CN112220792A - 石胆酸用于制备缓解肝纤维化的药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及胆汁酸中的石胆酸(LCA)通过与肠道菌群相互作用，维持肝脏免疫稳态抑制炎症缓解肝脏纤维化的用途，即石胆酸用于制备缓解肝纤维化的药物中的应用。具体的，用CCl4造的小鼠药物性肝炎模型中，LCA具有减少肝脏中NKT细胞数目，降低TNF‑a浓度，抑制肝脏炎症，最终缓解肝脏纤维化的进展的作用。当用抗生素杀死小鼠肠道中共生菌后，LCA的抑炎症反应反而减弱。LCA在肝脏炎症中的作用是由肠道微生物介导的。胆汁酸‑微生态‑肝脏疾病三角将可能有助于炎性肝脏疾病的研究和治疗。

Description

石胆酸用于制备缓解肝纤维化的药物中的应用
技术领域
本发明涉及胆汁酸中的石胆酸(LCA)通过与肠道菌群相互作用，维持肝脏免疫稳态抑 制炎症缓解肝脏纤维化的用途，即石胆酸用于制备缓解肝纤维化的药物中的应用。
背景技术
胆汁酸在肝脏中经由细胞色素P450介导的胆固醇的氧化而合成，包括经典和替代途径。 在肝脏中，胆汁酸主要通过甘氨酸和牛磺酸耦合，然后再通过胆盐输出泵(bilesalt export pump,BSEP)运送到胆囊中储存。同时，肝脏也能通过磺基转移酶和UDP-葡糖醛酸转移酶作 用生成磺酸化和葡糖醛酸化的胆汁酸，然后再与甘氨酸和牛磺酸耦合，通过多药耐药相关蛋 白2(MRP2)转运并分泌到胆囊中。在小肠中，耦合形式的胆汁酸被胆酸盐水解酶BSH水解变 成游离形式的胆汁酸，紧接着又通过7-α脱羟基作用生成次级胆汁酸。胆酸(CA)和鹅脱氧 胆酸(CDCA)分别转化为脱氧胆酸(DCA)和LCA。参与胆汁酸代谢的主要肠道菌群包括具 有解耦合作用的拟杆菌，梭菌，乳酸杆菌，双歧杆菌和李斯特菌；Bacteroides、Eubacterium、 Clostridium、Escherichia、Eggerthella、Eubacterium、Peptostreptococcus和Ruminococcus能 使C3，C7和C12的羟基氧化和差向异构化；梭菌和真细菌具有7-脱羟基作用；拟杆菌，真 细菌和乳酸杆菌具有酯化作用；梭菌，梭杆菌，球菌和假单胞菌具有脱硫作用。游离胆汁酸 可以消除细胞膜内外的酸碱度差异。最终导致质子泵驱动的生物能量消失，从而对细胞膜造 成直接损害。通过这种方式，胆汁酸抑制某些细菌的生长，参与肠道微生物的组成。
代谢系统和免疫细胞之间的相互作用在炎性疾病中发挥重要作用。胆汁酸主要通过激活 FXR和TGR5受体发挥生物学作用，改善代谢综合征和控制炎症，而LCA是TGR5的最强天然 激动剂。已有数据证明胆汁酸可以通过TGR5-cAMP-PKA轴抑制NLRP3炎症小体的激活。TGR5 胆汁酸受体诱导的PKA激酶活化导致NLRP3泛素化，而NLRP3泛素化与pka诱导NLRP3在一个单独的残基Ser291磷酸化。更重要的是,这种PKA诱导的NLRP3的磷酸化是NLRP3炎症小体激活的关键制动点。此外,活体实验结果显示胆汁酸和TGR5激活可以阻断NLRP3炎症小体依赖性炎症，包括脂多糖诱导的全身炎症、alum诱导的腹膜炎症和2型糖尿病相关炎症。
肝脏纤维化是继发于肝脏炎症或损伤后组织修复过程中的代偿反应，最终可发展为肝硬 化甚至肝癌。有研究表明，抑制肝脏炎症肝脏纤维化可发生逆转，而LCA具有抑制肝脏炎症 的功能。鉴于肝脏-微生态轴在多种炎症疾病中的重要作用以及LCA与肠道菌群的密切关系。 通过肠道-胆汁酸-肝脏轴调节肝脏炎症性疾病是缓解肝脏纤维化的一个重要治疗靶点。
发明内容
本发明解决的技术问题是，提供石胆酸的新用途，即一种调节肠道微生态和石胆酸肝脏 浓度来抑制肝脏炎症及缓解肝脏纤维化的方法。
石胆酸用于制备缓解肝纤维化的药物中的应用。
石胆酸用于制备抑制肝脏炎症的药物中的应用。
本发明的技术方案是，利用肠道微生态-胆汁酸-肝脏三角，通过口服石胆酸并与肠道共 生菌相互作用，调节肝脏免疫细胞及炎症因子分泌降低肝脏炎症水平，缓解肝脏纤维化的作 用。
本发明的有益效果是，LCA能够调节肝纤维化小鼠的肠道微生态，降低杜氏杆菌的相对 丰度，增加益生菌乳酸杆菌及拟杆菌的肠道相对丰度。同时LCA抑制肝脏中NKT细胞活化， 减少TNF-a分泌，缓解肝脏纤维化。
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本发明涉及肠道菌群通过石胆酸抑制炎症缓解肝脏纤维化的用途。具体的，用CCl4造的小 鼠药物性肝炎模型中，LCA具有减少肝脏中NKT细胞数目，降低TNF-a浓度，抑制肝脏炎症， 最终缓解肝脏纤维化的进展的作用。当用抗生素杀死小鼠肠道中共生菌后，LCA的抑炎症反 应反而减弱。LCA在肝脏炎症中的作用是由肠道微生物介导的。胆汁酸-微生态-肝脏疾病三 角将可能有助于炎性肝脏疾病的研究和治疗。
附图说明
图1各组小鼠ALT和AST表达差异。*为与一组比较p<0.05，#为与四组比较p<0.05；ALT谷 丙转氨酶、AST谷草转氨酶；一组空白对照组、二组四氯化碳模型组、三组抗生素处理模型 干预组、四组模型干预组。
图2为各组小鼠肝脏组织的Masson染色结果。*为与一组比较p<0.05，#为与四组比较p<0.05； CVF胶原容积分数；一组空白对照组、二组四氯化碳模型组、三组抗生素处理模型干预组、 四组模型干预组。
图3各组肝脏纤维化指标RNA表达水平。*为与一组比较p<0.05，#为与二组比较p<0.05；Collagen I I型胶原酶、CollagenIII III型胶原酶、a-SMA平滑肌肌动蛋白、Timp-1组织金属 蛋白酶1、MMP-2基质金属蛋白酶2；一组空白对照组、二组四氯化碳模型组、三组抗生素 处理模型干预组、四组模型干预组。
图4为各组小鼠肝脏中NKT细胞的百分比及各组小鼠血液中TNF-a浓度差异。*为与一组比 较p<0.05，#为与四组比较p<0.05；NKT自然杀伤T细胞、TNF-a肿瘤坏死因子；一组空白对 照组、二组四氯化碳模型组、三组抗生素处理模型干预组、四组模型干预组。
图5各组小鼠不同菌群相对丰度。与一组比较p<0.05，#为与四组比较p<0.05；con空白对 照组、CCl4四氯化碳模型组、CCl4+LCA+VA抗生素处理模型干预组、CCl4+LCA模型干预组。
具体实施方式
通过下面具体的实施例可以更容易的了解本发明的内容，本发明的保护范围不局限于下述特 定的具体实施方案。
实施例1 LCA可以抑制肝脏炎症缓解肝脏纤维化
实验方法
取小鼠40只，随机分为4组，每组10只。
1组：每周生理盐水腹腔注射两次，去离子水灌胃两次；
2组：四氯化碳模型组(CCl4)：橄榄油1：4，1ul/g剂量每给小鼠每周腹腔注射两次。去离子水每周灌胃两次；
3组：抗生素处理模型干预组(CCl4+LCA+VA)：橄榄油1：4，1ul/g剂量每给小鼠每周腹腔注射两次，LCA以1mg/15g剂量每周给小鼠灌胃2次。用抗生素(万古霉素0.5g/L+氨 苄西林1g/L即VA)杀灭小鼠肠道菌群；
4组：模型干预组(CCl4+LCA)：橄榄油1：4，1ul/g剂量每给小鼠每周腹腔注射两次，LCA以1mg/15g剂量每周给小鼠灌胃2次。
以上各组，持续干预8周。处理前24h收集各组小鼠的新鲜粪便，-80℃冻存。末次给药12h后采血，用酶比色法测定血清中的ATL和AST。留取肝脏组织，做HE染色和Masson 染色。
实验结果：
小鼠长期石胆酸灌胃，其血液中的ALT和AST与正常组小鼠无明显差异，当用抗生素杀 灭肠道菌群，小鼠的ALT和AST明显增高(图2)。肝脏组织经Masson染色后，各组间的肝脏纤维化程度差异也显示LCA具有抗纤维化的作用，但是当消除肠道菌群的协同作用后，LCA 的抗纤维化作用减弱(图3)。用ELISA检测肝脏组织中的纤维化指标CollagenI、CollagenIII、Timp-1、MMP-2和a-SMA的RNA表达量(图4)，结果与上述一致。
实施例2 LCA与肠道菌群相互作用
实验方法：
以上各组，处理前24h收集各组小鼠的新鲜粪便，-80℃冻存。用16sRNA技术检测各组 小鼠间的肠道菌群，并比较各组间的菌群差异。
实验结果：
发现LCA灌胃组小鼠肠道中有害菌杜氏杆菌(Dubosiella)相对丰度降低，益生菌乳酸 杆菌和拟杆菌总的相对丰度增加(图5)。用抗生杀灭肠道共生菌，LCA的抑制肝脏炎症及缓 解纤维化的作用消失。证明肠道微生态-胆汁酸-肝脏三角的相互作用是LCA作用的基石。
实施例3 LCA通过抑制肝脏NKT细胞激活剂降低TNF-a浓度达到抗纤维化作用
实验方法：
留取小鼠新鲜肝脏，制备肝脏单细胞悬液，用流式仪检测肝脏内的免疫细胞：NKT细胞、 NK细胞和巨噬细胞，及小鼠血液中的巨噬细胞。对小鼠的血清进行流式CBA检测。
实验结果：
发现LCA具有抑制NKT细胞活化的作用，而NKT细胞活化表现为肝脏组织中NKT细胞下调，这与NKT细胞激活后特异性抗原丢失有关。抗生素杀灭肠道菌群后，NKT细胞百分比增加。血清中的TNF-a浓度在各组中的变化，与上述结果一致(图5)。

Claims (2)

1.石胆酸用于制备缓解肝纤维化的药物中的应用。
2.石胆酸用于制备抑制肝脏炎症的药物中的应用。
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