CN112229991B - 一种纳米捕获器件及其制备方法和用途 - Google Patents

一种纳米捕获器件及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种纳米捕获器件及其制备方法和用途。纳米捕获器件，其特征在于，以环糊精、卟啉、冠醚为主体分子，利用其的活性基团将其修饰到纳米磁珠表面，并在主体分子的亲水基端固定化核酸适体或抗体。该纳米捕获器件方便实施，无需昂贵仪器检测系统。实现定量、快速、可靠的黄曲霉毒素检测。

Description

一种纳米捕获器件及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及食品检测领域，尤其涉及一种纳米捕获器件及其制备方法和用途。
背景技术
食源性生物毒素(以真菌毒素最为常见，例如黄曲霉毒素)一直是食品安全关注的重大问题，黄曲霉毒素(Aflatoxin，英文简写AF)常由黄曲霉和寄生曲霉等霉菌在霉变的谷物中产生，属于剧毒物质，其毒性比氰化钾、砒霜毒性高出数倍、数十倍以上，它也是目前已知最强致癌物之一，可诱发多种癌，特别是肝癌，被世界卫生组织的癌症研究机构划定为1类致癌物[1]。黄曲霉毒素中，以黄曲霉毒素B1最为多见，其毒性与致癌作用也最强，它的半数致死量为0.36毫克/公斤体重，属特剧毒的毒物范围。黄曲霉毒素的危害性表现在，容易被黄曲霉毒素污染的食品非常广泛，包括玉米、花生、大米、食用油、发酵食品等等，而且，从作物田间生长、收割、运输、储藏到餐桌，其中任何一个环节都可能产生黄曲霉毒素。尤其是黄曲霉毒素耐高温，食物中产生了黄曲霉毒素也不易发现和去除，除非是肉眼可见的霉烂。然而，黄曲霉毒素的快速检测始终存在一个问题，即黄曲霉毒素的基本结构为二呋喃环和香豆素，难溶于水、易溶于油相及部分有机溶剂，而直接在油相中进行检测存在不小的困难，目前发展的快速检测方法通常需要对油相中的黄曲霉毒素先进行提取、还可能需要衍生等前处理操作，因此这限制了这些快速检测方法的实际运用。最常见的黄曲霉毒素样品前处理方法是将试样中的黄曲霉毒素用一定比例的甲醇-水提取液提取出来后，用免疫亲和柱净化、并将亲和柱上的黄曲霉毒素淋洗下来，再对甲醇-黄曲霉毒素淋洗液进行分析。免疫亲和柱是用大量的黄曲霉毒素单克隆抗体固定化在载体上然后装柱而成，成本高。在目前绝大多数的检测方法中，这些样品前处理方式在面临大量样品时无法满足快速检测的需要，制约了其快速、简便并且经济的广泛运用。
因此，发展快速的黄曲霉毒素即时检测方法与技术，满足人们日益提高的食品健康与安全需求，一直是人们关注和十分迫切的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种方便实施，无需昂贵仪器检测系统的定量、快速、可靠的黄曲霉毒素检测的纳米捕获器件。
为实现上述目的，本发明提供一种纳米捕获器件，其特征在于，以环糊精、卟啉、冠醚为主体分子，利用其的活性基团将其修饰到纳米磁珠表面，并在主体分子的亲水基端固定化核酸适体或抗体。
进一步，制备方法为，将羧基纳米磁珠用去离子水和无水乙醇洗涤，再用无水丙酮洗涤后使磁珠处在无水的环境中；再加入无水丙酮和偶联剂，于旋涡混合器上反应后得到活化的磁珠；将活化的磁珠与抗体偶联的环糊精或卟啉或冠醚分子反应过夜；再用洗涤缓冲液洗涤磁珠后加入封闭液封闭磁珠载体上其它活性位点，反应12小时，即得到本发明的纳米捕获器件。
进一步，所述羧基纳米磁珠，活化步骤用的无水丙酮，偶联剂，抗体偶联的环糊精或卟啉或冠醚分子的用量比为10mg:1ml:150mg:150mg。
进一步，制备方法为，将羧基纳米磁珠用去离子水和无水乙醇洗涤，离心弃上清，重复上述步骤1-5遍；用相同的方法，加入无水丙酮洗涤1-5遍，使磁珠处在无水的环境中；在此磁珠中加入无水丙酮和偶联剂羰基二米唑CDI，放在旋涡混合器上反应0.5-2小时，使得磁珠载体上修饰上咪唑基团即得到CDI活化的磁珠；将CDI活化的磁珠与抗体偶联的氨基-β-环糊精或四氨基苯基卟啉TAPP或氨基苯并-18-冠醚-6反应过夜；用洗涤缓冲液洗涤磁珠，加入1％牛血清白蛋白封闭磁珠载体上其它活性位点，反应过夜，即得到本发明的纳米捕获器件。
5.如权利要求4所述纳米捕获器件，其特征在于，所述反应过夜的条件为4℃，260r/min。
本发明还提供一种所述纳米捕获器件的制备方法，其特征在于，将羧基纳米磁珠用去离子水和无水乙醇洗涤，再用无水丙酮洗涤后使磁珠处在无水的环境中；再加入无水丙酮和偶联剂，于旋涡混合器上反应后得到活化的磁珠；将活化的磁珠与抗体偶联的环糊精或卟啉或冠醚分子反应过夜；再用洗涤缓冲液洗涤磁珠后加入封闭液封闭磁珠载体上其它活性位点，反应12小时，即得到本发明的纳米捕获器件；
优选的，所述羧基纳米磁珠，活化步骤用的无水丙酮，偶联剂，抗体偶联的环糊精或卟啉或冠醚分子的用量比为10mg:1ml:150mg:150mg。
进一步，将羧基纳米磁珠用去离子水和无水乙醇洗涤，离心弃上清，重复上述步骤1-5遍；用相同的方法，加入无水丙酮洗涤1-5遍，使磁珠处在无水的环境中；在此磁珠中加入无水丙酮和偶联剂羰基二米唑CDI，放在旋涡混合器上反应0.5-2小时，使得磁珠载体上修饰上咪唑基团即得到CDI活化的磁珠；将CDI活化的磁珠与抗体偶联的氨基-β-环糊精或四氨基苯基卟啉TAPP或氨基苯并-18-冠醚-6反应过夜；用洗涤缓冲液洗涤磁珠，加入1％牛血清白蛋白封闭磁珠载体上其它活性位点，反应过夜，即得到本发明的纳米捕获器件；
优选的，所述反应过夜的条件为4℃，260r/min。
本发明还提供所述纳米捕获器件用于检测黄曲霉毒素的用途；优选的，用于检测液体样品中黄曲霉毒素的用途；更优选的，所述液体样品为油类、酱类或液态奶。
进一步，使用了所述的纳米捕获器件。
进一步，方法为，将所述纳米捕获器件加入到检测样品中，充分搅拌后，通过磁分离设备将纳米捕获器件从样品中分离出来；分离出的纳米捕获器件加入HRP标记的黄曲霉毒素AFB1核酸适体溶液中反应；再采用酶联免疫方法在酶标仪上进行测定即可；
更优选的，检测样品：纳米捕获器件的用量比例为1ml：10.0mg。
本发明以环糊精、卟啉、冠醚等为主体分子，构建主客体相互作用的超双亲分子组装体，将其修饰到纳米磁珠表面，并在主体分子的亲水基端固定化核酸适体/抗体作为捕获探针。通过这种方式构筑的纳米捕获器件，在油相介质中，其疏水端朝外与油相相溶，连接上探针的亲水端收缩朝内、面向磁珠表面，形成亲水环境的微囊腔，在微囊腔中探针保持活性位点的识别能力。当油相中有靶标存在时，靶标靠近和进入磁珠超双亲分子膜相，即被探针捕获、识别和富集。磁珠从油相中分离出来进入水相，微囊腔膜层实现翻转，结合了靶标的探针即从囊腔中释放出来。
本发明的作用是在捕获磁珠表面构建出性能优越的超双亲分子组装膜层，油相介质中的靶标如黄曲霉毒素可以通过组装膜层进入微囊腔，从而建立靶标的膜通路、完成靶标从油相到水相的转移和富集。建立了基于超双亲分子组装膜层的核酸适体/抗体活性识别位点保持的分子机制。
本发明运用分子识别与传感技术发展油相中靶标识别的即时检测，即在纳米磁珠表面构建一个超双亲分子组装膜，存在于油相中的靶标在双亲膜相被选择性识别、捕获和富集，从而构造出针对油相中靶标的、精准的纳米捕获器件，这一纳米捕获器件可以非常灵活地与微流控芯片、试纸、可视化芯片检测系统等进行集成，进而建立一体化芯片即时检测新方法。
本发明的实施例验证了实际液体样品中黄曲霉毒素的即时检测效果。考察了实际体系复杂组分给即时检测带来的干扰，研究优化实验条件，提高了检测方法的选择性、可靠性。采用国标方法做对照，验证其可行性与优越性，面向食品安全领域建立用户友好、无需昂贵仪器检测系统的黄曲霉毒素定量、快速、可靠的芯片即时检测新方法。大大拓宽食品安全领域的检测能力与应用范围。
本发明针对食源性生物毒素的危害，开展构建油-水界面的黄曲霉毒素的快速、灵敏、高选择性的即时检测方法研究，基于微流控芯片和磁珠富集技术，在油相-水相之间构建一个超双亲分子组装体系中间层(双亲膜相)，黄曲霉毒素进入双亲膜相，被膜相的固定化抗体/核酸适体识别捕获、富集，然后在水相中进行检测，从而将前处理与检测功能集成为一体，实现快速、灵敏、高选择性的信号响应。
附图说明
图1是本发明所述纳米捕获器件的工作原理图。
图2是实施例2的标准工作曲线和样品检测数据结果图。
图3是实施例3的标准工作曲线和样品检测数据结果图。
图4是实施例4的标准工作曲线和样品检测数据结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：纳米捕获器件的制备
称取100mg羧基纳米磁珠于EP管中，加入400μl去离子水和100μl无水乙醇洗涤，离心后用移液枪吸弃上清液，重复上述步骤3遍。用相同的方法，加入400μl无水丙酮洗涤3遍，使磁珠处在无水的环境中。在此磁珠中加入10ml无水丙酮和1.5g偶联剂羰基二米唑(CDI)，放在旋涡混合器上反应1小时，使得磁珠载体上修饰上咪唑基团即得到CDI活化的磁珠。将CDI活化的磁珠与抗体偶联的氨基-β-环糊精(或四氨基苯基卟啉(TAPP)、或氨基苯并-18-冠醚-6)1.5g反应12小时(4℃，260r/min)；用洗涤缓冲液洗涤磁珠，加入1％牛血清白蛋白(BSA)封闭磁珠载体上其它活性位点，反应12小时，即得到本发明的纳米捕获器件。
实施例2：花生油中黄曲霉毒的检测
取花生油1.00ml，往里面加入10.0mg实施例1制备得到的纳米捕获器件，充分搅拌后，通过磁分离设备将纳米捕获器件从样品中分离出来。分离出的纳米捕获器件加入200μl、0.1μM的HRP标记的黄曲霉毒素AFB1核酸适体溶液中，反应10min。采用酶联免疫方法在酶标仪上进行测定。通过标准加入工作曲线法，其线性范围为5.00-550nM，检测下限为1.4nM，标准曲线见图2。样品即花生油的测量值为62.8nM(见图2)，图2为标准工作曲线和样品检测数据结果图。标准值为66.0nM，相对误差为-4.8％。
可以看出，采用本发明的方法，快速，准确度高，灵敏，相对误差为-4.8％。
实施例3：酱油中黄曲霉毒的检测
取酱油1.00ml，往里面加入10.0mg实施例1制备得到的纳米捕获器件，充分搅拌后，通过磁分离设备将纳米捕获器件从样品中分离出来。分离出的纳米捕获器件加入200μl、0.1μM的HRP标记的黄曲霉毒素AFB1核酸适体溶液中，反应10min。采用酶联免疫方法在酶标仪上进行测定。通过标准加入工作曲线法，其线性范围为5.00-500nM，检测下限为1.9nM，标准曲线见图3。样品即酱油的测量值为87.6nM(见图3)，图3为标准工作曲线和样品检测数据结果图。标准值为80.0nM，相对误差为+9.5％。
可以看出，采用本发明的方法，快速，准确度高，灵敏，相对误差为+9.5％。
实施例4：液态奶中黄曲霉毒的检测
取液态奶1.00ml，往里面加入10.0mg实施例1制备得到的纳米捕获器件，充分搅拌后，通过磁分离设备将纳米捕获器件从样品中分离出来。分离出的纳米捕获器件加入200μl、0.1μM的HRP标记的黄曲霉毒素AFB1核酸适体溶液中，反应10min。采用酶联免疫方法在酶标仪上进行测定。通过标准加入工作曲线法，其线性范围为5.00-500nM，检测下限为1.7nM，标准曲线见图4。样品即液态奶的测量值为53.9nM(见图4)，图4为标准工作曲线和样品检测数据结果图。标准值为50.0nM，相对误差为+7.8％。可以看出，采用本发明的方法，快速，准确度高，灵敏，相对误差为+7.8％。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (14)

1.一种纳米捕获器件，其特征在于，以环糊精、卟啉、冠醚为主体分子，利用其的活性基团将其修饰到纳米磁珠表面，并在主体分子的亲水基端固定化核酸适体或抗体；
以所述环糊精、卟啉、冠醚为主体分子，构建主客体相互作用的超双亲分子组装体，将其修饰到纳米磁珠表面，并在主体分子的亲水基端固定化核酸适体/抗体作为捕获探针；
所述纳米捕获器件，在油相介质中，其疏水端朝外与油相相溶，连接上探针的亲水端收缩朝内、面向磁珠表面，形成亲水环境的微囊腔，在微囊腔中探针保持活性位点的识别能力。
2.如权利要求1所述纳米捕获器件，其特征在于，制备方法为，将羧基纳米磁珠用去离子水和无水乙醇洗涤，再用无水丙酮洗涤后使磁珠处在无水的环境中；再加入无水丙酮和偶联剂，于旋涡混合器上反应后得到活化的磁珠；将活化的磁珠与抗体偶联的环糊精或卟啉或冠醚分子反应过夜；再用洗涤缓冲液洗涤磁珠后加入封闭液封闭磁珠载体上其它活性位点，反应12小时，即得到所述纳米捕获器件。
3.如权利要求2所述纳米捕获器件，其特征在于，所述羧基纳米磁珠，活化步骤用的无水丙酮，偶联剂，抗体偶联的环糊精或卟啉或冠醚分子的用量比为10mg:1ml:150mg:150mg。
4.如权利要求2所述纳米捕获器件，其特征在于，制备方法为，将羧基纳米磁珠用去离子水和无水乙醇洗涤，离心弃上清，重复上述步骤1-5遍；用相同的方法，加入无水丙酮洗涤1-5遍，使磁珠处在无水的环境中；在此磁珠中加入无水丙酮和偶联剂羰基二米唑CDI，放在旋涡混合器上反应0.5-2小时，使得磁珠载体上修饰上咪唑基团即得到CDI活化的磁珠；将CDI活化的磁珠与抗体偶联的氨基-环糊精或四氨基苯基卟啉TAPP或氨基苯并-18-冠醚-6反应过夜；用洗涤缓冲液洗涤磁珠，加入1％牛血清白蛋白封闭磁珠载体上其它活性位点，反应过夜，即得到所述纳米捕获器件。
5.如权利要求4所述纳米捕获器件，其特征在于，所述反应过夜的条件为4℃，260r/min。
6.一种权利要求1所述纳米捕获器件的制备方法，其特征在于，将羧基纳米磁珠用去离子水和无水乙醇洗涤，再用无水丙酮洗涤后使磁珠处在无水的环境中；再加入无水丙酮和偶联剂，于旋涡混合器上反应后得到活化的磁珠；将活化的磁珠与抗体偶联的环糊精或卟啉或冠醚分子反应过夜；再用洗涤缓冲液洗涤磁珠后加入封闭液封闭磁珠载体上其它活性位点，反应12小时，即得到所述纳米捕获器件。
7.如权利要求6所述纳米捕获器件的制备方法，其特征在于，所述羧基纳米磁珠，活化步骤用的无水丙酮，偶联剂，抗体偶联的环糊精或卟啉或冠醚分子的用量比为10mg:1ml:150mg:150mg。
8.如权利要求6所述纳米捕获器件的制备方法，其特征在于，将羧基纳米磁珠用去离子水和无水乙醇洗涤，离心弃上清，重复上述步骤1-5遍；用相同的方法，加入无水丙酮洗涤1-5遍，使磁珠处在无水的环境中；在此磁珠中加入无水丙酮和偶联剂羰基二米唑CDI，放在旋涡混合器上反应0.5-2小时，使得磁珠载体上修饰上咪唑基团即得到CDI活化的磁珠；将CDI活化的磁珠与抗体偶联的氨基-环糊精或四氨基苯基卟啉TAPP或氨基苯并-18-冠醚-6反应过夜；用洗涤缓冲液洗涤磁珠，加入1％牛血清白蛋白封闭磁珠载体上其它活性位点，反应过夜，即得到所述纳米捕获器件。
9.如权利要求8所述纳米捕获器件的制备方法，其特征在于，所述反应过夜的条件为4℃，260r/min。
10.一种权利要求1-5任一项所述纳米捕获器件用于检测黄曲霉毒素的用途。
11.如权利要求10所述纳米捕获器件用于检测黄曲霉毒素的用途，其特征在于，用于检测液体样品中黄曲霉毒素的用途。
12.如权利要求11所述纳米捕获器件用于检测黄曲霉毒素的用途，其特征在于，所述液体样品为油类、酱类或液态奶。
13.如权利要求10所述纳米捕获器件用于检测黄曲霉毒素的用途，其特征在于，方法为，将权利要求1-5任一项所述纳米捕获器件加入到检测样品中，充分搅拌后，通过磁分离设备将纳米捕获器件从样品中分离出来；分离出的纳米捕获器件加入HRP标记的黄曲霉毒素AFB1核酸适体溶液中反应；再采用酶联免疫方法在酶标仪上进行测定即可。
14.如权利要求13所述纳米捕获器件用于检测黄曲霉毒素的用途，其特征在于，检测样品：纳米捕获器件的用量比例为1ml：10.0mg。
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