24.一种用于预测或评估人类癌症患者对用MDM2拮抗剂治疗的反应的方法，所述方法包括评估来自癌症患者的样品中一种或多种DDR途径基因的表达或活性水平，以及确定所测试的表达或活性水平是否指示所述癌症应当用MDM2拮抗剂治疗。
25.根据实施方案24所述的方法，其中所述评估步骤包括将所述表达或活性水平与(i)对用MDM2拮抗剂治疗有反应或无反应相关的表达或活性水平相比较，或(ii)来自同一类型的健康非癌细胞的表达或活性水平相比较。
26.根据实施方案24或实施方案25所述的方法，其中基于所述生物标志物概况将所述患者分类成组，任选地其中所述组包括以下各项或由以下各项组成：
(i)有反应者和无反应者；或
(ii)强烈的反应者
27.根据实施方案24至26中任一项所述的方法、其中当1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种DDR途径基因的表达水平低于被鉴定为不适合治疗的患者时，患者被鉴定为特别适合治疗。
28.根据实施方案24至27中任一项所述的方法，其中相对于(i)对用MDM2拮抗剂治疗无反应相关的表达水平或(ii)来自同一类型的健康非癌细胞的表达水平，当检测到一种或多种DDR途径基因的表达降低时，所述患者被鉴定为可用所述MDM2拮抗剂治疗。
29.根据实施方案24至28中任一项所述的方法，所述方法包括检测来自所述人类患者的癌细胞样品中所述生物标志物的表达或活性水平的步骤。
30.根据实施方案29所述的方法，其中所述检测是使用体外检测测定法进行的。
31.一种确定人类癌症患者对用MDM2拮抗剂治疗的敏感性的方法，所述方法包括在来自所述患者的癌细胞样品中检测一种或多种DDR途径基因的所述表达或活性，并且基于所述样品中所述生物标志物的表达或活性水平评估所述患者中的所述癌症是否可能对用MDM2拮抗剂治疗有反应。
32.一种检测患有癌症的人类患者中一种或多种DDR途径基因的表达或活性水平的方法。
33.根据实施方案32所述的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)从人类患者获得癌细胞样品；并且
(b)通过将所述样品与一种或多种用于检测一种或多种生物标志物的表达的试剂接触来检测所述一种或多种生物标志物是否在取样的癌细胞中表达。
34.根据实施方案24至33中任一项所述的方法，其中所述MDM2拮抗剂是如本文所定义的式(I°)的化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，例如(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
35.根据实施方案24至33中任一项所述的方法，其中所述MDM2拮抗剂选自由以下组成的组：依达奴林、HDM-201、KRT-232、ALRN-6924、ALRN-6924、CGM-097、甲苯磺酸米拉德美坦、APG-115、BI-907828、LE-004、DS-5272、SJ-0211、BI-0252、AM-7209、SP-141、SCH-1450206、NXN-6、ADO-21、CTX-50-CTX-1、ISA-27、RO-8994、RO-6839921、ATSP-7041、SAH-p53-8、PM-2、K-178、MMRi-64和或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐。
36.根据实施方案24至35中任一项所述的方法，所述方法还包括通过施用MDM2拮抗剂来治疗患者的癌症的步骤。
37.根据实施方案36所述的方法，其中所述MDM2拮抗剂是如本文所定义的式(I°)的化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，例如(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
38.根据实施方案36所述的方法，其中所述MDM2拮抗剂选自由以下组成的组：依达奴林、HDM-201、KRT-232、ALRN-6924、ALRN-6924、CGM-097、甲苯磺酸米拉德美坦、APG-115、BI-907828、LE-004、DS-5272、SJ-0211、BI-0252、AM-7209、SP-141、SCH-1450206、NXN-6、ADO-21、CTX-50-CTX-1、ISA-27、RO-8994、RO-6839921、ATSP-7041、SAH-p53-8、PM-2、K-178、MMRi-64和或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐。
39.根据实施方案36至38中任一项所述的方法，其中基于所述方法的结果向所述患者提供所述治疗。
40.一种用于检测来自人类患者的样品中对MDM2抑制敏感的至少一种生物标志物的表达或活性水平的试剂盒或装置，所述试剂盒或装置包含用于检测一种或多种DDR途径基因或基因产物的检测试剂。
41.一种用于确定人类癌症患者对用MDM2拮抗剂治疗的适合性的系统，所述系统包括用于存储与来自所述患者的样品相关的数据的存储存储器，所述数据包括与生物标志物组相关的指示来自所述受试者的所述样品中的生物标志物表达或活性水平的数据，所述生物标志物组包含一种或多种DDR途径基因或基因产物；以及
以能够通信的方式耦合到所述存储存储器，用于对所述患者进行分类的处理器。
42.根据任一前述实施方案所述的所用MDM2拮抗剂、用途、方法、试剂盒或系统，其中所述癌症显示一种或多种DDR途径基因、基因产物或活性的丧失。
43.根据实施方案1至39或42中任一项所述的所用MDM2拮抗剂、用途或方法，其中所述MDM2拮抗剂是与第二治疗剂的组合治疗的一部分。
44.一种在治疗癌症的方法中使用的MDM2拮抗剂，其中所述癌症在一种或多种DNA损伤修复(DDR)途径中具有正常或高水平的一种或多种基因或基因产物，或者其中所述癌症在任何DDR途径基因中都没有可检测的功能丧失突变，
所述MDM2拮抗剂与诱导对MDM2拮抗剂的敏感性的试剂组合，例如降低DNA损伤修复(DDR)途径中一种或多种基因或基因产物的水平。
45.一种治疗患者的癌症的方法，其中所述方法包括选择患者的步骤：
(a)在从所述患者获得的生物样品中具有正常或高水平的DDR途径基因或基因产物；以及
(b)向步骤(a)中选择的所述患者施用治疗有效量的MDM2拮抗剂，和通过降低DNA损伤修复(DDR)途径中的一种或多种基因或基因产物的水平来诱导对MDM2拮抗剂的敏感性的试剂。
46.根据实施方案44所述的MDM2拮抗剂或者根据实施方案45所述的方法，其中诱导对MDM2拮抗剂的敏感性的所述试剂是DNA损伤剂或DNA修复抑制剂。
47.一种包含MDM2抑制剂的药物组合物，其中所述MDM2抑制剂是式(I°)的化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，例如(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，所述药物组合物用于治疗患者的癌症，其中所述癌症如实施方案1至7中任一项所定义。
48.一种在治疗癌症患者的方法中使用的MDM2拮抗剂，其中所述方法包括：
(i)确定来自所述患者的样品耗损一种或多种DNA损伤修复(DDR)途径中的一种或多种基因或基因产物，或者其中所述癌症在DDR途径基因中具有至少一种功能丧失突变：
(ii)向所述患者施用有效量的所述MDM2拮抗剂。
49.一种在治疗癌症的方法中使用的MDM2拮抗剂，
其中所述癌症在一种或多种DNA损伤修复(DDR)途径中具有低水平的一种或多种基因或基因产物，或者其中所述癌症在任何DDR途径基因中具有可检测的功能丧失突变，
所述MDM2拮抗剂与抗癌剂，例如DNA损伤剂或DNA修复抑制剂组合。
50.一种治疗患者的癌症的方法，其中所述方法包括选择患者的步骤：
(a)在从所述患者获得的生物样品中具有低水平的DDR途径基因或基因产物；以及
(b)向步骤(a)中选择的所述患者施用治疗有效量的MDM2拮抗剂和抗癌剂，例如DNA损伤剂或DNA修复抑制剂。
51.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用MDM2拮抗剂，其中所述癌症耗损一种或多种DNA损伤修复(DDR)途径中的一种或多种基因或基因产物，或者其中所述癌症在至少一种DDR途径基因中具有至少一种功能丧失突变，任选地其中所述一种或多种DDR途径基因或基因产物包含BRCA1和/或BRCA2。
52.根据实施方案51所述的方法，其中所述DDR途径是：
a.同源重组修复(HRR)途径；
b.所述非同源末端连接(NHEJ)途径；
c.所述错配修复(MMR)途径；
d.所述范科尼贫血(FA)途径；和/或
e.所述碱基切除修复(BER)途径。
53.根据实施方案51或实施方案52所述的方法，其中：
所述一种或多种基因或基因产物中的一种或多种基因或基因产物选自除ATM以外的HRR途径基因或基因产物；或
所述一种或多种基因或基因产物中的一种或多种基因或基因产物选自BRCA1、BRCA2和ATM，或选自BRCA1和/或BRCA2和ATM。
54.根据实施方案51至53中任一项所述的方法，其中所述一种或多种基因或基因产物中的一种或多种基因或基因产物包含ATRX。
55.根据实施方案51至54中任一项所述的方法，其中：
所述一种或多种基因或基因产物中的一种或多种基因或基因产物选自MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、MLH3、PMS2、POLE和POLD1；或
所述癌症包含突变特征SBS6或与DNA错配修复中的缺陷相关的SBS26，和POLD1突变特征SBS20中的一种或多种。
56.根据实施方案51至55中任一项所述的方法，其中所述一种或多种基因或基因产物中的一种或多种基因或基因产物选自FANCA、FANCB、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCJ、FANCL、FANCM、FANCN、FANCO、FANCP、FANCQ、FANCR、FANCS、FANCT、FANCU、FANCV和FANCW。
57.根据实施方案51至56中任一项所述的方法，所述方法还包括评估或已经评估了所述癌症的微卫星不稳定状态和所述癌症的肿瘤突变负荷中的一项或多项，并且通过所述微卫星不稳定状态和所述肿瘤突变负荷中的一项或多项来确定DDR途径基因中的耗损或突变。
58.根据实施方案57所述的方法，其中所述癌症是MSI高的。
59.根据实施方案51至58中任一项所述的方法，所述方法还包括测试或已经测试患者组织样品以确定施用前的癌症表达谱。
60.根据实施方案59所述的方法，其中所述样品包含癌症DNA、ctDNA或癌细胞。
61.根据实施方案59或实施方案60所述的方法，其中所述测试包括检测蛋白质、mRNA和ctDNA中的一种或多种的测定法。
62.根据实施方案61所述的方法，其中以下的一项或两项：(i)使用免疫测定法、蛋白质结合测定法、基于抗体的测定法、基于抗原结合蛋白的测定法、基于蛋白质的阵列、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、流式细胞术、蛋白质阵列、印迹、蛋白质印迹、浊度测定法、比浊法、色谱法、质谱法、酶活性、放射免疫测定法、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫电化学发光法、免疫电泳法、竞争性免疫测定法或免疫沉淀检测蛋白质；和(ii)使用RT-PCR或定量基因表达测定法检测mRNA；并且/或者(iii)其中通过下一代测序检测DNA或RNA；并且/或者(iv)其中通过免疫组织化学检测蛋白质。
63.根据实施方案59至62中任一项所述的方法，其中基于所确定的癌症表达谱选择所述患者进行治疗。
64.根据任一前述实施方案所述的方法，其中所述癌症是：
非小细胞肺癌、间皮瘤、胶质母细胞瘤或肾透明细胞癌；或
子宫癌、子宫内膜癌、膀胱癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌或DLBCL；或
脑癌、透明细胞肾细胞癌(ccRCC)、食管癌或黑素瘤或
急性骨髓性白血病(AML)、鳞状细胞癌或头、颈、皮肤、胃肠系统或生殖道的肿瘤；或
前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌或妇科癌症；或
结直肠癌、胃癌或妇科癌症。
65.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述癌症是P53野生型。
66.根据任一前述权利要求所述的方法，其中癌细胞在施用后经历细胞凋亡。
67.根据任一前述实施方案所述的方法，其中在至少一部分癌细胞中所述MDM2拮抗剂诱导活化的半胱天冬酶-3。
68.根据实施方案67所述的方法，其中在至少40％的癌细胞或至少60％的癌细胞中所述MDM2拮抗剂诱导活化的半胱天冬酶-3。
69.根据任一前述实施方案所述的方法，其中所述癌症显示以下一种或多种：相对于对照，CDKN2A、BAP1和SKP2中的一种、两种或三种的表达降低；以及相对于对照，干扰素特征基因中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种的表达增加。
70.根据实施方案69所述的方法，其中：
一种或多种干扰素特征基因选自CXCL10、CXCL11、RSAD2、MX1、BATF2、IFI44L、IFITM1、ISG15、CMPK2、IFI27、CD74、IFIH1、CCRL2、IFI44、HERC6、ISG20、IFIT3、HLA-C、OAS1、IFI35、IRF9、EPSTI1、USP18、BST2、CSF1、C1S、DHX58、TRIM14、OASL、IRF7、LGALS3BP、DDX60、LAP3、LAMP3、PARP12、PARP9、SP110、PLSCR1、WARS、STAT1、IRF3、IRF5、MSC、JUN、SPI1、IRF1、COMMD3-BMI1、STAT2、RUNX3、SREBF1和FLI1；或
所述癌症显示CXCL10或CXCL11的表达增加。
71.根据任一前述实施方案所述的方法，其中所述癌症显示以下中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种的表达增加：IRF7、STAT1、IRF3、IRF5、MSC、JUN、SPI1、IRF1、COMMD3-BMI1、STAT2、RUNX3、SREBF1、IRF9和FLI1。
72.根据任一前述实施方案所述的方法，其中所述MDM2拮抗剂是式(I°)的化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
73.根据任一前述实施方案所述的方法，其中所述MDM2拮抗剂是(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
74.根据任一前述实施方案所述的方法，其中所述MDM2拮抗剂选自化合物1、依达奴林(RG-7388)、HDM-201、KRT-232(AMG-232)、ALRN-6924、MI-773(SAR405838)、CGM-097、甲苯磺酸米拉德美坦、APG-115、BI-907828、LE-004、DS-5272、SJ-0211、BI-0252、AM-7209、SP-141、SCH-1450206、NXN-6、ADO-21、CTX-50-CTX-1、ISA-27、RO-8994、RO-6839921、ATSP-7041、SAH-p53-8、PM-2、K-178、MMRi-64、及前述任一者的互变异构体、溶剂化物和药学上可接受的盐中的一种或多种。
75.一种用于治疗患者的MDM2拮抗剂敏感性癌症的方法，所述方法包括检测或已经检测了来自所述患者的癌细胞样品中一种或多种DDR途径基因的表达或活性水平，并且如果来自所述患者的癌细胞样品中所述一种或多种DDR途径基因的表达或活性水平分别低于非癌细胞样品或来自第二患者的细胞样品中的所述一种或多种DDR途径基因中的一种或多种的表达或活性水平，则向所述患者施用所述MDM2拮抗剂，其中所述第二患者患有对MDM2拮抗剂治疗不敏感的癌症，任选地其中所述一种或多种DDR途径基因包含BRCA1和/或BRCA2。
76.根据实施方案75所述的方法，所述方法还包括基于来自所述患者的癌细胞样品中一种或多种DDR途径基因的表达或活性水平将所述患者分组。
77.根据实施方案76所述的方法，其中所述组选自：
(i)有反应者和无反应者；以及
(ii)强烈的反应者。
78.根据实施方案75至77中任一项所述的方法，所述方法包括如果1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种DDR途径基因的表达或活性水平分别低于非癌细胞样品或来自患有对MDM2拮抗剂治疗不敏感的癌症的患者的细胞样品中的表达或活性水平，则向所述患者施用MDM2拮抗剂。
79.根据实施方案75至78中任一项所述的方法，其中所述检测是使用体外检测测定法进行的。
80.根据实施方案75至79中任一项所述的方法，其中所述MDM2拮抗剂是如本文所定义的式(I°)的化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
81.根据实施方案75至80中任一项所述的方法，其中所述MDM2拮抗剂是(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
82.根据实施方案75至81中任一项所述的方法，其中所述MDM2拮抗剂选自化合物1、依达奴林、HDM-201、KRT-232、ALRN-6924、ALRN-6924、CGM-097、甲苯磺酸米拉德美坦、APG-115、BI-907828、LE-004、DS-5272、SJ-0211、BI-0252、AM-7209、SP-141、SCH-1450206、NXN-6、ADO-21、CTX-50-CTX-1、ISA-27、RO-8994、RO-6839921、ATSP-7041、SAH-p53-8、PM-2、K-178、MMRi-64和或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐。
83.一种治疗患者的癌症的方法，其中所述癌症显示一种或多种DDR途径基因、基因产物或活性的丧失，所述方法包括向所述患者施用MDM2拮抗剂，任选地其中所述一种或多种DDR途径基因包含BRCA1和/或BRCA2。
84.根据前述实施方案中任一项所述的方法，所述方法还包括向所述患者施用第二治疗剂(例如PARP抑制剂)作为组合疗法的一部分。
85.一种治疗患者的癌症的方法，
其中所述癌症在一种或多种DNA损伤修复(DDR)途径中具有正常或高水平的一种或多种基因或基因产物，或者其中所述癌症在任何DDR途径基因中没有可检测的功能丧失突变，所述方法包括
与诱导对所述MDM2拮抗剂的敏感性的试剂组合向所述患者施用MDM2拮抗剂。
86.根据实施方案85所述的方法，其中诱导对所述MDM2拮抗剂的敏感性的所述试剂降低DNA损伤修复(DDR)途径中一种或多种基因或基因产物的水平。
87.根据实施方案85或实施方案86所述的方法，其中诱导对MDM2拮抗剂的敏感性的所述试剂是DNA损伤剂或DNA修复抑制剂。
88.一种治疗患有对MDM2拮抗剂治疗敏感的癌症的患者的方法，其中所述方法包括：
(i)确定来自所述患者的样品耗损一种或多种DNA损伤修复(DDR)途径中的一种或多种基因或基因产物，或者其中所述癌症在DDR途径基因中具有至少一种功能丧失突变：
(ii)向所述患者施用有效量的所述MDM2拮抗剂。
89.一种治疗患者的癌症的方法，所述方法包括与癌剂，例如DNA损伤剂或DNA修复抑制剂组合向所述患者施用MDM2拮抗剂，其中
所述癌症在一种或多种DNA损伤修复(DDR)途径中具有低水平的一种或多种基因或基因产物，或者其中所述癌症在任何DDR途径基因中具有可检测的功能丧失突变。
90.根据上述实施方案所述的方法，其中所述一种或多种DDR途径基因包含BRCA1和/或BRCA2。
91.根据上述实施方案所述的方法，其中所述两种或更多种DDR途径基因不包含ATM和/或ATR。
92.根据上述实施方案所述的方法，其中所述两种或更多种DDR途径基因包含ATR和/或ATM。
93.根据上述实施方案所述的方法或用途，其中所述两种或更多种DDR途径基因包含BRCA1和/或BRCA2和ATM。
94.根据上述实施方案所述的方法或用途，其中所述第二试剂是PARP抑制剂。
现在参考以下非限制性实施例进一步描述本发明。
实施例
现在本发明的MDM2拮抗剂将通过但不限于参考以下实施例中所描述的具体实施方案来说明。例如，使用自动命名包，如AutoNom(MDL)或ChemAxon Structure to Name对化合物进行命名，或由化学品供应来命名。
下面第一组MDM2拮抗剂的实例，其中cyc是苯基，可以按照国际专利申请号PCT/GB2016/053042中的描述进行制备，该申请于2017年04月06日以WO 2017/055860公布：
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下面第二组MDM2拮抗剂的实例，其中cyc是Het，可以按照国际专利申请号PCT/GB2016/053041中的描述进行制备，该申请于2017年04月06日以WO 2017/055859公布：
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(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂 环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸(“化合物 1”)的制备1
步骤1：(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[1-(4-氯苯基)-7-氟-1-羟基-5-[(1S))-1-羟 基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸丙-2- 烯-1-基酯
向(S)-2-(4-氯苯甲酰基)-3-氟-5-(1-羟基-1-(四氢-2H-吡喃-4-基)丙基)苯甲酸溶液(制备52)(0.686g，1.6mmol)、(2S,3S)-3-氨基-3-(4-氯苯基)-2-甲基丙酸丙-2-烯-1-基酯(制备62)(0.54g，2.12mmol)和二异丙基乙胺(0.83mL，4.8mmol)在DMF(15mL)中的溶液中添加HATU(0.91g，2.4mmol)，并将反应混合物搅拌2小时。添加水并用乙酸乙酯萃取。有机相用饱和NaHCO3、盐水洗涤，干燥并蒸发溶剂。粗产物通过色谱法纯化，得到标题化合物(0.75g，72％)。MS:[M-H]-＝654。
步骤2：(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S))-1-羟基- 1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸 丙-2-烯-1-基酯
标题化合物由(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[1-(4-氯苯基)-7-氟-1-羟基-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸乙酯和甲醇以制备10中描述的类似方式制备，但使用MeOH替代1,1-双(羟甲基)环丙烷。非对映异构体通过手性SFC分离，标题化合物是较快洗脱的异构体。MS：[M+H]+＝670。
步骤3：(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基- 1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸
标题化合物由(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸丙-2-烯-1-基酯，以实例90的步骤4中描述的类似方式制备。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):12.56-12.00(1H,m),7.71(1H,s),7.42(1H,d),7.02(4H,d),6.88(3H,d),4.91(1H,s),4.23(1H,d),3.99-3.85(2H,m),3.75(1H,dd),3.25-3.10(5H,m),2.02-1.90(1H,m),1.90-1.78(2H,m),1.67(1H,d),1.43-1.17(6H,m),0.95(1H,d),0.58(3H,t)。MS：[M+H]+＝630。
(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂 环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸(三(羟甲 基)氨基甲烷盐)
将上述化合物溶解在EtOH和加入1mol.eq.的三(羟甲基)氨基甲烷。真空除去溶剂，得到无色固体。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)6 7.69(s,1H),7.39(d,J＝10.7Hz,1H),7.01(broad s,4H),6.96-6.88(m,4H),4.92(broad s,1H),4.34-4.22(m,1H),3.88(dd,J＝10.9,4.2Hz,1H),3.74(dd,J＝11.1,4.2Hz,1H),3.71-3.61(m,1H),3.29(s,6H),3.33-3.22(m,1H),3.21-3.14(m,1H),3.13(s,3H),1.94(tt,J＝12.2,3.6Hz,1H),1.89-1.78(m,2H),1.66(d,J＝12.8Hz,1H),1.41-1.24(m,2H),1.19(d,J＝6.8Hz,3H),0.93(d,J＝13.2Hz,1H),0.57(t,J＝7.3Hz,3H)。MS：[M+H]+＝630。
(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂 环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸(“化合物 1”)的制备2
第1阶段：3-溴-5-氟苯甲酸叔丁酯
将3-溴-5-氟苯甲酸(32.0g，1.0当量)在DCM(288mL，9体积)和THF(32mL，1体积)的混合物中搅拌直至大部分固体溶解。添加DMF(0.57mL，5摩尔％)，并将烧瓶置于环境温度水浴中。通过注射泵在1小时内添加草酰氯(13.7mL，1.10当量)；在添加结束后30分钟，用HPLC完成反应(样品在MeOH中淬灭以在分析前形成甲酯)。将所得稀浆液老化过夜，浓缩至100mL体积，用THF(160mL，5体积)稀释并再次浓缩至100mL。用THF将所得的酰氯稀浆液稀释至160mL总体积。用THF(243mL)稀释LiOtBu在THF中的溶液(20重量％，67.3g，77mL，1.15当量)，然后用冰/盐浴将该溶液冷却至-9℃的内部温度。在55分钟内向其中添加含有酰氯的浆液，同时内部温度保持在-3℃以下。添加结束后15分钟反应完成。随着溶液升温至环境温度，溶液老化过夜，用庚烷(320mL，10体积)稀释，并用水(160mL，5体积)洗涤。将水层去除至界面处的不溶性碎布，然后有机层通过solka-floc垫来进行过滤。垫用庚烷(10mL)冲洗，然后将合并的有机层用水(2×80mL，2.5体积)洗涤2次。将所得有机层减压蒸馏至最终体积为100mL，用庚烷(160mL，5体积)稀释，并再次浓缩至总体积为100mL。3-溴-5-氟苯甲酸叔丁酯溶液直接用于下一步。NMR 1H(400MHz；CDCh):7.89-7.88(1H,m),7.60-7.57(1H,m),7.40-7.37(1H,m),1.57(9H,s)。
第2阶段：3-氟-5-[1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]苯甲酸
将3-溴-5-氟苯甲酸叔丁酯(20.0g，1.0当量)和1-(氧杂环己烷-4-基)丙-1-酮(10.85g，1.05当量)在2-MeTHF(200mL，10体积)中的溶液用0.5M LiCl在THF中的溶液(72.7mL，0.5当量)处理并冷却至-70℃。在1小时内滴加正丁基锂在己烷中的溶液(2.2M，39.0mL，1.1当量)；添加结束后反应完成。将混合物升温至-20℃，用半饱和NH4CI水溶液(200mL)淬灭并搅拌10分钟。使混合物沉降并分离各层。有机相用水(50mL，2.5体积)洗涤。通过HPLC测定该溶液的20.6g的3-氟-5-[1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]苯甲酸叔丁酯(84％测定产率)。LCMS(M-H)-；m/z＝337.2。通过减压蒸馏将有机溶液浓缩至约40mL总体积(～2体积)。3-氟-5-[1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]苯甲酸叔丁酯的浓缩溶液在20℃处用TFA(28.0mL，6.0当量)处理并且当HPLC分析显示反应完成98％时将溶液升温至60℃并老化2小时；将混合物冷却至20℃，然后用MTBE(40mL，2体积)和庚烷(80mL，4体积)稀释。溶液用真实的3-氟-5-[1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]苯甲酸叔丁酯接种并在种床生长的同时老化30分钟。通过加入庚烷(120mL)将浆液稀释1小时，过滤，滤饼用庚烷(40mL)洗涤，得到为灰白色固体状的标题化合物(14.89g，87％产率)。NMR 1H(400MHz；DMSO):13.23(1H,s),7.79(1H,t),7.50-7.47(1H,m),7.43-7.39(1H,m),4.79(1H,s,broad),3.79(2H,ddd),3.18(2H,dt),1.86-1.79(3H,m),1.64(1H,d),1.36-1.09(2H,m),0.93(1H,d),0.58(3H,t)；LCMS(M+H)+:m/z＝283.1
第3阶段：3-氟-5-[1-(氧杂环己烷-4-基)-1-[(三甲基甲硅烷基)氧基]丙基]苯甲 酸
在0℃处在30分钟内向3-氟-5-[1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]苯甲酸(7.06g，1.0当量)在DCM(40mL)中的悬浮液中添加Et3N(7.08g，2.6当量)(保持温度低于5℃)。用TMSOTf(13.34g，2.4当量)的DCM(40mL)溶液用所得澄清溶液处理60分钟(保持温度低于5℃)。将反应混合物在0℃再搅拌1小时。15分钟内将水(88mL)加入冷反应混合物中，然后各相分离。有机相用0.2M KHSO4溶液(53mL)和水(2×88mL)洗涤。溶液经Na2SO4干燥并真空浓缩。将粗产物(油状物)从DCM/庚烷中结晶，得到为灰白色固体状的标题化合物(8.24g，93％)。NMR 1H(400MHz；DMSO):7.79(1H,t),7.65-8.62(1H,m),7.35-7.31(1H,m),3.98(2H,ddd),3.33(2H,dtd),2.04-1.84(3H,m),1.75(1H,d),1.37(1h,qd),1.26-1.20(2H,m),0.72(3H,t),0.25(9H,s)；LCMS(M+H)+:m/z＝355.2
第4阶段：2-(4-氯苯甲酰基)-3-氟-5-[1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]苯甲 酸
在-70℃内部温度处向THF(60mL，15体积)中加入n-BuLi(9.8mL，2.0当量，2.3M己烷溶液)。在60分钟内滴加3-氟-5-[1-(氧杂环己烷-4-基)-1-[(三甲基甲硅烷基)氧基]丙基]苯甲酸(4.0g，1.0当量)在THF(20.0mL，5体积)中的溶液，同时保持内部温度低于-65℃。添加结束后将所得的淡红色溶液搅拌30分钟，并在10分钟内添加4-氯苯甲酰氯(1.6mL，1.15当量)的THF(2体积，8.0mL)溶液，同时保持内部温度低于-60℃-添加结束时反应完成；将该溶液升温至0℃，得到2-(4-氯苯甲酰基)-3-氟-5-[1-(氧杂环己烷-4-基)-1-[(三甲基甲硅烷基)氧基]丙基]苯甲酸在THF中的溶液。LCMS(M+H)+:m/z＝493.2
向该溶液中添加浓H3PO4(3.8mL，5.0当量)并将混合物在50℃处搅拌18小时。将混合物用甲苯(40mL，10体积)和4％NaCl水溶液(20mL，5体积)稀释。各相分离，并且顶部有机层用4％NaCl水溶液(20mL)和水(10mL)洗涤。将有机层浓缩至～1/3体积，然后用甲苯(60mL，15体积)稀释。将溶液浓缩至总体积约35mL(～9体积，50℃浴温，80mbar压力)，经过一段时间固体沉淀。将浆液在50℃处老化1小时，然后冷却至环境温度并老化3小时。将浆液过滤，并将滤饼用2×8mL(2×2体积)甲苯洗涤，然后在真空烘箱(50℃烘箱温度)中干燥至质量恒定。得到为白色固体状的标题化合物，校正产率为81％(4.04g，95重量％)。LCMS(M+H)+:m/z＝421.1
第5阶段：2-(4-氯苯甲酰基)-3-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基] 苯甲酸-双[(1S)-1-苯基乙基]胺盐
将2-(4-氯苯甲酰基)-3-氟-5-[1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]苯甲酸(外消旋体，300g，85重量％，255g 6，1.0当量)溶于异丙醇(4000mL)中，在55℃处搅拌10分钟以得到均匀溶液，然后冷却至25℃。在2分钟内向该溶液中添加双[(1S)-1-苯基乙基]胺(136.52g；1.0当量)在IPA(300ml)中的溶液，随后用IPA冲洗(200mL)。将溶液在环境温度(22-23℃)处搅拌15分钟，然后用标题化合物的真实样品(0.50g)接种；固体容易结晶并且观察到轻微的吸热(约-0.4°)。将悬浮液在19℃的内部温度下搅拌20小时，过滤，滤饼用IPA(450mL)洗涤。将固体在真空抽吸下干燥2小时，然后在50℃的真空烘箱中干燥20小时，得到米色固体；175.5g(产率41％，作为IPA溶剂化物)-通过HPLC分析，混合物为95:5e.r.。
手性HPLC条件：
柱：ChiralPak IC-3 3μ柱4.6×150mm
柱温：27°
洗脱液：庚烷/IPA 80:20，含0.1％的TFA
流量：在254nm处，1.0mL/min
保留所需的(S)对映异构体；RT＝4.60分钟。不需要的(R)对映异构体，RT＝5.83分钟。
通过升温至80°并在该温度下搅拌15分钟直至形成均匀溶液的方式，将材料(250g，1.0当量，95:5e.r.)溶解在IPA(4000mL，16体积)中。将溶液在约1小时内冷却至52℃，用真实的标题化合物样品(0.50g)接种并将悬浮液在4小时内冷却至20℃，然后在室温下搅拌，在该温度下过夜(总共24小时)。通过真空过滤分离固体，滤饼用IPA(2×450mL)洗涤，滤饼吸干5分钟，然后在50℃真空烘箱中进一步干燥。获得呈米色固体的2-(4-氯苯甲酰基)-3-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]苯甲酸-双[(1S)-1-
苯乙基]胺盐(219.2g；88％回收率)；通过HPLC分析，e.r.为99.6:0.4。NMR 1H(400MHz；DMSO):7.84(1H,d),7.67(1H,t),7.65(1H,t),7.58(1H,t),7.56(1H,t),7.47(1H,dd),7.34-7.30(4H,m),7.28-7.20(6H,m),4.90(1H,s),3.90(1H,dd),3.80-3.72(1H,m),3.51-3.46(1H,m),3.30-3.15(1H,m),1.93-1.83(3H,m),1.68(1H,d),1.41-1.28(1H,m),1.26(3H,s),1.24(3H,s),1.04(3H,s),1.03(3H,s),0.65(3H,t)
第6阶段：(2S,3S)-3-氨基-3-(4-氯苯基)-2-甲基丙酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯- 盐酸盐
在-10℃处向(2S,3S)-3-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-(4-氯苯基)-2-甲基丙酸(109.82g，1.0当量)、2-三甲基甲硅烷基乙醇(49.66g，1.2当量)和DMAP(4.28g，0.05mol％)在DCM(1100mL，10体积)中的悬浮液中在75分钟内以五等份添加EDC·HCl(100.65g，1.5当量)(保持温度低于0℃)。所得澄清溶液缓慢升温至室温并搅拌16小时。在15分钟内将1NHCl溶液(1000mL)缓慢添加到反应混合物中并分离各相。有机相用5％ NaHCO3溶液(500mL)和水(2×500mL)洗涤。将有机相真空浓缩，得到(2S,3S)-3-{[(叔丁氧基)羰基]氨基}-3-(4-氯苯基)-2-甲基丙酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯，其在下一步骤中直接使用。LCMS(M+H)+:m/z＝414.2
将粗物质(蜡状白色固体)重新溶解在DCM(200mL)/庚烷(1500mL)中，并在2小时内将4N HCl在二噁烷中的溶液(350mL，4.0当量)滴加到庚烷溶液中。在该添加过程中，HCl盐开始沉淀并且随着反应在环境温度处老化24小时，悬浮液逐渐变稠。将悬浮液用MTBE(800mL)稀释，过滤并将滤饼用MTBE(2×200mL)洗涤，在真空烘箱中在50℃处干燥至恒重后得到呈白色片状固体的标题化合物(108.22g，88％)。NMR 1H(400MHz；CDCh):8.93(3H,bs),7.39-7.29(4H,m),4.3(1H,bd),4.06-3.92(2H,m),3.17-3.08(1H,m),1.32(3H,d),0.80-0.71(2H,m),-0.02(9H,s)；LCMS(M+H)+:m/z＝314.1
第7阶段：(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-1-羟基-5- [(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基 丙酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
将二氯甲烷(150mL，10体积)添加到2-(4-氯苯甲酰基)-3-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]苯甲酸-双[(1S)-1-苯乙基]胺盐(15.0g，1.0当量)、(2S,3S)-3-氨基-3-(4-氯苯基)-2-甲基丙酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯-盐酸盐(8.2g，1.1当量)、EDC盐酸盐(4.7g，1.15当量)、DMAP(260mg，0.1当量)和2-羟基吡啶-N-氧化物(230mg，0.1当量)的混合物。将混合物搅拌18小时，然后加入NaHCO3水溶液(4.5g，2.5当量在60mLH2O中)进行淬灭。分离各层并将DCM相浓缩至30mL(2体积)。添加MTBE(150mL，10体积)，并将有机层依次用2xH3PO4水溶液(3.5mL，2.5当量在60mL水中)、NaHCO3水溶液(4.5g，2.5当量在60mL H2O中)和水(60mL)洗涤。将有机层浓缩至60mL(2体积)，用MeOH(300mL，20体积)稀释，并浓缩至150mL(10体积)。用水(15mL)稀释MeOH溶液，用真实样品(15mg，0.1重量％)接种，种子床生长的同时在环境温度下老化30分钟。用2小时内加入水(45mL)稀释浆液，老化1小时，然后过滤。将滤饼用2.5/1MeOH:H2O(45mL)和水(45mL)洗涤，并在真空烘箱中在50℃处干燥18小时，得到呈白色固体的标题化合物(13.5g，产率89％，使用19F NMR分析，d.r.>99:1)。NMR1H(400MHz；CDCh):7.80(1H,s),7.15(1H,d),7.01-6.99(4H,m),6.97-6.92(4H,m),4.77(1H,s),4.36(1H,d),4.16-4.08(1H,m),3.94-3.90(1H,m),3.89-3.79(2H,m),3.47(1H,d),3.31(1H,t),3.08(1H,t),2.55(1H,s),1.91(1H,sep),1.86-1.77(2H,m),1.74-1.71(1H,m),1.41-1.22(5H,m),0.94(1H,d),0.68-0.54(5H,m),0.10(9H,s),NMR 19F(376MHz,CDCh)6:-119.1and LCMS(M+H)+:m/z＝716.2
第8阶段：(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯
在100mL的三颈烧瓶中，在室温处将固体(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-1-羟基-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(2.5g，1.0当量)溶解在无水THF(12.5mL，5体积)中。将溶液冷却至-70℃内部温度，并添加MeOTf(三氟甲磺酸甲酯)(0.46mL，1.2当量)。将所得澄清溶液保持在-70℃的内部温度处，通过注射泵在1小时内滴加LiOtBu(20肿瘤％在THF中，1.9mL，1.2当量)。将混合物在-70℃保持18小时，然后在2小时内升温至-15℃，此时转化率>98％。将反应混合物用IPA(12.5mL)稀释，然后用水(12.5mL)稀释。该溶液用产物10接种，并在形成种床的同时，于环境温度下搅拌30分钟。在1.5小时内通过注射泵缓慢的进一步加水(25mL)，并将浆液在环境温度下老化1小时，然后过滤。将滤饼用1:1IPA/水(20mL)洗涤并在真空烘箱中在50℃处干燥，得到标题化合物(2.4g)(未校正产率94％，通过19F NMR分析为100:0.5d.r.)。NMR 1H(400MHz；CDCh):7.67(1H,d),7.28(1H,dd),6.93-6.88(8H,m),4.30-4.19(m,2H),4.01(dd,1H),3.92-3.77(m,3H),3.40-3.26(m,2H),3.22(s,3H),1.97-1.84(m,4H),1.72(bs,3H),1.49-1.38(m,2H),1.36(d,3H),1.07(bd,1H),0.69(t,3H),0.61-0.52(m,2H),-0.08(s,9H)；NMR 19F(376MHz,CDCh)6:-118.8andLCMS(M+H)+:m/z＝730.3
第9阶段：(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟 基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙 酸
将(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸2-(三甲基甲硅烷基)乙酯(170.0g，1.0当量)和CsF(70.7g，2.0当量)装入5L固定容器中，并在环境温度处添加DMF(510mL，3体积)。将混合物升温至60℃并在该温度老化7小时，此时反应完成。将混合物冷却至20℃并搅拌过夜。DMF用EtOAc(1700mL，10mL)和1M HCl(510mL，3体积)稀释。分离各层，进行浓缩前有机层依次用5％LiCl水溶液(4x680mL，4体积)和水(2x680mL，4体积)洗涤。将所得油状物从EtOAc中浓缩两次(每次250mL)，得到标题化合物，为淡黄色泡沫状(141g校正量，92重量％，96％产率)。将固体悬浮在EtOAc(684mL，4体积)中并加热至70℃，在该温度下保持1小时，然后经2小时冷却至20℃。在70分钟内添加庚烷(1370mL，8体积)并将浆液老化过夜。过滤固体，用EtOAc/庚烷1:2(2x300mL)洗涤，并在真空烘箱中在50℃处干燥至恒重，得到133g(86％产率)。
产物以稳定的无水结晶形式分离。这被指定为游离酸“形式F”，是一种稳定的结晶多晶型物。
XRPD在以下共振处出峰(表6)：
表6.
步骤10a：(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟 基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙 酸三(羟甲基)氨基甲烷盐
(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4)-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸(113.0g，1.0当量)和三(羟甲基)氨基甲烷(21.95g，1.01当量)以固体形式装入2L容器中。在氮气下搅拌加入甲醇(1130mL)，得到流动悬浮液。通过在30分钟内升温至38-40°溶解固体，得到澄清溶液。将其冷却至20°-22°，然后在Buchi旋转蒸发仪上减压浓缩，得到白色泡沫。将泡沫转移到结晶盘中并在真空下(约20mmHg)在60°处干燥一个周末(60小时)，得到呈易碎白色泡沫的标题化合物(134.1g；99.5)。
制备化合物1的其他方法可见于2018年10月04日以WO 2018/178691公布的国际专利申请PCT/GB2018/050845。
生物测定
实施例1-式(I°)的化合物
使用96孔板结合测定法(ELISA)测定MDM2-p53相互作用
ELISA测定法在链霉亲和素包被的板中进行，每孔用200μl的1μg ml-1生物素化的IP3肽预孵育。用PBS洗涤板后，板即可用于MDM2结合。
将96孔板中等分的在DMSO中的化合物和对照溶液以最终2.5-5％(v/v)DMSO浓度在室温(例如20℃)处与190μl优化浓度的体外翻译的MDM2等分试样预孵育20分钟，然后将MDM2-化合物混合物转移至b-IP3链霉亲和素板中，并在4℃处孵育90分钟。在用PBS洗涤三次以去除未结合的MDM2之后，每个孔在20℃处与TBS-吐温(50mM Tris pH7.5；150mM NaCl；0.05％吐温20非离子洗涤剂)缓冲的小鼠单克隆抗MDM2一抗溶液(Ab-5，Calbiochem，根据使用的抗体储备溶液以1/10000或1/200稀释度使用)孵育1小时，然后用TBS-吐温洗涤三次，然后在20℃处用TBS-吐温缓冲的山羊抗小鼠辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二抗溶液(根据抗体储备溶液以1/20000或1/2000使用)孵育45分钟。通过用TBS-Tween洗涤三次去除未结合的二抗。结合的HRP活性通过增强化学发光(ECLTM，Amersham Biosciences)测量，使用二酰肼底物鲁米诺的氧化来产生可量化的光信号。给定浓度下MDM2抑制的百分比计算如下：[1-(在化合物处理的样品中检测到的RLU-RLU阴性DMSO对照)÷(DMSO阳性对照和阴性对照的RLU)]×100或(在化合物处理的样品中检测到的RLU÷DMSO对照的RLU)x100。IC50是使用MDM2抑制％对比浓度的图计算的，并且是两个或三个独立实验的平均值。
蛋白质印迹分析
用的5μM、10μM和20μM化合物的0.5％ DMSO溶液处理SJSA细胞6小时。用冰冷的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞以及仅含0.5％ DMSO的对照并且通过以下方式制备蛋白质提取物：在SDS缓冲液(62.5mM Tris pH 6.8；2％十二烷基硫酸钠(SDS)；10％甘油)中超声处理2×5秒(Soniprep 150ME)裂解细胞以分解高分子量DNA并降低样品的粘度。使用PierceBCA测定系统(Pierce，Rockford，IL)估计样品的蛋白质浓度，并使用标准SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹程序对50μg蛋白质等分试样进行分析。添加β-巯基乙醇(5％)和溴酚蓝(0.05％)，然后将样品煮沸5分钟，接着短暂离心，然后装载到预浇铸的4-20％梯度Tris-甘氨酸缓冲的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)上。每块凝胶上都含有分子量标准品(SeeBlueTM,Invitrogen)，并且在Novex XL槽(Invitrogen)中在180伏下进行90分钟的电泳。使用BioRad电泳槽和25mM Tris、190mM甘氨酸和20％甲醇转移缓冲液在30伏或70伏两小时将分离的蛋白质通过电泳过夜从凝胶上转移到HybondC硝酸纤维素膜(Amersham)上。用于转移蛋白质的免疫检测的一抗是：1:1000的小鼠单克隆NCL-p53DO-7(Novocastra)；1:500的MDM2(Ab-1，克隆IF2)(Oncogene)；1:100的WAF1(Ab-1，克隆4D10)(Oncogene)；1:1000的肌动蛋白(AC40)(Sigma)。所用的二抗是1:1000的过氧化物酶偶联的、亲和纯化的山羊抗小鼠(Dako)。通过增强化学发光(ECLTM，Amersham)进行蛋白质检测和目视观察，通过暴露于蓝光敏感放射自显影胶片(Super RX，Fuji)进行光检测。
方案A：SJSA-1和SN40R2测定
测试的MDM2扩增细胞系是一对等基因匹配的p53野生型和突变骨肉瘤基因(分别为SJSA-1和SN40R2)。所有细胞培养均在补充有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基(Gibco，Paisley，UK)中生长，进行常规检测来确认支原体感染呈阴性。使用如前所述的磺基罗丹明(B)(SRB)方法测定细胞的生长及抑制。将100μl的3×104/ml和2×104/ml SJSA-1和SN40R2细胞分别接种到96孔组织培养板中，在5％ CO2加湿培养箱中在37℃处孵育24小时，然后将培养基更换为100μl含有一系列MDM2-p53拮抗剂浓度的测试培养基，再孵育72小时使细胞生长，然后在4℃处添加25μL的50％三氯乙酸(TCA)固定细胞1小时。用蒸馏水洗掉TCA，并向板的每个孔中添加将100μL的SRB染料(0.4％w/v在1％乙酸中)(Sigma-Aldrich，Poole，Dorset)。在室温下与SRB染料孵育30分钟后，用1％乙酸洗涤板，然后放干。SRB染色的蛋白质，是孔中细胞数目的量度，然后将其重悬于100μL的10mM Tris-HCl(pH10.5)中，并使用FluoStar Omega读板器在每个孔中测量λ＝570nm处的吸光度。使用Prism v4.0统计软件通过数据的非线性回归分析计算GI50。
方案B：SJSA-1和SN40R2测定
CellTiter-LuminescentCell Viability Assay是一种基于定量ATP的存在确定培养中活细胞数量的均相方法，ATP的存在表明存在代谢活性细胞。SJSA-1和SN40R2均在补充有10％FBS(PAA#A15-204)和10U/ml青霉素/链霉素的RPMI1640(LifeTechnologies#61870)中生长。将2000个细胞(75μl)接种到96孔板的每个孔中，并在37℃处在5％ CO2加湿培养箱中放置24小时。然后将一系列浓度的MDM2-p53拮抗剂的DMSO溶液添加到细胞中，使最终DMSO浓度为0.3％，并再孵育72小时让细胞生长。向所有孔中添加100μlCTG试剂(Promega#G7573)，并在顶部计数点测量发光。
EC50值由S型4参数曲线拟合，使用XLfit连同Activity Base(IDBS；Guildford,Surrey,UK)来确定。
抗增殖活性
使用Alamar Blue测定法测量对细胞生长的抑制作用(Nociari,M.M,Shalev,A.,Benias,P.,Russo,C.Journal of Immunological Methods 1998,213,157-167)。该方法基于活细胞将重苏灵还原为其荧光产物间苯二酚的能力。在每个增殖测定中，将细胞铺板到96孔板上，使其恢复16小时后，再添加抑制剂化合物处理72小时(在0.1％ DMSOv/v中)。在孵育期结束时，添加10％(v/v)Alamar Blue并且再孵育6小时，然后测定在535nM ex/590nMem处的荧光产物。本发明化合物的抗增殖活性可通过测量化合物抑制癌细胞系生长的能力来测定，例如可从DSMZ、ECACC或ATCC获得。
结果：其中cyc是苯基的第一组实例
表7–从如本文所述的测定法获得的生物数据
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在获得了多于一个数据点的情况下，上表示出了这些数据点的平均值(例如，几何或算术平均值)。
当然应当理解，本发明不旨在限于仅通过实施例的方式描述的上述实施方案的细节。
结果：其中cyc为Het的第二组实例
结果
表8–从如本文所述的测定法获得的生物数据
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在获得了多于一个数据点的情况下，上表示出了这些数据点的平均值(例如，几何或算术平均值)。
当然应当理解，本发明不旨在限于仅通过实施例的方式描述的上述实施方案的细节。
实施例2-DNA损伤反应(DDR)是化合物1的最主要的敏化途径，其通过CRISPR功能 丧失筛选鉴定并通过进一步的实验和数据证实。
在存在或不存在化合物1的情况下，在一组三个P53-野生肺癌细胞系中进行双重CRISPR筛选(CRISPR敲除和CRISPRi)，以鉴定MDM2拮抗剂敏感性的新型预测性生物标志物。
几种DNA损伤反应(DDR)相关基因被鉴定为最高命中物(图1A-图1B)。有趣的是，这些基因牵涉于几种DDR途径，诸如同源重组途径、范科尼贫血(FA)途径、碱基切除修复途径(BER)和复制应激途径。图1A显示CRISPR命中物中范科尼贫血途径的富集。
复制应激是基因组不稳定性的读出，并且由DDR途径中的多个缺陷引起，导致高水平的DNA损伤。高水平的DNA损伤转而影响DNA复制过程。CRISPR筛选数据指示在其DDR机器中具有缺陷的肿瘤通常对化合物1治疗敏感。
因此这些数据证明了MDM2拮抗剂敏感性与多种DDR途径(包括范科尼贫血(FA)途径和碱基切除修复(BER)途径)中的缺陷之间的联系。因此DDR途径中的功能丧失是MDM2拮抗剂敏感性的生物标志物。
为了证实CRISPR筛选的结果，将先前表征其对化合物1的敏感性的早期传代人间皮瘤细胞系用于鉴定凋亡样品和非凋亡样品之间差异性表达的转录组学特征。“复制应激”特征在间皮瘤凋亡细胞系中强烈富集，证实化合物1敏感性与活化的DDR途径之间的联系(图1C)。
以下实施例描述了对多个系统的生物信息学和湿实验室分析，这些分析验证DDR途径中的特定生物标志物为MDM2拮抗剂敏感性的生物标志物。这些另外验证的生物标志物途径汇总于图5中。除了提供关于例示的生物标志物途径的进一步证据之外，这些数据更通常地再次证实CRISPR筛选数据的可靠性。
全基因组CRISPR筛选数据的生物信息学分析
在化合物1的存在下，全基因组双重LoF筛选筛选(CRISPRko和CRISPRi)通过Horizon Discovery(https://horizondiscovery.com)在一组三个P53野生型肺癌细胞系(A549、NCI-H460、NCI-H292)中进行。CRISPRko和CRISPRi平行运行并一起分析以鉴定潜在命中物和对化合物1致敏途径。
NGS分析显示出优良的QC，平均质量评分为35，所有样品测序>97％的读数，质量评分大于30。总之，所有样品的重复之间存在优良相关性。对照sgRNA(阳性、阴性和非靶向)表现如预期的那样，与初始文库质粒相比在对照处理的样品中有明显的必需基因漏失。
使用两种不同的计算方法：DrugZ和MAGeCK，通过Horizon以及内部分析数据。按倍数变化和显著性p值对CRISPR命中物进行分级。在CRISPRko和CRISPRi之间存在显著命中物的良好重叠。鉴定了独特的和重叠的致敏基因，特别是与DNA损伤修复(DDR)相关的基因在筛选中显示出强漏失。进一步地，CRISPR命中物的网络分析显示来自范科尼贫血途径的基因的强富集，表明在链间交联修复中起作用(FANCA、FANCB、FANCD2)(图1A)。对CRISPR命中物进行基因集富集分析(GSEA)，所述命中物使用不同的基因集特征按倍数变化值分级：Hallmark、Reactome、KEGG和Biocarta途径。GSEA结果揭示DNA修复相关途径诸如碱基切除修复途径和同源重组(图1B)在耗损最多的命中物中显著富集。
基于我们从CRISPR筛选的发现，我们还在我们的凋亡和非凋亡间皮瘤细胞系的内部RNA-seq数据中研究了DDR基因表达特征。
早期传代人间皮瘤细胞系购自UK Mesobank(www.mesobank.com)。使用IlluminaHiSeq平台和每个样品的3个生物重复，通过配对末端、链RNA测序对mesobank细胞系进行基因表达谱分析。测序由GATC Biotech(现为Eurofins Genomics)完成，并且RNA-seq数据的生物信息学分析在内部完成。每个样品平均产生约3700万条读数。使用STAR对齐器(v2.5.4b)将RNA-seq读数与人类基因组hg38/GRCh38对齐。平均而言，94％的读数与基因组唯一一致。基于GENCODE v27注释，使用HTSeq软件套件(版本0.11.1)的htseq计数工具将对齐的BAM文件用于转录和基因定量。采用来自DESeq2 R包(v1.20.0)的方差稳定转换函数用于对原始计数数据进行归一化，并进行非监督的层次聚类。生物重复高度相关(R2＝0.98)。使用DESeq2 R包进行差异基因表达。认为具有超过2倍表达且调整后的P值<1e-7的基因在凋亡和非凋亡样品之间显著差异性表达。有趣的是，我们发现与凋亡间皮瘤细胞系中的复制应激相关的基因的显著上调(图1C)，这与CRISPR数据筛选输出一致。
HR途径：BRCA1、BRCA2和ATM改变
在CRISPR筛选中鉴定了牵涉同源重组途径的基因。同源重组(HR)是无错误的DSB修复途径，其在很大程度上限于细胞周期的S期和G2期。通过鉴定多种癌症中BRCA1、BRCA2、ATM、CHEK2、RAD50、RAD51C中的几种癌症失能突变，证实了HR途径对于基因组维持的巨大重要性。
HR的中心组分之一是丝氨酸-苏氨酸激酶共济失调毛细血管扩张突变蛋白(ATM)，使DDR各分支中的许多关键参与者磷酸化。通常在淋巴恶性肿瘤以及几种实体瘤中发现体细胞ATM突变或缺失，导致蛋白质表达的丢失和基因组中DNA双链断裂修复的损害。
对MDM2的公开可用的DepMAP RNAi数据(版本20Q4)的生物信息学分析预测，与ATM野生细胞系相比，ATM突变细胞系显著更依赖于MDM2(图2a)。此外，与全部为ATM野生型的非凋亡细胞系(6/6)相比，在患者来源的凋亡性间皮瘤细胞系(6/9)中检测到ATM突变的强烈富集(图2B)。
进一步地，对来自不同适应症的四种ATMmut细胞系(HCC1500-乳腺、LNCap-前列腺、HT-144-黑素瘤、HepG2-肝脏)的体外验证显示对化合物1的敏感性，正如通过细胞增殖的减少所测量的(图2C)，同时关于LNCap-前列腺和HepG2-肝脏的数据显示对化合物1的敏感性，正如通过增加的细胞凋亡所测量的(图2D)。此外，蛋白质印迹分析显示在化合物1处理后DDR信号传导途径的明显调节(图2E)。
与鉴定ATM突变为MDM2拮抗剂敏感性的生物标志物一起，额外的生物信息学分析指示其他HR途径基因的丢失或突变可充当MDM2拮抗剂敏感性的生物标志物。可充当MDM2拮抗剂治疗的生物标志物的HR途径基因包括但不限于BRCA1和/或BRCA2。
为了证实ATM、BRCA1和/或BRCA2突变(或表达的丢失)是否可能与MDM2拮抗剂敏感性有联系，对患者来源的类器官(PDO)进行了进一步的体外验证。在ATM、BRCA1和/或BRCA2中有改变的各种适应症的4个PDO显示出对化合物1的敏感性，正如通过细胞增殖的减少所测量的(图2F-图2G)。值得注意的是，来自相同适应症但在ATM、BRCA1和/或BRCA2中没有改变的4个另外的PDO对化合物1有抗性。
还鉴定FA途径基因为MDM2拮抗剂治疗的生物标志物。
生物信息学分析
我们从DepMAP(www.depmap.org)查询了癌细胞系的公开可获得的MDM2 RNAi依赖性数据(版本20Q4)。从DepMAP数据集获得了这些癌细胞系的基因组特点，诸如体细胞突变和拷贝数改变。我们发现差异性依赖于MDM2的细胞系富集ATM中的突变(图2A)。基于我们对来自公开可获得的RNAi依赖性数据集的ATM突变的发现，我们进一步研究了在我们专有的一组凋亡和非凋亡间皮瘤细胞系中ATM基因的状态(图2B)。
间皮瘤细胞系的DNA分离和外显子测序由GATC Biotech(现Eurofins)根据其指导进行。提取基因组DNA并使用Agilent SureSelect Human All Exon V6试剂盒进行外显子组测序。构建测序文库并使用101bp配对末端测序，通过Illumina HiSeq分析。在进行任何进一步处理之前去除低质量调用(平均Phred评分低于15)，并且仅使用配对(mate pair)(正向和反向读数)进行分析。使用BWA vO.7.15以默认参数进行对参考人基因组组件hg19的映射。平均而言，96％的读数唯一地映射到参考基因组，并且平均靶覆盖为94.02±18.66倍。外显子组数据用于调用单核苷酸多态性(SNP)和插入-缺失(InDel)，其由GATC Biotech使用GATK和Ingenuity软件进行。也在内部使用VarScan2分析数据。我们仅考虑通常通过至少两种方法调用的SNP和InDel以获得高置信度结果。对于GATK，通过进行局部比对来改进序列比对，并使用PICARD(http://picard.sourceforge.net/)去除PCR重复。SNP和InDel调用使用GATK的Haplotype Caller进行，并使用snpEff注释。对于varScan2，使用SAMtool、mpileup数据作为输入并以体细胞模式运行varScan2来调用SNP和InDel。考虑通过至少两种方法预测为有害的功能丧失突变的ATM突变用于进一步分析。
对癌细胞系的增殖测定
癌细胞在适当的培养基中培养。将细胞收获、计数、调整至适当的密度并以100μL的体积接种到96孔不透明壁透明底板中，并在5％ CO2加湿气氛中在37℃处孵育过夜。在DMSO中制备浓度10m的化合物1的储备液。储备液在DMSO中进一步稀释，然后添加到含有细胞的96孔板重复的孔中，得到0.1％的DMSO终浓度。然后将板在5％ CO2的加湿气氛中在37℃处孵育3天。每个细胞系一式三份地进行测试。向测定板的每个孔中添加100μL的CellTiter-Glo试剂。将板在定轨振荡器上混合10分钟，然后在室温下孵育10分钟。然后在EnSpire读板器中读取该板(用于发光)。计算每个孔，减去仅培养基对照(无细胞)作为平均DMSO对照减去仅培养基对照的百分比。使用GraphPad Prism(GraphPad Software,LaJolla California USA)计算S型剂量反应(可变斜率)曲线和IC50值。
细胞凋亡测定
将细胞以每孔2×105个的密度接种到6孔板中，并在空气中在5％ CO2的加湿气氛中在37℃处孵育过夜。在DMSO中制备化合物1，并以所示浓度添加到细胞中。细胞与化合物孵育72小时后，将细胞用胰蛋白酶消化，用PBS洗涤并立即用于流式细胞术分析。
根据制造商的建议，用eBioscienceTM膜联蛋白V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(#BMS500FI-100，Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)对样品进行染色。简言之，将样品在PBS中洗涤并在室温处重悬于200μl含有5μl
膜联蛋白V-FITC的1×结合缓冲液中。孵育后，用1×结合缓冲液洗涤样品并重悬于200μl的1×结合缓冲液和10μl的20μg/ml PI中。
然后立即在Guava easyCyte HT细胞计数器(Merck-Millipore)上通过流式细胞术分析染色的样品。将细胞群分成三个组：仅显示低水平荧光的活细胞(膜联蛋白V-/PI-)、显示绿色荧光的凋亡细胞(膜联蛋白V+/PI-)和显示红色和绿色荧光的死细胞(膜联蛋白V+/PI+)。使用Microsoft excel进行数据分析并在Prism版本7(GraphPad Software,California,USA)上对结构进行作图。
蛋白质印迹
通过取细胞团块并添加冰冷的1x完全Tris裂解缓冲液(1％ Triton x-100、150mMNaCl、20mM Tris.HCl pH 7.5，加上蛋白酶抑制剂(完全迷你型，1片/10ml，Roche,WelwynGarden City,Herts,UK)、50mM NaF和1mM Na3V04)来制备细胞裂解物。将样品漩涡震荡并在冰上放置30分钟。通过在冷却的微量离心机中以14,000rpm离心15分钟来净化裂解物，并取出上清液样品用于蛋白质测定(BCA测定-Pierce,Paisley,UK)。
然后通过蛋白质印迹分析细胞裂解物。将等量的蛋白质裂解物与SDS样品缓冲液(Novex,Paisley,UK)和DTT混合，然后煮沸10分钟。通过SDS PAGE(4-12％ Nu-PAGE凝胶-Novex,Paisley,Scotland)分解样品，印迹到硝酸纤维素滤纸上，用Odyssey封闭缓冲液(LI-COR Bioscience,Lincoln,USA)封闭，并与稀释于Odyssey封闭缓冲液中的特异性一抗在4℃处孵育过夜。洗涤后，将印迹与用Odyssey封闭缓冲液(LiCor Biosciences，Lincoln，USA)以1:10,000稀释的红外染料标记的抗兔IR800或抗山羊IR800二抗度孵育1小时。然后扫描印迹以检测Odyssey红外成像系统(LiCOR Biosciences，Lincoln，USA)上的红外荧光。
对患者来源的类器官(PDO)的增殖测定
从CrownBIO类器官库中取回类器官并扩增，之后根据标准操作程序获得足够数量之前。在类器官接种前一天，使用50％ Matrigel和50％相应培养基使所需数目的类器官1:1传代。在第0天，接种类器官并添加化合物：通过向6孔板的每个孔中添加20μl 100xDispase溶液并在37℃处孵育30分钟来收集类器官。在孵育后，从所有孔中收集类器官并通过预润湿的100μm过滤器移液至50ml塑料管中，然后在预润湿的20μm过滤器上过滤流体，倒转20μm过滤器并将类器官回收在新的50ml管中，然后将收集的类器官重悬于相应的培养基中，并计数。通过Multidrop分配器将类器官细胞悬浮液添加到384孔板中。在类器官接种后2小时-4小时，通过Tecan D300e添加化合物，然后将板放回培养箱中孵育5天。在第5天，通过CellTiter-Glo测定法测定增殖。向测定板的每个孔中添加CTG试剂。将板在定轨振荡器上混合10分钟，然后在室温下孵育10分钟。然后在Envision读板器中读取该板(用于发光)。
NHEJ途径：ATRX丢失
另外，对细胞组数据的生物信息学分析预测ATRX的丢失是对MDM2化合物1的敏感性的显著生物标志物(图3)。ATRX还通过非同源末端连接(NHEJ)和同源重组修复(HRR)参与DDR的调控。
鉴定ATRX丢失为MDM2拮抗治疗的生物标志物及生物信息学分析证明其他NHEJ或HRR途径基因的丢失或突变可充当MDM2拮抗剂敏感性的生物标志物。
生物信息学分析
在一组237个癌细胞系中对化合物1进行筛选。从原始剂量反应曲线计算IC50和活性面积。这些细胞系的基因组特点诸如体细胞突变、拷贝数改变和超甲基化，从Garnett等 人(2016)提及的癌症功能事件列表中获得。使用ANOVA方法鉴定基因组特点与药物反应的显著关联。我们将ATRX丢失鉴定为化合物1敏感性的统计学上显著的(调整后的p值<0.20)生物标志物(图3a和图3b)。
MMR途径：微卫星不稳定性(MSI)
微卫星是含有1至5个碱基对基序的多个重复的区域，其广泛地分散在整个人类基因组中。在正常细胞中，在细胞分裂期间通过错配修复(MMR)验证并维持微卫星的重复计数。MMR系统的损害可致使细胞在细胞分裂期间不能调控其微卫星的长度，称为MSI(微卫星不稳定性)。已经在几种类型的癌症(结直肠癌、子宫内膜癌和胃腺癌)中经常地观察到MSI，并且已经证实MSI-高的结直肠肿瘤对免疫增强疗法更敏感。
在细胞组数据中，MSI-H结直肠细胞系对化合物1敏感。从Sanger Cell ModelsPassport数据库获得关于微卫星稳定性和肿瘤细胞突变负荷的信息。我们发现MSI-H细胞系表现出高的肿瘤突变负荷(突变/Mb)并且富含与DNA错配修复途径(例如MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、MLH3、PMS2)相关的突变。进一步地，MSI-H细胞系显示与DNA错配修复中的缺陷及POLD1和/或POLE突变相关的突变特征的强烈富集(图4A)。总之，这些发现是一致的并且表明MSI肿瘤诸如结直肠肿瘤、子宫内膜样肿瘤和胃部肿瘤对MDM2拮抗剂敏感。进一步地，对来自不同适应症的八种MSI-H细胞系的体外验证显示对化合物1的敏感性，正如通过细胞增殖的减少所测量的(图4B)。为了证实MSI-H状态是否可能与MDM2拮抗剂敏感性有联系，对患者来源的类器官(PDO)进行了进一步的体外验证。6种MSI-H结直肠癌PDO显示出对化合物1的敏感性，正如通过细胞增殖的减少所测量的(图4C)。体内功效数据证实化合物1在MSI-H结直肠癌(HCT-116)的异种移植模型中显著抑制肿瘤生长(图4D)。
对癌细胞系的增殖测定
癌细胞在适当的培养基中培养。将细胞收获、计数、调整至适当的密度并以100μL的体积接种到96孔不透明壁透明底板中，并在5％ CO2加湿气氛中在37℃处孵育过夜。在DMSO中制备浓度10m的化合物1的储备液。储备液在DMSO中进一步稀释，然后添加到含有细胞的96孔板重复的孔中，得到0.1％的DMSO终浓度。然后将板在5％ CO2的加湿气氛中在37℃处孵育3天。每个细胞系一式三份地进行测试。向测定板的每个孔中添加100μL的CellTiter-Glo试剂。将板在定轨振荡器上混合10分钟，然后在室温下孵育10分钟。然后在EnSpire读板器中读取该板(用于发光)。计算每个孔，减去仅培养基对照(无细胞)作为平均DMSO对照减去仅培养基对照的百分比。使用GraphPad Prism(GraphPad Software,LaJolla California USA)计算S型剂量反应(可变斜率)曲线和IC50值。
对患者来源的类器官(PDO)的增殖测定
从CrownBIO类器官库中取回类器官并扩增，之后根据标准操作程序获得足够数量之前。在类器官接种前一天，使用50％ Matrigel和50％相应培养基使所需数目的类器官1:1传代。在第0天，接种类器官并添加化合物：通过向6孔板的每个孔中添加20μl 100xDispase溶液并在37℃处孵育30分钟来收集类器官。在孵育后，从所有孔中收集类器官并通过预润湿的100μm过滤器移液至50ml塑料管中，然后在预润湿的20μm过滤器上过滤流体，倒转20μm过滤器并将类器官回收在新的50ml管中，然后将收集的类器官重悬于相应的培养基中，并计数。通过Multidrop分配器将类器官细胞悬浮液添加到384孔板中。在类器官接种后2小时-4小时，通过Tecan D300e添加化合物，然后将板放回培养箱中孵育5天。在第5天，通过CellTiter-Glo测定法测定增殖。向测定板的每个孔中添加CTG试剂。将板在定轨振荡器上混合10分钟，然后在室温下孵育10分钟。然后在Envision读板器中读取该板(用于发光)。
体内功效
将5×106个HCT116细胞(在10μl的PBS中)皮下注射到多组BALB/c裸鼠的右后胁腹中。通过使用一对数字卡尺从外部测量肿瘤并按照长度x宽度2×0.523计算体积。在开始研究之前，根据肿瘤体积将小鼠分组，每组8只；平均体积应约为100mm3，正常范围为50mm3-150mm3。每天以50mg/kg的化合物1对小鼠进行给药，并在实验期间每天记录体重。如果动物显示出任何毒性迹象或者如果体重下降到初始体重的85％以下，则停止给药。每2天至3天测量肿瘤体积；当肿瘤体积>1000mm3时或者如果肿瘤开始显示出任何异常诸如溃疡形成，将动物处死。
DDR途径数据的汇总
双重功能丧失CRISPR筛选将DDR途径鉴定为对MDM2拮抗最致敏的命中物。这些分析通常与HORIZON(HR、复制应激、NER、FA途径)一致。
进一步的分析支持DDR缺陷与MDM2拮抗剂敏感性之间的联系：
·患者来源的凋亡间皮瘤中存在的DDR/复制应激特征
·ATRX突变与肉瘤中的IFN簇相关
·除1个外，所有患者来源的凋亡间皮瘤系都携带ATM突变。非凋亡细胞系都是ATM野生型。
·ATM突变与RNAi数据集中的MDM2依赖性相关；与临床中无对照的观察结果一致
·ATM突变细胞系(HCC1500、HT-144、LNCap、HepG2)对化合物1显示出增加的敏感性
·BRCA1、BRCA2和/或ATM突变型患者来源的类器官与那些基因中不携带改变的PDO相比对化合物1显示出增加的敏感性
·来自各种适应症和患者来源的结直肠癌模型的MSI-H细胞系对化合物1显示出的敏感性
·化合物1在MSI-H异种移植模型(HCT-116)中显著抑制肿瘤生长
实施例3-化合物1与PARP抑制剂对癌细胞活力的组合效应
目的：
本研究的目的是研究化合物1与2种化合物对癌细胞活力的潜在组合效应。首先，在与不同测试品浓度孵育后使用CellTiter-Glo(CTG)发光细胞活力测定，测定3种化合物的50％抑制浓度(IC50)。然后，分别通过组合基质评价化合物1与1种化合物(奥拉帕尼、他拉唑帕尼)的组合的协同效应。
实验设计
用单独的测试品、基质与测试品的组合和作为媒剂对照的培养基处理细胞系。
材料和方法
1.细胞系
细胞系名称 组织来源 参考对照 孵育时间
CAL-51 乳房 顺铂 72h
A2780 卵巢 顺铂 72h
在补充有10％ FBS(胎牛血清)的培养基中，在37℃的温度、5％ CO2和95％湿度下培养细胞。
2.材料和试剂
一般细胞培养试剂和塑料。
FBS，(目录号FND500，ExCell Bio)
96孔平面透明底黑色聚苯乙烯TC处理的微孔板(目录号3603，Corning)。
CellTiter发光细胞活力测定(目录号G7572，Promega)/>
试剂制备
a.将CellTiter-Glo缓冲液解冻，并且在使用前平衡至室温(RT)。
b.使用前将冻干的CellTiter-Glo底物平衡至室温。
c.将适当体积(100mL)的CellTiter-Glo缓冲液转移到含有CellTiter-Glo底物的琥珀色瓶中以重构冻干的酶/底物混合物。这样形成CellTiter-Glo试剂。
底物小瓶。
d.通过轻轻涡旋、旋转或通过倒转内容物混合以获得均匀溶液。CellTiter-Glo底物应在小于一分钟内容易地进入溶液。
3.测试品和参考对照
3.1测试品：
项号 样品标签 样品描述 量(小瓶，mg) 储存条件 分子量 溶剂
1 化合物1 粉末 31.41mg+30.75mg RT 751.74 DMSO
2 奥拉帕尼 粉末 10.74mg+12.54mg RT 434.51 DMSO
3 他拉唑帕尼 粉末 11mg+12.12mg RT 380.39 DMSO
3.2参考对照：
受试者 分子量 包装 供应商 性质 储存
顺铂 300.05 20mg Qilu Pharm,China 粉末 RT
半最大抑制浓度IC50的测定
部分1：使用CellTiter-GloTM细胞活力测定法测定IC50
1.在对数生长期收获细胞并对细胞数进行计数。
2.用相应的培养基将细胞浓度调节至4.0×104个细胞/mL。
3.向三张96孔板(板A、板B和板C)中添加100μL细胞悬浮液，最终细胞密度为4×103个细胞/孔。
4a.次日：对于T0读数的板：
1)将板A及其内容物在室温处平衡大约30分钟。
2)向每个孔中添加50μL CellTiter-Glo试剂。
3)在定轨振荡器上混合内容物5分钟以诱导细胞裂解。
4)使板在室温处孵育20分钟以稳定发光信号。
5)使用EnVision多标记读数器记录发光(T0)。
4b.对于测试读数的板：
1)制备500×测试品溶液(最高工作浓度：在培养基中10μM/100μM测试品，3倍连续稀释以获得9个剂量水平。
2)制备10×参考对照溶液(最高工作浓度：在培养基中100μM，3.16倍连续稀释。
3)使用数字分配器在板B的每个孔中分配500×药物溶液(每个药物浓度一式三份)。(在培养基中的DMSO最终浓度：0.2％[v/v])
4)用液体处理Biomek FXP取出参考对照板C的10μL培养基
5)在板C的每个孔中分配10μL(10×)参考对照药物溶液(每个药物浓度一式三份。
6)将测试板B和测试板C在加湿培养箱中在37℃处以5％CO2孵育72小时，然后通过CTG测定法测量。
5.将板及其内容物在室温处平衡大约30分钟。
6.向每个孔中添加50μL CellTiter-Glo试剂。
7.在定轨振荡器上混合内容物5分钟以诱导细胞裂解。
8.使板在室温处孵育20分钟以稳定发光信号。
9.使用EnVision多标记读数器记录发光(T3)。
部分2：协同作用或拮抗作用测定
1.在对数生长期收获细胞并对细胞数进行计数。
2.用相应的培养基将细胞浓度调节至4.0×104个细胞/mL。
3.向三张96孔板(板A、板B、板C、板D)中添加100μL细胞悬浮液，最终细胞密度为4×103个细胞/孔。
4a.次日：对于T0读数的板：
1)将板A及其内容物在室温处平衡大约30分钟。
2)向每个孔中添加50μL CellTiter-Glo试剂。
3)在定轨振荡器上混合内容物5分钟以诱导细胞裂解。
4)使板在室温处孵育20分钟以稳定发光信号。
5)使用EnVision多标记读数器记录发光(T0)。
4b.对于测试读数的板：
1)制备每种测试品的药物溶液，剂量范围：10μM、3.33μM、1.11μM、0.37μM、0.12μM、0.041μM。
2)使用数字分配器在测试板B、C、D的每个孔中同时分配每个测试品的1000×药物溶液(每个药物浓度一式三份)以获得以下最终浓度：10μM、3.33μM、1.11μM、0.37μM、0.12μM、0.041μM。
3)将测试板B、C、D在加湿培养箱中在37℃处以5％ CO2孵育72小时，然后通过CTG测定法测量。
4)将板及其内容物在室温处平衡大约30分钟。
5)向每个孔中添加50μL CellTiter-Glo。
6)在定轨振荡器上混合内容物5分钟以诱导细胞裂解。
7)使板在室温处孵育20分钟以稳定发光信号。
注意：标准板内不均匀的发光信号可由温度梯度、细胞的不均匀接种或多孔板中的边缘效应引起。
8)使用EnVision多标记读数器记录发光(T3)。
数据分析
部分1：IC50测定
使用GraphPad Prism 5.0以图形显示数据。
为了计算绝对IC50(EC50)，将使用具有S形剂量反应的非线性回归模型拟合剂量反应曲线。用于计算存活率的公式如下所示，并且绝对IC50(EC50)将根据由GraphPadPrism 5.0生成的剂量-反应曲线计算。
存活率(％)＝(Lum测试品-Lum培养基对照)/(Lum未处理 _Lum培养基对照)×100％。
部分2：协同作用或拮抗作用测定
基于Combenefit软件[Bioinformatics 2016,32(18),2866-2868.]，使用用于计算协同作用-最高单一试剂(HSA)的三种内置算法之一计算协同作用[Naturebiotechnology 2012,30(11),1125-30]。
高于5的平均Δ评分(超过预期的5％反应)被认为是显著的。
本文报道的Δ评分指示在某些特定剂量水平下超过药物组合预期的反应百分比。高于5的Δ评分(超过预期的5％反应)被认为是显著的。
结果
据报道*A2780携带DDR缺陷(The Journal of Molecular Diagnostics第21卷，第2期，2019年3月，第198-213页)。
结果显示化合物1和PARP抑制剂之间有明确协同作用。具体而言，结果显示在DDR耗损的细胞系中化合物1和PARP抑制剂之间有明确协同作用。
药物配方实例
(i)片剂配方
通过将适量的化合物(例如，50mg-250mg)与适当的稀释剂、崩解剂、压缩剂和/或助流剂混合来制备含有式(I°)化合物的片剂组合物。一种可能的片剂包括50mg化合物和197mg乳糖(BP)作为稀释剂和3mg硬脂酸镁作为润滑剂并以已知方式压制形成片剂。压制而成的片剂可以任选地进行薄膜包衣。
(ii)胶囊配方
通过将100mg-250mg式(I°)化合物与等量乳糖混合并将所得的混合物填充到标准硬明胶胶囊中来制备胶囊配方。可以根据需要以适当的量包括适当的崩解剂和/或助滑剂。
(iii)可注射配方I
可以通过将式(I°)化合物(例如，以盐形式)溶解在含有10％丙二醇的水中以得到浓度为1.5重量％的活性化合物来制备通过注射施用的肠胃外组合物。然后将溶液做等渗处理，过滤灭菌或最终灭菌，装入安瓿或小瓶或预填充注射器中，并密封。
(iv)可注射配方II
通过将式(I°)化合物(例如，以盐形式)(2mg/ml)和甘露醇(50mg/ml)溶解在水中，将溶液无菌过滤或通过最终灭菌并填充到可密封的1ml小瓶或安瓿或预填充注射器中来制备注射用肠胃外组合物。
(v)可注射配方III
可通过将式(I°)化合物(例如，以盐形式)以20mg/ml溶解在水中并且然后调整等渗性来制备用于通过注射或输注进行静脉内递送的配方。然后将小瓶密封，并通过高压灭菌，或装入安瓿或小瓶或预填充注射器中，通过过滤灭菌，并密封。
(vi)可注射配方IV
可通过将式(I°)化合物(例如，以盐形式)以20mg/ml溶解在含有缓冲液(例如，0.2M乙酸盐pH 4.6)的水中来制备通过注射或输注进行静脉内递送的配方。然后将小瓶、安瓿或预填充注射器密封，并通过高压灭菌或通过过滤灭菌，并密封。
(vii)皮下或肌肉内注射配方
通过将式(I°)化合物与药用级玉米油混合以得到5-50mg/ml的浓度来制备用于皮下或肌肉内施用的组合物。将组合物灭菌，并装入合适的容器中。
(viii)冻干配方I
将调配的式(I°)化合物的等分试样放入50ml小瓶中并冻干。在冻干期间，使用一步冷冻方案将组合物在(-45℃)下冷冻。将温度升至-10℃以进行退火，然后降至-45℃冷冻，然后在+25℃处初次干燥大约3400分钟，然后进行二次干燥，如果温度达到50℃，则增加步骤。将初次和二次干燥期间的压力设定为80毫托。
(ix)冻干配方II
将调配的如本文所定义的式(I°)化合物或其盐的等分试样放入50mL小瓶中并冻干。在冻干期间，使用一步冷冻方案将组合物在(-45℃)下冷冻。将温度升至-10℃以进行退火，然后降至-45℃冷冻，然后在+25℃处初次干燥大约3400分钟，然后进行二次干燥，如果温度达到50℃，则增加步骤。将初次和二次干燥期间的压力设定为80毫托。
(x)用于静脉内施用的冻干配方III
通过将式(I°)化合物溶解在缓冲液中来制备水性缓冲溶液。将缓冲溶液装入容器(例如1型玻璃小瓶)，进行过滤以去除颗粒物质，然后将其部分密封(例如，通过Fluorotec活塞)。如果化合物和配方足够稳定，则通过在121℃处高压灭菌合适的时间段对配方进行灭菌。如果配方对高压灭菌不稳定，则可以使用合适的过滤器对其进行灭菌，并在无菌条件下装入无菌小瓶中。使用合适的循环将溶液冷冻干燥。冷冻干燥循环完成后，将小瓶用氮气回填至大气压力，加塞并固定(例如，用铝卷边)。对于静脉内施用，冷冻干燥的固体可以用药学上可接受的稀释剂，如0.9％盐水或5％右旋糖重构。溶液可以按原样给药，或可以在施用前进一步稀释到输注袋(含有药学上可接受的稀释剂，如0.9％盐水或5％右旋糖)中。
(xii)瓶装粉末剂
通过用式(I°)化合物填充瓶子或小瓶来制备用于口服施用的组合物。然后用合适的稀释剂，例如水、果汁或可商购获得的媒剂，如OraSweet或Syrspend对组合物进行重构。可以将重构的溶液分配到给药杯或口服注射器中以进行施用。
应当理解，本文描述的实施例和实施方案仅用于说明目的，并且将向本领域的技术人员提出根据其的各种修改或变化，并且将被包括在本申请的精神和范围内以及本申请的范围内。附加权利要求。本文引用的所有出版物、序列登录号、专利和专利申请均出于所有目的通过引用整体并入本文。

Claims (58)

1.一种在治疗癌症的方法中使用的MDM2拮抗剂，其中所述癌症耗损一种或多种DNA损伤修复(DDR)途径中的一种或多种基因或基因产物，或者其中所述癌症在至少一种DDR途径基因中具有至少一种功能丧失突变，其中所述一种或多种DDR途径基因或基因产物包含BRCA1和/或BRCA2。
2.根据权利要求1所述的在方法中使用的MDM2拮抗剂，其中所述一种或多种DDR途径是：
a.同源重组修复(HRR)途径；
b.非同源末端连接(NHEJ)途径；
c.错配修复(MMR)途径；
d.范科尼贫血(FA)途径；和/或
e.碱基切除修复(BER)途径。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的在方法中使用的MDM2拮抗剂，其中：
所述一种或多种基因或基因产物包含除ATM以外的HRR途径基因或基因产物或由除ATM以外的HRR途径基因或基因产物组成；或者
所述一种或多种基因或基因产物包含BRCA1和/或BRCA2和ATM或由BRCA1和/或BRCA2和ATM组成。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的在方法中使用的MDM2拮抗剂，其中所述一种或多种基因或基因产物包含ATRX。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的在方法中使用的MDM2拮抗剂，其中：
所述一种或多种基因或基因产物包含MSH2、MSH3、MSH6、MLH1、MLH3、PMS2、POLE和/或POLD1；或者
所述癌症包含突变特征SBS6或与DNA错配修复中的缺陷相关的SBS26，和/或POLD1突变特征SBS20。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的在方法中使用的MDM2拮抗剂，其中所述一种或多种基因或基因产物包含FANCA、FANCB、FANCC、FANCD1、FANCD2、FANCE、FANCF、FANCG、FANCI、FANCJ、FANCL、FANCM、FANCN、FANCO、FANCP、FANCQ、FANCR、FANCS、FANCT、FANCU、FANCV和/或FANCW。
7.根据任一前述权利要求所述的在方法中使用的MDM2拮抗剂，其中通过评估所述癌症的微卫星不稳定状态和/或肿瘤突变负荷来检测DDR基因的耗损或突变，任选地其中所述癌症是MSI高的。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的所用MDM2拮抗剂，其中在治疗前测试患者组织样品以确定所述癌症表达谱。
9.根据权利要求8所述的所用MDM2拮抗剂，其中所述样品包括癌症DNA、ctDNA或癌细胞。
10.根据权利要求8或权利要求9所述的所用MDM2拮抗剂，其中所述测试包括检测蛋白质、mRNA和/或ctDNA的测定法。
11.根据权利要求10所述的所用MDM2拮抗剂，其中(i)使用免疫测定法、蛋白质结合测定法、基于抗体的测定法、基于抗原结合蛋白的测定法、基于蛋白质的阵列、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、流式细胞术、蛋白质阵列、印迹、蛋白质印迹、浊度测定法、比浊法、色谱法、质谱法、酶活性、放射免疫测定法、免疫荧光法、免疫化学发光法、免疫电化学发光法、免疫电泳法、竞争性免疫测定法或免疫沉淀检测蛋白质；并且/或者(ii)其中使用RT-PCR或定量基因表达测定法检测mRNA；并且/或者(iii)其中通过下一代测序检测DNA或RNA；并且/或者(iv)其中通过免疫组织化学检测蛋白质。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的所用MDM2拮抗剂，其中基于所确定的表达谱选择所述患者进行治疗。
13.根据任一前述权利要求所述的所用MDM2拮抗剂，其中所述癌症是：
急性髓样白血病(AML)、鳞状细胞癌或头、颈、皮肤、胃肠系统或生殖道的肿瘤；或
前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌或妇科癌症；或
结直肠癌、胃癌或妇科癌症。
14.根据任一前述权利要求所述的所用MDM2拮抗剂，其中所述癌症是P53野生型。
15.根据任一前述权利要求所述的所用MDM2拮抗剂，其中所述癌细胞在所述治疗步骤之后发生细胞凋亡。
16.根据任一前述权利要求所述的所用MDM2拮抗剂，其中在至少一部分癌细胞中所述MDM2拮抗剂诱导活化的半胱天冬酶-3。
17.根据权利要求16所述的所用MDM2拮抗剂，其中在至少40％的癌细胞或至少60％的癌细胞中所述MDM2拮抗剂诱导活化的半胱天冬酶-3。
18.根据任一前述权利要求所述的所用MDM2拮抗剂，其中所述癌症显示：
相对于对照，CDKN2A、BAP1和SKP2中的一种、两种或三种的表达降低；和/或
相对于对照，干扰素特征基因中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种的表达增加。
19.根据权利要求18所述的所用MDM2拮抗剂，其中：
所述干扰素特征基因是CXCL10、CXCL11、RSAD2、MX1、BATF2、IFI44L、IFITM1、ISG15、CMPK2、IFI27、CD74、IFIH1、CCRL2、IFI44、HERC6、ISG20、IFIT3、HLA-C、OAS1、IFI35、IRF9、EPSTI1、USP18、BST2、CSF1、C1S、DHX58、TRIM14、OASL、IRF7、LGALS3BP、DDX60、LAP3、LAMP3、PARP12、PARP9、SP110、PLSCR1、WARS、STAT1、IRF3、IRF5、MSC、JUN、SPI1、IRF1、COMMD3-BMI1、STAT2、RUNX3、SREBF1和FLI1；或者
所述癌症显示CXCL10或CXCL11的表达增加。
20.根据任一前述权利要求所述的所用MDM2拮抗剂，其中所述癌症显示以下中的一种、两种、三种、四种、五种或更多种的表达增加：IRF7、STAT1、IRF3、IRF5、MSC、JUN、SPI1、IRF1、COMMD3-BMI1、STAT2、RUNX3、SREBF1、IRF9和FLI1。
21.根据任一前述权利要求所述的所用MDM2拮抗剂，其中所述MDM2拮抗剂是式(I°)的化合物或如本文所定义的其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，例如(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
22.根据任一项前述权利要求所述的所用MDM2拮抗剂，其中所述MDM2拮抗剂选自由以下组成的组：化合物1、依达奴林(RG-7388)、HDM-201、KRT-232(AMG-232)、ALRN-6924、MI-773(SAR405838)、CGM-097、甲苯磺酸米拉德美坦、APG-115、BI-907828、LE-004、DS-5272、SJ-0211、BI-0252、AM-7209、SP-141、SCH-1450206、NXN-6、ADO-21、CTX-50-CTX-1、ISA-27、RO-8994、RO-6839921、ATSP-7041、SAH-p53-8、PM-2、K-178、MMRi-64和或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐。
23.在人类患者的癌细胞样品中一种或多种DDR途径基因或基因产物中的一种或多种的表达或活性水平作为一种或多种生物标志物用于评估癌症是否对用MDM2拮抗剂治疗敏感的用途，其中所述一种或多种DDR途径基因或基因产物包含BRCA1和/或BRCA2，例如其中所述MDM2拮抗剂是式(I°)的化合物或如本文所定义的其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，例如(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
24.一种用于预测或评估人类癌症患者对用MDM2拮抗剂治疗的反应的方法，所述方法包括评估来自癌症患者的样品中一种或多种DDR途径基因的表达或活性水平，其中所述一种或多种DDR途径基因包含BRCA1和/或BRCA2，以及确定所测试的表达或活性水平是否指示所述癌症应当用MDM2拮抗剂治疗。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述评估步骤包括将所述表达或活性水平与(i)对用MDM2拮抗剂治疗有反应或无反应相关的表达或活性水平相比较，或(ii)来自同一类型的健康非癌细胞的表达或活性水平相比较。
26.根据权利要求24或权利要求25所述的方法，其中基于所述生物标志物概况将所述患者分类成组，任选地其中所述组包括以下各项或由以下各项组成：
(i)有反应者和无反应者；或者
(ii)强烈的反应者。
27.根据权利要求24至26中任一项所述的方法，其中当1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种DDR途径基因的表达水平低于被鉴定为不适合治疗的患者时，患者被鉴定为特别适合治疗。
28.根据权利要求24至27中任一项所述的方法，其中相对于(i)对用MDM2拮抗剂治疗无反应相关的表达水平或(ii)来自同一类型的健康非癌细胞的表达水平，当检测到一种或多种DDR途径基因的表达降低时，所述患者被鉴定为可用所述MDM2拮抗剂治疗。
29.根据权利要求24至28中任一项所述的方法，所述方法包括检测来自所述人类患者的癌细胞样品中所述生物标志物的表达或活性水平的步骤。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述检测是使用体外检测测定法进行的。
31.一种确定人类癌症患者对用MDM2拮抗剂治疗的敏感性的方法，所述方法包括在来自所述患者的癌细胞样品中检测一种或多种DDR途径基因的所述表达或活性，其中所述一种或多种DDR途径基因包含BRCA1和/或BRCA2，并且基于所述样品中所述生物标志物的表达或活性水平评估所述患者中的所述癌症是否可能对用MDM2拮抗剂治疗有反应。
32.一种检测患有癌症的人类患者中一种或多种DDR途径基因的表达或活性水平的方法，其中所述一种或多种DDR基因包含BRCA1和/或BRCA2。
33.根据权利要求32所述的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)从人类患者获得癌细胞样品；以及
(b)通过将所述样品与一种或多种用于检测一种或多种生物标志物的表达的试剂接触来检测所述一种或多种生物标志物是否在取样的癌细胞中表达。
34.根据权利要求24至33中任一项所述的方法，其中所述MDM2拮抗剂是如本文所定义的式(I°)的化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，例如(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
35.根据权利要求24至33中任一项所述的方法，其中所述MDM2拮抗剂选自由以下组成的组：化合物1、依达奴林、HDM-201、KRT-232、ALRN-6924、ALRN-6924、CGM-097、甲苯磺酸米拉德美坦、APG-115、BI-907828、LE-004、DS-5272、SJ-0211、Bl-0252、AM-7209、SP-141、SCH-1450206、NXN-6、ADO-21、CTX-50-CTX-1、ISA-27、RO-8994、RO-6839921、ATSP-7041、SAH-p53-8、PM-2、K-178、MMRi-64和或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐。
36.根据权利要求24至35中任一项所述的方法，所述方法还包括通过施用MDM2拮抗剂来治疗所述患者的所述癌症的所述步骤。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述MDM2拮抗剂是如本文所定义的式(I°)的化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，例如(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物。
38.根据权利要求36所述的方法，其中所述MDM2拮抗剂选自由以下组成的组：依达奴林、HDM-201、KRT-232、ALRN-6924、ALRN-6924、CGM-097、甲苯磺酸米拉德美坦、APG-115、BI-907828、LE-004、DS-5272、SJ-0211、BI-0252、AM-7209、SP-141、SCH-1450206、NXN-6、ADO-21、CTX-50-CTX-1、ISA-27、RO-8994、RO-6839921、ATSP-7041、SAH-p53-8、PM-2、K-178、MMRi-64和或其互变异构体或溶剂化物或药学上可接受的盐。
39.根据权利要求36至38中任一项所述的方法，其中基于所述方法的结果向所述患者提供所述治疗。
40.一种用于检测来自人类患者的样品中对MDM2抑制敏感的至少一种生物标志物的表达或活性水平的试剂盒或装置，所述试剂盒或装置包含用于检测一种或多种DDR途径基因或基因产物的检测试剂，其中所述一种或多种DDR途径基因或基因产物包含BRCA1和/或BRCA2。
41.一种用于确定人类癌症患者对用MDM2拮抗剂治疗的适合性的系统，所述系统包括用于存储与来自所述患者的样品相关的数据的存储存储器，所述数据包括与生物标志物组相关的指示来自所述受试者的所述样品中的生物标志物表达或活性水平的数据，所述生物标志物组包含一种或多种DDR途径基因或基因产物，其中所述一种或多种DDR途径基因或基因产物包含BRCA1和/或BRCA2；以及
以能够通信的方式耦合到所述存储存储器，用于对所述患者进行分类的处理器。
42.根据任一前述权利要求所述的所用MDM2拮抗剂、用途、方法、试剂盒或系统，其中所述癌症显示一种或多种DDR途径基因、基因产物或活性的丧失，其中所述一种或多种DDR途径基因、基因产物或活性包含BRCA1和/或BRCA2。
43.根据权利要求1至39或42中任一项所述的所用MDM2拮抗剂、用途或方法，其中所述MDM2拮抗剂是与第二治疗剂，任选地PARP抑制剂的组合治疗的一部分。
44.一种在治疗癌症的方法中使用的MDM2拮抗剂，
其中所述癌症在一种或多种DNA损伤修复(DDR)途径中具有正常或高水平的一种或多种基因或基因产物，其中所述一种或多种DDR基因或基因产物包含BRCA1和/或BRCA2，或者其中所述癌症在任何DDR途径基因中都没有可检测的功能丧失突变，
所述MDM2拮抗剂与诱导对MDM2拮抗剂的敏感性的试剂组合，例如降低DNA损伤修复(DDR)途径中一种或多种基因或基因产物的水平。
45.一种治疗患者的癌症的方法，其中所述方法包括选择患者的步骤：
(a)在从所述患者获得的生物样品中具有正常或高水平的DDR途径基因或基因产物，其中所述一种或多种DDR途径基因或基因产物包含BRCA1和/或BRCA2；并且
(b)向步骤(a)中选择的所述患者施用治疗有效量的MDM2拮抗剂，和通过降低DNA损伤修复(DDR)途径中的一种或多种基因或基因产物的水平来诱导对MDM2拮抗剂的敏感性的试剂。
46.根据权利要求44所述的MDM2拮抗剂或者根据权利要求45所述的方法，其中诱导对MDM2拮抗剂的敏感性的所述试剂是DNA损伤剂或DNA修复抑制剂。
47.一种包含MDM2抑制剂的药物组合物，其中所述MDM2抑制剂是式(I°)的化合物或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，例如(2S,3S)-3-(4-氯苯基)-3-[(1R)-1-(4-氯苯基)-7-氟-5-[(1S)-1-羟基-1-(氧杂环己烷-4-基)丙基]-1-甲氧基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-2-基]-2-甲基丙酸或其互变异构体、N-氧化物、药学上可接受的盐或溶剂化物，所述药物组合物用于治疗患者的癌症，其中所述癌症如权利要求1至7中任一项所定义。
48.一种在治疗癌症患者的方法中使用的MDM2拮抗剂，其中所述方法包括：
(i)确定来自所述患者的样品耗损一种或多种DNA损伤修复(DDR)途径中的一种或多种基因或基因产物，或者其中所述癌症在DDR途径基因中具有至少一种功能丧失突变，其中所述一种或多种DDR途径基因或基因产物包含BRCA1和/或BRCA2；
(ii)向所述患者施用有效量的所述MDM2拮抗剂。
49.一种在治疗癌症的方法中使用的MDM2拮抗剂，
其中所述癌症在一种或多种DNA损伤修复(DDR)途径中具有低水平的一种或多种基因或基因产物，或者其中所述癌症在任何DDR途径基因中具有可检测的功能丧失突变，其中所述一种或多种DDR途径基因或基因产物包含BRCA1和/或BRCA2；
所述MDM2拮抗剂与抗癌剂，例如DNA损伤剂或DNA修复抑制剂组合。
50.一种治疗患者的癌症的方法，其中所述方法包括选择患者的步骤：
(a)在从所述患者获得的生物样品中具有低水平的DDR途径基因或基因产物，其中所述DDR途径基因或基因产物包含BRCA1和/或BRCA2；并且
(b)向步骤(a)中选择的所述患者施用治疗有效量的MDM2拮抗剂和抗癌剂，例如DNA损伤剂或DNA修复抑制剂。
51.一种在治疗癌症的方法中使用的MDM2拮抗剂，其中所述癌症耗损一种或多种DNA损伤修复(DDR)途径中的一种或多种基因或基因产物，或者其中所述癌症在至少一种DDR途径基因中具有至少一种功能丧失突变，其中所述一种或多种DDR基因或基因产物不是由ATM和/或ATR组成。
52.一种在治疗癌症的方法中使用的MDM2拮抗剂，其中所述癌症耗损一种或多种DNA损伤修复(DDR)途径中的两种或更多种基因或基因产物，或者其中所述癌症在至少两种DDR途径基因中具有至少一种功能丧失突变。
53.根据权利要求51或52所述的在方法中使用的MDM2拮抗剂，其中所述DDR途径是：
a.所述同源重组修复(HRR)途径，其中所述DDR基因或基因产物不是由ATM和/或ATR组成；
b.所述非同源末端连接(NHEJ)途径；
c.所述错配修复(MMR)途径；
d.所述范科尼贫血(FA)途径；和/或
e.所述碱基切除修复(BER)途径。
54.一种在根据本文的实施方案的方法中使用的MDM2拮抗剂。
55.一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用MDM2拮抗剂，其中所述癌症耗损一种或多种DNA损伤修复(DDR)途径中的一种或多种基因或基因产物，或者其中所述癌症在至少一种DDR途径基因中具有至少一种功能丧失突变，其中所述一种或多种DDR途径基因或基因产物包含BRCA1和/或BRCA2。
56.一种治疗患者的癌症的方法，其中所述癌症显示一种或多种DDR途径基因、基因产物或活性的丧失，所述方法包括向所述患者施用MDM2拮抗剂，其中所述一种或多种DDR途径基因包含BRCA1和/或BRCA2。
57.一种治疗患者的癌症的方法，
其中所述癌症在一种或多种DNA损伤修复(DDR)途径中具有正常或高水平的一种或多种基因或基因产物，或者其中所述癌症在任何DDR途径基因中没有可检测的功能丧失突变，所述方法包括
与诱导对所述MDM2拮抗剂的敏感性的试剂组合向所述患者施用MDM2拮抗剂。
58.一种治疗患有对MDM2拮抗剂治疗敏感的癌症的患者的方法，其中所述方法包括：
(i)确定来自所述患者的样品耗损一种或多种DNA损伤修复(DDR)途径中的一种或多种基因或基因产物，或者其中所述癌症在DDR途径基因中具有至少一种功能丧失突变，其中所述一种或多种DDR途径基因或基因产物包含BRCA1和/或BRCA2；
(iii)向所述患者施用有效量的所述MDM2拮抗剂。
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