CN112226415A - 一种提高稳转细胞株细胞池形成率的方法 - Google Patents

一种提高稳转细胞株细胞池形成率的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种提高稳转细胞株细胞池形成率的方法，在三维混合培养基条件下，提供合适的细胞接种密度及MSX加压浓度，使其在短时间内能得到较多的阳性率高的细胞池。所述的三维混合培养基由三种基础培养基CD Fusion，CHO Cloning Medium，GrowthA按比例组成。本发明提供的方法能够显著提高细胞池克隆率，显著降低筛选周期，具有较好的实际应用意义。

Description

一种提高稳转细胞株细胞池形成率的方法
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种提高稳转细胞株细胞池形成率的方法。
背景技术
随着生物技术的发展，抗体、疫苗的表达和生产在生物制药中占据着重要地位，细胞株筛选可获得稳定高产的细胞株，稳转细胞株的构建是表达抗体疫苗的重要手段之一。目前细胞株筛选流程主要为：构建表达质粒，宿主细胞转染，细胞池加压筛选，单克隆筛选，获得高表达细胞株。
Merck的CHO-K1表达系统，在细胞筛选时时添加谷氨酸合成酶(glutaminesythetase，GS)抑制剂氨基亚砜蛋氨酸(methionine sulfoximine，MSX)，使GS基因及与之相连的目的基因一起扩增，达到提高目的基因表达水平的目的。从而大大提高了转染的效率和阳性克隆的筛选率。评估高表达细胞株的主要指标有蛋白表达量、蛋白质质量、细胞稳定性，这些指标与筛选出的细胞池密切相关。
常规细胞池筛选方法为宿主细胞转入质粒后，进行多轮加压筛选，经过漫长的加压筛选后以获得高表达细胞池。目前CHO-K1存在着细胞池筛选生长缓慢，克隆形成率低，阳性率低等问题，这严重的影响了稳转细胞株筛选的进程。因此如何利用工艺提高稳转细胞株细胞池的克隆率，缩短筛选时间，提高筛选通量，是亟需解决的问题。
中国专利201910831248.5中公开了一种NDUFS3基因敲低和/或过表达的稳转株及其构建方法，其中通过将目的基因导入细胞株，采用8-10μg/mL嘌呤霉素对转染后的细胞株进行至少一次筛选，得到NDUFS3基因敲低和/或过表达的稳转株。该方法方法操作简单、用时短、转染率高，但更适用于NDUFS3基因敲低和/或过表达的A875细胞、A375细胞和/或SK-MEL-110细胞。
中国专利201610173410.5公开了一种GS表达系统细胞株的高通量筛选方法，其中包括在25-100μM氨基亚砜蛋氨酸加压后，选择细胞活力在25％-35％的细胞池进行单克隆化筛选。其中GS表达系统为携带GS基因的并且GS基因下游插入了外源基因的表达载体转染至NS0细胞或者敲除了GS基因的CHO细胞。但该筛选步骤中选用的是半固体培养基，与细胞悬液混匀时操作不便，有待进一步改进。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种提高稳转细胞株细胞池形成率的方法。首先，本申请优化了培养稳转细胞的培养基，由传统培养基优化为混合三维培养基；其次，本申请优化了包括细胞接种密度及MSX加压浓度在内的培养条件。根据本申请提供的方法，可以显著提高稳转细胞株细胞池的形成率。
一方面，本发明提供了一种用于稳转细胞株培养中细胞池加压筛选的混合三维培养基。
所述的培养基由三种基础培养基CD Fusion，CHO Cloning Medium，GrowthA组成。
所述的培养基为L1-L10中的一种，L1-L10中各基础培养基的组成比例如表1所示。
表1.改良培养基组成成分表
CD Fusion CHO Cloning Medium GrowthA
L1 1 0 0
L2 0.5 0 0.5
L3 0.75 0.25 0
L4 0.5 0.5 0
L5 0.5 0.25 0.25
L6 0.75 0 0.25
L7 0.67 0.165 0.165
L8 0.8 0.1 0.1
L9 0.6 0.3 0.1
L10 0.6 0.1 0.3
在一些实施例中，所述的CD CHO Fusion为EX-CELL® CD CHO Fusion，购自Sigma，货号为24365C；所述的CHO Cloning Medium为ExcellCHO Cloning Medium，购自Sigma，货号为C6366；所述的GrowthA为BalanCD CHO GrowthA，购自Irvine，货号为91128。
优选地，所述的培养基为L3。
优选地，所述的稳转细胞株为CHO-K1。
另一方面，本发明提供了一种提高稳转细胞株细胞池加压筛选时细胞池形成率的方法。
所述的稳转细胞株在细胞池加压筛选时采用前述混合三维培养基进行培养。
所述的培养过程中，培养基筛选压力（MSX）为10-50μM。
所述的培养过程中，铺板细胞密度为5000-20000个/孔。
所述的培养过程中对混合培养基、铺板细胞密度、培养基筛选压力进行DOE设计如表2所示。
表2.混合培养基/铺板细胞密度/培养基筛选压力DOE分组表格
Cells（个/孔） MSX（uM） Basal
1 20000 10 L1
2 5000 25 L1
3 10000 50 L1
4 10000 10 L10
5 5000 25 L10
6 20000 50 L10
7 5000 10 L2
8 10000 25 L2
9 20000 50 L2
10 10000 10 L3
11 20000 25 L3
12 5000 50 L3
13 5000 10 L4
14 10000 25 L4
15 20000 50 L4
16 5000 10 L5
17 10000 25 L5
18 20000 50 L5
19 10000 10 L6
20 20000 25 L6
21 5000 50 L6
22 5000 10 L7
23 20000 25 L7
24 10000 50 L7
25 20000 10 L8
26 10000 25 L8
27 5000 50 L8
28 20000 10 L9
29 5000 25 L9
30 10000 50 L9
优选地，所述的稳转细胞株细胞池加压筛选时的培育条件为L3培养基，MSX压力为25μM，该条件下的铺板细胞密度为20000个/孔。
优选地，所述的稳转细胞株细胞池加压筛选时的培育条件为L3培养基，MSX压力为10μM，该条件下的铺板细胞密度为10000个/孔。
优选地，所述的稳转细胞株细胞池加压筛选时的培育条件为L8培养基，MSX压力为10μM，该条件下的铺板细胞密度为20000个/孔。
优选地，所述的稳转细胞株细胞池加压筛选时的培育条件为L9培养基，MSX压力为10μM，该条件下的铺板细胞密度为20000个/孔。
优选地，所述的稳转细胞株为CHO-K1。
再一方面，本发明提供了一种稳转细胞株的培养方法。
所述的培养方法包括以下步骤：
1)细胞准备：电转前一天，将宿主细胞取样计数后接种于摇瓶中；
2)电染当天：
I、取步骤1中处于对数生长期的宿主细胞计数后，计算每个电转反应所需细胞体积。将细胞悬液以800rpm，4℃离心5min。弃上清，用CD Fusion培养基重悬细胞，加入待转染质粒，吹打混匀，电转体积共800μL，将混合物加入电转杯中并冰浴1min；
II、将CD Fusion培养基加入10cm平皿中，放入培养箱预热；
III、用Bio-rad电转仪进行电转；
IV、电击结束后，将电转后细胞转移至预热的培养基中，置于37℃，5%CO2培养箱中静置培养；
3)电染48h后：
将转染后细胞计数，根据表2所示，每组按对应的细胞密度，对应的培养基将细胞离心重悬后接种于96孔板中，每组接种4块96孔板，培养体积为200μL；
4）培养18天后统计每个培养条件下细胞池的形成率，以汇合度为20%为阳性克隆孔，计算每个条件阳性克隆孔个数。
所述的步骤2）的第III步中，设置点击参数如下：voltage time pulse：300V；capacitance：950μF，4mm进行电击。
优选地，所述的稳转细胞株为CHO-K1。
本发明的有益效果：
1、在稳转细胞培养过程中，单独使用任意单种类基础培养基，在细胞池加压筛选时克隆形成率低，细胞恢复缓慢。本发明利用混料设计，将几种基础培养基按不同比例进行三维混合，能够显著提高细胞池克隆率。
2、CHO-K1 GS（Merck）表达系统通过MSX加压筛选，使用用三维混合改良培养基相比基础优化细胞密度使96孔板中细胞池克隆形成率提升至20.8%，筛选周期显著降低。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 一种稳转细胞株的培养方法
本实施例中：
EX-CELL® CD CHO Fusion购自Sigma，货号为24365C；
ExcellCHO Cloning Medium购自Sigma，货号为C6366；
BalanCD CHO GrowthA购自Irvine，货号为91128。
待转染质粒的空载体为pcGS3，来自Merck；待转染质粒表达Fc融合蛋白。
（1）细胞准备
电转前一天，将宿主细胞CHOZN® CHO K1 cells（购自SAFC）取样计数后，以0.8×106cells/mL细胞密度接种于摇瓶中。
（2）电染
I、取步骤（1）中处于对数生长期的宿主细胞计数后，以1×107cells/transfection计算每个电转反应所需细胞体积。将细胞悬液以800rpm，4℃离心5min；
弃上清，用CD Fusion培养基重悬细胞，加入待转染质粒60μg，吹打混匀，电转体积共800μL，将混合物加入电转杯中并冰浴1min；
II、将10mL CD Fusion培养基加入10cm平皿中，放入培养箱预热；
III、用Bio-rad电转仪进行电转，设置点击参数如下：voltage time pulse：300V；capacitance:950μF，4mm进行电击；
IV、电击结束后，将电转后细胞转移至预热的培养基中，置于37℃，5%CO2培养箱中静置培养。
（3）电染48h后将转染后细胞计数，根据表2所示每组按对应的细胞密度和培养基将细胞离心重悬后接种于96孔板中，每组接种4块96孔板，培养体积为200μL；
培养18天后统计每个培养条件下细胞池的形成率，以汇合度为20%为阳性克隆孔，计算每个条件阳性克隆孔个数。
结果如下表3所示：
表3.96孔板中混料培养基/铺板细胞密度/培养基筛选压力对细胞池克隆形成的影响
RUN Cells MSX Basal 板号 Pool数量 克隆率% 备注
1 20000 10 L1 1 13 13.5
1 20000 10 L1 2 15 15.6
1 20000 10 L1 3 6 6.3
1 20000 10 L1 4 11 11.5
2 5000 25 L1 1 0 0.0
2 5000 25 L1 2 0 0.0
2 5000 25 L1 3 0 0.0
2 5000 25 L1 4 0 0.0
3 10000 50 L1 1 0 0.0
3 10000 50 L1 2 0 0.0
3 10000 50 L1 3 0 0.0
3 10000 50 L1 4 0 0.0
4 10000 10 L10 1 9 9.4
4 10000 10 L10 2 6 6.3
4 10000 10 L10 3 5 5.2 克隆形成小，多
4 10000 10 L10 4 16 16.7 克隆形成小，多
5 5000 25 L10 1 0 0.0
5 5000 25 L10 2 0 0.0
5 5000 25 L10 3 0 0.0
5 5000 25 L10 4 0 0.0
6 20000 50 L10 1 1 1.0
6 20000 50 L10 2 1 1.0
6 20000 50 L10 3 0 0.0
6 20000 50 L10 4 0 0.0
7 5000 10 L2 1 0 0.0
7 5000 10 L2 2 0 0.0
7 5000 10 L2 3 0 0.0
7 5000 10 L2 4 0 0.0
8 10000 25 L2 1 0 0.0
8 10000 25 L2 2 0 0.0
8 10000 25 L2 3 0 0.0
8 10000 25 L2 4 0 0.0
9 20000 50 L2 1 0 0.0
9 20000 50 L2 2 0 0.0
9 20000 50 L2 3 0 0.0
9 20000 50 L2 4 0 0.0
10 10000 10 L3 1 20 20.8 克隆形成小，多
10 10000 10 L3 2 11 11.5
10 10000 10 L3 3 14 14.6
10 10000 10 L3 4 3 3.1 克隆形成小，多
11 20000 25 L3 1 9 9.4
11 20000 25 L3 2 17 17.7
11 20000 25 L3 3 0 0.0 克隆形成小，多
11 20000 25 L3 4 4 4.2 克隆形成小，多
12 5000 50 L3 1 0 0.0
12 5000 50 L3 2 0 0.0
12 5000 50 L3 3 0 0.0
12 5000 50 L3 4 0 0.0
13 5000 10 L4 1 0 0.0
13 5000 10 L4 2 1 1.0
13 5000 10 L4 3 0 0.0
13 5000 10 L4 4 0 0.0
14 10000 25 L4 1 0 0.0
14 10000 25 L4 2 0 0.0
14 10000 25 L4 3 0 0.0
14 10000 25 L4 4 1 1.0
15 20000 50 L4 1 0 0.0
15 20000 50 L4 2 0 0.0
15 20000 50 L4 3 0 0.0
15 20000 50 L4 4 0 0.0
16 5000 10 L5 1 0 0.0
16 5000 10 L5 2 0 0.0
16 5000 10 L5 3 0 0.0
16 5000 10 L5 4 0 0.0
17 10000 25 L5 1 0 0.0
17 10000 25 L5 2 0 0.0
17 10000 25 L5 3 0 0.0
17 10000 25 L5 4 0 0.0
18 20000 50 L5 1 0 0.0
18 20000 50 L5 2 0 0.0
18 20000 50 L5 3 0 0.0
18 20000 50 L5 4 0 0.0
19 10000 10 L6 1 12 12.5 克隆形成小，多
19 10000 10 L6 2 11 11.5
19 10000 10 L6 3 18 18.8
19 10000 10 L6 4 4 4.2 克隆形成小，多
20 20000 25 L6 1 0 0.0
20 20000 25 L6 2 0 0.0
20 20000 25 L6 3 0 0.0
20 20000 25 L6 4 0 0.0
21 5000 50 L6 1 0 0.0
21 5000 50 L6 2 0 0.0
21 5000 50 L6 3 0 0.0
21 5000 50 L6 4 0 0.0
22 5000 10 L7 1 6 0.0 克隆形成小，多
22 5000 10 L7 2 7 7.3
22 5000 10 L7 3 1 1.0
22 5000 10 L7 4 4 4.2
23 20000 25 L7 1 11 11.5
23 20000 25 L7 2 9 0.0 克隆形成小，多
23 20000 25 L7 3 9 9.4
23 20000 25 L7 4 4 4.2
24 10000 50 L7 1 0 0.0
24 10000 50 L7 2 0 0.0
24 10000 50 L7 3 0 0.0
24 10000 50 L7 4 0 0.0
25 20000 10 L8 1 11 0.0 克隆形成小，多
25 20000 10 L8 2 18 0.0 克隆形成小，多
25 20000 10 L8 3 10 10.4
25 20000 10 L8 4 17 17.7
26 10000 25 L8 1 0 0.0
26 10000 25 L8 2 0 0.0
26 10000 25 L8 3 0 0.0
26 10000 25 L8 4 0 0.0
27 5000 50 L8 1 0 0.0
27 5000 50 L8 2 0 0.0
27 5000 50 L8 3 0 0.0
27 5000 50 L8 4 0 0.0
28 20000 10 L9 1 18 18.8
28 20000 10 L9 2 6 6.3
28 20000 10 L9 3 11 11.5
28 20000 10 L9 4 13 13.5
29 5000 25 L9 1 0 0.0
29 5000 25 L9 2 0 0.0
29 5000 25 L9 3 0 0.0
29 5000 25 L9 4 0 0.0
30 10000 50 L9 1 0 0.0
30 10000 50 L9 2 0 0.0
30 10000 50 L9 3 0 0.0
30 10000 50 L9 4 0 0.0
备注：如表3数据所示，96孔板最终统计克隆率是以形成细胞整体团块且团块汇合度＞20%作为统计标准，因此组10-L10-3，10-L10-4，10-L3-1，10-L3-4，25-L3-3，25-L3-4，10-L6-1，10-L6-4，10-L7-1，25-L7-2，10-L8-1，10-L8-2，虽然其细胞生长情况较好，有很多分散的小克隆，但没纳入统计中。
如上表3所示，经培养基混料优化后，使用L3混料配方75%CD Fusion（Sigma，24365C）+25% CHO Cloning Medium（Sigma，C6366）在MSX压力为10μM和25μM时，均有较多阳性克隆形成；MSX压力为10μM时，相比其他基础培养基组或其余混料组，用L3培养基组克隆形成由0提高至20.8%；MSX压力为25μM时，相比其他基础培养基组或其余混料组，用L3培养基组克隆形成由0提高至17.7%。
需要说明的是，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种用于稳转细胞株培养中细胞池加压筛选的混合三维培养基，其特征在于，所述的培养基由三种基础培养基CD Fusion，CHO Cloning Medium，GrowthA组成。
2.根据权利要求1所述的混合三维培养基，其特征在于，所述的培养基为L2-L3、L5-L10中的一种，L2-L3、L5-L10中各基础培养基的组成比例如下：
CD Fusion CHO Cloning Medium GrowthA L2 0.5 0 0.5 L3 0.75 0.25 0 L5 0.5 0.25 0.25 L6 0.75 0 0.25 L7 0.67 0.165 0.165 L8 0.8 0.1 0.1 L9 0.6 0.3 0.1 L10 0.6 0.1 0.3
。
3.根据权利要求2所述的混合三维培养基，其特征在于，所述的培养基为L3。
4.一种提高稳转细胞株细胞池加压筛选时细胞池形成率的方法，其特征在于，所述的稳转细胞株在采用权利要求1-3中任一项所述的混合三维培养基进行培养。
5.根据权利要求4所述的提高稳转细胞株细胞池加压筛选时细胞池形成率的方法，其特征在于，所述的培养过程中，培养基筛选压力为10-50μM。
6.根据权利要求5所述的提高稳转细胞株细胞池加压筛选时细胞池形成率的方法，其特征在于，所述的培养过程中，铺板细胞密度为5000-20000个/孔。
7.根据权利要求6所述的提高稳转细胞株细胞池加压筛选时细胞池形成率的方法，其特征在于，所述的培养过程中对混合培养基、铺板细胞密度、培养基筛选压力进行DOE设计如下：
Cells（个/孔） MSX（μM） Basal 1 20000 10 L1 2 5000 25 L1 3 10000 50 L1 4 10000 10 L10 5 5000 25 L10 6 20000 50 L10 7 5000 10 L2 8 10000 25 L2 9 20000 50 L2 10 10000 10 L3 11 20000 25 L3 12 5000 50 L3 13 5000 10 L4 14 10000 25 L4 15 20000 50 L4 16 5000 10 L5 17 10000 25 L5 18 20000 50 L5 19 10000 10 L6 20 20000 25 L6 21 5000 50 L6 22 5000 10 L7 23 20000 25 L7 24 10000 50 L7 25 20000 10 L8 26 10000 25 L8 27 5000 50 L8 28 20000 10 L9 29 5000 25 L9 30 10000 50 L9
。
8.根据权利要求7所述的提高稳转细胞株细胞池加压筛选时细胞池形成率的方法，其特征在于，所述的培养过程中混合培养基为L3，铺板细胞密度为10000或20000个/孔，培养基筛选压力为10或25μM。
9.一种稳转细胞株的培养方法，其特征在于，所述的培养方法包括以下步骤：
1)细胞准备：电转前一天，将宿主细胞取样计数后接种于摇瓶中；
2)电染当天：
I、取步骤1中处于对数生长期的宿主细胞计数后，计算每个电转反应所需细胞体积；
将细胞悬液以800rpm，4℃离心5min；
弃上清，用CD Fusion培养基重悬细胞，加入待转染质粒，吹打混匀，电转体积共800μL，将混合物加入电转杯中并冰浴1min；
II、将CD Fusion培养基加入10cm平皿中，放入培养箱预热；
III、用Bio-rad电转仪进行电转；
IV、电击结束后，将电转后细胞转移至预热的培养基中，置于37℃，5%CO2培养箱中静置培养；
3)电染48h后：
将转染后细胞计数，根据权利要求7所示的DOE设计，每组按对应的细胞密度，对应的培养基将细胞离心重悬后接种于96孔板中，每组接种4块96孔板，培养体积为200μL；
4)培养18天后统计每个培养条件下细胞池的形成率，以汇合度为20%为阳性克隆孔，计算每个条件阳性克隆孔个数。
10.根据权利要求9所述的培养方法，其特征在于，所述的步骤2）的第III步中电转仪设置点击参数：voltage time pulse：300V；capacitance：950μF，4mm进行电击。
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