JP7148403B2 - 癌患者の層別化および癌治療のための化合物、組成物および方法 - Google Patents
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Description
本出願は、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる2015年2月5日に出願された米国仮特許出願第62/291935号の優先権および利益を主張するものである。
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号3U54HG005032の下で、政府支援によってなされた。政府は本発明における一定の権利を有する。
該細胞が、参照と比較してPDE3AまたはSchlafen12(SLFN12)ポリペプチドまたはポリヌクレオチド、またはその組合せのレベルが増加しているとして選択されたものであり、それによって前記癌細胞の生存を減少させる工程を含む、ホスホジエステラーゼ3A(PDE3A)モジュレーターに反応性であるとして選択された癌細胞を死滅させるかまたはその生存を減少させる方法を提供する。
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、当業者に本発明で使用される用語の多くの一般的な定義を提供する:Singletonら, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(第2版1994);The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker編、1988);The Glossary of Genetics、第5版、R. Riegerら(編), Springer Verlag(1991);およびHale&Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。本明細書で使用される場合、以下の用語は、他に特定されない限り、以下のそれらに帰属する意味を有する。
ラセミ化合物3a
を含む。
場合により先行する工程で化合物3a
MAVPGDAARVRDKPVHSGVSQAPTAGRDCHHRADPASPRDSGCRGCWGDLVLQPLRSSRKLSSALCAGSLSFLLALLVRLVRGEVGCDLEQCKEAAAAEEEEAAPGAEGGVFPGPRGGAPGGGARLSPWLQPSALLFSLLCAFFWMGLYLLRAGVRLPLAVALLAACCGGEALVQIGLGVGEDHLLSLPAAGVVLSCLAAATWLVLRLRLGVLMIALTSAVRTVSLISLERFKVAWRPYLAYLAGVLGILLARYVEQILPQSAEAAPREHLGSQLIAGTKEDIPVFKRRRRSSSVVSAEMSGCSSKSHRRTSLPCIPREQLMGHSEWDHKRGPRGSQSSGTSITVDIAVMGEAHGLITDLLADPSLPPNVCTSLRAVSNLLSTQLTFQAIHKPRVNPVTSLSENYTCSDSEESSEKDKLAIPKRLRRSLPPGLLRRVSSTWTTTTSATGLPTLEPAPVRRDRSTSIKLQEAPSSSPDSWNNPVMMTLTKSRSFTSSYAISAANHVKAKKQSRPGALAKISPLSSPCSSPLQGTPASSLVSKISAVQFPESADTTAKQSLGSHRALTYTQSAPDLSPQILTPPVICSSCGRPYSQGNPADEPLERSGVATRTPSRTDDTAQVTSDYETNNNSDSSDIVQNEDETECLREPLRKASACSTYAPETMMFLDKPILAPEPLVMDNLDSIMEQLNTWNFPIFDLVENIGRKCGRILSQVSYRLFEDMGLFEAFKIPIREFMNYFHALEIGYRDIPYHNRIHATDVLHAVWYLTTQPIPGLSTVINDHGSTSDSDSDSGFTHGHMGYVFSKTYNVTDDKYGCLSGNIPALELMALYVAAAMHDYDHPGRTNAFLVATSAPQAVLYNDRSVLENHHAAAAWNLFMSRPEYNFLINLDHVEFKHFRFLVIEAILATDLKKHFDFVAKFNGKVNDDVGIDWTNENDRLLVCQMCIKLADINGPAKCKELHLQWTDGIVNEFYEQGDEEASLGLPISPFMDRSAPQLANLQESFISHIVGPLCNSYDSAGLMPGKWVEDSDESGDTDDPEEEEEEAPAPNEEETCENNESPKKKTFKRRKIYCQITQHLLQNHKMWKKVIEEEQRLAGIENQSLDQTPQSHSSEQIQAIKEEEEEKGKPRGEEIPTQKPDQ(配列番号3)
MNISVDLETNYAELVLDVGRVTLGENSRKKMKDCKLRKKQNESVSRAMCALLNSGGGVIKAEIENEDYSYTKDGIGLDLENSFSNILLFVPEYLDFMQNGNYFLIFVKSWSLNTSGLRITTLSSNLYKRDITSAKVMNATAALEFLKDMKKTRGRLYLRPELLAKRPCVDIQEENNMKALAGVFFDRTELDRKEKLTFTESTHVEIKNFSTEKLLQRIKEILPQYVSAFANTDGGYLFIGLNEDKEIIGFKAEMSDLDDLEREIEKSIRKMPVHHFCMEKKKINYSCKFLGVYDKGSLCGYVCALRVERFCCAVFAKEPDSWHVKDNRVMQLTRKEWIQFMVEAEPKFSSSYEEVISQINTSLPAPHSWPLLEWQRQRHHCPGLSGRITYTPENLCRKLFLQHEGLKQLICEEMDSVRKGSLIFSRSWSVDLGLQENHKVLCDALLISQDSPPVLYTFHMVQDEEFKGYSTQTALTLKQKLAKIGGYTKKVCVMTKIFYLSPEGMTSCQYDLRSQVIYPESYYFTRRKYLLKALFKALKRLKSLRDQFSFAENLYQIIGIDCFQKNDKKMFKSCRRLT(配列番号5)
PDE3Aモジュレーターの同定を、変異型tp53バックグラウンド中の細胞傷害性小分子を同定するよう設計された表現型スクリーニングに関連して行った。予測的ケモゲノミクスアプローチは、広範なインビトロおよびインビボ標的検証からなる標的駆動薬物開発プログラムを補完し、逆ケモゲノミクスとも呼ばれ得る(Zhengら、Curr Issues Mol Biol 4、33~43、2002)。こうして多くの米国食品医薬品局(FDA)承認標的療法が開発され、その中に発癌性体細胞ドライバー変異を標的とする小分子キナーゼ阻害剤がある(Moffatら、Nat Rev Drug Discov 13、588~602、2014)。しかしながら、標的療法の発見および開発は、しばしば、標的の生物学的機能、その作用機序、および標的を選択的に阻害するための利用可能な化学物質に関する知識の限界によって妨げられる。
本発明の化合物は、化合物自体、ならびに適用可能であればそれらの塩およびそれらのプロドラッグを含む。塩は、例えば、アニオンと、本明細書に記載される化合物上の正に帯電した置換基(例えば、アミノ)との間で形成され得る。適切なアニオンには、塩化物、臭化物、ヨウ化物、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、トリフルオロ酢酸塩および酢酸塩が含まれる。同様に、塩は、カチオンと、本明細書に記載される化合物上の負に帯電した置換基(例えば、カルボキシレート)との間でも形成され得る。適切なカチオンには、ナトリウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオンおよびアンモニウムカチオン(テトラメチルアンモニウムイオンなど)が含まれる。プロドラッグの例としては、対象に投与すると、活性化合物を提供することができるカルボン酸基のC1~6アルキルエステルが挙げられる。
化合物1~6、特に化合物6は、全身および/または局所活性を有することが可能である。この目的のために、これらを適当な様式で、例えば、経口、非経口、肺、経鼻、舌下、舌、頬側、直腸、真皮、経皮、結膜、耳経路により、またはインプラントもしくはステントとして投与することができる。
・増量剤および担体(例えばセルロース、微結晶性セルロース(例えば、Avicel(登録商標)など)、ラクトース、マンニトール、デンプン、リン酸カルシウム(例えば、Di-Cafos(登録商標))など)、
・軟膏基剤(例えばワセリン、パラフィン、トリグリセリド、ワックス、羊毛脂、羊毛脂アルコール、ラノリン、親水性軟膏、ポリエチレングリコール)、
・坐剤用基剤(例えばポリエチレングリコール、カカオバター、ハードファット)、
・溶媒(例えば水、エタノール、イソプロパノール、グリセロール、プロピレングリコール、中鎖長トリグリセリド脂肪油、液体ポリエチレングリコール、パラフィン)、
・界面活性剤、乳化剤、分散剤または湿潤剤(例えばドデシル硫酸ナトリウム)、レシチン、リン脂質、脂肪アルコール(例えば、Lanette(登録商標)など)、ソルビタン脂肪酸エステル(例えば、Span(登録商標)など)、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル(例えば、Tween(登録商標)など)、ポリオキシエチレン脂肪酸グリセリド(例えば、Cremophor(登録商標)など)、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、グリセロール脂肪酸エステル、ポロキサマー(例えば、Pluronic(登録商標)など)、
・緩衝剤および酸および塩基(例えば、リン酸塩、炭酸塩、クエン酸、酢酸、塩酸、水酸化ナトリウム溶液、炭酸アンモニウム、トロメタモール、トリエタノールアミン)
・等張剤(例えば、グルコース、塩化ナトリウム)、
・吸着剤(例えば、高分散シリカ)
・増粘剤、ゲル形成剤、増粘剤および/または結合剤(例えばポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デンプン、カルボマー、ポリアクリル酸(例えば、Carbopol(登録商標)など);アルギン酸塩、ゼラチン)、
・崩壊剤(例えば、修飾デンプン、カルボキシメチルセルロースナトリウム、グリコール酸ナトリウムデンプン(例えば、Explotab(登録商標)など)、架橋ポリビニルピロリドン、クロスカルメロースナトリウム(例えば、AcDiSol(登録商標)など))
・流動調節剤、滑沢剤、磨砕剤および離型剤(例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、タルク、高分散性シリカシリカ(例えば、Aerosil(登録商標)など))、
・塗料(例えば、砂糖、セラック)および迅速にまたは変更された様式で溶解するフィルムまたは拡散膜のためのフィルム形成剤(例えばポリビニルピロリドン(例えば、Kollidon(登録商標)など)、ポリビニルアルコール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、例えば、Eudragit(登録商標)など))
・カプセル材料(例えば、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース)、
・合成ポリマー(例えば、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリアクリレート、ポリメタクリレート(例えば、Eudragit(登録商標)など)、ポリビニルピロリドン(例えば、Kollidon(登録商標)など)、ポリビニルアルコール、ポリ酢酸ビニル、ポリエチレンオキシド、ポリエチレングリコールならびにそれらの共重合体およびブロック共重合体)、
・可塑剤(例えば、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、トリアセチン、クエン酸トリアセチル、フタル酸ジブチル)、
・浸透促進剤、
・安定剤(例えば、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、アスコルビン酸ナトリウム、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、没食子酸プロピルなどの抗酸化剤)、
・防腐剤(例えば、パラベン、ソルビン酸、チオメルサール、塩化ベンザルコニウム、酢酸クロルヘキシジン、安息香酸ナトリウム)、
・着色剤(例えば無機顔料、例えば、酸化鉄、二酸化チタンなど)、
・香料、甘味料、風味および/または臭気マスキング剤
が挙げられる。
別の態様によれば、本発明は、特に過剰増殖性疾患、特に癌の治療および/または予防のための、少なくとも1つの化合物1~6、特に化合物6と、少なくとも1または複数のさらなる有効成分を含む医薬組合せ、特に医薬を包含する。
・1または複数の第1の有効成分、特に上に定義される化合物1~6の1つ、特に化合物6および、
・1または複数のさらなる有効成分、特に過剰増殖性疾患、特に癌
を含む医薬品の組合せを包含する。
131I-chTNT、アバレリックス、アビラテロン、アクラルビシン、アダリムマブ、ado-トラスツズマブエムタンシン、アファチニブ、アフリベルセプト、アルデスロイキン、アレクチニブ、アレムツズマブ、アレンドロン酸、アリトレチノイン、アルトレタミン、アミフォスチン、アミノグルテチミド、ヘキシルアミノレブリン酸、アムルビシン、アムサクリン、アナストロゾール、アンセスチム、アネトールジチオールチオン、アネツマブ・ラブタンシン、アンジオテンシンII、抗トロンビンIII、アプレピタント、アルシツモマブ、アルグラビン、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アテゾリズマブ、アキシチニブ、アザシチジン、バシリキシマブ、ベロテカン、ベンダムスチン、ベシレソマブ、ベリノスタット、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビカルタミド、ビサントレン、ブレオマイシン、ブリナツモマブ、ボルテゾミブ、ブセレリン、ボスチニブ、ブレンツキシマブベドチン、ブスルファン、カバジタキセル、カボザンチニブ、カルシトニン、ホリナートカルシウム、レボホリナートカルシウム、カペシタビン、カプロマブ、カルバマゼピン、カルボプラチン、カルボコン、カルフィルゾミブ、カルモフール、カルムスチン、カツマキソマブ、セレコキシブ、セルモロイキン、セリチニブ、セツキシマブ、クロラムブシル、クロルマジノン、クロルメチン、シドホビル、シナカルセト、シスプラチン、クラドリビン、クロドロン酸、クロファラビン、コビメチニブ、コパンリシブ、クリサンタスパーゼ、クリゾチニブ、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダラツムマブ、ダルベポエチンアルファ、ダブラフェニブ、ダサチニブ、ダウノルビシン、デシタビン、デガレリクス、デニロイキンジフチトクス、デノスマブ、デプレオチド、デスロレリン、ジアンヒドロガラクチトール、デクスラゾキサン、塩化ジブロスピジウム、ジアンヒドロガラクチトール、ジクロフェナク、ジヌツキシマブ、ドセタキセル、ドラセトロン、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、ドキソルビシン+エストロン、ドロナビノール、エクリズマブ、エドレコロマブ、酢酸エリプチニウム、エロツズマブ、エルトロンボパグ、エンドスタチン、エノシタビン、エンザルタミド、エピルビシン、エピチオスタノール、エポエチンアルファ、エポエチンベータ、エポエチンゼータ、エプタプラチン、エリブリン、エルロチニブ、エソメプラゾール、エストラジオール、エストラムスチン、エチニルエストラジオール、エトポシド、エベロリムス、エキセメスタン、ファドロゾール、フェンタニル、フィルグラスチム、フルオキシメステロン、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルタミド、フォリン酸、フォルメスタン、ホスアプレピタント、ホテムスチン、フルベストラント、ガドブトロール、ガドテリドール、ガドテル酸メグルミン、ガドベルセタミド、ガドキセト酸、硝酸ガリウム、ガニレリクス、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブ、グルカルピダーゼ、グルトキシム、GM-CSF、ゴセレリン、グラニセトロン、顆粒球コロニー刺激因子、ヒスタミン二塩酸塩、ヒストレリン、ヒドロキシカルバミド、I-125シード、ランソプラゾール、イバンドロン酸、イブリツモマブ・ティウキセタン、イブルチニブ、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、イミキモド、インプロスルファン、インジセトロン、インカドロン酸、インゲノールメブテート、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、イオビトリドール、イオベングアン(123I)、イオメプロール、イピリムマブ、イリノテカン、イトラコナゾール、イクサベピロン、イキサゾミブ、ランレオチド、ランソプラゾール、ラパチニブ、IASOコリン(Iasocholine)、レナリドミド、レンバチニブ、レノグラスチム、レンチナン、レトロゾール、ロイプロレリン、レバミソール、レボノルゲストレル、レボチロキシンナトリウム、リスリド、ロバプラチン、ロムスチン、ロニダミン、マソプロコール、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メラルソプロール、メルファラン、メピチオスタン、メルカプトプリン、メスナ、メタドン、メトトレキサート、メトキサレン、アミノレブリン酸メチル、メチルプレドニゾロン、メチルテストステロン、メチロシン、ミファムルチド、ミルテホシン、ミリプラチン、ミトブロニトール、ミトグアゾン、ミトラクトール、マイトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、モガムリズマブ、モルグラモスチム、モピダモール、モルヒネ塩酸塩、モルヒネ硫酸塩、ナビロン、ナビキシモルス、ナファレリン、ナロキソン+ペンタゾシン、ナルトレキソン、ナルトグラスチム、ネシツムマブ、ネダプラチン、ネララビン、ネリドロン酸、ネツピタント/パロノセトロン、ニボルマブ、ペンテトレオチド、ニロチニブ、ニルタミド、ニモラゾール、ニモツズマブ、ニムスチン、ニンテダニブ、ニトラクリン、ニボルマブ、オビヌツズマブ、オクトレオチド、オファツムマブ、オラパリブ、オララツマブ、オマセタキシン・メペサクシネート、オメプラゾール、オンダンセトロン、オプレルベキン、オルゴテイン、オリロチモド、オシメルチニブ、オキサリプラチン、オキシコドン、オキシメトロン、オゾガマイシン、p53遺伝子療法、パクリタキセル、パルボシクリブ、パリフェルミン、パラジウム-103シード、パロノセトロン、パミドロン酸、パニツムマブ、パノビノスタット、パントプラゾール、パゾパニブ、ペグアスパルガーゼ、PEG-エポエチンベータ(メトキシPEG-エポエチンベータ)、ペムブロリズマブ、ベグフィルグラスチム、pegインターフェロンアルファ-2b、ペムブロリズマブ、ペメトレキセド、ペンタゾシン、ペントスタチン、ペプロマイシン、ペルフルブタン、ペルホスファミド、ペルツズマブ、ピシバニール、ピロカルピン、ピラルビシン、ピクサントロン、プレリキサホル、プリカマイシン、ポリグルサム、リン酸ポリエストラジオール、ポリビニルピロリドン+ヒアルロン酸ナトリウム、ポリサッカリド-K、ポマリドミド、ポナチニブ、ポルフィマーナトリウム、プララトレキサート、プレドニムスチン、プレドニゾン、プロカルバジン、プロコダゾール、プロプラノロール、キナゴリド、ラベプラゾール、ラコツモマブ、塩化ラジウム223、ラドチニブ、ラロキシフェン、ラルチトレキセド、ラモセトロン、ラムシルマブ、ラニムスチン、ラスブリカーゼ、ラゾキサン、レファメチニブ、レゴラフェニブ、リセドロン酸、エチドロン酸レニウム-186、リツキシマブ、ロラピタント、ロミデプシン、ロミプロスチム、ロムルチド、ロニシクリブ、サマリウム(153Sm)レキシドロナム、サルグラモスチム、サツモマブ、セクレチン、シルツキシマブ、シプロイセルT、シゾフィラン、ソブゾキサン、グリシジダゾールナトリウム、ソニデギブ、ソラフェニブ、スタノゾロール、ストレプトゾシン、スニチニブ、タラポルフィン、タリモジーン・ラハーパレプベック、タミバロテン、タモキシフェン、タペンタドール、タソネルミン、テセロイキン、テクネチウム(99mTc)ノフェツモマブメルペンタン、99mTc-HYNIC-[Tyr3]-オクトレオチド、テガフール、テガフール+ギメラシル+オテラシル、テモポルフィン、テモゾロミド、テムシロリムス、テニポシド、テストステロン、テトロホスミン、サリドマイド、チオテパ、チマルファシン、サイロトロピンアルファ、チオグアニン、トシリズマブ、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラベクテジン、トラメチニブ、トラマドール、トラスツズマブ、トラスツズマブエムタンシン、トレオスルファン、トレチノイン、トリフルリジン+チピラシル、トリロスタン、トリプトレリン、トラメチニブ、トロフォスファミド、トロンボポエチン、トリプトファン、ウベニメクス、バラチニブ、バルルビシン、バンデタニブ、バプレオチド、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンフルニン、ビノレルビン、ビスモデギブ、ボリノスタット、ボロゾール、イットリウム90ガラスミクロスフェア、ジノスタチン、ジノスタチンスチマラマー、ゾレドロン酸、ゾルビシン。
化合物6は、PDE3A阻害剤であり、したがってホスホジエステラーゼ阻害剤で癌を標的化することが有望な手法であり得るという事実によれば、化合物6は癌の治療に有用である。
本発明は、癌の特徴付けのための診断アッセイを特徴とする。一実施形態では、PDE3A、Schlafen12(SLFN12)、またはCREB3L1ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルを対象試料で測定し、PDE3Aモジュレーターによる治療に反応性である癌の指標として使用する。もう一つの実施形態では、CREB3L1ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルは、対象の生体試料で測定される。参照と比較して対象の生体試料(例えば、癌細胞を含む生体試料)でのCREB3L1またはSLFN12ポリヌクレオチドまたはポリペプチド発現レベルの消失または低下は、その癌がPDE3Aモジュレーターによる治療に抵抗性であることを示す。PDE3A、Schlafen12および/またはCREB3L1ポリヌクレオチドのレベルは、定量的PCR、RNAシーケンシング、ノーザンブロット、マイクロアレイ、質量分析およびインサイチュハイブリダイゼーションなどの標準的な方法によって測定することができる。標準的な方法を使用して腫瘍由来の生体試料中のPDE3A、Schlafen12、および/またはCREB3L1ポリペプチドのレベルを測定することができる。このような方法には、PDE3A、Schlafen12、および/またはCREB3L1に結合する抗体を用いるイムノアッセイ、ELISA、ウェスタンブロット法、ならびにラジオイムノアッセイが含まれる。参照と比較してPDE3AおよびSchlafen12ポリヌクレオチドまたはポリペプチドレベルが上昇していることは、PDE3Aモジュレーターによる治療に反応性の癌の陽性指標と考えられる。CREB3L1またはSLFN12ポリヌクレオチドまたはポリペプチドレベルの低下は、PDE3Aモジュレーターによる治療に抵抗性である癌の指標と考えられる。
PDE3Aモジュレーター治療に対する対象の悪性腫瘍の反応性を特徴付ける際に、PDE3A、SLFN12および/またはCREB3L1発現のレベルを、様々な種類の生体試料で測定する。一実施形態では、生体試料が腫瘍試料である。
本明細書で以下に報告されるように、過剰増殖性疾患に罹患している対象を、治療方法を選択する過程でPDE3A、SLFN12および/またはCREB3L1発現について試験することができる。参照と比較してPDE3Aおよび/またはSLFN12が増加していると特徴付けられた患者は、PDE3Aモジュレーター治療に反応性であると特定される。参照と比較してSLFN12またはCREB3L1発現レベルが低下しているかまたは検出限界以下である対象は、PDE3Aモジュレーター治療に抵抗性があると特定される。
本発明は、PDE3Aモジュレーター治療に対する対象の反応性または耐性を特徴付けるためのキットを提供する。
細胞選択的細胞傷害活性を有する抗癌化合物を同定するために、2つの肺腺癌細胞株、A549およびNCI-H1734(いずれも発癌性KRAS変異および短縮型STK11変異を有し、それぞれTP53野生型および変異体(R273L)であった)で不偏化学スクリーニングを行った。1924種の化合物を、2連で384ウェルフォーマットの10μMの単一濃度でA549およびNCI-H1734細胞株の分子ライブラリー小分子貯蔵確認セットからスクリーニングした。細胞生存率の代理として、化合物処理の48時間後にATP含量を測定した。
(細胞増殖)
一般式(I)の化合物の増殖抑制作用を、インビトロでヒト癌細胞で調査した。この目的のために、適切な増殖培地を含む384ウェルプレートに1000個の細胞を蒔き、37℃で一晩インキュベートした。24時間後、1つのプレート上の細胞(0hプレート)を30μl/穴のCTG溶液(Promega Cell Titer Glo(カタログ番号G755BおよびG756B))で処理し、室温で10分間インキュベートし、処理開始時の細胞生存力を求めるためにVICTOR V(Perkin Elmer)を用いて発光を測定した。試験プレートの細胞を一般式(I)の化合物で処理し、37℃で72時間インキュベートした。HP D300デジタルディスペンサーを10段階2.5倍希釈系列で用いて化合物を細胞に添加した。対照として、細胞をビヒクル(終濃度0.3%のDMSO)で処理した。72時間後、細胞を30μl/穴のCTG溶液(Promega Cell Titer Glo(カタログ番号G755BおよびG756B))で処理し、室温で10分間インキュベートし、処理の終了時の細胞生存力を求めるためにVICTOR V(Perkin Elmer)を用いて発光を測定した。細胞増殖への効果率と、それから導いたIC50を、0hプレート(=最大抑制)の値とDMSO対照(=最小抑制)の値を用いて試験物質ごとに求めた。4パラメータ当てはめを用いて、IC50値を計算した。
6-(4-(ジエチルアミノ)-3-ニトロフェニル)-5-メチル-4,5-ジヒドロピリダジン-3(2H)-オン(DNMDP)による強力な細胞選択的増殖阻害を考慮して、その作用機序をより詳細に調べた。DNMDPの分子標的を決定するために、癌細胞株百科事典(CCLE、Barretinaら、2012)の一部として突然変異、コピー数および遺伝子発現特徴について以前特徴付けられた766の試験細胞株のケモゲノミクス分析を行って、これらのゲノム特徴とDNMDP感受性との間の相関を探した。細胞株セットにわたるDNMDP感受性と個々の遺伝子の発現との間のピアソン相関の分析は、ホスホジエステラーゼ3AをコードするPDE3A遺伝子の発現と強い相関を示した(図5A)。DNMDP感受性とPDE3A発現との間の相関は完全ではなく(図18)、全766細胞株の手動検証がロジスティックに実行可能ではないため、細胞株感受性特性のハイスループット性のためいくつかの誤差が導入される可能性がある。対照的に、突然変異およびコピー数の特徴はDNMDP感受性と相関しなかった。逆に、試験した480種の化合物で、DNMDP感受性はPDE3A発現と最も相関しており(図5B)、PDE3A発現の高い癌細胞株は他の試験化合物よりもDNMDPに対してより明確に感受性であることが示された。最初のスクリーニングの動機とは対照的に、TP53突然変異またはp53機能の他の尺度とDNMDP感受性との間に相関はなかった。
6-(4-(ジエチルアミノ)-3-ニトロフェニル)-5-メチル-4,5-ジヒドロピリダジン-3(2H)-オン(DNMDP)およびいくつかのPDE3阻害剤がHeLaおよび他のDNMDP感受性細胞を死滅させるが、他のPDE3阻害剤は細胞生存率に影響を与えない、ホスホジエステラーゼ3A(PDE3A)阻害と細胞死滅との複雑な関係は、以下を含むいくつかの可能な解釈を示した:1)細胞傷害活性はPDE3非依存性であり、スクリーニングを通した異なるタンパク質に対する作用により、234種のキナーゼは10μMのDNMDPによるキナーゼ阻害を見出さなかった;2)細胞傷害性および非細胞傷害性のPDE3阻害剤は、タンパク質内の異なる部位に結合し、異なる活性を発揮する可能性がある;または3)細胞傷害性および非細胞傷害性のPDE3阻害剤はPDE3活性部位に結合するが、タンパク質の立体配座および活性に異なる効果を有する可能性がある。この第3の可能性は予期されないかもしれないが、PDE4のアロステリックモジュレーターはPDE4活性部位に結合し、上流(UCR2)および下流(CR3)調節ドメインと相互作用し、それによって特異的な不活性コンフォメーションを安定化することが示されている(Burginら、Nat Biotechnol 28巻、63~70頁、2010)。最も重要なことに、インビトロでのcAMP加水分解について類似のIC50を有するPDE4競合阻害剤およびPDE4アロステリックモジュレーターは、動物試験において異なる細胞活性および安全性プロファイルを有していた(Burginら、Nat Biotechnol 28、63~70、2010)。PDE阻害剤または他の小分子がDNMDPと競合するかどうかを評価するために、1600種の生物活性化合物のPHARMAKON 1600コレクション(PHARMAKON 1600は米国および国際薬局方の1600の既知の薬物の独特なコレクションである)をスクリーニングして、DNMDPによって誘発される細胞死を救済することができた化合物を同定した。HeLa細胞を30nMのDNMDP(EC70濃度)および20μMの各生物活性化合物で同時処理した。48時間処理後の細胞生存率を、先に記載されるようにATP消費によって評価した。DNMDPによって誘発された細胞死を救済した5種の最も強力な化合物は全てPDE阻害剤であり、3種の最も強力な化合物、レボシメンダン、ミルリノンおよびシロスタゾールは全て選択的PDE3阻害剤であった(図9A)。
ホスホジエステラーゼ3A(PDE3A)タンパク質存在量への6-(4-(ジエチルアミノ)-3-ニトロフェニル)-5-メチル-4,5-ジヒドロピリダジン-3(2H)-オン(DNMDP)細胞傷害性の依存性は、セレブロンとIKAROSファミリージンクフィンガー1(IKZF1)およびIKZF3との間の相互作用を安定化することによって新形態または高次形態機序によって作用するレナリドミドについて最近観測されたものと同様の可能な機序を示した(Kronkeら、Science 343、301~305、2014;Luら、Science343、305~309、2014)。さらに、PDE4アロステリックモジュレーターは、競合阻害剤ではないが、PDE4パートナータンパク質DISC1に独特に結合することが独立に示されている「閉じた」タンパク質コンフォメーションに結合し、これを安定化することが示されている(Millarら、Science 310、1187~1191、2005)。PDE3Aが存在するタンパク質複合体を正常条件下で特徴付け、PDE3AがDNMDPまたは非細胞傷害性PDE3阻害剤トレキンシンに結合した場合、これらの複合体がどのように変化するかを調べた。Hela細胞からのPDE3Aおよび相互作用タンパク質を、DNMDPおよびトレキンシンの存在下で免疫沈降させ、引き続いて相対存在量のために同重体安定同位体タグによる標識化をし、質量分析によって定量化した(iTRAQ/MS、図13A)。HeLa細胞からのPDE3A免疫沈降物は、タンパク質ホスファターゼ2サブユニット(PPP2CA、PPP2R1A、PPP2R1B、PPP2R2A、PPP2R2D)、カルシニューリン(PPP3R1、PPP3CA、Becaら、Circ. Res. 112、289~297、2013)、14-3-3(YWHAB、YWHAQ、YWHAG、YWHAZ、Pozuelo Rubioら、Biochem. J. 392、163~172、2005)およびチューブリン(TUBA1C、TUBA1B)ファミリーメンバーを含む複数のタンパク質ホスファターゼサブユニットについて濃縮されていた(図13Bおよび図14A)。さらに、PDE3AおよびPDE3Bは以前に報告された同じタンパク質複合体に存在することが見出された(Malovannayaら、Cell 145、787~799、2011)。
1500個のNCI-H1734または1000個のA549細胞を、10%ウシ胎児血清および1%Pen/Strepを補充した40μlのRPMI中384ウェルプレートに蒔いた。プレーティング24時間後、1924種の小分子の化合物ライブラリーを10μMの濃度で添加した。スタウロスポリンを10μMの濃度で細胞傷害性についての陽性対照として使用し、DMSOを1%の濃度で陰性対照として使用した。全ての化合物を、示される小分子と共に48時間インキュベートした。48時間後、384ウェルプレートをインキュベーターから取り出し、20分間室温に冷却させた。THERMO COMBI(商標)またはマルチチャネルピペットを用いてPBS中25%CELLTITERGLO(登録商標)(Promega)40μlを添加し、10分間インキュベートすることによって細胞生存率を評価した。Perkin-Elmer EnVisionを用いて発光シグナルを読み取った。生存率を、DMSO対照に正規化することによって計算した。
1000個のHeLa(DMEM)、1000個のA549(RPMI)、500個のMCF-7(DMEM)、4000個のPC3(F12-K)、1000個のNCI-H2122(RPMI)または1500個のNCI-H1563(RPMI)細胞を、10%ウシ胎児血清を補充した対応する増殖培地40μl中384ウェルプレートに蒔いた。プレーティング24時間後、示される化合物を示される濃度で添加し、48時間インキュベートした。NCI-H1734およびA549細胞株における化合物ライブラリースクリーニングに記載されるように細胞生存率を評価した。化合物6をHeLa細胞生存力アッセイで試験し、そのEC50が1.1nMであると求めた。
1000個のHeLa細胞を、10%ウシ胎児血清を補充した対応する増殖培地40μl中384ウェルプレートに蒔いた。プレーティング24時間後、示される化合物を示される濃度で添加し、48時間インキュベートした。Promega製のCaspase-Gloを製造者の推奨に従って添加し、NCI-H1734およびA549細胞株における化合物ライブラリースクリーニングに記載されるように発光を測定した。
DNMDPに対する、23の異なる系統から引き抜いた777の癌細胞株(CCL)の感受性を測定した。癌細胞株は、Cancer Cell Line Encyclopediaの一部であり、その同一性がSNPアレイおよび体細胞DNAの変化によって確かめられた。各細胞株を、500個の細胞/ウェルの密度で、白色不透明の1536個のプレート中の好ましい培地に蒔いた。一晩インキュベートした後、DNMDPを、2連で、2倍段階で66.4μM~2nMに及ぶ16濃度で音響伝達により添加した(Labcyte Echo 555, Labcyte Inc.、Sunnyvale、CA)。72時間の処理後、ViewLux Microplateイメージャ(PerkinElmer、Waltham、MA)を用いて製造業者のプロトコルに従って、細胞ATPレベルを生存率の代用として測定し(CELLTITERGLO(登録商標)、Promega Corporation、Madison、WI)、バックグラウンド(媒体のみ)およびビヒクル(DMSO)処理対照ウェルに正規化した。
Affymetrix GeneChip Human Genome U133 Plus 2.0 Arrayで測定された遺伝子中心ロバストマルチチップ平均(RMA)-正規化基礎mRNA遺伝子発現データを、癌細胞株百科事典(CCLE、ヒト癌細胞の大きなパネルの詳細な遺伝的特徴付け;Barretinaら, Nature 483, 603~607, 2012)からダウンロードした。ピアソン相関係数を、760個の重複するCCLにわたり遺伝子発現(18988個の転写産物)と曲線下面積(AUC)との間で計算した。異なる数のCCLに曝露された小分子間の比較のために、フィッシャーの変換を用いて相関係数を変換した。
市販の3H-cAMPシンチレーション近接アッセイ(SPA、Perkin Elmer)系を酵素抑制研究に使用した。インビトロでの被験物質のPDE3A反応への効果を決定するために、DMSO中のそれぞれの被験化合物溶液(段階希釈)2μlをマイクロタイタープレート(Isoplate-96/200W;Perkin Elmer)のウェルに入れた。緩衝液A(50mM Tris/HCl pH7.5、8.3mM MgCl2、1.7mM EDTA、0.2%BSA)中の、ヒト全長PDE3Aを過剰発現するSf9細胞由来のPDE3A細胞抽出物(SB Drug Discovery、UK)の希釈物50μlを添加した。PDE3A細胞抽出物の希釈物は、反応速度が線形であり、基質の70%未満が消費されるように選択した(典型的な希釈1:5000)。BSAを含まない緩衝液A中1:2000に希釈した基質[8-3H]アデノシン3’,5’-環状リン酸(1μCi/μl;Perkin Elmer)50μl(0.025μCi)を添加することによって反応を開始させた。室温で60分間のインキュベーションの後、18mg/mlイットリウムシンチレーション近接ビーズを含有する水中懸濁液(Perkin Elmer)25μlの添加によって反応を停止した。マイクロタイタープレートを密封し、Microbetaシンチレーションカウンター(PerkinElmer Wallac)で測定した。IC50値は、化合物濃度に対するPDE3A活性百分率をプロットすることによってシグモイド曲線から求めた。化合物6について、IC50値は、それぞれ2.4nM(PDE3A IC50)および3.4nM(PDE3B IC50)である。
凍結保存したヒト肝細胞におけるインビトロ代謝安定性の研究(肝臓インビボ血液クリアランス(CL)および最大経口バイオアベイラビリティ(Fmax)の計算を含む)
(全体的な詳細)
全ての反応は窒素(N2)雰囲気下で行った。全ての試薬および溶媒は、商業的供給業者から購入し、受け取ったまま使用した。核磁気共鳴(NMR)スペクトルは、Bruker(300または400MHz 1H、75または101MHz 13C)分光計で記録した。プロトンおよび炭素化学シフトは、NMR溶媒を参照とするppm(δ)で報告する。データを以下の通り報告する:化学シフト、多重度(br=ブロード、s=一重項、d=二重項、t=三重項、q=四重項、m=多重項;1つまたは複数のカップリング定数(Hz))。フラッシュクロマトグラフィーは、Teledyne Isco Combiflash Rfで40~60μmのシリカゲル(60Åメッシュ)を用いて行った。一定の0.1%ギ酸を含む2.5分にわたり水中0~100%CH3CNの勾配を用いるWaters Symmetry C18カラム(3.5μm、4.6×100mm)を用いて、Waters 2795分離モジュールおよび3100質量検出器で、タンデム液体クロマトグラフィー/質量分析(LC/MS)を行った。分析用薄層クロマトグラフィー(TLC)は、EM Reagent 0.25mmシリカゲル60-Fプレートで行った。元素分析は、Robertson Microlit Laboratories、Ledgewood NJによって行った。
1L一口フラスコに、3,4-ジフルオロプロピオフェノン40g(235mmol)、CH3CN400mL、モルホリン250mL(2.86mol)、およびDIPEA50mL(360mmol)を添加し、溶液を一晩100℃に加熱した。翌日、反応物を冷却し、濃縮した。この混合物をCH2Cl2に溶解し、水、次にブラインで数回すすぎ、乾燥させ(MgSO4)、濾過し、濃縮した。粗生成物の大部分を約1Lの熱ヘキサンに溶解し、一晩冷却した。濾過すると、さらに多くの結晶が母液に現れた。母液を濃縮し、ヘキサンから再結晶させた。合計52.5gの乾燥白色固体を得た(94%)。1H NMR(400 MHz, CDCl3)δ7.72(dd, J=8.4, 1.9 Hz, 1H), 7.66(dd, J=14.0, 2.0 Hz, 1H), 6.93(t, J=8.5 Hz, 1H), 3.94-3.85(m, 4H), 3.26-3.17(m, 4H), 2.94(q, J=7.3 Hz, 2H), 1.23(t, J=7.3 Hz, 3H). 19F NMR(376 MHz, CDCl3)δ-121.48. MS:238(M+1).
2L三口フラスコに、無水THF200mLおよびLiHMDS溶液(THF中1M)200mLを添加し、ドライアイス/イソプロパノール浴でフラスコを冷却した。冷たくなったら、THF300mLに溶解した3-フルオロ-4-モルホリノ)プロピオフェノン(196mmol)46.5gを、カニューレを介して添加した。1時間撹拌した後、THF44mLに溶解したブロモ酢酸エチル(202mmol)44mLを添加し、反応混合物を一晩撹拌し、室温まで温めた。翌朝、反応物はまだ少し冷たかった。それにNH4Cl溶液を添加し、それに続いてEtOAcおよびヘキサンを添加した。層を分離し、水層をEtOAcで2回すすぎ、合わせた有機層をブラインですすぎ、乾燥させ(MgSO4)、濃縮して65.6gの淡黄色の油状物質(100%)とし、それを粗製のまま続けた。
粗4-(3-フルオロ-4-モルホリノフェニル)-3-メチル-4-オキソブタン酸エチル(65.6g、202mmol)をEtOH400mLに溶解し、それにヒドラジン(1.01mol)31.6mLを添加し、反応物を還流温度で一晩加熱した。翌朝、多量の白色の沈殿が室温に冷却されたフラスコの中に存在していた、固体を濾過し、冷EtOHですすいだ。固体を1L一口フラスコに入れ、ロータリーエバポレーターに設置して残留するEtOHを除去し、42gの正常な固体を得た(71%)。
計測器:Thar analytical SFC
カラム:ChiralPak AS-H、250×4.6mm
移動相:CO2用のAおよびMeOH(0.05%DEA)用のB
勾配:B 40%
流量:2.4mL/分
背圧:100bar
カラム温度:35℃
波長:220nm
計測器:Thar200 preparative SFC
カカラム:ChiralPak AS-10μm、300×50mmI.D.
移動相:CO2用のAおよびEtOH(0.1%NH3・H2O)用のB
勾配:B 45%
流量:200mL/分
背圧:100bar
カラム温度:38℃
波長:220nm
化合物3aをエタノールに溶解して約100mg/mlとした。注射:5ml/注射。
分離後、画分を湯浴温度40℃のロータリーエバポレーターで乾燥させて所望の異性体化合物3
カラム:ChiralPak AS-H、250×4.6mm、5um
移動相修飾剤:100%メタノール
勾配:10分間で5~50%メタノール
流量:4mL/分
背圧:100bar
カラム温度:40℃
UV検出は200~400nmであった。
分離されたエナンチオマーの保持時間:6.11((R))および8.82((S))分。
計測器:Waters Acquity UPC2
カラム:ChiralPak AS-H、250×4.6mm I.D.
移動相:CO2用のAおよびMeOH用のB
勾配:3~50B、5分、10分運転
流量:1.5ml/分
背圧:100bar
カラム温度:45℃
波長:210nm
DNMDP-2L 18mg(0.04mmol)のCH2Cl2 0.8mL中溶液に、トリフルオロ酢酸(TFA)0.2mLを添加し、溶液を2時間撹拌した後、濃縮し、DMSO0.5mLに溶解した。これに、Et3N10uL(0.07mmol)およびN,N’-ジスクシンイミジルカーボネート(DSC)12mg(0.05mmol)を添加し、溶液を一晩撹拌した。LC分析が反応が完了していないことを示したので、さらなるN,N’-ジスクシンイミジルカーボネート25mg(0.1mmol)を添加した。2時間後のLC分析は、約5:1比のDSC生成物:アミンを示した。Affi-Gel 102樹脂の1mL試料を遠心分離機を用いてDMSOで5回すすぎ、次いで、DMSO0.5mLに懸濁した。樹脂にDSC生成物溶液30μLおよびEt3N 25μLを添加し、混合物を旋回させた。2日後、DMSO溶液のLC分析は、DCS付加物の完全な消失を示した。未誘導体化アミンが依然として存在していた。DMSOを遠心分離によって除去し、デカントし、樹脂をDMSOで数回すすぎ、PBS緩衝液に保存した。
1000個のHeLa細胞を、10%ウシ胎児血清および1%Pen/Strepを補充した40μlのDMEM中384ウェルプレートに蒔いた。プレーティング24時間後、1600種の生理活性分子(Pharmacon)の化合物ライブラリーを20μMの濃度で添加した。生物活性化合物のインキュベーションと並行して、DNMDPを30nMの最終濃度まで添加し、48時間インキュベートした。NCI-H1734およびA549細胞株における化合物ライブラリースクリーニングに記載されるように細胞生存率を評価した。
HeLa細胞を氷冷PBSで洗浄した後、EDTAを含まないプロテアーゼ阻害剤(Roche)ならびにホスファターゼ阻害剤混合物IおよびII(Calbiochem)を補充したNP-40溶解緩衝液(150mM NaCl、10%グリセロール、50mMトリス-Cl pH8.0、50mM MgCl2、1%NP-40)で溶解した。細胞溶解物を氷上で少なくとも2分間インキュベートし、その後、4℃で15700×gで10分間遠心分離し、その後、BCAタンパク質アッセイキット(Pierce)を用いて上清を定量化した。合計200μgのHeLa細胞溶解物を、親和性リンカーDNMDP-2Lに結合した3μlのAffi-Gel102樹脂(BioRad)と総体積400μlで4時間インキュベートした。インキュベーションの前に、示される化合物を10μMの最終濃度で親和性精製に添加した。10μMの対応する化合物濃度を含有する溶解緩衝液で試料を3回洗浄した。Affi-Gel 102樹脂に結合したタンパク質を、還元し、変性させ、トリス-グリシンゲル(Novex)を用いて分離し、iBlot移送システム(Novex)を用いてニトロセルロース膜に移した。膜をPDE3Aに対する一次抗体(1:1000、Bethyl)と共に4℃で一晩インキュベートした。室温で2時間の二次抗体(1:20,000、LI-COR Biosciences)とのインキュベーションおよびその後の検出(Odyssey Imaging System、LI-COR Biosciences)を、製造業者の推奨に従って行った。
HeLa細胞を示される濃度のDNMDPおよびスタウロスポリンで36時間処理した。HeLa細胞を溶解し、DNMDPの分子標的のリンカー親和性精製および免疫ブロットに記載されるように処理した。膜をPARPに対する抗体(1:1000、Cell Signaling#9532)およびアクチンと共にインキュベートし、その後、DNMDPの分子標的のリンカー親和性精製および免疫ブロットに記載されるように画像化した。
CRISPR標的部位を、MIT CRISPR設計ツール(オンラインMIT CRISPR設計ポータル)を用いて同定した。sgRNAのクローニングのために、順方向および逆方向オリゴヌクレオチド(オリゴ)をアニールし、リン酸化し、BsmBI消化pXPR_BRD001に連結した。オリゴ配列は以下の通りである:
HeLa細胞を96ウェルプレートに蒔き、製造者の推奨に従って、PDE3Aおよび非標的siRNAスマートプール(On Target Plus、Thermo Scientific)で24時間後にトランスフェクトした。HeLa細胞溶解物をトランスフェクションの24時間後および72時間後に得て、DNMDPの分子標的のリンカー-親和性精製および免疫ブロットに記載されるように、PDE3Aおよびアクチン(1:20,000、Cell Signaling)について免疫ブロットした。HeLa細胞を示される濃度の化合物3で48時間処理した。NCI-H1734およびA549細胞株における化合物ライブラリースクリーニングに記載されるように細胞生存率を評価した。
5000個のHeLa細胞を96ウェルプレートに蒔いた。プレーティングの24時間後、HeLa細胞を示される濃度の示される化合物と共に1時間インキュベートした。cAMPレベルを、製造業者の推奨に従ってCAMP-GLO(商標)アッセイ(Promega)を用いて測定した。製造業者の推奨に従って作成された標準曲線に正規化することによって、cAMPの細胞濃度を決定した。
(HeLa細胞におけるPDE3Aの免疫沈降)
HeLa細胞を、10μMの示される化合物:DMSO、DNMDPおよびトレキンシンで溶解前に4時間処理した。DNMDPの分子標的のリンカー-親和性精製および免疫ブロットに記載されるように、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤、ならびに最終濃度10μMまでの上記の示される化合物を補充したModRipa溶解緩衝液(1%NP-40:50mM トリス-HCl、pH7.8、150mM NaCl、0.1%デオキシコール酸ナトリウム、1mM EDTA)でHeLa細胞を溶解した。HeLa全細胞溶解物13mgを0.5%PDE3A抗体(Bethyl)と共にインキュベートし、一晩インキュベートした。PDE3A抗体に対するブロッキングペプチド(Bethyl)を、対応する条件でPDE3A抗体と同時に添加した。次いで、全細胞溶解物と抗体混合物をプロテインAプラスアガロース10μl(Fisher Scientific)と共に4℃で30分間インキュベートした。次いで、プロテインAプラスアガロースを、10μMの濃度の示される化合物を含有する溶解緩衝液で2回洗浄した。最後に、プロテインAプラスアガロースを、NP-40を含有せず、10μMの濃度の示される化合物を含有する溶解緩衝液で1回洗浄した。
免疫精製からのビーズをIP溶解緩衝液で1回洗浄し、次いで、PBSで3回洗浄し、各反復の3つの異なる溶解物を90μL消化緩衝液(2M尿素、50mMトリスHCl)に再懸濁し、配列決定グレードのトリプシン2μgを添加し、700rpmで1時間振盪した。上清を取り出し、新しいチューブに入れた。次いで、ビーズを消化緩衝液50μLで2回洗浄し、上清と合わせた。合わせた上清を還元し(2μL500mM DTT、30分間、室温)、アルキル化し(4μL500mM IAA、45分間、暗所)、より長い一晩の消化を行った:トリプシン2μg(4μL)、一晩振盪。次いで、試料を10%葉酸(FA)20uLでクエンチし、10mgのSEP-PAK(登録商標)カラムで脱塩した。
脱塩されたペプチドを、製造者の指示(AB Sciex、Foster City、CA)に従って相対および絶対定量(iTRAQ)-試薬のために同重体タグで標識した。ペプチドを0.5M TEAB pH8.5溶液30μlに溶解し、標識試薬をエタノール70μlに添加した。1時間のインキュベーション後、50mM Tris/HCl pH7.5で反応を停止させた。示差的に標識したペプチドを混合し、その後、10mgのSEP-PAK(登録商標)カラムで脱塩した。
1:酢酸アンモニウム50mM、pH4.5
2:酢酸アンモニウム50mM pH5.5
3:酢酸アンモニウム50mM、pH6.5
4:重炭酸アンモニウム50mM pH8
5:水酸化アンモニウム0.1%pH9
6:水酸化アンモニウム0.1%pH11
再構成されたペプチドを、オンラインナノフローEASY-NLC(商標)1000UHPLCシステム(Thermo Fisher Scientific)上で分離し、卓上Orbitrap Q EXACTIVE(商標)質量分析計(Thermo Fisher Scientific)で分析した。ペプチド試料を、20cm C18シリカ材料(1.9μm REPROSIL-PUR(登録商標)C18-AQ培地、Dr. Maisch GmbH、r119.aq)を用いて社内で充填したキャピラリーカラム(10μm先端開口部/直径75μmのPICOFRIT(登録商標)、New Objective、PF360-75-10-N-5)に注入した。UHPLCセットアップを、カスタムフィットマイクロ適合ティー(360μm、IDEX Health&Science、UH-753)と接続し、キャピラリーカラムをカラムヒータースリーブ(Phoenix-ST)で50℃に加熱して、UHPLC分離中の背圧を低減した。注入したペプチドを、100%溶媒A(3%アセトニトリル、0.1%ギ酸)から30%溶媒B(90%アセトニトリル、0.1%ギ酸)の線形80分勾配、引き続いて30%溶媒Bから90%溶媒Bの直線形6分勾配で、200nL/分の流量で分離した。各試料を、試料ローディングおよびカラム平衡時間を含めて120分間流した。Q EXACTIVE(商標)装置を、3×106イオンのMS1イオン標的および5×104イオンのMS2標的を用いて、12種の上位の最も豊富なイオンで各MS1スキャン(R=70000)後の高エネルギー衝突解離(HCD)MS/MSスキャン(R=17500)を取得するデータ依存モードで運転した。MS/MSスキャンに利用した最大イオン時間は120msであった;HCD正規化衝突エネルギーを27に設定した;動的排除時間を20秒に設定し、ペプチドの一致および同位体排除機能を使用可能にした。
全ての質量スペクトルを、相対および絶対定量(iTRAQ)に基づく定量のための同重体タグのために出願人によって開発されたモジュールを含むSpectrum Millソフトウェアパッケージv4.1ベータ(Agilent Technologies)を用いて処理した。前駆体イオン定量を、各前駆体イオンについて抽出イオンクロマトグラム(XIC’s)を用いて行った。MS/MSに供された各前駆体イオンのXICのピーク面積を、Spectrum Millソフトウェアによって、同位体クラスターの各個々のメンバーの周りの狭い窓を用いた液体クロマトグラフィー(LC)-MS/MS実行の介在する高分解能MS1スキャンで自動的に計算した。同位体クラスター内のピークの相対的分布に関する品質メトリクス対理論を条件に、MSスキャン分解能、前駆体電荷およびm/zに基づいて、時間とm/z領域の両方におけるピーク幅を動的に決定した。+/-60秒以内に同じ解離モードで同じ前駆体m/zで得られた類似のMS/MSスペクトルを併合した。シーケンスタグ長>1(すなわち、アミノ酸の鎖内質量によって分離される3質量の最小)を有さないことによって品質フィルタに不合格であった前駆体電荷>7および品質の悪いMS/MSスペクトルを有するMS/MSスペクトルを検索から除外した。
HeLa細胞を、V5タグ化SIRT7、V5タグ化SLFN12またはV5タグ化GFPを発現するORF過剰発現構築物でトランスフェクトした。ORF発現構築物を、TRC(クローンID:TRCN0000468231、TRCN0000476272、ccsbBroad304_99997)から得た。トランスフェクションの72時間後、細胞を10μM DNMDPまたはトレキンシンで4時間処理し、引き続いてModRipa溶解緩衝液を用いて溶解し、PDE3Aを免疫沈降させた。各条件について、全タンパク質溶解物2mgを抗PDE3A抗体1μgと4℃で一晩インキュベートし、その後、プロテインA-およびプロテインG-Dynabeadsそれぞれ7.5μl(Life Technologies 10001Dおよび10003D)を添加し、さらに1時間インキュベートした。ビーズを洗浄し、結合したタンパク質をLDS PAGEゲルローディング緩衝液30μlで溶出させた。4~12%トリス-グリシンPAGEゲル上でインプット(全タンパク質溶解物約60μg)およびIP生成物を分離し、抗V5抗体(Life Technologies R96205、1:5000)、Bethyl抗PDE3A抗体(1:1000)およびLiCOR Biosciences製の二次抗体(カタログ番号926-32210および926068021、それぞれ1:10,000)で免疫ブロットした。ブロットを洗浄し、LiCOR Odyssey赤外線撮像装置を用いて画像化した。
SLFN12を標的とするshRNAを発現する構築物、または対照ベクターをレンチウイルスにパッケージングし、ウイルス形質導入によってHeLa細胞に送達した。3つのSLFN12標的化shRNAを使用したが、これらの全てをTRC(クローンID:TRCN0000152141およびTRCN0000153520)から得た。感染した細胞を1μg/mlピューロマイシンを用いて3日間選択し、次いで、非選択培地でさらに3日間増殖させた。次いで、細胞を384ウェルアッセイプレートに蒔き、上記のように薬物感受性について試験した。SLFN12のノックダウンをqPCRによって検証した。キット試薬(RNeasy Mini Kit(Qiagen#74104)およびQIAschredder(Qiagen#79656))を用いて全RNAを抽出した。キット試薬(SuperScript III First-Strand Synthesis System(Life Technologies#18080-051))を用いてcDNAを作製した。qPCRを、製造業者の推奨に従ってGAPDHおよびSLFN12(Life Technologies Hs00430118_m1)について行った。SLFN12発現を、対応する試料GAPDH ct値に正規化した。
上記の説明から、種々の使用および条件に採用するために、本明細書に記載される本発明に対して変更および修正を行うことができることは明らかであろう。このような実施形態もまた、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
本明細書で言及した全ての特許および刊行物は、それぞれの独立した特許および刊行物が具体的かつ個別的に参照により組み込まれることが示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
Claims (22)
- 前記癌細胞または対象が、更に、CREB3L1ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現レベルが参照と比較して低下していないとして検出されたものである、請求項1または2に記載の医薬組成物。
- 対象の生体試料中のCREB3L1ポリペプチドまたはポリヌクレオチドおよびSLFN12ポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルを決定し、前記レベルが参照と比較して低下している場合には、対象がPDE3A調節に抵抗性の癌を有するという基準と比較することにより、対象がPDE3A調節に抵抗性の癌を有するかどうかを試験する方法。
- PDE3Aを検出する工程を更に含み、PDE3A、SLFN12、およびCREB3L1ポリペプチドのレベルが、免疫ブロット法、質量分析、および免疫沈降からなる群から選択される方法によって検出される、請求項4に記載の方法。
- PDE3Aを検出する工程を更に含み、PDE3A、SLFN12、またはCREB3L1ポリヌクレオチドのレベルが、定量的PCR、RNAシーケンシング、ノーザンブロット、マイクロアレイ、質量分析、およびインサイチュハイブリダイゼーションからなる群から選択される方法によって検出される、請求項4に記載の方法。
- ホスホジエステラーゼ3A(PDE3A)モジュレーターに抵抗性であるとして選択された前記癌細胞が、骨癌、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、子宮内膜癌、消化管間質腫瘍(GIST)、頭頚部癌、造血系癌、腎癌、平滑筋肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ系癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、軟部組織肉腫、甲状腺癌、尿路癌細胞である、請求項4に記載の方法。
- 前記PDE3AモジュレーターがPDE3Aの活性を低下させる、請求項1または2に記載の医薬組成物。
- 経口投与または静脈内投与される、請求項2に記載の医薬組成物。
- 前記生体試料が癌細胞を含む組織試料である、請求項4に記載の方法。
- 前記過剰増殖性疾患が癌である、請求項13に記載の医薬組成物。
- 対象が、PDE3Aモジュレーターに反応性である癌と診断されている、請求項13に記載の医薬組成物。
- 前記疾患が、骨癌、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、子宮内膜癌、消化管間質腫瘍(GIST)、頭頚部癌、造血系癌、腎癌、平滑筋肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ系癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、軟部組織肉腫、甲状腺癌、尿路癌である、請求項13に記載の医薬組成物。
- 前記癌が、骨癌、乳癌、子宮頚癌、結腸癌、子宮内膜癌、消化管間質腫瘍(GIST)、頭頚部癌、造血系癌、腎癌、平滑筋肉腫、肝臓癌、肺癌、リンパ系癌、黒色腫、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、軟部組織肉腫、甲状腺癌、尿路癌である、請求項18に記載の使用。
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