相關申請案的交叉引用 本申請案主張於2015年2月5日提申之美國臨時申請案第62/291,935號的優先權及權益，該件臨時申請案的揭示內容以全文引用的方式併入本文中。 在受到聯邦政府資助之研究下對本發明做出的權利聲明 受到國家衛生研究院以補助金第3U54HG005032號的政府資助進行本發明。政府在本發明中擁有某些權利。 如下所述，本發明之特點為鑑別患有會對用磷酸二酯酶3A (PDE3A)調節劑治療敏感之癌症(例如本文所述之癌症類型)的病人的改良方法，其係藉由在源自此類病人之癌細胞中偵測到PDE3A與施拉芬12(Schlafen 12；SLFN12)聚核苷酸或多肽之共表現來進行。本發明至少部分基於如下發現：766種癌細胞株中，對磷酸二酯酶3A調節劑(諸如5-(4-(二乙基胺基)-3-硝基苯基)-5-甲基-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮或DNMDP)之敏感性與磷酸二酯酶3A基因
PDE3A
之表現有關。如DNMDP (PDE3A抑制劑之一個子集)會殺滅所選癌細胞，而其他不能；此等對細胞寬容之PDE3A抑制劑替代地阻斷DNMDP誘導之細胞毒性。此外，PDE3A缺失會引起DNMDP抗性。DNMDP結合於PDE3A會促進PDE3A與Sirtuin 7 (SIRT7)及施拉芬12(Schlafen 12；SLFN12)之間的相互作用，推測新生形態活性，及SLFN12與PDE3A共表現係與DNMDP敏感性有關。此等結果顯示PDE3A調節劑為有前景之癌症治療劑且展示預測化學基因組在小分子發現及標靶鑑別中之能力。 因此，本發明提供選擇患有會對PDE3A調節劑起反應之癌症的個體的方法，其中選擇方法包括在源自此類個體之癌細胞中偵測到
PDE3A
與
施拉芬 12
(
Schlafen 12 ； SLFN12 )
多肽或聚核苷酸之共表現。 在一個特定實施例中，在對PDE3A調節劑產生抗性之癌細胞中，CREB3L1或SLFN12聚核苷酸或多肽之表現係經降低或無法偵測到。 PDE3A調節劑 PDE3A調節劑之鑑別係與經設計以在突變體
tp53
背景中鑑別細胞毒性小分子之表現型篩選一起進行。預測化學基因組可輔助標靶驅動之藥物開發計畫，該預測化學基因組係由廣泛的活體外及活體內標靶確效試驗組成，且亦可稱為逆向化學基因組(Zheng等人, Curr Issues Mol Biol 4, 33-43, 2002)。諸多經美國食品藥物管理局(U.S. Food and Drug Administration；FDA)批准之靶向療法已以此方式開發，尤其靶向致癌體細胞驅動子突變之小分子激酶抑制劑(Moffat等人, Nat Rev Drug Discov 13, 588-602, 2014)。然而，靶向療法之發現及開發通常因標靶之生物功能、其作用機制及選擇性抑制該標靶之可用化學物質的知識的限制而受到阻礙。 表現型篩選可發現癌症療法之新穎標靶，其特定分子機制通常會被未來研究闡明(Swinney等人, Nat Rev Drug Discov 10, 507-519, 2011)。近年來，由無偏差性表現型篩選工作發現的兩類抗癌藥物已經被FDA批准。來那度胺(Lenalidomide)及泊利度胺(pomalidomide)被發現是E3-接合酶之調節劑，其會改變其標靶物之親和力，從而導致譜系特異性轉錄因子的降解(Krönke等人, Science 343, 301-305, 2014；Lu等人, Science 343, 305-309, 2014)，而後來羅米地辛(romidepsin)及伏立諾他(vorinostat)被鑑別是組蛋白去乙醯酶(histone deacetylase；HDAC)抑制劑(Moffat等人, Nat Rev Drug Discov 13, 588-602, 2014；Nakajima等人, Exp. Cell Res. 241, 126-133, 1998, Marks等人, Nat Biotechnol 25, 84-90, 2007)。 腫瘤抑制因子變化為表現型篩選之適合標靶，因為其等無法用小分子直接靶向，但合成致死方法(諸如奧拉帕尼(olaparib)治療BRCA1/BRCA2突變體癌症)已證實為有效的。根據當前知識，
tp53
腫瘤抑制基因在人類癌症中最常突變，其中在經受全外顯子組定序(whole exome sequencing)的4742個癌症中有36%偵測到體細胞突變。儘管進行諸多嘗試，但尚未鑑別出可選擇性殺滅
tp53
突變體細胞之化合物。 開發出用以鑑別
tp53
突變體癌細胞中小分子造成之合成致死率的表現型篩選使得偶然發現一類下述癌症選擇性細胞毒性劑，其係充當磷酸二酯酶3A (PDE3A)之調節劑。環核苷酸磷酸二酯酶會催化第二信使分子環單磷酸腺苷(cAMP)及環單磷酸鳥苷(cGMP)之水解，且其在諸多生理學過程中很重要。數種磷酸二酯酶抑制劑已批准用於臨床治療，包括PDE3抑制劑米利酮、西洛他唑及左西孟旦用於心血管適應症及抑制血小板凝集，以及PDE3抑制劑阿那格雷用於血小板增多症。其他PDE3A抑制劑可從WO 2014/164704得知。PDE5抑制劑(例如伐地那非)可用於平滑肌病症(包括勃起功能障礙及肺動脈高血壓)，而PDE4抑制劑羅氟司特(roflumilast)可降低慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease；COPD)之惡化。 磷酸二酯酶抑制劑係藉由直接抑制其標靶或藉由異位調節而起作用；例如PDE4之結構分析可用於設計PDE4D及PDE4B異位調節劑(Burgin等人, Nat Biotechnol 28, 63-70, 2010；Gurney等人, Neurotherapeutics 12, 49-56, 2015)。下文提供之資料顯示癌細胞毒性磷酸二酯酶調節劑DNMDP可能經由類似異位機制起作用。 因此，本發明提供基於包含癌細胞之個體生物樣品中
PDE3A
及
SLFN12
表現含量鑑別出患有可能會對PDE3A調節劑治療起反應之惡性病的個體的方法。在一些實施例中，PDE3A調節劑為DNMDP。在一些其他實施例中，PDE3A調節劑為阿那格雷或紮達維林。在其他實施例中，PDE3A調節劑為化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5或化合物6。 在特定實施例中，本發明提供基於CREB3L1或SLFN12表現含量相對於參考物係缺失或降低而鑑別出患有會對PDE3A調節劑治療具有抗性之惡性病的個體的方法。 化合物形式及鹽 本發明化合物包括化合物自身，以及如果適用的話包括其鹽及其前藥。舉例而言，鹽可在陰離子與本文所述化合物上帶正電之取代基(例如胺基)之間形成。適合陰離子包括氯離子、溴離子、碘離子、硫酸根、硝酸根、磷酸根、檸檬酸根、甲烷磺酸根、三氟乙酸根及乙酸根。同樣，鹽亦可在陽離子與本文所述化合物上帶負電之取代基(例如羧酸酯)之間形成。適合陽離子包括鈉離子、鉀離子、鎂離子、鈣離子及銨陽離子，諸如四甲銨離子。前藥之實例包括羧酸基之C
1 - 6
烷基酯，其在投與個體後能夠提供活性化合物。 本發明化合物之醫藥學上可接受之鹽包括衍生自醫藥學上可接受之無機及有機酸及鹼的彼等鹽。如本文所用，術語「醫藥學上可接受之鹽」係指藉由向本文所揭示化合物添加醫藥學上可接受之酸或鹼形成的鹽。如本文所用，片語「醫藥學上可接受」係指出於毒理學觀點，物質可接受用於醫藥應用，且不會不利地與活性成分相互作用。 本發明化合物之醫藥學上可接受之適合鹽可為例如在鏈或環中攜帶氮原子且例如呈足夠鹼性之本發明化合物之酸加成鹽，諸如與無機酸或「礦物酸」之酸加成鹽，該無機酸或「礦物酸」諸如鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、胺磺酸、重硫酸、磷酸或硝酸，例如與有機酸之酸加成鹽，該有機酸諸如甲酸、乙酸、乙醯乙酸、丙酮酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、十一烷酸、月桂酸、苯甲酸、水楊酸、2-(4-羥基苯甲醯基)-苯甲酸、樟腦酸、肉桂酸、環戊丙酸、二葡萄糖酸、3-羥基-2-萘甲酸、菸鹼酸、雙羥萘酸、果膠酯酸、3-苯基丙酸、特戊酸、2-羥基乙磺酸、衣康酸、三氟甲烷磺酸、十二烷基硫酸、乙烷磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸、甲烷磺酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、樟腦磺酸、檸檬酸、酒石酸、硬脂酸、乳酸、草酸、丙二酸、丁二酸、蘋果酸、己二酸、海藻酸、順丁烯二酸、反丁烯二酸、D-葡萄糖酸、杏仁酸、抗壞血酸、葡糖庚酸、甘油磷酸、天冬胺酸、磺基水楊酸或硫氰酸。 適合酸鹽之其他實例包括乙酸鹽、己二酸鹽、海藻酸鹽、天冬胺酸鹽、苯甲酸鹽、苯磺酸鹽、硫酸氫鹽、丁酸鹽、檸檬酸鹽、樟腦酸鹽、樟腦磺酸鹽、二葡糖酸鹽、十二烷基硫酸鹽、乙烷磺酸鹽、甲酸鹽、反丁烯二酸鹽、葡糖庚酸鹽、羥乙酸鹽、半硫酸鹽、庚酸鹽、己酸鹽、鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、2-羥基乙烷磺酸鹽、乳酸鹽、順丁烯二酸鹽、丙二酸鹽、甲烷磺酸鹽、2-萘磺酸鹽、菸鹼酸鹽、硝酸鹽、雙羥萘酸鹽、果膠酸鹽、過硫酸鹽、3-苯基丙酸鹽、磷酸鹽、苦味酸鹽、特戊酸鹽、丙酸鹽、水楊酸鹽、丁二酸鹽、硫酸鹽、酒石酸鹽、硫氰酸鹽、甲苯磺酸鹽及十一烷酸鹽。其他酸(諸如草酸)，儘管自身不為醫藥學上可接受，但可用於製備在獲得本發明化合物及其醫藥學上可接受之酸加成鹽中適用作中間物的鹽。 此外，呈足夠酸性的化合物1-6、尤其化合物6之另一醫藥學上可接受之適合鹽為鹼金屬鹽，例如鈉或鉀鹽；鹼土金屬鹽，例如鈣、鎂或鍶鹽；或鋁或鋅鹽；或衍生自氨或具有1至20個碳原子之有機一級、二級或三級胺之銨鹽，該胺諸如乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二異丙胺、單乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二環己胺、二甲胺基乙醇、二乙胺基乙醇、參(羥基甲基)胺基甲烷、普魯卡因(procaine)、二苯甲基胺、N-甲基嗎啉、精胺酸、離胺酸、1,2-乙二胺、N-甲基哌啶、N-甲基-還原葡糖胺、N,N-二甲基-還原葡糖胺、N-乙基-還原葡糖胺、1,6-己二胺、葡糖胺、肌胺酸、絲胺醇、2-胺基-1,3-丙二醇、3-胺基-1,2-丙二醇、4-胺基-1,2,3-丁三醇；或與具有1至20個碳原子之四級銨離子之鹽，該銨離子諸如四甲銨、四乙銨、四(正丙基)銨、四(正丁基)銨、N-苯甲基-N,N,N-三甲銨、膽鹼或苯甲烴銨。 在某些實施例中，鹽衍生自適當鹼，包括鹼金屬(例如鈉)、鹼土金屬(例如鎂)、銨及N-(烷基)
4 +
鹽。本發明亦設想本文中所揭示化合物之任何鹼性含氮基團之四級銨化。可藉由該四級銨化來獲得水或油溶性或分散性產物。本文任何式之化合物的鹽形式可為羧基之胺基酸鹽(例如L-精胺酸、L-離胺酸、L-組胺酸鹽)。 適合鹽之清單見於Remington's Pharmaceutical Sciences, 第17版, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1985, 第1418頁；Journal of Pharmaceutical Science, 66, 2 (1977)；及「Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use A Handbook」；Wermuth, C. G.及Stahl, P. H. (編) Verlag Helvetica Chimica Acta, Zurich, 2002 [ISBN 3-906390-26-8]其各自以全文引用的方式併入本文中。熟習此項技術者應進一步瞭解，所主張化合物之酸加成鹽有可能藉由使化合物與適當無機酸或有機酸經由多種已知方法中之任一者反應而製備。或者，本發明之酸性化合物之鹼金屬鹽及鹼土金屬鹽係藉由使本發明化合物與適當鹼經由多種已知方法反應而製備。 本發明包括本發明化合物之所有可能鹽，其為單一鹽或任何比率之該等鹽之任何混合物形式。 化合物之中性形式可藉由使鹽與鹼或酸接觸且以習知方式分離母化合物而再生。化合物之母形式與各種鹽形式的不同之處在於某些物理特性，諸如在極性溶劑中之溶解性，但出於本發明之目的，在其他方面，鹽等效於化合物之母形式。 除鹽形式之外，本發明提供前藥形式之化合物。本文所述化合物之前藥為在生理條件下經歷化學變化以提供本發明化合物之彼等化合物。此外，前藥可藉由化學或生物化學方法在離體環境中轉化成本發明化合物。舉例而言，當與適合酶或化學試劑一起置於經皮貼片儲集層中時，前藥可緩慢轉化成本發明化合物。前藥通常為適用的，因為在一些情形下，其比母藥物容易投與。該等前藥可例如藉由經口投與而生物可用性大於母藥物。前藥在藥理學組合物中亦可具有優於母藥物之經改良溶解性。此項技術中已知各種前藥衍生物，諸如依賴於前藥之水解裂解或氧化活化的衍生物。前藥之一實例為(但不限於)如下本發明化合物，其以酯(「前藥」)形式投與，但隨後代謝水解為羧酸，即活性實體。其他實例包括本發明化合物之肽基衍生物。 本發明亦包括本發明之各種水合物及溶劑合物形式。 本發明化合物亦可在構成此等化合物之原子中之一或多者處含有非天然比例之原子同位素。舉例而言，化合物可經諸如氚(
3
H)、碘-125(
125
I)或碳-14(
14
C)之放射性同位素進行放射性標記。本發明化合物之所有同位素變體無論是否具放射性均意欲涵蓋於本發明之範疇內。尤其含氘化合物。 術語化合物或試劑之「同位素變體」定義為如下化合物，其展現構成此類化合物之同位素中之一或多者的非天然比例。 表述「非天然比例」意謂此類同位素的高於其天然豐度之比例。在此情形下，待應用之同位素之天然豐度描述於「Isotopic Compositions of the Elements 1997」, Pure Appl. Chem., 70(1), 217-235, 1998中。 此類同位素之實例包括氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟、氯、溴及碘之穩定的放射性同位素，分別諸如
2
H (氘)、
3
H (氚)、
11
C、
13
C、
14
C、
15
N、
17
O、
18
O、
32
P、
33
P、
33
S、
34
S、
35
S、
36
S、
18
F、
36
Cl、
82
Br、
123
I、
124
I、
125
I、
129
I及
131
I。 對於治療及/或預防本文指定之病症，化合物1-6、尤其化合物6之同位素變體較佳含有氘(「含氘」)。化合物1-6、尤其化合物6之同位素變體適用於例如藥物及/或受質組織分佈研究，其中併入一或多個放射性同位素(諸如
3
H或
14
C)。為方便同位素之併入及可偵測性，此等同位素為尤其較佳的。諸如
18
F或
11
C之正電子發射同位素可併入化合物1-6中，尤其化合物6中。化合物1-6之此等同位素變體適用於活體內成像應用。含氘及含
13
C之化合物1-6可在臨床前或臨床研究之情形下用於質譜分析中。 化合物1-6之同位素變體通常可藉由熟習此項技術者已知之方法製備，諸如本文流程及/或實例中所述之方法，藉由用試劑之同位素變體、較佳含氘試劑取代該試劑。視所要氘化位點而定，在一些情況下，來自D
2
O之氘可直接併入化合物中或併入適用於合成此類化合物之試劑中。氘氣亦為適用於將氘併入分子中之試劑。烯鍵及炔鍵之催化氘化為併入氘之快速途徑。在氘氣存在下金屬催化劑(亦即Pd、Pt及Rh)可用以直接將含有烴之官能基中的氫交換為氘。各種氘化試劑及合成構建塊可購自如下公司，諸如C/D/N Isotopes, Quebec, Canada；Cambridge Isotope Laboratories Inc., Andover, MA, USA；及CombiPhos Catalysts, Inc., Princeton, NJ, USA。 術語「含氘化合物1-6」定義為如下化合物，其中一或多個氫原子經一或多個氘原子置換，且其中化合物1-6中之任一者的各氘化位置處的氘之豐度高於氘之天然豐度(其為約0.015%)。特定言之，在含氘化合物1-6之任一者中，化合物之各氘化位置之氘的豐度高於10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%或80%，較佳高於90%、95%、96%或97%，甚至更佳在該(該等)位置高於98%或99%。應瞭解，各氘化位置之氘的豐度與其他氘化位置之氘的豐度無關。 於化合物1-6之任一者中選擇性併入一或多個氘原子可改變分子之物理化學特性(諸如酸性[C. L. Perrin等人, J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 4490]、鹼性[C. L. Perrin等人, J. Am. Chem. Soc., 2005, 127, 9641]、親脂性[B. Testa等人, Int. J. Pharm., 1984, 19(3), 271])及/或代謝概況，且可引起母化合物與代謝物之比率或所形成代謝物之量變化。此類改變可產生某些治療優勢且因此在一些情況下可為較佳的。在代謝物之比率改變時，已報導降低之代謝速率及代謝轉換(A. E. Mutlib等人, Toxicol. Appl. Pharmacol., 2000, 169, 102)。暴露於母藥物及代謝物時之此等改變可對含氘之通式(I)化合物之藥效學、耐受性及功效具有重要意義。在一些情況下，氘取代減少或去除非所要或毒性代謝物之形成且增加所要代謝物之形成(例如Nevirapine: A. M. Sharma等人, Chem. Res. Toxicol., 2013, 26, 410；Efavirenz: A. E. Mutlib等人, Toxicol. Appl. Pharmacol., 2000, 169, 102)。在其他情況下，氘化之主要作用為降低全身清除率。因此，化合物之生物半衰期延長。潛在臨床益處將包括在降低之峰值含量及增加之最低含量下維持類似的全身性暴露之能力。此舉可視特定化合物之藥物動力學/藥效學關係而定，減少副作用及增強功效。ML-337 (C. J. Wenthur等人, J. Med. Chem., 2013, 56, 5208)及奧當卡替(Odanacatib)(K. Kassahun等人, WO2012/112363)為此氘作用之實例。已報導其他情況，其中降低之代謝速率使得藥物暴露增加而不改變全身性清除率(例如羅非昔布(Rofecoxib)：F. Schneider等人, Arzneim. Forsch./Drug. Res., 2006, 56, 295；特拉匹韋(Telaprevir)：F. Maltais等人, J. Med. Chem., 2009, 52, 7993)。展示此作用之氘化藥物可具有降低之給藥要求(例如，用於達成所要作用之劑量數降低或劑量降低)及/或可產生較低之代謝物負載。 化合物1-6可具有多個潛在代謝攻擊位點。為最佳化上述對物理化學特性及代謝概況的作用，可選擇具有一或多個氘-氫交換特定模式的含氘化合物1-6。特定言之，含氘化合物1-6之氘原子連接於碳原子及/或位於化合物1-6之如下位置，其為代謝酶(諸如細胞色素P450)之攻擊位點。 醫藥組合物 化合物1-6、尤其化合物6可具有全身性及/或局部活性。出於此目的，其可以適合方式投與，諸如經由口服、非經腸、經肺、經鼻、舌下、經舌、經頰、經直腸、經陰道、經由皮膚、經皮、經結膜、經耳途徑或以植入物或血管支架形式。 對於此等投藥途徑，化合物1-6可以適合投藥形式投與。 對於經口投與，可將化合物1-6調配成此項技術中已知之快速及/或以改良方式傳遞本發明化合物的劑型，諸如錠劑(未包覆包衣或包衣錠劑，例如具有延遲溶解或不溶性的腸溶性或控制釋放包衣)、經口崩解錠劑、膜/粉片、膜/凍乾粉、膠囊(例如硬明膠膠囊或軟明膠膠囊)、糖衣錠劑、顆粒、丸粒、粉末、乳液、懸浮液、氣溶膠或溶液。化合物1-6可以結晶及/或非晶形及/或溶解形式併入該等劑型中。 非經腸投藥可在避免吸收步驟之情況下(例如靜脈內、動脈內、心內、脊椎內或腰內)或在包括吸收之情況下(例如肌肉內、皮下、皮內、經皮或腹膜內)實現。適用於非經腸投藥之投藥形式尤其為用於注射及輸注之呈溶液、懸浮液、乳液、凍乾粉或無菌粉末形式的製劑。 適用於其他投藥途徑之實例為用於吸入之醫藥形式[尤其粉末吸入劑、噴霧劑]、經鼻滴劑、經鼻溶液、經鼻噴霧劑；用於經舌、舌下或經頰投藥之錠劑/膜/粉片/膠囊；栓劑；滴眼劑、眼膏、洗眼液、眼部插入物、滴耳劑、噴耳劑、耳用粉劑、沖耳劑、耳塞；陰道膠囊、水性懸浮液(洗劑、震盪混合物)、親脂性懸浮液、乳液、軟膏、乳膏、經皮治療系統(諸如貼片)、牛奶、糊劑、泡沫、敷粉、植入物或血管支架。 本發明化合物可併入所述之投藥形式中。此可以本身已知之方式藉由與醫藥學上適合之賦形劑混合而實現。醫藥學上適合之賦形劑尤其包括 •填充劑及載劑(例如纖維素、微晶纖維素(諸如Avicel
®
)、乳糖、甘露糖醇、澱粉、磷酸鈣(諸如Di-Cafos
®
))， • 軟膏基質(例如石油膏、石蠟、甘油三酯、蠟、毛絨蠟、毛絨蠟醇、羊毛脂、親水性軟膏、聚乙二醇)， • 栓劑用基質(例如聚乙二醇、可可脂、硬脂肪)， •溶劑(例如水、乙醇、異丙醇、甘油、丙二醇、中等鏈長甘油三酯脂肪油、液體聚乙二醇、石蠟)， •界面活性劑、乳化劑、分散劑或潤濕劑(例如十二烷基硫酸鈉)、卵磷脂、磷脂、脂肪醇(諸如Lanette
®
)、脫水山梨糖醇脂肪酸酯(諸如Span®)、聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯(諸如Tween®)、聚氧乙烯脂肪酸甘油酯(諸如Cremophor®)、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、甘油脂肪酸酯、泊洛沙姆(諸如Pluronic
®
)， •緩衝劑、酸及鹼(例如磷酸鹽、碳酸鹽、檸檬酸、乙酸、鹽酸、氫氧化鈉溶液、碳酸銨、胺丁三醇、三乙醇胺)， • 等滲劑(例如葡萄糖、氯化鈉)， •吸附劑(例如高分散性二氧化矽)， •增黏劑、凝膠形成劑、增稠劑及/或黏合劑(例如聚乙烯吡咯啶酮、甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、羥基丙基纖維素、羧基甲基纖維素鈉、澱粉、卡波姆、聚丙烯酸(諸如Carbopol
®
)；海藻酸鹽、明膠)， •崩解劑(例如改質澱粉、羧基甲基纖維素鈉、羥基乙酸澱粉鈉(諸如Explotab
®
)、交聯聚乙烯吡咯啶酮、交聯羧甲纖維素鈉(諸如AcDiSol
®
))， •流量調節劑、潤滑劑、滑動劑及脫模劑(例如硬脂酸鎂、硬脂酸、滑石、高分散性二氧化矽(諸如Aerosil
®
))， • 快速或以經調節之方式溶解之包衣材料(例如糖、蟲膠)及用於薄膜或擴散膜之成膜劑(例如聚乙烯吡咯啶酮(諸如Kollidon
®
)、聚乙烯醇、羥基丙基甲基纖維素、羥基丙基纖維素、乙基纖維素、鄰苯二甲酸羥基丙基甲基纖維素、乙酸纖維素、鄰苯二甲酸乙酸纖維素、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯(諸如Eudragit
®
))， • 膠囊材料(例如明膠、羥基丙基甲基纖維素)， •合成聚合物(例如聚乳酸交酯、聚乙交酯、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯(諸如Eudragit
®
)、聚乙烯吡咯啶酮(諸如Kollidon
®
)、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚氧化乙烯、聚乙二醇及其共聚物及嵌段共聚物)， • 塑化劑(例如聚乙二醇、丙二醇、丙三醇、三乙酸甘油酯、檸檬酸三乙醯酯、鄰苯二甲酸二丁酯)， • 穿透增強劑， • 穩定劑(例如抗氧化劑，諸如抗壞血酸、抗壞血酸棕櫚酸酯、抗壞血酸鈉、丁基羥基苯甲醚、丁基羥基甲苯、沒食子酸丙酯)， • 防腐劑(例如對羥苯甲酸酯、山梨酸、硫柳汞、苯紮氯銨、氯己定乙酸酯、苯甲酸鈉)， • 著色劑(例如無機顏料，諸如氧化鐵、二氧化鈦)， • 調味劑、甜味劑、味道及/或氣味遮蔽劑。 本發明另外係關於一種醫藥組合物，其包含至少一種化合物1-6、尤其化合物6，通常與一或多種醫藥學適合賦形劑一起，且關於其根據本發明之用途。 組合 根據另一態樣，本發明覆蓋醫藥組合，尤其藥劑，其包含化合物1-6中之至少一者，尤其化合物6，及至少一或多種其他活性成分，尤其用於治療及/或預防過度增生性疾病，尤其癌症。 特定言之，本發明覆蓋一種醫藥組合，其包含： •如上文所定義之一或多種第一活性成分，尤其化合物1-6中之一者，尤其化合物6，及 •一或多種其他活性成分，尤其過度增生性疾病，尤其癌症。 在本發明中，術語「組合」如熟習此項技術者所已知般使用，該組合有可為固定組合、非固定組合或分裝部分之套組。 在本發明中，「固定組合」如熟習此項技術者所已知般使用且定義為如下組合，其中例如第一活性成分(諸如化合物1-6中之一或多者)與另一活性成分一起存在於一個單位劑量中或單一實體中。「固定組合」之一個實例為如下醫藥組合物，其中第一活性成分與另一活性成分存在於用於同時投與之混合物中，諸如調配物中。「固定組合」之另一實例為如下醫藥組合，其中第一活性成分與第二活性成分存在於一個單位中而未經混合。 本發明中之非固定組合或「分裝部分之套組」如熟習此項技術者所已知般使用，且定義為如下組合，其中第一活性成分與另一活性成分存在於多於一個單位中。非固定組合或分裝部分之套組之一個實例為如下組合，其中第一活性成分與另一活性成分單獨存在。非固定組合或分裝部分之套組之組分可單獨、依序、同時、共同或按交錯時間順序投與。 本發明化合物可以單一藥劑之形式或與一或多種其他醫藥學上活性成分組合投與，其中該組合不會引起不可接受之副作用。本發明亦覆蓋此類醫藥組合。舉例而言，本發明化合物可與已知抗癌劑及改善此等抗癌劑可具有之可能副作用的藥劑組合。此等藥劑之實例包括：131I-chTNT、阿巴瑞克(abarelix)、阿比特龍(abiraterone)、阿柔比星(aclarubicin)、阿達木單抗(adalimumab)、阿多-曲妥珠單抗恩他新(ado-trastuzumab emtansine)、阿法替尼(afatinib)、阿柏西普(aflibercept)、阿地介白素(aldesleukin)、艾樂替尼(alectinib)、阿侖單抗(alemtuzumab)、阿侖膦酸(alendronic acid)、阿利維甲酸(alitretinoin)、六甲蜜胺(altretamine)、阿米福汀(amifostine)、胺格魯米特(aminoglutethimide)、胺基乙醯丙酸己酯、胺柔比星(amrubicin)、安吖啶(amsacrine)、阿那曲唑(anastrozole)、安西司亭(ancestim)、大茴香腦二硫雜環戊二烯硫酮(anethole dithiolethione)、阿內圖單抗拉夫坦辛(anetumab ravtansine)、血管緊張素II、抗凝血酶III、阿匹坦(aprepitant)、阿西莫單抗(arcitumomab)、阿格拉賓(arglabin)、三氧化二砷(arsenic trioxide)、天冬醯胺酶(asparaginase)、阿特唑單抗(atezolizumab)、阿西替尼(axitinib)、阿紮胞苷(azacitidine)、巴利昔單抗(basiliximab)、貝洛替康(belotecan)、苯達莫司汀(bendamustine)、貝索單抗(besilesomab)、貝林諾他(belinostat)、貝伐單抗(bevacizumab)、貝瑟羅汀(bexarotene)、比卡魯胺(bicalutamide)、比生群(bisantrene)、博萊黴素(bleomycin)、布林莫單抗(blinatumomab)、硼替佐米(bortezomib)、布舍瑞林(buserelin)、伯舒替尼(bosutinib)、貝倫妥單抗維多汀(brentuximab vedotin)、白消安(busulfan)、卡巴利他索(cabazitaxel)、卡博替尼(cabozantinib)、降鈣素(calcitonine)、亞葉酸鈣(calcium folinate)、左醛葉酸鈣(calcium levofolinate)、卡培他濱(capecitabine)、卡羅單抗(capromab)、卡馬西平卡鉑(carbamazepine carboplatin)、卡波醌(carboquone)、卡非佐米(carfilzomib)、卡莫氟(carmofur)、卡莫司汀(carmustine)、卡托莫西單抗(catumaxomab)、塞內昔布(celecoxib)、西莫白介素(celmoleukin)、色瑞替尼(ceritinib)、西妥昔單抗(cetuximab)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氯地孕酮(chlormadinone)、氮芥(chlormethine)、西多福韋(cidofovir)、西那卡塞(cinacalcet)、順鉑(cisplatin)、克拉屈濱(cladribine)、氯膦酸(clodronic acid)、氯法拉濱(clofarabine)、考比替尼(cobimetinib)、考班昔布(copanlisib )、克立他酶(crisantaspase)、克卓替尼(crizotinib)、環磷醯胺、環丙孕酮(cyproterone)、阿糖胞苷(cytarabine)、達卡巴嗪(dacarbazine)、放線菌素(dactinomycin)、達土木單抗(daratumumab)、α貝泊汀(darbepoetin alfa)、達拉菲尼(dabrafenib)、達沙替尼(dasatinib)、道諾黴素(daunorubicin)、地西他濱(decitabine)、地加瑞克(degarelix)、地尼白介素迪夫托斯(denileukin diftitox)、德諾單抗(denosumab)、地普奧肽(depreotide)、德舍瑞林(deslorelin)、衛康醇(dianhydrogalactitol)、右雷佐生(dexrazoxane)、二溴螺氯銨(dibrospidium chloride)、衛康醇、雙氯芬酸(diclofenac)、迪奴圖單抗(dinutuximab)、多西他賽(docetaxel)、多拉司瓊(dolasetron)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、小紅莓(doxorubicin)、小紅莓+雌酮、屈大麻酚(dronabinol)、艾庫組單抗(eculizumab)、依決洛單抗(edrecolomab)、依利醋銨(elliptinium acetate)、埃羅妥珠單抗(elotuzumab)、艾曲波帕(eltrombopag)、內皮生長抑素(endostatin)、依諾他濱(enocitabine)、恩雜魯胺(enzalutamide)、表柔比星(epirubicin)、環硫雄醇(epitiostanol)、α依泊汀(epoetin alfa)、β依伯汀(epoetin beta)、ζ依伯汀(epoetin zeta)、依鉑(eptaplatin)、艾日布林(eribulin)、埃羅替尼(erlotinib)、埃索美拉唑(esomeprazole)、雌二醇、雌氮芥(estramustine)、炔雌醇(ethinylestradiol)、依託泊苷(etoposide)、依維莫司(everolimus)、依西美坦(exemestane)、法屈唑(fadrozole)、芬太尼(fentanyl)、非格司亭(filgrastim)、氟甲睾酮(fluoxymesterone)、氟尿苷(floxuridine)、氟達拉濱(fludarabine)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟他胺(flutamide)、醛葉酸(folinic acid)、福美司坦(formestane)、福沙匹坦(fosaprepitant)、福莫司汀(fotemustine)、氟維司群(fulvestrant)、釓布醇(gadobutrol)、釓特醇(gadoteridol)、釓特酸葡甲胺(gadoteric acid meglumine)、釓弗塞胺(gadoversetamide)、釓塞酸(gadoxetic acid)、硝酸鎵、加尼瑞克(ganirelix)、吉非替尼(gefitinib)、吉西他濱(gemcitabine)、吉妥單抗(gemtuzumab)、谷卡匹酶(Glucarpidase)、氧化型谷胱甘肽(glutoxim)、GM-CSF、戈舍瑞林(goserelin)、格拉司瓊(granisetron)、粒細胞群落刺激因子、組胺二鹽酸鹽、組胺瑞林(histrelin)、羥基脲(hydroxycarbamide)、I-125粒子、蘭索拉唑(lansoprazole)、伊班膦酸(ibandronic acid)、異貝莫單抗替坦(ibritumomab tiuxetan)、依魯替尼(ibrutinib)、艾達黴素(idarubicin)、異環磷醯胺(ifosfamide)、伊馬替尼(imatinib)、咪喹莫特(imiquimod)、英丙舒凡(improsulfan)、吲地司瓊(indisetron)、英卡膦酸(incadronic acid)、巨大戟二萜醇甲基丁烯酸酯(ingenol mebutate)、干擾素α、干擾素β、干擾素γ、碘比醇(iobitridol)、碘苄胍(iobenguane)(123I)、碘美普爾(iomeprol)、伊匹單抗(ipilimumab)、伊立替康(irinotecan)、伊曲康唑(Itraconazole)、伊沙匹隆(ixabepilone)、依薩佐米(ixazomib)、蘭瑞肽(lanreotide)、蘭索拉唑(lansoprazole)、拉帕替尼(lapatinib)、艾沙克林(Iasocholine)、來那度胺(lenalidomide)、樂伐替尼(lenvatinib)、來格司亭(lenograstim)、蘑菇多醣(lentinan)、來曲唑(letrozole)、亮丙瑞林(leuprorelin)、左旋咪唑(levamisole)、左炔諾孕酮(levonorgestrel)、左旋甲狀腺素鈉(levothyroxine sodium)、麥角乙脲(lisuride)、洛鉑(lobaplatin)、洛莫司汀(lomustine)、氯尼達明(lonidamine)、馬索羅酚(masoprocol)、甲羥孕酮(medroxyprogesterone)、甲地孕酮(megestrol)、美拉胂醇(melarsoprol)、美法侖(melphalan)、美雄烷(mepitiostane)、巰基嘌呤、美司鈉(mesna)、美沙酮(methadone)、甲胺喋呤(methotrexate)、甲氧沙林(methoxsalen)、胺基乙醯丙酸甲酯(methylaminolevulinate)、甲基潑尼松龍(methylprednisolone)、甲睾酮(methyltestosterone)、甲酪胺酸(metirosine)、米伐木肽(mifamurtide)、米替福新(miltefosine)、米鉑(miriplatin)、二溴甘露醇(mitobronitol)、米托胍腙(mitoguazone)、二溴衛矛醇(mitolactol)、絲裂黴素(mitomycin)、米托坦(mitotane)、米托蒽醌(mitoxantrone)、莫格利珠單抗(mogamulizumab)、莫拉司亭(molgramostim)、莫哌達醇(mopidamol)、嗎啡鹽酸鹽(morphine hydrochloride)、嗎啡硫酸鹽(morphine sulfate)、大麻隆(nabilone)、納比西莫(nabiximols)、那法瑞林(nafarelin)、納洛酮(naloxone)+戊唑星(pentazocine)、納曲酮(naltrexone)、那托司亭(nartograstim)、萊西單抗(necitumumab)、奈達鉑(nedaplatin)、奈拉濱(nelarabine)、奈立膦酸(neridronic acid)、奈妥吡坦(netupitant)/帕洛諾司瓊(palonosetron)、尼沃單抗(nivolumab)、噴曲肽(pentetreotide)、尼羅替尼(nilotinib)、尼魯胺(nilutamide)、尼莫唑(nimorazole)、尼妥珠單抗(nimotuzumab)、尼莫司汀(nimustine)、尼達尼布(nintedanib)、二胺硝吖啶(nitracrine)、尼沃單抗(nivolumab)、歐比托珠單抗(obinutuzumab)、奧曲肽(octreotide)、奧伐木單抗(ofatumumab)、奧拉帕尼(olaparib)、奧拉單抗(olaratumab)、高三尖杉酯鹼(omacetaxine mepesuccinate)、奧美拉唑(omeprazole)、昂丹司瓊(ondansetron)、奧普瑞白介素(oprelvekin)、奧古蛋白(orgotein)、奧瑞洛替莫德(orilotimod)、奧希替尼(osimertinib)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、羥考酮(oxycodone)、羥次甲氫龍(oxymetholone)、奧佐米星(ozogamicine)、p53基因療法、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、帕博西里(palbociclib)、帕利夫明(palifermin)、鈀-103粒子、帕洛諾司瓊(palonosetron)、帕米膦酸(pamidronic acid)、帕尼單抗(panitumumab)、帕比司他(panobinostat)、泮托拉唑(pantoprazole)、帕唑帕尼(pazopanib)、培門冬酶(pegaspargase)、PEG-β依泊汀(甲氧基PEG-β依泊汀)、派立珠單抗(pembrolizumab)、派非格司亭(pegfilgrastim)、聚乙二醇化干擾素α-2b、派立珠單抗(pembrolizumab)、培美曲塞(pemetrexed)、戊唑星(pentazocine)、噴司他汀(pentostatin)、培洛黴素(peplomycin)、全氟正丁烷(Perflubutane)、培磷醯胺(perfosfamide)、帕妥珠單抗(Pertuzumab)、畢西巴尼(picibanil)、匹魯卡品(pilocarpine)、吡柔比星(pirarubicin)、匹蒽醌(pixantrone)、普樂沙福(plerixafor)、普卡黴素(plicamycin)、聚胺葡糖(poliglusam)、聚磷酸雌二醇、聚乙烯吡咯啶酮+玻尿酸鈉、多醣-K(polysaccharide-K)、泊利度胺(pomalidomide)、普納替尼(ponatinib)、卟吩姆鈉(porfimer sodium)、普拉曲沙(pralatrexate)、潑尼氮芥(prednimustine)、潑尼松(prednisone)、丙卡巴肼(procarbazine)、丙考達唑(procodazole)、普萘洛爾(propranolol)、喹高利特(quinagolide)、雷貝拉唑(rabeprazole)、拉克莫單抗(racotumomab)、氯化鐳-223、拉多替尼(radotinib)、雷洛昔芬(raloxifene)、雷替曲塞(raltitrexed)、拉莫司瓊(ramosetron)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、雷莫司汀(ranimustine)、拉布立酶(rasburicase)、雷佐生(razoxane)、瑞法美替尼(refametinib )、瑞戈非尼(regorafenib)、利塞膦酸(risedronic acid)、依替膦酸錸-186、利妥昔單抗(rituximab)、羅拉皮坦(rolapitant)、羅米地辛(romidepsin)、羅米司亭(romiplostim)、羅莫肽(romurtide)、羅尼西克萊伯(roniciclib )、來昔屈南釤(153Sm)(samarium (153Sm) lexidronam)、沙格司亭(sargramostim)、沙妥莫單抗(satumomab)、腸泌素(secretin)、思圖昔單抗(siltuximab)、西普亮塞-T (sipuleucel-T)、西索菲蘭(sizofiran)、索布佐生(sobuzoxane)、甘胺雙唑鈉(sodium glycididazole)、索尼蒂吉伯(sonidegib)、索拉非尼(sorafenib)、康力龍(stanozolol)、鏈脲菌素(streptozocin)、舒尼替尼(sunitinib)、他拉泊芬(talaporfin)、塔里拉和(talimogene laherparepvec)、他米巴羅汀(tamibarotene)、他莫昔芬(tamoxifen)、他噴他多(tapentadol)、他索那明(tasonermin)、替西白介素(teceleukin)、諾非單抗美噴坦鎝(99mTc)(technetium (99mTc) nofetumomab merpentan)、99mTc-HYNIC-[Tyr3]-奧曲肽(99mTc-HYNIC-[Tyr3]-octreotide)、替加氟(tegafur)、替加氟(tegafur)+吉美拉西(gimeracil) +奧特拉西(oteracil)、替莫泊芬(temoporfin)、替莫唑胺(temozolomide)、坦羅莫司(temsirolimus)、替尼泊苷(teniposide)、睪固酮(testosterone)、替曲膦(tetrofosmin)、沙力度胺(thalidomide)、噻替派(thiotepa)、胸腺法新(thymalfasin)、α促甲狀腺素、硫鳥嘌呤、托西利單抗(tocilizumab)、拓朴替康(topotecan)、托瑞米芬(toremifene)、托西莫單抗(tositumomab)、曲貝替定(trabectedin)、曲美替尼(trametinib)、曲馬多(tramadol)、曲妥珠單抗(trastuzumab)、曲妥珠單抗恩他新(trastuzumab emtansine)、曲奧舒凡(treosulfan)、維甲酸(tretinoin)、曲氟尿苷(trifluridine) + 替吡嘧啶(tipiracil)、曲洛司坦(trilostane)、曲普瑞林(triptorelin)、曲美替尼(trametinib)、曲磷胺(trofosfamide)、血小板生成素(thrombopoietin)、色胺酸(tryptophan)、烏苯美司(ubenimex)、伐拉替尼(valatinib)、伐柔比星(valrubicin)、凡德他尼(vandetanib)、伐普肽(vapreotide)、維羅非尼(vemurafenib)、長春花鹼(vinblastine)、長春新鹼(vincristine)、長春地辛(vindesine)、長春氟寧(vinflunine)、長春瑞賓(vinorelbine)、維莫德吉(vismodegib)、伏立諾他(vorinostat)、伏羅唑(vorozole)、釔-90玻璃微球體、淨司他丁(zinostatin)、淨司他丁司他美(zinostatin stimalamer)、唑來膦酸(zoledronic acid)、左柔比星(zorubicin)。
效用
化合物6為PDE3A抑制劑，因此，根據用磷酸二酯酶抑制劑靶向癌症可為有前景之方法的實情，化合物6適用於治療癌症。 本發明之另一態樣為用於治療過度增生性疾病之化合物6。 本發明之另一態樣為用於治療過度增生性疾病之化合物6，該等過度增生性疾病為造血性過度增生性疾病，包括尤其真性紅血球增多症、原發性血小板增多、原發性骨髓纖維化。 另一態樣為預防及/或治療過度增生性疾病之方法，其包含投與有效量之一或多種化合物6之化合物，尤其治療過度增生性疾病之方法。 化合物6亦適用於預防及/或治療良性過度增生性疾病，例如子宮內膜異位、平滑肌瘤及良性前列腺增生。 因此，另一態樣為過度增生性疾病為良性過度增生性疾病。 本發明之另一態樣為用於治療癌症之化合物6。其尤其適用於治療轉移性或惡性腫瘤。 因此，本發明之另一態樣為一種治療癌症之方法，其包含投與有效量之至少一種化合物6。 本發明之另一態樣為一種治療轉移性或惡性腫瘤之方法，其包含投與有效量之化合物6。 本發明之另一態樣為化合物6之用途，其係用於治療實體腫瘤。 本發明之另一態樣為用於治療實體腫瘤之化合物6。 本發明之另一態樣為一種治療實體腫瘤之方法，其包含投與有效量之化合物6。 本發明之另一態樣為化合物6用於治療實體腫瘤之用途，可治療之實體腫瘤如以下之腫瘤：乳房、呼吸道、腦、骨、中樞及周邊神經系統、結腸、直腸、肛門、生殖器官(例如子宮頸、卵巢、前列腺)、胃腸道(包括胃腸基質腫瘤)、泌尿生殖道、內分泌腺(例如甲狀腺及腎上腺皮質)、甲狀腺、副甲狀腺、食道、子宮內膜、眼睛、生殖細胞、頭部及頸部、腎臟、肝臟、喉及下嚥、肺、間皮瘤、胰臟、前列腺、直腸、腎臟、小腸、皮膚、軟組織、胃、睪丸、尿管、陰道及外陰及結締組織及此等腫瘤之癌轉移。惡性贅瘤包括遺傳性癌症，例如視網膜母細胞瘤及威爾姆斯腫瘤。 本發明之另一態樣為一種治療上述腫瘤之方法，其包含投與有效量之化合物6。 本發明之另一態樣為化合物6之用途，其係用於治療血液腫瘤。 本發明之另一態樣為用於治療血液腫瘤之化合物6。 本發明之另一態樣為一種治療血液腫瘤之方法，其包含投與有效量之化合物6。 本發明之另一態樣為化合物6用於治療癌症之用途，其中癌症類型為骨癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、子宮內膜癌、胃腸基質腫瘤(GIST)、頭部及頸部癌症(尤其頭部癌症，更尤其神經膠質瘤、神經膠母細胞瘤)、造血性癌症、腎癌、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴癌、黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、軟組織肉瘤、甲狀腺癌、泌尿道癌。 本發明之另一態樣為化合物6之用途，其用於治療黑色素瘤、腺癌、乳癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、神經膠母細胞瘤、造血性/淋巴性癌症、腎癌、平滑肌肉瘤、肝癌、肺癌、卵巢癌、胰腺癌、軟組織肉瘤、甲狀腺癌或泌尿道癌。 本發明之另一態樣為化合物6用於治療癌症之用途，其中癌症類型為黑色素瘤、子宮內膜癌、肺癌、造血性癌症、淋巴癌、卵巢癌、子宮頸癌、軟組織肉瘤、平滑肌肉瘤、泌尿道癌、胰腺癌、甲狀腺癌。 本發明之另一態樣為化合物6之用途，其用於治療皮膚癌(尤其黑色素瘤)、肺癌(尤其肺腺癌)及子宮頸癌。 本發明之另一態樣為化合物6之用途，其用於治療如下之癌症：骨、中樞神經系統(尤其多形性膠質母細胞瘤及神經膠質瘤)、結腸、造血及淋巴組織(尤其紅白血病及T細胞淋巴瘤)、肝臟、肺(尤其肺腺癌及小細胞肺癌(SCLC))、卵巢、皮膚(尤其黑色素瘤)。 診斷 本發明之特點是用於表徵癌症之診斷分析。在一個實施例中，在個體樣品中量測
PDE3A
、
施拉芬 12
(
Schlafen 12 ； SLFN12 )
或CREB3L1聚核苷酸或多肽之含量及作為會對用PDE3A調節劑治療起反應之癌症的指標。在另一實施例中，在個體生物樣品中量測CREB3L1聚核苷酸或多肽之含量。個體生物樣品(例如包含癌細胞之生物樣品)中CREB3L1或SLFN12聚核苷酸或多肽表現相對於參考物缺失或降低係指示該癌症對用PDE3A調節劑治療具有抗性。
PDE3A
、
施拉芬 12
及/或CREB3L1聚核苷酸之含量可藉由標準方法量測，諸如定量PCR、RNA定序、北方墨點、微陣列、質譜及原位雜交。可使用標準方法量測源自腫瘤生物樣品中PDE3A、施拉芬12及/或CREB3L1多肽之含量。此類方法包括免疫分析；ELISA；使用結合PDE3A、施拉芬12及/或CREB3L1之抗體進行的西方墨點法；及放射免疫分析。
PDE3A
及
施拉芬 12
聚核苷酸或多肽之含量相對於參考物經提高被認為是對用PDE3A調節劑治療起反應之癌症的陽性指標。CREB3L1或SLFN12聚核苷酸或多肽之經降低含量被認為是對用PDE3A調節劑治療具有抗性之癌症的指標。 生物樣品之類型 在表徵個體惡性病對PDE3A調節劑治療之反應時，量測不同類型生物樣品中PDE3A、SLFN12及/或CREB3L1表現之含量。在一個實施例中，生物樣品為腫瘤樣品。 在獲自對PDE3A調節劑治療起反應之個體的樣品中，PDE3A及/或SLFN12表現高於非反應性個體中之表現量。在另一實施例中，患有惡性病之個體中的PDE3A及/或SLFN12為健康對照之至少約5、10、20或30倍。使用此項技術中已知之任何方法確定倍數變化值。在一個實施例中，CREB3L1或SLFN12表現相對於參考物係經降低的或無法偵測到。在特定實施例中，CREB3L1或SLFN12表現經降低約10%、25%、50%、75%、85%、95%或大於95%。在一個實施例中，變化係藉由計算癌細胞中PDE3A、SLFN12及/或CREB3L1之表現與非反應性癌細胞中所存在之含量或相應健康對照細胞中所存在之含量的差值測定。 治療方法之選擇 如下文所報導，在選擇治療方法之過程中，可測試罹患過度增生性疾病個體的PDE3A、SLFN12及/或CREB3L1表現。將特徵為相對於參考含量PDE3A及/或SLFN12增加的病人鑑別為對PDE3A調節劑治療起反應。將相對於參考物SLFN12或CREB3L1表現量降低或無法偵測的個體鑑別為對PDE3A調節劑治療具有抗性。 套組 本發明提供用於表徵個體對PDE3A調節劑治療之反應或抗性的套組。 本文亦提供如下套組，其可包括含有有效量之例如單位劑型之PDE3A調節劑的治療性組合物。 在一個實施例中，本發明之診斷套組提供用於量測PDE3A及SLFN12之相對表現的試劑。此類試劑包括捕捉分子(例如識別PDE3A及SLFN12多肽之抗體或與PDE3A及SLFN12聚核苷酸雜交之核酸探針)。 在另一實施例中，診斷套組包括結合CREB3L1多肽或聚核苷酸之捕捉試劑(例如抗體或核酸探針)。 在一些實施例中，套組包含無菌容器，其包括治療性或診斷性組合物；此類容器可為盒、安瓿、瓶子、小瓶、管、袋、小袋、泡殼包裝或此項技術中已知之其他合適容器形式。此類容器可由塑膠、玻璃、層壓紙、金屬箔片或適合於保存藥劑藥物之其他材料製成。 在一個實施例中，本發明套組包含用於量測PDE3A、SLFN12及/或CREB3L1含量之試劑。必要時，套組進一步包含量測PDE3A及/或SLFN12之說明及/或向患有惡性病(例如經選為會對PDE3A調節劑治療起反應之惡性病)之個體投與PDE3A調節劑的說明。在特定實施例中，說明包括以下中之至少一者：治療劑之描述；用於治療或預防惡性病或其症狀之給藥時程及投藥；注意事項；警告；適應症；對立適應症；過量劑量資訊；不良反應；動物藥理學；臨床研究；及/或參考文獻。說明可直接印在容器(當存在時)上或以標籤形式施用於容器或為於容器中或與容器一起供應之單獨紙片、小冊子、卡片或摺疊式印刷品。 除非另外指示，否則本發明之實踐採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學之習知技術，其完全處於熟習此項技術者之範圍內。此類技術在以下文獻中充分說明，諸如：「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, 第二版 (Sambrook, 1989)；「Oligonucleotide Synthesis」 (Gait, 1984)；「Animal Cell Culture」 (Freshney, 1987)；「Methods in Enzymology」 「Handbook of Experimental Immunology」 (Weir, 1996)；「Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells」 (Miller及Calos, 1987)；「Current Protocols in Molecular Biology」 (Ausubel, 1987)；「PCR: The Polymerase Chain Reaction」, (Mullis, 1994)；「Current Protocols in Immunology」 (Coligan, 1991)。此等技術可適用於生產本發明之聚核苷酸及多肽，且因此可在進行及實踐本發明時考慮。特定實施例之尤其適用技術將在隨後的章節中論述。 提出以下實例以向一般技術者提供完整揭示內容及如何進行及使用本發明之分析、篩選及治療方法的描述，且不欲限制本發明之範疇。 實例 實例1.細胞選擇性細胞毒性小分子之鑑別 為鑑別具有細胞選擇性細胞毒性活性之抗癌化合物，在兩種肺腺癌細胞株A549及NCI-H1734中進行無偏差性化學物質篩選，其兩者均具有致癌
KRAS
突變及截斷
STK11
突變，且分別為
TP53
野生型及突變體(R273L)。在A549及NCI-H1734細胞株中，在10 μM之單一濃度下，於384孔規格以雙重複實驗，從分子庫小分子儲存庫確效實驗群組(Molecular Libraries Small-Molecule Repository validation set)篩選出1,924種化合物。ATP係作為細胞活力之特徵，在化合物處理48小時後量測ATP含量。 三種化合物在NCI-H1734細胞株中相較於A549細胞株顯示出細胞活力是選擇性降低，其在NCI-H1734細胞株中降低約50%，其與負方向之中值的中值絕對偏差＞4，相比之下，在A549細胞株中，與中值之中值絕對偏差最小變化＜1 (圖1A)。在劑量反應分析中再測試該三種化合物證實一種化合物6-(4-(二乙基胺基)-3-硝基苯基)-5-甲基-4,5-二氫噠嗪-3(2
H
)-酮或DNMDP對NCI-H1734細胞株具有特異性毒性(圖2)。 用DNMDP測試其他細胞株展示明顯細胞選擇性細胞毒性，其中對於兩種其他肺腺癌細胞株NCI-H1563與NCI-H2122及HeLa子宮頸癌細胞，EC
50
在10至100 nM之間，但對於A549、MCF7及PC3細胞，EC
50
則大於1 μM (圖1B；圖1C)。因此，本發明之一個態樣為DNMDP用於治療肺腺癌及子宮頸癌之用途。HeLa細胞在DNMDP處理後，藉由卡斯蛋白酶敏感性螢光素酶分析及藉由聚ADP核糖聚合酶(PARP)裂解可偵測卡斯蛋白酶活性，指示敏感細在DNMDP暴露後經受細胞凋亡(圖17A-17B)。 為進一步表徵細胞對DNMDP之敏感性，篩選766個經基因組表徵癌細胞株以2倍稀釋梯度介於66.4 μM至2 nM範圍內濃度之DMNDP處理72小時的敏感性(參見下文進一步描述之
大規模細胞株活力量測
)。由此等細胞株，22個細胞株被歸類為敏感，其穩健Z分值低於-4，其代表多種譜系，包括尤其多種黑色素瘤細胞株(表1)。 隨後，藉由對掌性超臨界流體(SCF)層析分離DNMDP對映異構體。一種對映異構體在HeLa細胞中之有效性為其他細胞之500倍(圖1C及D)。由市售起始物質合成(R)-對映異構體(圖3)。此合成之對映異構體與更有效分離物質具有類似活性且藉由對掌性SCF層析證實一致，從而確定活性對映異構體之立體化學(圖4A-4C)。合成DNMDP之兩種(R)-去硝基類似物，其兩者類似於(R)-DNMDP測試(圖3)。圖4A-4C展示(6-(4-(二乙基胺基)-3-硝基苯基)-5-甲基-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮(DNMDP)之超臨界流體(SCF)層析(由上至下：ES+、二極體陣列、ES-跡線)。圖4A展示峰1 (CRO分離)；圖4B為展示峰2 (CRO分離)；且圖4C為展示合成之(R)-DNMDP (藉由uv，峰1:2比率為5:95)。
表 1 ： 用 DNMDP 處理之 766 個癌細胞株之敏感性資料
實例1b 細胞增殖量測 活體外檢驗通式(I)化合物在人類癌細胞中之抗增殖活性。出於此目的，將1000個細胞塗佈在具有適當生長培養基之384孔盤中且在37℃下培育隔夜。在24小時之後，一個培養盤(0小時盤)上之細胞用30微升/孔之CTG溶液(Promega Cell Titer Glo (目錄號G755B及G756B))處理且在室溫下培育10分鐘，且藉助於VICTOR V (Perkin Elmer)量測發光，以測定處理開始時之細胞活力。用通式(I)化合物處理測試盤上之細胞且在37℃下培育72小時。藉助於HP D300數位分配器以10步2.5倍稀釋系列將化合物添加至細胞中。作為對照，用媒劑(0.3%最終濃度之DMSO)處理細胞。72小時後，細胞用30微升/孔之CTG溶液(Promega Cell Titer Glo (目錄號G755B及G756B))處理且在室溫下培育10分鐘，且藉助於VICTOR V (Perkin Elmer)量測發光，以測定在處理結束時之細胞活力。使用來自0小時盤(=最大抑制)及DMSO對照(=最小抑制)之值測定各測試物質對細胞生長之作用百分比及由其獲得之IC
50
。使用4參數擬合計算IC
50
值。 對於化合物6，獲得以下IC
50
值：
表 1a 細胞增殖結果
本發明之另一態樣為化合物6之用途，其用於治療皮膚癌(尤其黑色素瘤)及子宮頸癌。
實例 2 . 使用 預測化學基因組及鑑別 PDE3A 為 DNMDP 之推定標靶
鑒於6-(4-(二乙基胺基)-3-硝基苯基)-5-甲基-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮(DNMDP)可達成有效細胞選擇性生長抑制，更詳細地檢驗其作用機制。為確定DNMDP之分子標靶，進行766個測試細胞株之化學基因組分析，以尋找此等基因組特徵與DNMDP敏感性之間的相關性，該等測試細胞株先前已針對突變、複本數及基因表現特徵進行表徵而作為Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE, Barretina等人, 2012)之部分。DNMDP敏感性與細胞株集合中個別基因表現之間的皮爾森相關性分析展示與編碼磷酸二酯酶3A之
PDE3A
基因之表現強烈相關(圖5A)。DNMDP敏感性與
PDE3A
表現之間的相關性不完美(圖18)，且有可能由於細胞株敏感性表徵之高處理量性質而引入一些錯誤，因為手動驗證所有766個細胞株邏輯上不可行。相比之下，突變及複本數特徵不與DNMDP敏感性相關。相反地，在480種測試化合物中，DNMDP敏感性與
PDE3A
表現最相關(圖5B)，指示相較於任何其他測試化合物，具有高
PDE3A
表現之癌細胞株對DNMDP更明顯地敏感。與初始篩選之動機相比，
TP53
突變或p53功能之其他量測值與DNMDP敏感性之間無相關性。 鑒於此等結果及DNMDP與已知PDE3抑制劑(例如左西孟旦及氰胍佐旦)之明顯結構類似性(圖6A-6C)，執行針對代表11個PDE超家族之19種磷酸二酯酶的DNMDP之生物化學分析。在100 nM之濃度下，DNMDP特異性抑制PDE3A與PDE3B，弱抑制PDE10，且對其他磷酸二酯酶幾乎無可偵測之作用(表2)。 由於
PDE3A
表現與DNMDP敏感性之間的細胞相關性、DNMDP對PDE3A及PDE3B之活體外抑制及DNMDP與已知PDE3抑制劑之結構類似性，故分析是否所有PDE3抑制劑均對DNMDP展現類似細胞毒性概況。意外地，一系列測試化合物的活體外酶促PDE3A抑制之IC
50
與HeLa細胞細胞毒性之間幾乎無相關性(圖5C及圖7A及7B)。實際上，有效PDE3抑制劑曲喹辛(PDE3 IC
50
= 0.25 nM，Ruppert等人, Life Sci. 31, 2037-2043, 1982)不以任何可偵測方式影響HeLa細胞活力。儘管非細胞毒性PDE3抑制劑曲喹辛及有效細胞毒性化合物DNMDP對HeLa細胞活力之作用不同，但其在弗斯可林處理之HeLa細胞中對胞內cAMP含量具有類似作用(圖8A及8B)。此結果指示抑制PDE3A之cAMP及cGMP水解功能對於DNMDP之細胞毒性活性並不足夠。
表 2 ：磷酸二酯酶抑制反應之結果 實例 3 . PDE3A 之標靶驗證
磷酸二酯酶3A (PDE3A)抑制與細胞殺滅之間的複雜關係，其中6-(4-(二乙基胺基)-3-硝基苯基)-5-甲基-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮(DNMDP)及一些PDE3抑制劑殺滅HeLa細胞及其他DNMDP敏感性細胞，而其他PDE3抑制劑不影響細胞活力，指示數種可能解釋，包括：1)細胞毒性活性可能不依賴於PDE3且歸因於對不同蛋白質之作用，儘管篩選234種激酶未發現激酶由10 μM DNMDP抑制；2)細胞毒性及非細胞毒性PDE3抑制劑可結合於蛋白質內之不同位點且發揮獨特活性；或3)細胞毒性及非細胞毒性PDE3抑制劑可結合於PDE3活性位點，但對蛋白質之構形及活性具有不同作用。此第三種可能為意外的，單PDE4之異位調節劑已展示結合PDE4活性位點且與上游調節域(UCR2)及下游調節域(CR3)相互作用，從而穩定特定無活性構形(Burgin等人, Nat Biotechnol 28, 63-70, 2010)。最重要的是，對活體外cAMP水解具有類似IC
50
之PDE4競爭性抑制劑及PDE4異位調節劑在動物研究中具有不同細胞活性及安全概況(Burgin等人, Nat Biotechnol 28, 63-70, 2010)。為評估PDE抑制劑或其他小分子是否與DNMDP競爭，篩選具有1600種生物活性化合物之PHARMAKON 1600集合(PHARMAKON 1600為具有來自美國和國際藥典(US and International Pharmacopeia)的1600種已知藥物的獨特集合)以鑑別能夠拯救DNMDP誘導之細胞死亡的化合物。用30 nM DNMDP (EC
70
濃度)及20 μM各生物活性化合物共處理HeLa細胞。48小時處理後藉由前述ATP消耗評定細胞活力。拯救DNMDP誘導之細胞死亡的五種最有效化合物為所有PDE抑制劑，且三種最有效化合物左西孟旦、米利酮及西洛他唑為所有選擇性PDE3抑制劑(圖9A)。 在追蹤實驗中，證實西洛醯胺、左西孟旦及米利酮及數種其他非細胞毒性選擇性PDE3抑制劑能夠以劑量依賴性方式拯救DNMDP細胞毒性(圖9B)。最有效DNMDP競爭者為曲喹辛，「RC
50
」(其達成50%拯救之濃度) ＜1 nM；相比之下，在此分析中，直至10 μM濃度，諸如西地那非及伐地那非之PDE5抑制劑以及泛PDE抑制劑艾度拉斯(idubulast)及雙嘧達莫(dipyridamole)為非有效競爭者(圖9B)。此指示非細胞毒性PDE3抑制劑與DNMDP競爭結合於相同分子標靶，從而調節細胞毒性表型。 為鑑別DNMDP之分子標靶，使用與HeLa細胞溶解物一起培育的(
R
)-去硝基-DNMDP固相繫栓之連接子類似物(圖10A)執行親和力純化。此連接子類似物與上述非細胞毒性PDE3抑制劑具有相同DNMDP細胞毒性拯救表型(圖10B)，指示其亦結合於相同分子標靶。藉由添加過量曲喹辛或DNMDP之各別對映異構體，其競爭分子標靶，其中僅(
R
)-對映異構體具有細胞毒性。親和力純化物質之PDE3A的免疫墨點展示PDE3A實際上結合於連接子類似物。PDE3A與連接子類似物之結合經曲喹辛與(
R
)-DNMDP阻斷，但不經非細胞毒性對映異構體(
S
)-DNMDP阻斷(圖9C)。因此，曲喹辛與(
R
)-DNMDP均阻止PDE3A結合於繫栓之DNMDP類似物，且得出結論：兩個分子均直接結合PDE3A。 基於DNMDP敏感性細胞表現高含量之PDE3A且DNMDP與非細胞毒性抑制劑競爭PDE3A結合的觀察結果，假設DNMDP經由與PDE3A相互作用介導其細胞毒性表型且PDE3A豐度為DNMDP敏感性之直接細胞決定因素。為驗證此假定，測試降低PDE3A含量對於對DNMDP之反應的作用。用靶向
PDE3A
基因座中之三個不同位點的三個導引RNA (sgRNA)靶向的成簇且規律間隔的短回文(CRISPR)相關的CAS9酶使得PDE3A表現完全缺失(Cong等人, Science 339, 819-823, 2013)，sgRNA2及sgRNA3幾乎完全降低PDE3A蛋白質含量，而sgRNA1對PDE3A表現具有中等影響(圖11A)。重要的是，sgRNA2與sgRNA3均產生活性細胞毒性DNMDP類似物
3
所致之毒性的顯著拯救(圖11A及11B及圖5A-5C)。sgRNA2與sgRNA3均產生DNMDP所致之毒性的顯著拯救(圖11C)。未觀測到PDE3A表現降低之HeLa細胞中增殖速率或形態之變化，指示PDE3A並非為細胞存活所必需。在使用含有靶向
PDE3A
之四種不同siRNA的siRNA smart-pool進行的非依賴性方法中，HeLa細胞株中PDE3A表現降低，其中在轉染後24小時至72小時最大效率為70%。相較於對照siRNA條件，用siPDE3A處理之HeLa細胞對DNMDP類似物具有較高EC
50
(圖12A及12B)。在不受理論限制之情況下得出結論：DNMDP細胞毒性需要PDE3A，且DNMDP可調節PDE3A之功能。 實例4.確定DNMDP之作用機制 6-(4-(二乙基胺基)-3-硝基苯基)-5-甲基-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮(DNMDP)細胞毒性對磷酸二酯酶3A (PDE3A)蛋白質豐度之依賴性顯示類似於近年來對於來那度胺所觀測之可能機制，該機制係藉由新生形態或超生形態機制藉由穩定塞勒布隆(cereblon)與IKAROS家族鋅指1 (IKZF1)及IKZF3之間的相互作用來起作用(Kronke等人, Science 343, 301-305, 2014；Lu等人, Science 343, 305-309, 2014)。另外，PDE4異位調節劑而非競爭性抑制劑已證明會結合且穩定「閉合」蛋白質構形，該蛋白質構形獨立地展示獨特地結合PDE4-搭配物蛋白質DISC1(Millar等人, Science 310, 1187-1191, 2005)。在正常條件下表徵PDE3A所在的蛋白質複合物，且檢驗此等複合物在PDE3A結合於DNMDP或非細胞毒性PDE3抑制劑曲喹辛時如何變化。將來自HeLa細胞之PDE3A及相互作用蛋白在DNMDP及曲喹辛存在下進行免疫沈澱，繼而用同量異位穩定同位素標記物標記以獲得相對豐度且藉由質譜(iTRAQ/MS，圖13A)定量。來自HeLa細胞之PDE3A免疫沈澱物富集複數種蛋白質磷酸酶次單位，包括蛋白質磷酸酶2次單位(PPP2CA、PPP2R1A、PPP2R1B、PPP2R2A、PPP2R2D)、鈣調神經磷酸酶(PPP3R1、PPP3CA，Beca等人, Circ. Res. 112, 289-297, 2013)、14-3-3 (YWHAB、YWHAQ、YWHAG、YWHAZ，Pozuelo Rubio等人, Biochem. J. 392, 163-172, 2005)及微管蛋白(TUBA1C、TUBA1B)家族成員(圖13B及圖14A)。另外，咸發現，PDE3A及PDE3B處於相同的蛋白質複合物，先前已報導此現象(Malovannaya等人, Cell 145, 787-799, 2011)。 DNMDP之結合改變了與PDE3A共免疫沈澱之相互作用蛋白之組成。用DNMDP處理後，在PDE3A免疫沈澱物中特別富集的蛋白質包括Sirtuin 7 (SIRT7)及施拉芬12 (SLFN12)(圖13C及圖14B)。此等蛋白質在DNMDP存在下會與PDE3A相互作用，且在曲喹辛處理對照中未觀測到，但一種已知PDE3B相互作用子，即含有αβ水解酶域之蛋白質15 (ABHD15，Chavez等人, Biochem. Biophys. Res. Commun. 342, 1218-1222, 2006)在來自曲喹辛處理細胞之免疫沈澱物中富集(圖13C及圖14C)。用親和力試劑證實PDE3A與SIRT7及SLFN12兩者之間係由DNMDP促進的相互作用。用DNMDP而非DMSO或曲喹辛處理之HeLa細胞中內源PDE3A之免疫沈澱提高了異位表現之經V5標記的SIRT7及SLFN12與PDE3A之複合物形成，如藉由共免疫沈澱證明(圖19)。DNMDP及(弱)阿那格雷(而非曲喹辛)誘導PDE3A與SFLN12複合物形成(圖20)。在不受理論限制之情況下，PDE3A/SLFN12複合物形成與細胞殺滅有關(圖21A-21C)。 類似於PDE3A，過度表現SLFN12在DNMDP敏感性細胞株中似乎具有細胞毒性作用，從而造成全細胞溶解物中偵測SLFN12之難度。 PDE3A與SIRT7及SLFN12之相互作用提高指示此等相互作用蛋白中之一或多者可有助於DNMDP敏感性的可能性。在所有測試細胞中，
SIRT7
mRNA表現相對恆定，但
SLFN12
與
PDE3A
mRNA之共表現展示與DNMDP敏感性強烈相關；幾乎所有DNMDP敏感性細胞株均表現高含量之
SLFN12
(圖15A-15C)。重要的是，表現高含量之
SLFN12
及
PDE3A
的敏感性細胞株中幾乎一半被認為是黑色素瘤細胞株(圖15B)。單獨的
SLFN12
表現亦為與對DNMDP之敏感性有關的最高基因中之一者，從而確證了如下假定：SLFN12在功能上參與DNMDP誘導之細胞毒性(圖16A)。此外，在針對
PDE3A
表現進行校正時，
SLFN12
表現為DNMDP敏感性之最高關聯基因(圖16B)。為評定SLFN12是否為DMNDP之細胞毒性表型所必需，吾人藉由用兩種shRNA在HeLa細胞中阻斷基因表現而使
SLFN12
mRNA表現降低60% (圖15D)。類似於PDE3A表現降低，SLFN12表現降低未引起細胞毒性，且實際上對DNMDP之敏感性降低(圖15E)。此等結果展示，SLFN12，如PDE3A一般，為DMNDP之細胞毒性表型所需。藉由GTEX共生物種表徵
SLFN12
及
PDE3A
之正常表現(Pierson, E.等人, PLoS Comput. Biol. 11, e1004220 (2015))展示正常組織中
SLFN12
之表現低，同時幾乎觀測不到
PDE3A
與
SLFN12
之高共表現(表3)。此可表明DNMDP對標靶之毒性且相關化合物可能受限制。
表 3 ： 多個健康組織類型中 SLFN12 及 PDE3A 表現之 RPKM 值
圖22展示對DNMDP產生抗性之細胞中SLFN12及CREB3L1是減損的。藉由持久暴露於DNMDP使最初對DNMDP敏感之細胞株產生抗性，隨後藉由RNA-seq分析。在HeLa與H2122中下調兩種基因：SLFN 12及CREB3L1。因此，CREB3L1及/或SLFN 12之含量降低指示細胞變得對DNMDP及其他PDE3A調節劑具有抗性。 藉由延長暴露對DNMDP產生抗性之兩種不同細胞株(HeLa及H2122)的兩種基因(SLFN12及CREB3L1)之表現通常是下調的(圖22)。再表現SLFN12會恢復對DNMDP之敏感性(圖23A)。在不受理論限制之情況下，經恢復之敏感性會依賴於PDE3A，因為其會藉由PDE3A抑制劑曲喹辛競爭而消耗掉。DNMDP抗性細胞株A549會藉由表現SLFN12或表現SFLN12及PDE3A敏化(圖23B)。表現SLFN12足以賦予DNMDP對A549細胞之敏感性。PDE3A表現的加成會引起進一步敏化。 平滑肌肉瘤為惡性平滑肌腫瘤。分析來自平滑肌肉瘤之病人腫瘤樣品的PDE3A及SLFN12表現以預測平滑肌肉瘤(LMS)對DNMDP之敏感性。平滑肌肉瘤經預測會對DNMDP敏感，因為在高純度TCGA樣品中表現高含量之PDE3A及SLFN12是普遍性的(圖24，表4)。生物標記物表現與平滑肌肉瘤譜系之相關性的P值：0.0001。 表4.平滑肌肉瘤預計對DNMDP敏感
使用差示掃描螢光測定法(DSF)展示DNMDP與經純化PDE3A催化域PDE3A(677-1141)之結合。在此實驗中，如表5所示，在100 μM化合物不存在或存在下培育5 μM hsPDE3A (640-1141)。結合緩衝液：20 mM Hepes (pH 7.4)、100 μM TCEP、1 mM MgCl
2
、150 mM NaCl。
表 5 . DNMDP 與 PDE3A ( 677 - 1141 ) 之結合
使用預測化學基因組，發現一類由DNMDP例示之化合物，其藉由小分子調節PDE3A靶向新穎癌症相關性。此等化合物與非細胞毒性PDE3抑制劑一起以彼此不干擾之方式結合PDE3A，且對PDE3A之功能發揮新生形或超生形作用，從而引起其蛋白質-蛋白質相互作用之改變。一種獨特的蛋白質相互作用搭配物SLFN12高度表現於DNMDP敏感性細胞株中，指示轉送細胞毒性信號之路徑中的功能作用。因此，DNMDP在大量癌細胞株中具有選擇性與有效性。 本文鑑別出一種新穎細胞毒性化合物，其對多個譜系之癌細胞株具有大選擇性及低奈莫耳濃度之效能。使用預測化學基因組之基因表現相關性，將PDE3A鑑別為此小分子DNMDP之推定標靶。有趣的是，PDE3A表現缺失會引起對DNMDP之抗性。此外，PDE3A免疫沈澱，繼而用於獲得相對豐度之同量異位穩定同位素標記物及藉由質譜(iTRAQ/MS)定量將SLFN12及SIRT7鑑別為DNMDP結合後PDE3A之新穎蛋白質-蛋白質相互作用搭配物，此可能歸因於PDE3A之功能的異位調節。重要的是，在針對
PDE3A
表現進行校正時，
SLFN12
表現為DNMDP敏感性之最高關聯基因。單個基因或多個基因表現相關性展示輔助闡明小分子之作用機制及相關信號傳導路徑。鑑別出用於癌症治療之新穎生物化學標靶，其不太可能藉由標靶鑑別法(諸如功能缺失篩選)或基因組分析發現。 PDE3A屬於磷酸二酯酶之超家族且與PDE3B一起形成PDE3家族。PDE3家族具有雙重受質親和力且水解cAMP與cGMP。
PDE3A
之表現在心血管系統、血小板、腎臟及卵母細胞中最高(Ahmad等人, Horm Metab Res 44, 776-785, 2012)。已開發臨床PDE3抑制劑西洛他唑來治療間歇性跛行，因為血小板中之PDE3A抑制削弱活化及血小板凝集(Bedenis等人, Cochrane Database Syst Rev 10, CD003748, 2014)。其他PDE3抑制劑(諸如米利酮、氨利酮(amrinone)及左西孟旦)經指示可治療充血性心臟衰竭，其中血管擴張與心臟cAMP含量提高之組合提高心肌收縮性(Movsesian等人, Curr Opin Pharmacol 11, 707-713, 2011)。此等臨床抑制劑均不能模仿DNMDP之細胞毒性表型，指示環核苷酸水解不足以誘導DNMDP敏感性細胞株中之細胞死亡。 然而，有趣的是，先前已報導其他PDE3抑制劑(諸如紮達維林、阿那格雷及喹齊酮(quazinone))在所選數目之癌細胞株中具有細胞毒性特徵(Sun等人, PLoS ONE 9, e90627, 2014；Fryknäs等人, J Biomol Screen 11, 457-468, 2006)。與本發明之發現一致，發現其他PDE3及PDE4抑制劑不能模仿紮達維林之細胞毒性表型，其中據報導，視網膜母細胞瘤蛋白視網膜母細胞瘤1 (RB1)表現區分紮達維林敏感性細胞株與非敏感性細胞株(Sun等人, PLoS ONE 9, e90627, 2014)。將此發現與本發明資料相比，其中未鑑別DNMDP之細胞毒性活性與
RB1
之複本數或mRNA表現之間的相關性。另一PDE3抑制劑阿那格雷獨特地抑制巨核細胞分化，從而引起細胞凋亡。測試之其他PDE3抑制劑無此活性(Wang等人, Br. J. Pharmacol. 146, 324-332, 2005；Espasandin, Y.等人, J. Thromb. Haemost. n/a-n/a, 2015, doi: 10.1111/jth. 12850)。假設紮達維林對細胞存活之報導作用及阿那格雷對巨核細胞分化之報導作用經由此研究中所述之相同PDE3A調節介導。 多種PDE3抑制劑為競爭性抑制劑且已展示佔據cAMP及cGMP之催化結合位點 (Card等人, Structure 12, 2233-2247, 2004；Zhan等人, Mol. Pharmacol. 62, 514-520, 2002)。另外，紮達維林在與PDE4D之複合物中共結晶，在該複合物中，其佔據cAMP結合位點，且已模型化而以類似方式結合PDE3B(Lee等人, FEBS Lett. 530, 53-58, 2002)。鑒於DNMDP與紮達維林之結構類似性及DNMDP抑制PDE3A與PDE3B，假設DNMDP之結合模式極類似於紮達維林。此指示除充當cAMP/cGMP競爭性抑制劑以外，DNMDP亦異位誘導負責其細胞毒性表型之構形。先前已針對PDE4描述磷酸二酯酶之異位調節，其中小分子結合在活性位點中且同時與跨越PDE4活性位點之調節域相互作用。因此，異位調節劑穩定已展示區別地結合不同PDE4搭配物蛋白之蛋白質構形(Burgin等人, Nat Biotechnol 28, 63-70, 2010)。 與PDE3A相關之蛋白質之研究可闡明其正常功能與PDE3A調節劑(諸如DNMDP)殺滅癌細胞之方式。PDE3A與蛋白質磷酸酶2次單位相互作用，該等次單位參與致癌病毒轉型且在人類癌症中突變(Nagao等人, Int. Symp. Princess Takamatsu Cancer Res. Fund 20, 177-184, 1989；Imielinski等人, Cell 150, 1107-1120, 2012；Lawrence等人, Nature 499, 214-218, 2013)，指示PDE3A在癌細胞信號傳導中之作用。即使此等相互作用並非藉由DNMDP結合誘導，但蛋白質磷酸酶在癌症生物學中之重要性將保證其他研究。 藉由DNMDP結合於PDE3A促進的PDE3A與SLFN12之間的相互作用的提高及對DNMDP之敏感性與
SLFN12
表現之間的相關性強烈指示必需瞭解PDE3A-SLFN12相互作用之功能影響。然而，如今對於SLFN12在人類生理學及癌症生物學中之功能作用知之甚少。
SLFN12
為
schlafen
基因家族之一部分，其在人類與嚙齒動物之間基本上不同。該大的差異歸因於快速基因演變及陽性選擇(Bustos等人, Gene 447, 1-11, 2009)。因此，SLFN12無鼠類直系同源物，從而阻礙了SLFN12在充分瞭解模型生物體中進行研究。關於SLFN12之單一公開案展示異位表現SLFN12後前列腺癌細胞株經調節(Kovalenko等人, J. Surg. Res. 190, 177-184, 2014)。關於SLFN12之功能及其與PDE3A之相互作用的其他研究可闡明DNMDP細胞毒性之機制。兩個觀察結果指示DNMDP作為新生形或超生形對PDE3A功能起作用：1) DNMDP敏感性癌細胞株不依賴於PDE3A表現而存活，而是阻斷PDE3A表現引起DNMDP抗性；及2)結合於PDE3A後DNMDP誘導或提高蛋白質-蛋白質相互作用。來那度胺為作為新生形或超生形而非作為酶促抑制劑起作用的小分子之一實例。來那度胺調節塞勒布隆泛素接合酶與Ikaros轉錄因子之間的特定蛋白質-蛋白質相互作用，塞勒布隆泛素接合酶及Ikaros轉錄因子隨後經靶向而降解(Kronke等人, Science 343, 301-305, 2014；Lu等人, Science 343, 305-309, 2014)。藉由類比，DNMDP可直接穩定PDE3A-SLFN12相互作用，或DNMDP可異位穩定結合SLFN12之PDE3構形。此等機制中之任一者可產生新生形或超生形表型。DNMDP誘導之新生形表型之進一步表徵可有助於合成不抑制藉由PDE3A進行之環核苷酸水解的小分子。此類小分子之毒性概況應不同於心血管適應症指定之PDE3抑制劑。 此研究揭示了PDE3A在癌症維持中的先前未知作用，其中其功能可藉由PDE3抑制劑之子集改變，從而對癌細胞株之子集產生毒性。此等資料指示DNMDP及其類似物對PDE3A具有超生形或新生形作用，從而引起細胞毒性，此藉由以下證實：隨著細胞PDE3A之含量降低，細胞對DNMDP之敏感性變小。此等觀察結果與磷酸二酯酶之異位調節的其他報導相當(Burgin等人, Nat Biotechnol 28, 63-70, 2010)，指示DNMDP及類似物可對PDE3A具有類似作用。迄今，細胞選擇性細胞毒性之精確機制仍未知；然而，關於與SLFN12及可能SIRT7之新穎相互作用的進一步研究可能提供資訊。 概言之，本文之研究使用差示細胞毒性篩選發現癌細胞細胞毒性小分子DNMDP。766個經基因組表徵癌細胞株中之DNMDP分析揭示在約3%測試細胞株中具有立體特異性奈莫耳功效。預計敏感性之基因組特徵之搜尋揭示高PDE3A表現與DNMDP反應強烈相關。DNMDP抑制PDE3A及PDE3B，而對其他PDE幾乎無活性。然而，意外地，測試之大多數其他PDE3A抑制劑不能擬表型DNMDP，包括有效及選擇性PDE3A抑制劑曲喹辛。用曲喹辛共處理DNMDP敏感性細胞使DNMDP之癌細胞細胞毒性活性因競爭而消耗掉，且剔除PDE3A拯救了來自DNMDP誘導之細胞毒性的其他敏感細胞，致使吾人假設PDE3A為DNMDP殺滅癌細胞所必需，從而誘導PDE3A之新生形改變。對單獨或在DNMDP或曲喹辛存在下的PDE3A免疫沈澱物之質譜分析揭示僅在DNMDP存在下差別地結合SLFN12及SIRT7。類似於PDE3A，SLFN12表現量在DNMDP敏感性細胞株中提高，且用shRNA阻斷SLFN12表現降低細胞對DNMDP之敏感性，指示DNMDP誘導之PDE3A與SLFN12之複合物形成對於癌細胞細胞毒性表型很關鍵。因此，本文之結果暗示PDE3A調節劑為候選癌症治療劑且展示預測化學基因組在小分子發現中之能力。 以上實驗用以下方法及材料執行： 在NCI-H1734及A549細胞株中進行之化合物庫篩選 將1500個NCI-H1734或1000個A549細胞塗佈在384孔盤中之40 μl補充有10%胎牛血清及1% Pen/Strep之RPMI中。塗佈後24小時，以10 μM之濃度添加1924個小分子之化合物庫。使用濃度為10 μM之星形孢菌素作為細胞毒性之陽性對照，且使用濃度為1%之DMSO作為陰性對照。將所有化合物與指示小分子一起培育48小時。48小時後，自培育箱移出384孔盤且使其冷卻至室溫後維持20分鐘。藉由用THERMO COMBI
TM
或多通道吸液管添加40 μl 25% CELLTITERGLO
®
(Promega)於PBS中之溶液且培育10分鐘來評定細胞活力。使用Perkin-Elmer EnVision讀取發光信號。藉由標準化至DMSO對照計算活力百分比。 在細胞株中進行之化合物敏感性測試 將1000個HeLa (DMEM)、1000個A549 (RPMI)、500個MCF-7 (DMEM)、4000個PC3 (F12-K)、1000個NCI-H2122 (RPMI)或1500個NCI-H1563 (RPMI)細胞塗佈於384孔盤中之40 μl補充有10%胎牛血清的相應生長培養基中。塗佈後24小時，添加指示濃度之指示化合物且培育48小時。如
在 NCI - H1734 及 A549 細胞株中進行 之化合物庫篩選
中所述評定細胞活力。在HeLa細胞活力分析中測試化合物6且其EC50經測定為1.1 nM。 HeLa細胞中之卡斯蛋白酶活性 將1000個HeLa細胞塗佈於384孔盤中之40 μl補充有10%胎牛血清之相應生長培養基中。塗佈後24小時，添加指示濃度之指示化合物且培育48小時。根據製造商建議添加來自Promega之卡斯蛋白酶-Glo且如
在 NCI - H1734 及 A549 細胞株中進行之化合物庫篩選
中所述測定發光。 大規模細胞株活力量測 量測獲自23個不同譜系之777個癌細胞株(CCL)對DNMDP之敏感性。癌細胞株為Cancer Cell Line Encyclopedia之一部分且經由SNP陣列及體細胞DNA變化證實其身分。將各細胞株以500個細胞/孔之密度塗佈於白色不透明1536盤中之其較佳培養基中。培育隔夜後，藉由聲傳遞兩次重複添加16個在66.4 μM-2 nM範圍內之濃度下2倍梯度的DNMDP (Labcyte Echo 555, Labcyte Inc., Sunnyvale, CA)。72小時處理後，根據製造商之方案使用ViewLux微量盤成像儀(PerkinElmer, Waltham, MA)量測細胞ATP含量作為活力之替代物(CELLTITERGLO
®
，Promega Corporation, Madison, WI)且根據背景(僅培養基)及媒劑(DMSO)處理之對照孔標準化。 使用非線性擬合根據2或3參數S型函數經由所有16個濃度擬合濃度反應曲線，其中低濃度漸近線設定為DMSO標準化值，且鑑別出跨越該化合物敏感性範圍之最佳8點劑量曲線。藉由數值積分計算8點劑量曲線下面積(AUC)作為敏感性之量度以進行進一步分析。已針對一批480種其他化合物獲得類似敏感性量測，從而使得可進行鑑別細胞株對DNMDP之獨特反應的分析(參見Broad Institute Cancer Therapeutics Response Portal，一種資料集，其全面針對化合物之完整清單鑑別人類癌細胞株之遺傳及譜系特徵與小分子敏感性之間的關係)。 敏感性量測與基本基因表現之相關性 自Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE，大量人類癌細胞株之詳細遺傳表徵；Barretina等人, Nature 483, 603-607, 2012)。下載對Affymetrix基因晶片人類基因組U133 Plus 2.0陣列量測之基因中心穩健多晶片平均值(RMA)標準化的基本mRNA基因表現資料。計算760個重疊CCL的基因表現(18,988種轉錄物)與曲線下面積(AUC)之間的皮爾森相關性係數。為在暴露於不同數目之CCL的小分子中進行比較，使用費歇爾氏轉化(Fisher's transformation)來轉化相關性係數。 PDE3A酶抑制之方法 使用市售
3
H-cAMP閃爍近接分析(SPA，Perkin Elmer)系統進行酶抑制研究。為測定測試物質對PDE3A反應之活體外作用，將2 μl各別測試化合物於DMSO中之溶液(連續稀釋液)置於微量滴定盤(Isoplate-96/200W；Perkin Elmer)之孔中。添加50 μl來自過度表現人類全長PDE3A之Sf9細胞(SB Drug Discovery, UK)的PDE3A細胞提取物於緩衝液A (50 mM Tris/HCl pH 7.5、8.3 mM MgCl
2
、1.7 mM EDTA、0.2% BSA)中的稀釋液。選擇PDE3A細胞提取物之稀釋液以使得反應動力學為線性且少於70%之受質耗盡(典型稀釋度1:5000)。藉由添加50 μl (0.025 μCi)用無BSA之緩衝液A 1:2000稀釋之受質[8-
3
H]腺苷3',5'-環磷酸(1 μCi/μl；Perkin Elmer)起始反應。在室溫下培育60分鐘後，藉由添加25 μl含有18 mg/ml釔閃爍近接珠粒(Perkin Elmer)於水中之懸浮液終止反應。密封微量滴定盤且於Microbeta閃爍計數器(PerkinElmer Wallac)中量測。藉由繪製PDE3A活性百分比相對於對數化合物濃度之曲線自S形曲線測定IC
50
值。對於化合物6，IC50值分別為2.4 nM (PDE3A IC50)及3.4 nM (PDE3B IC50)。 人類低溫肝細胞之方法： 低溫保藏之人類肝細胞的活體外代謝穩定性的研究(包括計算肝臟活體內血液清除率(CL)及最大經口生物可用性(Fmax)) 將低溫保藏之肝細胞(例如購自Celsis InVitroTechnologies)簡單融化，用45 mL預溫熱之活體外GRO HT培養基洗滌且在50 ×g下離心5分鐘。將細胞集結粒再懸浮於5 mL克雷布斯-亨斯雷特黃油(Krebs-Henseleit Butter，KHB)中。藉由錐蟲藍排除法測定細胞活力。 對於代謝穩定性分析，將肝細胞以1.0 × 10
6
個活細胞/毫升之密度分佈在玻璃小瓶中含有5% FCS之WME中。添加測試化合物至1 μM之最終濃度。在培育期間，在580 rpm下連續震盪肝細胞懸浮液且在2、8、16、30、45及90分鐘時獲得等分試樣，立即向該等等分試樣中添加等體積冷甲醇。隨後在3000 rpm下離心15分鐘用具有LCMS/MS偵測之Agilent 1290 HPLC系統分析上清液之後，將樣品在-20℃下冷凍隔夜。 根據濃度-時間曲線確定測試化合物之半衰期。自半衰期計算內源性清除率。亦計算其他參數——肝臟血流量、活體內及活體外肝細胞數量。計算肝活體內血液清除率(CL)及最大經口生物可用性(Fmax)。使用下式計算肝臟活體內血液清除率(CL血液)及最大經口生物可用性(Fmax)：CL'固有[ml/(min*kg)] = kel [1/min]/((cellno/培育體積[ml])×fu,inc)×(cellno/肝臟重量[g])×(比肝臟重量[肝臟之公克數/體重之公斤數])；CL充分攪拌之血液[L/(h*kg)] = (QH [L/(h*kg)]×fu,血液×CL'固有 [L/(h*kg)] )/(QH [L/(h*kg)] + fu,血液×CL'固有 [L/(h*kg)])；Fmax = 1-CL血液/QH，且使用以下參數值：肝臟血流量-每公斤人類1.32 L/h；比肝臟重量-每公斤體重21 g；活體內肝臟細胞-每公克肝臟1.1×10
8
個細胞，活體外肝臟細胞-1.0×10
6
/ml；fu,inc及fu,血液視為1。 相較於(5R)-6-[3-氟-4-(嗎啉-4-基)苯基]-5-甲基-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮(WO 2014/164704之化合物3)(平均代謝穩定性(Fmax)=49%)，(5R)-6-[3-氯-5-氟-4-(嗎啉-4-基)苯基]-5-甲基-4,5-二氫噠嗪-3(2H)-酮(化合物6)呈現在人類肝細胞中之穩定性增加(平均代謝穩定性(Fmax)=93%)。 化學實驗方法 一般細節 所有反應均在氮氣(N2)氛圍下進行。所有試劑及溶劑均購自商業供應商且按原樣使用。核磁共振(NMR)譜在Bruker (300或400 MHz
1
H、75或101 MHz
13
C)光譜儀上記錄。參考NMR溶劑，以ppm (δ)報導質子及碳化學位移。資料報導如下：化學位移，多重性(br=寬峰，s=單峰，d=二重峰，t=三重峰，q=四重峰，m=多重峰；耦合常數(Hz))。使用40-60 μm矽膠(60Å網目)在Teledyne Isco Combiflash Rf上執行急驟層析。在具有Waters Symmetry C18管柱(3.5 μm，4.6×100 mm)之Waters 2795分離模組及3100 質量偵測器上執行串聯液相層析/質譜(LC/MS)，其中梯度為經2.5分鐘0-100% CH
3
CN於水中溶液，其含有恆定0.1%甲酸。在EM Reagent 0.25 mm矽膠60-F板上執行分析型薄層層析(TLC)。由Robertson Microlit Laboratories, Ledgewood NJ執行元素分析。 合成(R)-DNMDP
於5 mL乙酸酐中，攪拌2.00 g (9.84 mmol)(R)-6-(4-胺基苯基)-5-甲基-4,5-二氫噠嗪-3(2
H
)-酮(
A
，Toronto Research Chemicals) 1小時，隨後添加30 mL水，過濾，用水沖洗固體且乾燥，得到2.20 g產物
B
(91%)。
1
H NMR (300 MHz, DMSO-d
6
) δ 10.92 (s, 1H), 10.13 (s, 1H), 7.74 (d, J = 8.9, 2H), 7.65 (d, J = 8.8, 2H), 3.41-3.33 (m, 1H), 2.68 (dd, J = 6.8, 16.8, 1H), 2.23 (d, J = 16.7, 1H), 2.08 (s, 3H), 1.07 (d, J= 7.3, 3H)。
13
C NMR (75 MHz, DMSO-d
6
) δ 168.50, 166.27, 152.25, 140.27, 129.24, 126.24, 118.70, 33.47, 26.91, 24.02, 15.87。HPLC: R
t
0.72 min, 純度＞ 95%。MS: 246 (M + 1)。 經由加料漏斗經10分鐘向溶解於30 mL硫酸中且於冰浴中冷卻之3.09 g
B
(15.3 mmol)中添加0.72 mL 90%硝酸(15 mmol)於8 mL硫酸中之溶液。攪拌1小時後，將混合物傾倒於冰上。濾出黃色固體且用EtOAc沖洗水數次，隨後乾燥且與黃色固體組合。用40-60% EtOAc之己烷溶液層析，得到1.12 g (25%)呈黃色固體狀之產物，將其自EtOAc再結晶。
1
H NMR (300 MHz, DMSO-d
6
) δ 11.13 (s, 1H), 10.41 (s, 1H), 8.25 (d, J = 1.8, 1H), 8.07 (dd, J = 1.8, 8.6, 1H), 7.71 (d, J = 8.6, 1H), 3.55-3.40 (m, 1H), 2.74 (dd, J = 6.9, 16.8, 1H), 2.27 (d, J= 16.8, 1H), 2.09 (s, 3H), 1.08 (d,
J
= 7.2, 3H)。
13
C NMR (75 MHz, DMSO-d6) δ 168.57, 166.31, 150.37, 142.19, 131.69, 131.32, 130.60, 125.07, 121.70, 33.30, 26.81, 23.44, 15.64。TLC: Rf 0.25 (1:1 EtOAc:己烷)。HPLC: R
t
0.87 min, 純度＞ 95%。MS: 291 (M + 1)。HRMS精確質量(M + 1): 291.1088。實驗值: 291.1091 向溶解於10 mL MeOH中之58 mg C (0.20 mmol)中添加48 mg NaOH (1.2 mmol)於0.5 mL水中之溶液。1小時後，濃縮反應物，添加水且用EtOAc沖洗，乾燥EtOAc且濃縮，得到48 mg (93%)產物
D
。
1
H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 10.92 (s, 1H), 8.28 (d, J = 2.0, 1H), 7.87 (dd, J = 2.1, 9.0, 1H), 7.76 (s, 2H), 7.06 (d, J = 9.0, 1H), 3.33 (s, 1H), 2.67 (dd, J = 6.8, 16.8, 1H), 2.22 (d, J = 16.6, 1H), 1.06 (d, J = 7.3, 3H)。
13
C NMR (75 MHz, DMSO-d
6
) δ 166.25, 151.12, 146.69, 132.72, 129.80, 122.57, 122.19, 119.80, 33.43, 26.70, 15.77。MS: 249 (M + 1)。 向溶解於0.5 mL二甲基甲醯胺(DMF)中之35 mg胺
D
(0.14 mmol)中添加70 mg乙醛(1.6 mmol)及170 mg NaBH(OAc)
3
(0.80 mmol)及10 μL (0.2 mmol) HOAc。攪拌3小時後，添加水及EtOAc，分離EtOAc，乾燥，濃縮且用30-50% EtOAc之己烷溶液層析，分離到3 mg (R)-DNMDP (7%)。藉由TLC、HPLC及
1
H NMR證實合成之物質與所購買之外消旋物質一致。
1
H NMR (300 MHz, CDCl
3
) δ 8.58 (s, 1H), 8.04 (d, J = 2.3, 1H), 7.84 (dd, J = 2.3, 9.0, 1H), 7.11 (d, J = 9.0, 1H), 3.30-3.36 (m, 1H), 3.26 (q, J = 7.1, 4H), 2.71 (dd, J = 6.8, 16.9, 1H), 2.48 (d, J = 17.0, 1H), 1.25 (d, J = 7.4, 3H), 1.16 (t, J = 7.1, 6H)。TLC: Rf 0.25 (1:1 EtOAc:己烷)。HPLC: R
t
1.27 min, 純度＞ 95%。MS: 305 (M + 1)。精確質量(M + 1): 305.1608 實驗值: 305.1616。
13
C NMR (75 MHz, CDCl
3
, 所購買之物質) δ 166.28, 152.02, 145.24, 141.21, 129.77, 124.94, 123.94, 121.00, 46.10, 33.80, 27.81, 16.24, 12.56。 (R)-DNMDP之光學純度使用對掌性SCF層析測定且與市售外消旋物質比較：管柱：ChiralPak AS-H，250 × 4.6 mm，5 μm，移動相改質劑： 100%甲醇，梯度：5至50%甲醇，經10分鐘，流速： 4 mL/min，背壓： 100巴，管柱溫度：40℃，UV偵測在200-400 nm下進行。所分離異構體之滯留時間：5.36、6.64分鐘；(R)-DNMDP之滯留時間，6.60分鐘，所偵測對映異構體之比率為1:19。
2.
向溶解於5 mL MeOH中之200 mg (0.98 mmol)
A
中添加87 mg乙醛(2.0 mmol)、113 μL HOAc (2.0 mmol )及124 mg (2.0 mmol)NaBH
3
CN且在室溫下攪拌反應物隔夜。次日，添加相同量之試劑且再攪拌反應物24小時。濃縮混合物且分配於CH
2
Cl
2
與水之間，分離CH
2
Cl
2
，乾燥且濃縮，隨後用20-40% EtOAc之己烷溶液層析，分離到210 mg呈白色固體狀之產物(82%)。
1
H NMR (300 MHz, CDCl
3
) δ 8.95 (s, 1H), 7.64 (d, J = 8.7, 2H), 6.66 (d, J = 8.7, 2H), 3.37 (dd, J = 9.6, 16.4, 5H), 2.67 (dd, J = 6.5, 16.8, 1H), 2.43 (d, J = 16.8, 1H), 1.41-1.02 (m, 10H)。
13
C NMR (75 MHz, CDCl
3
) δ166.82, 154.55, 148.79, 127.32, 120.81, 111.08, 44.32, 33.92, 27.74, 16.37, 12.50。TLC: Rf 0.25 (1:1 EtOAc:己烷)。HPLC: R
t
1.05 min, 純度＞ 95%。MS: 260 (M + 1)。HRMS精確質量(M + 1): 260.1757。實驗值: 260.1764
3.
向溶解於1 mL二甲基甲醯胺(DMF)中之200 mg (0.984 mmol)
A
中添加250 μL (2.00 mmol)雙(2-溴乙基)醚及400 mg K2CO3且在60℃下攪拌混合物隔夜。次日，再添加250 μL雙(2-溴乙基)醚且添加170 mg K2CO3。3小時後，添加EtOAc及水，用EtOAc沖洗水，乾燥經合併之EtOAc洗滌液且濃縮。用0-4% MeOH之CH2Cl2溶液層析，得到125 mg產物(46%)。
1
H NMR (300 MHz, CDCl
3
) δ 8.61 (s, 1H), 7.68 (d, J= 8.8, 2H), 6.92 (d, J= 8.8, 2H), 3.99-3.76 (m, 4H), 3.44-3.31 (m, 1H), 3.29-3.22 (m, 4H), 2.70 (dd, J = 6.7, 16.8, 1H), 2.46 (d, J = 16.7, 1H), 1.24 (d, J = 7.3, 3H)。
13
C NMR (75 MHz, CDCl
3
) δ166.64, 154.05, 152.18, 127.10, 125.33, 114.73, 66.69, 48.33, 33.93, 27.94, 16.36。TLC: Rf 0.1 (1:50 MeOH:CH
2
Cl
2
)。HPLC: R
t
1.05 min, 純度＞ 95%。MS: 274 (M + 1)。HRMS: 計算值274.1556 (M + 1)；實驗值274.1552。C
15
H
19
N
3
O
2
之分析計算值: C, 65.91; H, 7.01; N, 15.37；實驗值 65.81, H, 6.66, N, 15.26。
DNMDP-2L. 向溶解於0.4 mL二甲基甲醯胺(DMF)中之130 mg
A
(0.64 mmol)中添加100 mg 2-(2-(2-溴乙氧基)乙氧基)-乙基胺基甲酸第三丁酯(Toronto Research Chemical，0.32 mmol)及90 mg K
2
CO
3
(64 mmol)且在60℃下攪拌混合物隔夜。冷卻後，添加水且用EtOAc沖洗數次。乾燥經合併之EtOAc層，濃縮且用50-70% EtOAc層析，得到81 mg產物(58%)。
1
H NMR (300 MHz, CDCl
3
) δ 9.06 (s, 1H), 7.59 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.62 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 5.15 (s, 1H), 4.53 (s, 1H), 3.72 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.65 (s, 4H), 3.55 (t, J = 5.2 Hz, 2H), 3.32 (m, 5H), 2.67 (dd, J = 16.8, 6.7 Hz, 1H), 2.42 (d, J = 16.4 Hz, 1H), 1.44 (s, 9H), 1.22 (d, J = 7.4 Hz, 3H)。
13
C NMR (75 MHz, CDCl
3
) δ 166.83, 155.99, 154.45, 149.64, 127.33, 123.24, 112.58, 79.28, 70.30, 70.26, 70.22, 69.45, 43.14, 40.39, 33.96, 28.43, 27.89, 16.40；HPLC: R
t
2.50 min (7.5 min操作), 純度＞ 95%。MS: 435 (M + 1)。將此產物(0.19 mmol)溶解於1 mL MeOH中且向溶液中添加乙醛(50 μL，0.89 mmol )、10 μL HOAc (0.2 mmol)及12 mg NaBH
3
CN (0.19 mmol)。1小時後，添加NaHCO
3
(水溶液)及CH
2
Cl
2
，分離CH
2
Cl
2
且用CH
2
Cl
2
洗滌水兩次。乾燥經合併之CH
2
Cl
2
，濃縮且用60-70% EtOAc之己烷溶液層析，得到71 mg呈透明油狀之產物(82%)。
1
H NMR (400 MHz, CDCl
3
) δ 8.91 (s, 1H), 7.63 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 6.69 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 5.07 (s, 1H), 3.65 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.61 (s, 4H), 3.55 (dt, J = 9.9, 5.5 Hz, 4H), 3.46 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.38-3.22 (m, 3H), 2.67 (dd, J = 16.8, 6.7 Hz, 1H), 2.43 (d, J = 16.7 Hz, 1H), 1.45 (s, 10H), 1.23 (d, J = 7.3 Hz, 3H), 1.18 (t, J = 7.0 Hz, 3H)。
13
C NMR (101 MHz, CDCl
3
) δ 166.84, 155.96, 154.46, 148.89, 127.35, 121.38, 111.28, 79.22, 70.68, 70.27, 70.24, 68.74, 49.95, 45.49, 40.32, 33.97, 28.43, 27.80, 16.43, 12.14。R
t
2.99 min (7.5 min操作), 純度＞ 95%。MS: 463 (M + 1)。 合成化合物6 A.化合物3 化合物3可經由兩種不同途徑獲得： 途徑1
或 途徑2
1 -( 3 - 氟 - 4 - 嗎啉基苯基 ) 丙 - 1 - 酮 .
向1 L一頸燒瓶中添加40 g 3,4-二氟苯丙酮(235 mmol)、400 mL CH
3
CN、250 mL嗎啉(2.86 mol)及50 mL DIPEA (360 mmol)且在100℃下加熱溶液隔夜。次日，冷卻反應物且濃縮。將混合物溶解於CH
2
Cl
2
中且依序用水及鹽水沖洗數次，且乾燥(MgSO
4
)，過濾且濃縮。將大多數粗產物溶解於約1 L熱己烷中且冷卻隔夜。過濾後，母液中出現更多晶體。濃縮母液且自己烷再結晶。獲得總共52.5 g乾燥白色固體(94%)。
1
H NMR (400 MHz, CDCl
3
) δ 7.72 (dd, J = 8.4, 1.9 Hz, 1H), 7.66 (dd, J = 14.0, 2.0 Hz, 1H), 6.93 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 3.94-3.85 (m, 4H), 3.26-3.17 (m, 4H), 2.94 (q, J = 7.3 Hz, 2H), 1.23 (t, J = 7.3 Hz, 3H)。
19
F NMR (376 MHz, CDCl
3
) δ-121.48。MS: 238 (M + 1)。
4 -( 3 - 氟 - 4 - 嗎啉基苯基 )- 3 - 甲基 - 4 - 側氧基丁酸乙酯 .
向2 L三頸燒瓶中添加200 mL無水THF及200 mL LiHMDS溶液(1 M THF溶液)，且在乾冰/異丙醇浴上冷卻燒瓶。冷卻後，經由導管添加溶解於300 mL THF中之46.5 g (3-氟-4-嗎啉基)苯丙酮(196 mmol)。攪拌1小時後，添加溶解於44 mL THF中之44 mL溴乙酸乙酯(202 mmol)，且攪拌反應混合物隔夜，升溫至室溫。次日早晨，反應物仍有點冷。向其中依序添加NH
4
Cl溶液、EtOAc及己烷。分離各層，用EtOAc沖洗水層兩次，用鹽水沖洗經合併之有機層，乾燥(MgSO
4
)且濃縮，得到65.6 g淺黃色油狀物(100%)，其以粗物質之形式繼續使用。
1
H NMR (400 MHz, CDCl
3
) δ 7.74 (dd, J = 8.4, 1.8 Hz, 1H), 7.67 (dd, J = 14.1, 1.9 Hz, 1H), 6.93 (t, J = 8.5 Hz, 1H), 4.09 (q, J = 6.9 Hz, 2H), 3.93-3.78 (m, 5H), 3.28-3.14 (m, 4H), 2.93 (dd, J = 16.8, 8.5 Hz, 1H), 2.43 (dd, J = 16.8, 5.6 Hz, 1H), 1.21 (dt, J = 7.1, 3.6 Hz, 6H)。
19
F NMR (376 MHz, CDCl
3
) δ-121.33。
1
H NMR、
19
F NMR及LC指示雜質為5-10%。
5R )- 6 -[ 3 - 氟 - 4 -( 嗎啉 - 4 - 基 ) 苯基 ]- 5 - 甲基 - 4 , 5 - 二氫噠嗪 - 3 ( 2H )- 酮化合物 3a ( 化合物 3 - 外消旋體 )
將粗4-(3-氟-4-嗎啉基苯基)-3-甲基-4-側氧基丁酸乙酯(65.6 g，202 mmol)溶解於400 mL EtOH中，向其中添加31.6 mL肼(1.01 mol)且在回流溫度下加熱反應物隔夜。次日早晨，大量白色沈澱物存在於燒瓶中，冷卻至室溫，過濾固體且用冷EtOH沖洗。將固體置於1 L一頸燒瓶中且置放在旋轉蒸發器上以移除殘餘EtOH，獲得42 g潔淨固體(71%)。
1
H NMR (300 MHz, CDCl
3
) δ 8.46 (s, 1H), 7.50 (dd, J = 2.1, 14.4, 1H), 7.43 (dd, J = 1.8, 8.4, 1H), 6.93 (t, J = 8.7, 1H), 3.95-3.83 (m, 4H), 3.37-3.23 (m, 1H), 3.21-3.11 (m, 4H), 2.70 (dd, J = 6.8, 16.9, 1H), 2.47 (d, J = 17.1, 1H), 1.24 (d, J = 7.4, 3H)。
13
C NMR (75 MHz, CDCl
3
) δ 166.45, 155.33 (d, J
C -F
= 246.3), 152.71, 141.1 (d, J
C -F
=8.6), 128.75 (d, J
C -F
= 7.6), 122.20 (d, J
C -F
= 3.0), 118.09 (d, J
C -F
= 3.6), 113.80 (d, J
C -F
= 23.0), 66.83, 50.50 (d, J
C -F
= 3.9), 33.84, 27.96, 16.29。
19
F NMR (282 MHz, CDCl
3
) δ-121.51。質量: 292 (M + 1)。 分析型分離方法 儀器： Thar分析型SFC 管柱：ChiralPak AS-H，250×4.6 mm 移動相：A為CO2，且B為MeOH (0.05% DEA) 梯度：B 40% 流速： 2.4 mL/min 背壓：100巴 管柱溫度：35℃ 波長： 220 nm 製備型分離方法 儀器： Thar製備型SFC 管柱：ChiralPak AS-10 μm，300×50 mm I.D. 移動相：A為CO2，且B為EtOH (0.1% NH3·H2O) 梯度：B 45% 流速： 200 mL/min 背壓：100巴 管柱溫度：38℃ 波長： 220 nm 樣品製備： 將化合物3a溶解於乙醇中至100 mg/ml。注射：每次注射5 ml。 處理： 分離後，經由旋轉蒸發器在浴溫40℃下乾燥溶離份，得到所要異構體化合物3
，其為較慢溶離之對映異構體，滯留時間3.76分鐘(另一對映異構體-化合物3b
滯留時間2.76分鐘)。
將95 mg對映異構純化合物3 (330 mmol)之溶液溶解於2 mL HOAc中。向其中經由注射器添加0.13 mL 10-15% NaOCl
( 水 )
溶液。約30分鐘後，再將0.25 mL 10-15% NaOCl
( 水 )
溶液添加至反應混合物中，攪拌約30分鐘，隨後添加水及CH
2
Cl
2
。分離各層，用NaHSO
3 ( 水溶液 )
及NaHCO
3 ( 水溶液 )
沖洗CH
2
Cl
2
層。乾燥(MgSO
4
)溶液，濃縮且用0-50% EtOAc之己烷溶液層析，得到52 mg呈白色固體狀之化合物6 (49%)。
1
H NMR (400 MHz, CDCl
3
) δ 9.08 (s, 1H), 7.62-7.55 (m, 1H), 7.40 (dd, J = 13.3, 2.1 Hz, 1H), 3.92-3.77 (m, 4H), 3.32-3.18 (m, 5H), 2.72 (dd, J = 17.0, 6.9 Hz, 1H), 2.50 (d, J = 17.0 Hz, 1H), 1.25 (d, J = 7.4 Hz, 3H)。
19
F NMR (376 MHz, CDCl
3
) δ-118.69。
13
C NMR (101 MHz, CDCl
3
) δ 166.50 , 159.68 (d, J = 249.9 Hz), 151.35 (d, J = 2.9 Hz), 137.26 (d, J = 13.4 Hz), 133.00 (d, J = 7.3 Hz), 131.36 (d, J = 8.9 Hz), 123.41 (d, J = 2.6 Hz), 112.97 (d, J = 24.0 Hz), 67.57, 51.08 (d, J = 4.7 Hz), 33.72, 27.84, 16.23。質量326 (M + 1)。 產物之對掌性SCF層析展示對映異構純度物損失： 管柱：ChiralPak AS-H，250×4.6 mm，5 μm 移動相改質劑：100%甲醇， 梯度：5至50%甲醇，經10分鐘 流速： 4 mL/min 背壓：100巴， 管柱溫度：40℃。 UV偵測在200-400 nm下進行。 所分離對映異構體之滯留時間：6.11 ((R))及8.82 ((S)) min。 對映異構體-化合物6a之分析型分離. 儀器： Waters Acquity UPC2 管柱：ChiralPak AS-H，250×4.6 mm I.D. 移動相：A為CO2，且B為MeOH 梯度：3至50B 5分鐘，操作10分鐘 流速： 1.5 mL/min 背壓：100巴 管柱溫度：45℃ 波長： 210 nm 化合物6
之滯留時間-7.23分鐘；無活性對映異構化合物6b
之滯留時間-6.28分鐘。 在HeLa細胞活力分析中測試化合物6且其EC50經測定為1.1 nM。 與樹脂之連接 向18 mg DNMDP-2L (0.04 mmol)於0.8 mL CH
2
Cl
2
中之溶液中添加0.2 mL三氟乙酸(TFA)且攪拌溶液2小時，隨後濃縮且溶解於0.5 mL DMSO中。向其中添加10 μL Et
3
N (0.07 mmol)及12 mg N,N'-二丁二醯亞胺基碳酸酯(DSC) (0.05 mmol)且攪拌溶液隔夜。LC分析指示反應不完全，再添加25 mg N,N'-二丁二醯亞胺基碳酸酯(0.1 mmol)。2小時後之LC分析展示DSC產物:胺之比率為約5:1。藉由離心機用DMSO沖洗1 mL Affi-Gel 102樹脂之樣品五次，隨後懸浮於0.5 mL DMSO中。向樹脂中添加30 μL DSC產物溶液及25 μL Et
3
N且使混合物渦旋。2天後，DMSO溶液之LC分析展示DCS加合物完全消失；未衍生化之胺仍存在。藉由離心機移除DMSO且傾析，且用DMSO沖洗樹脂數次且儲存於PBS緩衝液中。 拯救DNMDP誘導之細胞毒性的生物活性劑篩選 將1000個HeLa細胞塗佈於384孔盤中之40 μl補充有10%胎牛血清及1% 青黴素/鏈黴素的DMEM中。塗佈後24小時，添加濃度為20 μM之1600個生物活性分子(Pharmacon)之化合物庫。在培育生物活性化合物之同時，添加DNMDP以使最終濃度為30 nM且培育48小時。如在NCI-H1734及A549細胞株中進行之化合物庫篩選中所述評定細胞活力。 DNMDP之分子標靶的連接子-親和力純化及免疫墨點 用冰冷PBS洗滌HeLa細胞，隨後用補充有不含EDTA之蛋白酶抑制劑(Roche)及磷酸酶抑制劑混合物I及II (Calbiochem)的NP-40溶解緩衝液(150 mM NaCl、10%甘油、50 mM Tris-Cl pH 8.0、50 mM MgCl
2
、1% NP-40)溶解。在冰上培育細胞溶解物至少2分鐘，隨後在4℃下以15,700×g離心10分鐘，之後使用BCA蛋白質分析套組(Pierce)定量上清液。將200 μg總HeLa細胞溶解物與3 μl與親和力連接子DNMDP-2L偶合之Affi-Gel 102樹脂(BioRad)一起培育四小時，其中總體積為400 μl。培育前，添加最終濃度為10 μM之指示化合物以進行親和力純化。用含有濃度為10 μM之相應化合物的溶解緩衝液洗滌樣品三次。將結合於Affi-Gel 102樹脂之蛋白質還原，變性且使用Tris-甘胺酸凝膠(Novex)分離且使用iBlot轉移系統(Novex)轉移至硝化纖維素膜。在4℃下，將膜與針對PDE3A之初級抗體一起培育隔夜(1:1000，Bethyl)。根據製造商之建議，在室溫下與二次抗體(1:20,000，LI-COR Biosciences)一起培育兩小時，隨後進行偵測(Odyssey Imaging System，LI-COR Biosciences)。 PARP-裂解免疫墨點 用指示濃度之DNMDP及星形孢菌素處理HeLa細胞36小時。溶解HeLa細胞且如
DNMDP 之分子標靶的連接子 - 親和力純化及免疫墨點
中所述處理。將膜與針對PARP之抗體(1:1000，Cell Signaling #9532)及肌動蛋白一起培育，隨後如
DNMDP 之分子標靶的連接子 - 親和力純化及免疫墨點
中所述成像。 使用CRISPR靶向PDE3A基因座 使用MIT CRISPR設計工具(在線MIT CRISPR設計入口)鑑別CRISPR標靶位點。為選殖sgRNA，將正向及反向寡核苷酸(oligonucleotide/oligo)退火，磷酸化且接合至BsmBI消化之pXPR_BRD001。寡核苷酸序列如下：
為製備慢病毒，使用磷酸鈣用pXPR_BRD001、psPAX2及pMD2.G共轉染293T細胞。用2 μg/ml嘌呤黴素選擇經感染之HeLa細胞。 使用siRNA降低PDE3A表現 將HeLa細胞塗佈於96孔盤中且在24小時後根據製造商之建議用PDE3A及非靶向siRNA smartpool (On Target Plus, Thermo Scientific)轉染。轉染後24小時及72小時獲得HeLa細胞溶解物且如
DNMDP 之分子標靶的連接子 - 親和力純化及免疫墨點
中所述對PDE3A及肌動蛋白進行免疫墨點法(1:20,000, Cell Signaling)。用指示濃度之化合物3處理HeLa細胞48小時。如在NCI-H1734及A549細胞株中進行之化合物庫篩選中所述評定細胞活力。 量測HeLa細胞中之細胞cAMP濃度 將5000個HeLa細胞塗佈於96孔盤中。塗佈後24小時，將HeLa細胞與指示濃度之指示化合物一起培育一小時。用CAMP-GLO
TM
分析(Promega)根據製造商之建議測定cAMP含量。藉由標準化至根據製造商之建議產生之標準曲線測定cAMP之細胞濃度。 用於PDE3A-蛋白質相互作用研究的延伸蛋白質組研究方法 於HeLa細胞中免疫沈澱PDE3A 處理HeLa細胞四小時，最後用10 μM如下指示化合物溶解：DMSO、DNMDP及曲喹辛。如
DNMDP 之分子標靶的連接子 - 親和力純化及免疫墨點
中所述用補充有蛋白酶及磷酸酶抑制劑之ModRipa溶解緩衝液(1% NP-40：50 mM Tris-HCl (pH 7.8)、150 mM NaCl、0.1%去氧膽酸鈉、1 mM EDTA)溶解HeLa細胞，且添加最終濃度為10 μM之上述指示化合物。將13 mg HeLa總細胞溶解物與0.5% PDE3A抗體(Bethyl)一起培育且培育隔夜。在相應條件下，將針對PDE3A抗體之阻斷肽(Bethyl)與PDE3A抗體同時添加。隨後在4℃下將總細胞溶解物及抗體混合物與10 μl 蛋白A加上瓊脂糖(Protein A Plus Agarose)(Fisher Scientific)一起培育30分鐘。隨後用含有濃度為10 μM之指示化合物的溶解緩衝液洗滌蛋白A加上瓊脂糖兩次。最後，用不含NP-40且含有濃度為10 μM之指示化合物的溶解緩衝液洗滌蛋白A加上瓊脂糖一次。 珠粒上消化 用IP溶解緩衝液洗滌來自免疫純化之珠粒一次，隨後用PBS洗滌三次，將各重複實驗之三種不同溶解物再懸浮於90 μL消化緩衝液(2 M尿素、50 mM Tris HCl)中，添加2 μg定序級胰蛋白酶，在700 rpm下震盪1小時。移出上清液且置於新鮮管中。隨後用50 μL消化緩衝液洗滌珠粒兩次且與上清液組合。將經合併之上清液還原(2 μL 500 mM DTT，30分鐘，室溫)，烷基化(4 μL 500 mM IAA，45分鐘，黑暗)且執行較久隔夜消化：2 μg (4 μL)胰蛋白酶，震盪隔夜。隨後用20 μL 10%葉酸(FA)淬滅樣品且在10 mg SEP-PAK
®
管柱上去鹽。 iTRAQ標記肽及強陽離子交換(scx)分級分離 根據製造商之說明(AB Sciex, Foster City, CA)用針對相對及絕對定量(iTRAQ)試劑之同量異位標記物標記經去鹽之肽。將肽溶解於30 μl 0.5 M TEAB (pH 8.5)溶液中且添加標記試劑於70 μl乙醇中之溶液。培育1小時後，用50 mM Tris/HCl (pH 7.5)終止反應。混合區別標記之肽，隨後在10 mg SEP-PAK
®
管柱上去鹽。
如Rappsilber等人(Rappsilber等人, Nat Protoc 2, 1896-1906, 2007)中所述進行經區別標記且經合併之肽的SCX分級分離，其中6個pH步驟(緩衝液-均含有25%乙腈)如下： 1：乙酸銨50 mM pH 4.5， 2：乙酸銨50 mM pH 5.5， 3：乙酸銨50 mM pH 6.5， 4：碳酸氫銨50 mM pH 8， 5：氫氧化銨0.1% pH 9， 6：氫氧化銨0.1% pH 11。 如文件中所述，使用Empore SCX磁碟獲取停止及實行萃取提示(StageTips)。 MS分析 於在線奈米流EASY-NLC™ 1000 UHPLC系統(Thermo Fisher Scientific)上分離經復原之肽且在台式Orbitrap Q EXACTIVE™質譜儀(Thermo Fisher Scientific)上分析。將肽樣品注射於內部裝填有20 cm C18矽膠材料(1.9 μm REPROSIL-PUR
®
C18-AQ介質，Dr. Maisch GmbH，r119.水溶液)之毛細管柱(PICOFRIT
®
，其具有10 μm端部開口/75 μm直徑，New Objective，PF360-75-10-N-5)上。用定製適合之微調適T形件(360 μm，IDEX Health & Science，UH-753)連接UHPLC裝置，且於管柱加熱套管(Phoenix-ST)中加熱毛細管柱至50℃以在UHPLC分離期間降低背壓。以200 nL/min之流速分離所注射之肽，其中具有100%溶劑A (3%乙腈，0.1%甲酸)至30%溶劑B (90%乙腈，0.1%甲酸)之線性80分鐘梯度，繼而30%溶劑B至90%溶劑B之線性6分鐘梯度。操作各樣品120分鐘，包括樣品裝載及管柱平衡時間。以資料依賴性模式操作Q EXACTIVE
TM
器具，在關於12種最多離子使用3×10
6
個離子之MS1離子標靶及5×10
4
個離子之MS2標靶進行之各MS1掃描(R=70,000)後，獲得高能碰撞解離(HCD) MS/MS掃描(R=17,500)。用於MS/MS掃描之最大離子時間為120毫秒；HCD標準化碰撞能量設定為27；動力學排阻時間設定為20秒，且能夠發揮肽匹配及同位素排阻功能。
肽及蛋白質之定量及鑑別
所有質譜均使用Spectrum Mill軟體套件v4.1β (Agilent Technologies)處理，該軟體套件包括藉由申請者開發之用於同量異位標記物之模組以進行基於相對及絕對定量(iTRAQ)的定量。對於各前驅離子使用萃取離子層析(XIC)進行前驅離子定量。在液相層析(LC)-MS/MS操作之介入高解析度MS1掃描中，使用圍繞同位素叢集之各個別成員之窄窗，藉由Spectrum Mill軟體自動計算進行MS/MS之各前驅離子之XIC的峰面積。基於MS掃描解析度、前驅物電荷及m/z動態地測定時間與m/z域中之峰寬度，在同位素叢集中在峰之相對分佈上相對於理論進行品質度量。合併在相同前驅物m/z上以相同解離模式在+/-60秒內採集之類似MS/MS譜。自搜尋排除前驅物電荷＞7之MS/MS譜及不良品質MS/MS譜，其因為序列標記長度不大於1 (亦即最少3個質量藉由胺基酸之鏈內質量分離)而不能進行品質過濾。 為進行肽鑑別，針對常見實驗室污染蛋白質之組所附接之人類通用蛋白質資源(Uniprot)資料庫搜尋MS/MS譜。搜尋參數包括：ESI-Q EXACTIVE
TM
-HCD評分參數、最多具有兩個丟失之裂解的胰蛋白酶特異性、40%最小匹配峰值強度、+/-20 ppm前驅物質量容許度、+/-20 ppm產物質量容許度、半胱胺酸之胺甲醯胺基甲基化及作為固定修飾之離胺酸及肽N端之iTRAQ標記。允許之可變修飾為甲硫胺酸之氧化、N端乙醯化、焦麩胺酸(N端Q)、去醯胺(N)、焦胺甲醯胺基甲基Cys (N端C)，其中前驅物MH+變化範圍為-18至64 Da。藉由分別最佳化各液相層析(LC)-MS/MS中各前驅物電荷態之分值及δ等級1-等級2分值臨限值，同時在光譜層面下使得基於標靶-誘餌之最大錯誤發現率(FDR)為1.0%而將對於個別光譜說明之身分自動指定為有效的。 在於蛋白質層面上計算分值且報導所鑑別之蛋白質時，以如下方式解決冗餘：蛋白質分值為獨特肽之分值的總和。獨特肽為經由MS/MS譜偵測的肽之單個最高評分情況。特定肽之MS/MS譜可記錄多次(亦即作為不同前驅物電荷態，自相鄰SCX溶離份分離，藉由氧化Met修飾)，但仍視為單一獨特肽。當序列資料庫中之多個蛋白質條目中含有大於8個殘基長之肽序列時，將該地蛋白質分組在一起且報導最高評分1及其寄存編號。在一些情況下，當蛋白質序列以此方式分組時，存在獨特的肽，其獨特地代表該組之較低評分成員(同功異型物或家族成員)。此等情況各產生亞組，且報導多個亞組且對蛋白質之總數進行計數。自Spectrum Mill中之蛋白質比較輸出表獲得iTRAQ比率。為獲得iTRAQ蛋白質比率，對歸於各重複實驗之蛋白質亞組的所有獨特肽計算中值。為指定相互作用蛋白質，如先前所描述，使用R環境中之Limma套件計算適度t檢驗p，且增加布蘭登-奧爾特曼檢驗以濾出再現性之CI低於95%之蛋白質(Udeshi等人, Mol Cell Proteomics 11, 148-159, 2012)。 使用免疫沈澱及免疫墨點驗證DNMDP誘導之PDE3A蛋白質相互作用 用表現V5標記之SIRT7、V5標記之SLFN12或V5標記之GFP的ORF過度表現構築體轉染HeLa細胞。ORF表現構築體獲自TRC (純系ID：TRCN0000468231、TRCN0000476272、ccsbBroad304_99997)。在轉染後72小時，用10 μM DNMDP或曲喹辛處理細胞4小時，繼而使用ModRipa溶解緩衝液溶解且將PDE3A免疫沈澱。對於各條件，將2 mg總蛋白質溶解物與1 μg抗PDE3A抗體一起在4℃下培育隔夜，之後添加7.5 μl 蛋白A-及蛋白G-戴諾珠粒(Dynabead)(Life Technologies 10001D及10003D)且再培育1小時。洗滌珠粒且用30 μl LDS PAGE凝膠裝載緩衝液溶離結合之蛋白質。在4-12% Tris甘胺酸PAGE凝膠上解析輸入物(約60 μg總蛋白質溶解物)及IP產物，且用抗V5抗體(Life Technologies R96205，1:5000)、Bethyl抗PDE3A抗體(1:1000)及來自LiCOR Biosciences之二次抗體(目錄號926-32210及926068021，各以1:10,000)進行免疫墨點法。洗滌墨點且使用LiCOR Odyssey紅外線成像儀成像。 使用shRNA阻斷SLFN12表現且測試藥物敏感性 將表現靶向SLFN12之shRNA或對照載體的構築體包裝於慢病毒中且藉由病毒轉導傳遞至HeLa細胞中。使用三種靶向SLFN12之shRNA，其均獲自TRC (純系ID：TRCN0000152141及TRCN0000153520)。使用1 μg/ml嘌呤黴素3天，隨後再於非選擇性培養基中生長3天來選擇經感染細胞。隨後將細胞塗佈於384孔分析盤中且如上所述測試藥物敏感性。藉由qPCR證實SLFN12表現之阻斷。使用套組試劑(RNeasy微型套組(Qiagen #74104)及QIAschredder (Qiagen #79656))提取總RNA。使用套組試劑(SuperScript III第一股合成系統(Life Technologies #18080-051))產生cDNA。根據製造商之建議對
GAPDH
及
SLFN12
執行qPCR (Life Technologies Hs00430118_m1)。將
SLFN12
表現根據相應樣品
GAPDH
ct值標準化。 其他實施例 自前述描述顯而易見，可對本文中所描述之發明作出變化及修飾以根據不同用途及條件對其進行調整。此類實施例亦在以下申請專利範圍之範疇內。 本文中之變數之任何定義中之要素清單之敍述包括該變數作為所列出要素之任何單個要素或組合(或次組合)之定義。敍述本文中之實施例包括將該實施例作為任何單個實施例或與任何其他實施例或其部分組合。 以引用的方式併入 本說明書中所提及之所有專利及公開案均以相同程度以引用的方式併入本文中，其引用的程度如各獨立的專利及公開案經特定且個別指示以引入的方式併入一般。