CN112220783A - 一种西那卡塞通过nk1r靶点治疗炎性肠病的医药用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种西那卡塞通过NK1R靶点治疗炎性肠病的医药用途。本发明研究发现，西那卡塞在小鼠炎性肠病模型中可以有效抑制葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎，有效缓解模型葡聚糖硫酸钠导致的炎细胞侵润，有效提高模型小鼠的肠壁结构完整性。根据DARTs实验结果，西那卡塞可能通过靶点NK1R发挥上述作用。因此，西那卡塞具有开发成通过NK1R靶点治疗炎性肠病药物的前景。

Description

一种西那卡塞通过NK1R靶点治疗炎性肠病的医药用途
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种西那卡塞通过NK1R靶点治疗炎性肠病的医药用途。
背景技术
炎性肠病(inflammatory bowel disease,IBD)是一组以腹痛、腹泻、黏液脓血便为主要表现的慢性非特异性肠道炎症性疾病，其病因和发病机制均未明确，目前认为该疾病与遗传、免疫、精神应激等因素相关。由于该病迁延难愈，又易转化为结肠癌，因此被世界卫生组织定义为世界难治病之一，发病率为5/10万～12/10万。我国对此病尚无完整的统计，但就临床所见病例而言并非罕见，且有增多趋势。
盐酸西那卡塞(cinacalcet hydrochloride)，化学名为N-[(1R)-1-(1-萘基)乙基]-3-[3-(三氟甲基)苯基]丙基-1-胺盐酸盐，是一种由美国NPS药物公司研发的拟钙剂。该药物通过激活甲状旁腺中的钙离子受体来抑制甲状旁腺激素的分泌，进而增强受体对血流中钙离子的敏感程度，达到降低血清钙离子浓度的作用。盐酸西那卡塞在体内吸收良好，生物利用度高，人服用2～6h后达到最大血药浓度，临床用于治疗因慢性肾脏疾病接受透析而引起的继发性甲状旁腺功能亢进症及甲状旁腺肿瘤患者的高钙血症。2004年，其片剂首次在美国上市，是目前唯一被美国FDA批准用于人体的拟钙剂。
神经激肽1受体(NK1R)是一种在哺乳动物中高度保守的蛋白质，广泛分布在大脑中。NK1R被其高亲和力配体P物质(SP)激活后，参与炎症、疼痛、癌症、感染等多种疾病。
目前未见西那卡塞通过NK1R靶点治疗炎性肠病的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种西那卡塞通过NK1R靶点治疗炎性肠病的医药用途。
本发明上述目的通过如下技术方案实现：
靶点NK1R在开发制备治疗炎性肠病药物方面的应用。
西那卡塞用于制备靶点NK1R结合药物的用途。
西那卡塞用于制备通过NK1R靶点治疗炎性肠病药物的用途。
有益效果：
本发明实验结果表明，西那卡塞在小鼠炎性肠病模型中可以有效抑制葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎，有效缓解模型葡聚糖硫酸钠导致的炎细胞侵润，有效提高模型小鼠的肠壁结构完整性。根据DARTs实验结果，西那卡塞可能通过靶点NK1R发挥上述作用。因此，西那卡塞具有开发成治疗炎性肠病药物的前景。
附图说明
图1为各组小鼠体重变化曲线图；
图2为各组小鼠疾病活动指数评分结果；
图3为各组小鼠结直肠长度测量结果；
图4为各组小鼠结直肠H&E染色结果，其中A为染色图，B为A图的定量结果；
图5为DARTs实验的免疫印迹结果图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
一、实验材料
DMEM(10-017-CV，CORNING)
Fetal Bovine Serum，Austrial(10099141，Gibco)
青链霉素(SV30010，Hyclone)
DSS salt(molecular weight:36000-50000Da,MPBiomedicals)
Plastic feeding tubes,20ga×38mm(T-001，玉研仪器)
AMINOSALICYLIC ACID(5-ASA，HY-15027，MCE)
Cinacalcet(226256，麦克林)
RIPALysis Buffer(abs9228，ABSIN)
BCA试剂盒(23225，PIERCE)
SDS-PAGE Loading Buffer(5×)(BTN81204，百奥莱博)
Pronase from Streptomyces griseus(10165921001，Roche)
NK1R(DF4996，AFFINITY)
GAPDH(ab181602，ABCAM
Affinity ECLkit(KF005，AFFINITY)
二、实验方法
1、炎性肠病模型(IBD模型)复制和分组、给药
取体重相近的8周龄雄性C57BL/6小鼠，随机分为正常组、DSS组(模型组)、西那卡塞组(10mg/kg)和5-ASA组(阳性对照组，50mg/kg)，每组6只。正常组小鼠正常摄食、饮水，DSS组、西那卡塞组和5-ASA组小鼠自由饮用配制的3％葡聚糖硫酸钠(DSS)水溶液，每2天更换一次新配制DSS水溶液。从用3％DSS饮用水开始，每天记录小鼠体重、大便性状以及出血情况，详细评分标准如表1所示。西那卡塞组和5-ASA组每天按照剂量灌胃给药，直到实验结束。疾病活动指数(DieaseActivity Index，DAI)则为体重、大便性状以及出血评分的总和，分数越高，病情越严重。3％DSS饮用水饮用5天后，正常饮水3天，处死小鼠，取结直肠，用游标卡尺测量结直肠长度后固定、石蜡包埋、切片。
表1 DSS诱导IBD模型的评分标准
Figure BDA0002743793910000031
H&E染色肠炎评分标准：肠炎评分由炎细胞侵润和肠壁结构完整性组成，最高6分。炎细胞侵润评分为0无炎症侵润，1炎细胞侵润粘膜，2炎细胞侵润粘膜和粘膜下，3炎细胞侵润整个肠壁。肠壁结构完整性根据上皮细胞的改变进行评分，0分为无炎细胞侵润，结构完整，1分为局部侵润，2分为局部溃疡形成，3分为广泛溃疡形成，形成肉芽组织，或假息肉。
2、药物亲和反应靶点稳定性实验(DARTs)
根据动物模型，西那卡塞有效治疗DSS诱导的肠炎模型，为了找到药物的作用靶点，用生物信息学分析发现，作用靶点为神经激肽-1受体(NK1R)。为了明确西那卡塞与NK1R的结合，用药物亲和反应靶点稳定性实验(DARTs)进行验证。
操作步骤如下：
(1)准备细胞裂解液。种RAW264.7细胞于10cm板中，待细胞长到培养皿面积的90％左右收集细胞，加500μL含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解液，冰上放置10分钟。4摄氏度离心机18000rmp离心10分钟，取上清用BCA法测蛋白浓度；
(2)药物与蛋白裂解液共孵育。用细胞裂解液将蛋白浓度调到5mg/mL，取2个1.5mL离心管，每管中加99μL蛋白裂解液，然后向2管中分别加入1μL DMSO和1μL西那卡塞(10mM)，室温震荡仪上震荡1小时；
(3)加蛋白酶消化蛋白。将与DMSO和西那卡塞分别孵育的细胞裂解液分别分装到4个1.5mL离心管中，每管20μL，做好标记。跟据每管中细胞裂解液的蛋白总量，分别向每管中加蛋白酶，使加蛋白酶的量与细胞裂解液的蛋白总量的比值依次为1:100、1:200、1:400和不加蛋白酶。从向第一管开始加蛋白酶开始计时，与下一管加蛋白酶量的时间间隔为30s，每管中蛋白酶消化蛋白的时间为常温5分钟，然后以30s的时间间隔向每管中加5×上样液，加上样液后立即放于95度温度变性10分钟。
(4)检测药物对蛋白的保护作用。用免疫印迹方法检测目标蛋白NK1R，如果药物组的目标条带灰度高于未加药物组，则药物与目标分子结合，结合后保护分子免被蛋白酶消化。
3、数据统计与分析
所有数据采用SPSS软件和Prism6软件自带统计分析进行统计分析，疾病活动指数评分与体重使用重复测量的方差分析，结直肠长度和组织病理学定量评分用单因素方差分析，P＜0.05为有统计学意义，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。
三、实验结果
1、西那卡塞(cinacalcet)有效治疗葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎模型(DSS-IBD)
实验结果表明，西那卡塞可以有效抑制DSS-IBD小鼠体重降低(如图1所示)，有效减轻DSS-IBD小鼠疾病严重指数(如图2所示)，有效抑制DSS-IBD小鼠结直肠缩短(如图3所示)。H&E染色结果如图4(其中A为染色图，B为A图的定量结果)所示，西那卡塞可以有效缓解DSS导致的炎细胞侵润，有效提高IBD小鼠肠壁结构完整性。
2、西那卡塞治疗DSS-IBD的作用靶点为NK1R
DARTs实验结果如图5所示，该结果显示西那卡塞与NK1R结合后保护NK1R不被蛋白酶消化，说明西那卡塞治疗DSS-IBD的作用靶点为NK1R。
上述实验结果表明，西那卡塞在小鼠炎性肠病模型中可以有效抑制葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎，有效缓解模型葡聚糖硫酸钠导致的炎细胞侵润，有效提高模型小鼠的肠壁结构完整性。根据DARTs实验结果，西那卡塞可能通过靶点NK1R发挥上述作用。因此，西那卡塞具有开发成治疗炎性肠病药物的前景。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。

Claims (3)

1.靶点NK1R在开发制备治疗炎性肠病药物方面的应用。
2.西那卡塞用于制备靶点NK1R结合药物的用途。
3.西那卡塞用于制备通过NK1R靶点治疗炎性肠病药物的用途。
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