CN111363743A - Scd基因敲除的猪胎儿成纤维细胞系及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供SCD基因敲除的猪胎儿成纤维细胞系及其构建方法。利用CRISPR/Cas9系统编辑猪SCD基因，打靶位点位于SCD基因第二外显子，可以有效地敲除SCD基因，得到SCD基因敲除猪胎儿成纤维细胞，该敲除细胞可用于制备SCD基因敲除猪以及深入研究SCD基因对猪脂肪沉积的影响，为阐明猪脂肪代谢机制提供理论基础，亦为提高猪肉产量提供分子依据。

Description

SCD基因敲除的猪胎儿成纤维细胞系及其构建方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及SCD基因敲除的猪胎儿成纤维细胞系及其构建方法。
背景技术
硬脂酰辅酶A去饱和酶(Stearoyl-CoAdesaturase,SCD)是一种微粒体膜结合蛋白，是调控脂肪合成过程中的关键酶，它是位于内质网上的一种跨膜蛋白，能催化饱和脂肪酸(Saturated Fatty Acid,SFA)形成单不饱和脂肪酸(Monounsaturated Fatty Acid,MUFA)，主要作用是调节脂肪的从头合成以及催化棕榈酸和硬脂酸生成棕榈油酸和油酸。这一过程是通过一系列微粒体电子传递催化的，脂肪酸与NAD(P)H，经过细胞色素b5还原酶和细胞色素b5两个电子的氧化作用，失去H2O引入氢键，即在第9位和第10位碳原子引入双键，催化SFA成为MUFA。目前为止，已经鉴定出很多物种的SCD基因，包括大鼠、小鼠、仓鼠、绵羊、山羊、牛、猪和人。猪的SCD基因有2个亚型(SCD1和SCD5)，SCD1主要在皮下脂肪中表达，SCD5是在大脑中表达量较高。SCD的表达受发育、饮食、激素和环境调节，调控因子如固醇调节元件结合蛋白1(sterol regulatory element-binding protein-1c,SREBP-1c)，肝X受体(liver X receptor,LXR)，碳水化合物反应元件结合蛋白(carbohydrate responseelement-binding protein，CHREBP)对SCD基因的表达起到正向调控作用。SCD参与MUFA的生成，能够影响细胞膜流动性、脂质代谢，SCD活性的变化会改变SFA和MUFA的平衡。SCD还与一些慢性疾病的发生发展有关，如肥胖、癌症、糖尿病、动脉粥样硬化和高血脂症等。
基因编辑技术是现代生物研究领域的重要技术。成簇的、规律间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)作为一种精确的分子工具可以进行定点基因组修饰，与之前的技术相比具有突变效率高、操作简单、成本低等特点，能够开发功能基因组发展的无限潜能。该技术可以有效的编辑真核生物基因组，并用于诱导多种修饰包括碱基定点插入/删除、基因敲入、靶基因等位基因引入突变、删除小DNA片段，能够准确的对果蝇、酵母菌、小鼠、人体细胞、大鼠、斑马鱼和水稻进行基因修饰。其工作原理是，外源DNA的前间隔序列整合入宿主基因组中5’末端两个重复序列之间，CRISPR转录得到前体非编码RNA(pre-cursor non-coding RNA,pre-crRNA)，随后长链pre-crRNA变为短链crRNA，短链crRNA与tracrRNA结合形成二级结构，与Cas9蛋白组成复合物，根据预先设计好的特定基因的单向导RNA(single guide RNA，sgRNA)序列，识别靶基因的间隔区序列邻近基序(Protospacer Adjacent Motif,PAM)，以实现在特异位点剪切双链DNA，触发体内修复机制，通过非同源末端重组(Non-Homologous End Joining,NHEJ)修复方式可能出现小片段的插入或缺失产生移码突变，从而实现目的基因的敲除。
发明内容
本发明的目的是提供SCD基因敲除的猪胎儿成纤维细胞系及其构建方法。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种基于CRISPR/Cas9技术特异靶向猪SCD基因的sgRNA，sgRNA作用位点的核酸序列分别如SEQ ID NO:1和4所示。
第二方面，本发明提供猪SCD基因打靶载体，所述打靶载体是基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体，sgRNA作用位点位于猪SCD基因的2号外显子上，sgRNA作用位点的核酸序列分别如SEQ ID NO:1和4所示。
前述的打靶载体，其是将编码sgRNA的双链DNA序列分别构建到含有U6启动子和Cas9蛋白的载体上得到的。
优选地，骨架载体为Cas9/gRNA(puro-GFP)Vector(No.VK001-02，购自北京唯尚立德生物科技有限公司)。
第三方面，本发明提供所述打靶载体在制备SCD基因敲除的猪胎儿成纤维细胞系中的应用。
第四方面，本发明提供CRISPR/Cas9介导的SCD基因敲除的猪胎儿成纤维细胞系的构建方法，其是根据猪SCD基因序列，设计并合成靶向猪SCD基因的sgRNA，然后构建含有所述sgRNA的CRISPR/Cas9打靶载体，转入(优选电转染)猪胎儿成纤维细胞中，获得SCD基因敲除的猪胎儿成纤维细胞；
其中，sgRNA作用位点位于猪SCD基因的2号外显子上，sgRNA作用位点的核酸序列分别如SEQ ID NO:1和4所示。
第五方面，本发明提供SCD基因敲除的猪胎儿成纤维细胞系，用所述猪SCD基因打靶载体转染(优选电转染)猪胎儿成纤维细胞，获得的中靶阳性细胞克隆，即为SCD基因敲除的猪胎儿成纤维细胞系。
第六方面，本发明提供用于鉴定所述SCD基因敲除的猪胎儿成纤维细胞系的特异性PCR引物，引物序列如SEQ ID NO:5-6和SEQ ID NO:7-8所示。
第七方面，本发明提供所述猪SCD基因打靶载体、或所述SCD基因敲除的猪胎儿成纤维细胞系在制备SCD基因敲除转基因猪中的应用。
第八方面，本发明提供靶向编辑猪SCD基因的CRISPR/Cas9系统在调控细胞中脂肪合成的关键转录因子(包括SREBP-1C、PPARG和C/EBPA)、脂合成相关基因(包括FASN、ELVOL6、FADS2、DGAT1、DGAT2、FABP4和ACACA)以及甘油三酯和游离脂肪酸含量中的应用，其中，所述调控为脂合成的关键转录因子和脂合成相关基因表达量降低，甘油三酯和游离脂肪酸含量降低。
所述CRISPR/Cas9系统中靶向猪SCD基因的sgRNA，其作用位点的核酸序列分别如SEQ ID NO:1和4所示。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
(一)本发明提供SCD基因敲除猪胎儿成纤维细胞株制备的方法，避免引入外源基因，基因组上形成移码突变，得到稳定的猪SCD基因敲除细胞株。
(二)利用本方法获得的纯合的SCD基因敲除细胞株，可用于SCD基因敲除猪的制备，为阐明猪脂肪代谢机制提供理论基础，亦为提高猪肉产量提供分子依据。
(三)本发明根据sgRNA的作用位点，将若干候选sgRNA两两组合，分别共转染猪胎儿成纤维细胞，提高了SCD基因的敲除效率。
附图说明
图1为本发明猪SCD基因结构示意图。其中，以猪SCD基因为模板，打靶位点在第二外显子。灰色底纹标记的碱基为4个sgRNA的序列。F和R为验证sgRNAs是否发挥作用的特异性引物(SEQ ID NO:5-6)。SCDKO-GT-large-F和SCDKO-GT-large-R为扩增长片段的引物(SEQ ID NO:7-8)。
图2为本发明实施例1中sgRNA组合切割猪SCD基因组的鉴定示意图。其中，A：4个sgRNA两两组合，一共分为3组，PCR鉴定sgRNA1和sgRNA4共转染猪胎儿成纤维细胞发挥作用，使得第二外显子缺失140bp。B：SCD基因敲除猪胎儿成纤维细胞的鉴定示意图，其中，sgRNA1和sgRNA4组合共转染猪胎儿成纤维细胞，48h后进行细胞流式分选，将单细胞接种到96孔板。待细胞长满后传代得到猪成纤维细胞克隆20株。WT表示野生型，NC表示阴性对照。PCR鉴定和测序验证，筛选出5株单克隆细胞两条染色体均发生突变分别是#3、#6、#9、#16和#20。
图3为本发明实施例1中Cas9/sgRNA1和Cas9/sgRNA4的敲除效率鉴定结果。
图4为本发明实施例1中#9号细胞株序列信息，经测序鉴定#9号单克隆细胞株为SCD基因敲除细胞株。
图5为本发明实施例1中#9号细胞株的QPCR验证示意图。其中，WT为野生型细胞，#9为9号细胞株。
图6为本发明实施例1中敲除SCD基因后，猪胎儿成纤维细胞转分化为脂肪细胞受阻。其中，A：诱导野生型猪胎儿成纤维细胞和敲除SCD基因猪胎儿成纤维分化为脂肪细胞，油红O结果表明SCD基因敲除后，敲除细胞几乎没有脂滴，说明猪胎儿成纤维细胞分化为脂肪细胞效率非常低。B：细胞分化前后Western blot检测结果，敲除细胞在分化后未检测到SCD蛋白的表达。C：细胞分化后QPCR检测结果，在分化后，敲除细胞中调控脂肪合成的关键转录因子与脂肪合成相关基因的表达量显著降低。D和E：甘油三酯和游离脂肪酸含量的检测，结果显示，敲除细胞中甘油三酯和游离脂肪酸的含量均显著低于野生型细胞。
具体实施方式
本发明提供一种基于CRISPR/Cas9技术制备SCD基因敲除猪胎儿成纤维细胞的方法，利用CRISPR/Cas9系统编辑猪SCD基因，打靶位点位于SCD基因第二外显子，可以有效地敲除SCD基因，得到SCD基因敲除猪胎儿成纤维细胞，该敲除细胞可用于制备SCD基因敲除猪以及深入研究SCD基因对猪脂肪沉积的影响。
本发明提供一种利用CRISPR/Cas9技术敲除猪SCD基因的方法，包括：
1)根据猪SCD基因序列(NCBI No.NC_010456.5)，利用在线网站设计4个sgRNA，将4个sgRNA分别插入含有U6启动子和Cas9蛋白的载体上，构建含有sgRNA的CRISPR/Cas9打靶载体(Cas9/gRNA(puro-GFP)Vector)。
2)设计包含第二外显子的PCR引物，扩增产物长度为403bp。将4个sgRNA两两组合，使序列发生移码突变，得到3个组合，分别是sgRNA1和sgRNA2，sgRNA1和sgRNA4，sgRNA2和sgRNA3。
3)用步骤1)得到的质粒按照步骤2)的组合方式共转染猪胎儿成纤维细胞，提取细胞DNA，用特异性引物进行PCR扩增(SEQ ID NO:5-6)，确定第二组sgRNA1和sgRNA4同时转染发挥作用，使得第二外显子缺失140bp。缺失后片段长度为263bp。
4)用步骤3)确定好的sgRNA组合(sgRNA1和sgRNA4)共转染猪胎儿成纤维细胞(巴马猪胎儿成纤维细胞)，48h后进行流式分选，将得到的单个细胞分选到96孔板中，进行细胞培养，待细胞长满传代，共得到猪胎儿成纤维单克隆细胞20株，收集细胞DNA，PCR鉴定和测序分析。在测序分析单克隆细胞株，为防止出现大片段缺失情况，设计包含第二外显子在内的扩增长片段引物(SEQ ID NO:7-8)，扩增产物长度为1686bp。
测序分析后，鉴定出#9号为纯合的SCD基因敲除细胞株，SCD基因序列上Cas9/sgRNA1和Cas9/sgRNA4识别位点之间有1bp插入，140bp缺失。QPCR结果显示#9号细胞株中几乎检测不到SCD基因的表达。
5)诱导分化野生型猪胎儿成纤维细胞和步骤4)得到的SCD基因敲除细胞株，油红O检测结果发现，SCD基因敲除后猪胎儿成纤维细胞分化为脂肪细胞的效率非常低。Westernblot结果表明敲除细胞株在分化前后均检测不到SCD蛋白的表达，QPCR结果显示敲除细胞株中调控脂肪合成的关键转录因子(SREBP-1C、PPARG和C/EBPA)与脂合成相关基因(FASN、ELVOL6、FADS2、DGAT1、DGAT2、FABP4和ACACA)的表达量要显著低于野生型细胞。此外，敲除细胞中甘油三酯和游离脂肪酸的含量均显著低于野生型细胞。
在本发明的一个具体实施方案中，步骤1)所述的4个sgRNA是针对猪SCD基因第二外显子设计的：优选地，所述4个sgRNA序列分别是：
sgRNA1：5’-GGAGAAGACTCCCCAATACGTGG-3’(SEQ ID NO:1)
sgRNA2：5’-CATCTATGACCCAACCTACCAGG-3’(SEQ ID NO:2)
sgRNA3：5’-GGCCCAAGCTTGAATATGTTTGG-3’(SEQ ID NO:3)
sgRNA4：5’-TACACTTGGGAGCCCTGTATGGG-3’(SEQ ID NO:4)
本发明中，步骤2)所述的包括SCD基因第二外显子在内的特异性引物(SEQ ID NO:5-6)，上游引物：5’-GAAGTGGCCCCTAGTGTCTC-3’，下游引物：5’-TCCCAGGTTCTCTCCACTCT-3’。步骤3)所述是用电转染方式将sgRNA组合共转染猪胎儿成纤维细胞。
本发明中，步骤4)所述的流式细胞仪分选方法如下，连有sgRNA的Cas9/gRNA(puro-GFP)Vector载体带有GFP，通过流式分选仪可将带有GFP的单细胞分选到96孔细胞培养板中，待细胞长满后传代，通过PCR扩增和测序来鉴定基因型。为防止出现长片段缺失现象，设计扩增长片段引物(SEQ ID NO:7-8)，上游引物：5’-CACTGCCAGCTCTAGCCTTT-3’，下游引物：5’-GGCTCCACTATCAGCCCAAG-3’，扩增产物长度为1686bp。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
实施例1利用CRISPR/Cas9技术制备SCD基因敲除猪胎儿成纤维细胞
一、根据猪SCD基因设计sgRNA以及SCD基因敲除载体的制备
1、根据猪SCD基因序列(NCBI No.NC_010456.5)，打靶位点作用于SCD基因第二外显子，利用在线网站http://crispr.mit.edu/设计4个sgRNA，4个sgRNA的序列分别如SEQID NO:1-4所示。猪SCD基因结构示意图见图1。
SCD基因敲除载体的构建依据spCas91.1/gRNA构建试剂盒(No.VK001-02，购自北京唯尚立德生物科技有限公司)提供的方法，设计合成引物，按照试剂盒的要求需要在sgRNA序列5’端添加额外的碱基，同时去掉PAM序列，引物序列如下：
sgRNA1-F：5’-AAACACCGGGAGAAGACTCCCCAATACG-3’
sgRNA1-R：5’-CTCTAAAACCGTATTGGGGAGTCTTCTCC-3’
sgRNA2-F：5’-AAACACCGCATCTATGACCCAACCTACC-3’
sgRNA2-R：5’-CTCTAAAACGGTAGGTTGGGTCATAGATG-3’
sgRNA3-F：5’-AAACACCGGGCCCAAGCTTGAATATGTT-3’
sgRNA3-R：5’-CTCTAAAACAACATATTCAAGCTTGGGCC-3’
sgRNA4-F：5’-AAACACCGTACACTTGGGAGCCCTGTAT-3’
sgRNA4-R：5’-CTCTAAAACATACAGGGCTCCCAAGTGTA-3’
oligo二聚体的形成，反应体系如下：
Figure BDA0002388110640000061
混匀，95℃，3min，自然冷却至室温。
将上述步骤得到的oligo二聚体插入含有U6启动子和Cas9蛋白的载体Cas9/gRNA(puro-GFP)Vector(No.VK001-02，购自北京唯尚立德生物科技有限公司)上，构建含有sgRNA的CRISPR/Cas9打靶载体，反应体系及反应条件如下：
Figure BDA0002388110640000062
充分混匀后，放入PCR仪中，25℃，5min。
取上述产物5μL加入50μL DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min，42℃热激30s，立即于冰上静置2min。加入500μL LB培养基，放入37℃恒温箱中，200rpm，摇60min。取200μL涂于氨苄抗性的平板。12h后，挑取7个单克隆菌落摇菌，用试剂盒提供的引物测序。
二、猪SCD基因敲除猪胎儿成纤维细胞的制备，具体过程如下：
按上述步骤构建好sgRNA的CRISPR/Cas9打靶载体(Cas9/gRNA(puro-GFP)Vector)，为验证4个sgRNA是否发挥作用，设计包含第二外显子的PCR引物，产物长度为403bp，引物序列如SEQ ID NO:5和6所示。将4个sgRNA两两组合，根据切割位点，得到3个组合，分别是sgRNA1和sgRNA2，sgRNA1和sgRNA4，sgRNA2和sgRNA3。
复苏巴马猪胎儿成纤维细胞，将细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴锅中融化，等待的过程不停晃动冻存管。2min后将细胞悬液加入10mL培养基(DMEM高糖培养基+20％FBS+1％双抗)(购自Gibco公司)中重悬细胞，混匀细胞后转入100mm培养皿，置于37℃，5％CO2培养箱中培养，待传代的细胞长至80％时准备转染。
在转染之前先在6孔板中加入1.5mL培养基，置于培养箱中平衡。取出待转染细胞，用1×DPBS(购自Corning公司)洗细胞，吸弃1×DPBS加入1mL 0.25％胰蛋白酶(购自Gibco公司)，37℃消化2min，加入含有血清的培养基终止消化，用细胞悬液做细胞计数，确保每组细胞量在0.5×104-2×104个细胞，经过细胞计数每组细胞量为1.32×106个，1000rpm，离心5min。实验分为4组，第一组为空载，第二组为sgRNA1和sgRNA2，第三组为sgRNA1和sgRNA4，第四组为sgRNA2和sgRNA3。在离心过程中配制电转液，每组100μL电转液(82μL solution+18μL supplement，VPI-1002，购自Lonza公司)。用10μL电转液重悬质粒(质粒量为8μg)，90μL重悬细胞，将两者一起混匀后转至电转杯中，置于电转仪(Lonza 2b)中选择U-023程序。用500μL培养基重悬细胞后加入6孔板中。48h后，用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况，表达丰富可以提取细胞DNA，用特异性引物进行PCR扩增和序列测序，发现sgRNA1和sgRNA4共转染发挥作用，使得第二外显子缺失140bp，缺失后片段长度为263bp(图2，A)。
将确定好的sgRNA1和sgRNA4组合按照上述方法共转染猪胎儿成纤维细胞，48h后观察细胞，发现绿色荧光蛋白表达量丰富，可进行流式细胞术进行细胞分选。用0.25％胰蛋白酶消化细胞，1000rpm，离心5min去上清，用培养基重悬细胞。用100μm细胞筛网(购自Falcon公司)过滤细胞，细胞悬液转至流式管(购自Falcon公司)中，放入流式细胞仪中，将表达绿色荧光蛋白的单细胞分选到96孔板中，一共得到5个96孔板。继续培养细胞，4-5d换液，将有细胞的孔单独标出，长满后传至48孔板，48孔长满传至24孔板。待24孔板长满传至6孔板，此时分出一点细胞用于DNA提取，特异性引物扩增鉴定基因型。
单克隆细胞长满后，收集细胞提取DNA，用扩增长片段引物(SEQ ID NO:7-8)进行PCR扩增，反应条件为：95℃，5min，1个循环；95℃，30s，60℃，30s，72℃，90s，34个循环；72℃，10min，1个循环，所用试剂为2×Permix Taq(购自Takara公司)。PCR产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，野生型长度为1686bp，在得到的20个单克隆细胞株中，鉴定出#9号细胞株为纯合的SCD基因敲除细胞株(图2，B)。
第三组Cas9/sgRNA1和Cas9/sgRNA4的敲除效率鉴定结果见图3。#9号细胞株序列信息见图4。#9号细胞株的QPCR验证结果见图5。
三、SCD基因敲除后对脂肪细胞分化的影响
诱导分化野生型细胞和SCD基因敲除细胞，油红O结果表明，SCD基因敲除后猪胎儿成纤维细胞分化为脂肪细胞的效率非常低(图6，A)。Western blot证明敲除细胞在分化前后均检测不到SCD蛋白的表达(图6，B)。QPCR结果表明敲除细胞中调控脂肪合成的关键转录因子与脂肪合成相关基因的表达量显著降低(图6，C)。敲除SCD基因后细胞中甘油三酯和游离脂肪的含量显著降低(图6，D；图6，E)。
细胞中甘油三酯含量的检测，按照试剂盒说明书提供的方法进行操作(试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司)。先用0.25％的胰酶消化细胞，将细胞收集到1.5mL离心管中，加入800μL裂解液，用移液枪混匀后室温静置10min。静置后取30μL上清液到新的离心管中。70℃加热10min，200rpm离心5min。R1和R2按4:1比例配置工作液。将标准品倍比稀释，浓度如下：250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125和0μmol/L。在96孔板中加入标准品、样品或蒸馏水10μL，工作液190μL，37℃孵育15min，用酶标仪检测(波长550nm)读取OD值。以蛋白浓度校正甘油三酯含量，蛋白浓度测定试剂盒购自Thermo公司。
细胞中游离脂肪酸的检测，按照试剂盒说明书的方法进行测定(试剂盒购自Wako公司)。将Color Reagent A和Color Reagent B按照说明书的方法配置为工作液，制备标准品，将标准品倍比稀释，浓度如下：2mEq/L、1.5mEq/L、0.5mEq/L和0mEq/L。在96孔板中每个孔加入4μL标准品、蒸馏水和样品，接着加入80μL Color Reagent A，混匀后37℃孵育10min，再加入160μL Color Reagent B，混匀后37℃孵育10min，酶标仪读取OD值(波长550nm)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
<120> SCD基因敲除的猪胎儿成纤维细胞系及其构建方法
<130> KHP201110425.6
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggagaagact ccccaatacg tgg 23
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catctatgac ccaacctacc agg 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggcccaagct tgaatatgtt tgg 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tacacttggg agccctgtat ggg 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaagtggccc ctagtgtctc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcccaggttc tctccactct 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cactgccagc tctagccttt 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggctccacta tcagcccaag 20

Claims (10)

1.基于CRISPR/Cas9技术特异靶向猪SCD基因的sgRNA，其特征在于，sgRNA作用位点的核酸序列分别如SEQ ID NO:1和4所示。
2.猪SCD基因打靶载体，其特征在于，所述打靶载体是基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA表达载体，sgRNA作用位点位于猪SCD基因的2号外显子上，sgRNA作用位点的核酸序列分别如SEQ ID NO:1和4所示。
3.根据权利要求2所述的打靶载体，其特征在于，其是将编码sgRNA的双链DNA序列分别构建到含有U6启动子和Cas9蛋白的载体上得到的；
优选地，骨架载体为Cas9/gRNA(puro-GFP)Vector。
4.权利要求2或3所述打靶载体在制备SCD基因敲除的猪胎儿成纤维细胞系中的应用。
5.CRISPR/Cas9介导的SCD基因敲除的猪胎儿成纤维细胞系的构建方法，其特征在于，其是根据猪SCD基因序列，设计并合成靶向猪SCD基因的sgRNA，然后构建含有所述sgRNA的CRISPR/Cas9打靶载体，转入猪胎儿成纤维细胞中，获得SCD基因敲除的猪胎儿成纤维细胞；
其中，sgRNA作用位点位于猪SCD基因的2号外显子上，sgRNA作用位点的核酸序列分别如SEQ ID NO:1和4所示。
6.SCD基因敲除的猪胎儿成纤维细胞系，其特征在于，用权利要求2或3所述打靶载体转染猪胎儿成纤维细胞，获得的中靶阳性细胞克隆，即为SCD基因敲除的猪胎儿成纤维细胞系。
7.用于鉴定权利要求6所述细胞系的特异性PCR引物，其特征在于，引物序列如SEQ IDNO:5-6和SEQ ID NO:7-8所示。
8.权利要求2或3所述打靶载体、或权利要求6所述细胞系在制备SCD基因敲除转基因猪中的应用。
9.靶向编辑猪SCD基因的CRISPR/Cas9系统在调控细胞中脂肪合成的关键转录因子、脂合成相关基因以及甘油三酯和游离脂肪酸含量中的应用，其中，所述调控为脂合成的关键转录因子和脂合成相关基因表达量降低，甘油三酯和游离脂肪酸含量降低；
所述CRISPR/Cas9系统中靶向猪SCD基因的sgRNA，其作用位点的核酸序列分别如SEQID NO:1和4所示。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述脂肪合成的关键转录因子选自SREBP-1C、PPARG和C/EBPA；和/或
所述脂合成相关基因选自FASN、ELVOL6、FADS2、DGAT1、DGAT2、FABP4和ACACA。
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