CN112209875B - 一种6-氨基-4-(4-苯氧基苯乙基氨基)喹唑啉衍生物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，尤其涉及6‑氨基‑4‑(4‑苯氧基苯乙基氨基)喹唑啉（QNZ）衍生物及其制备方法和应用。本发明通过在喹唑啉母环的6位引入倒置氰基丙烯酰胺的结构单元，构建了一系列基于与胞内巯基蛋白可逆的共价加成反应打破癌细胞内的氧化还原平衡，进而杀死癌细胞的QNZ类活性化合物。通过这种可逆的反应有望改善活性化合物与靶点在体内的接触时间，从而提高药效和选择性。本发明、在人结肠癌细胞SW620中的IC50值只有74 nM（作用48 h）,而在正常细胞株中的IC50值接近30μM,具有较优的增殖抑制活性和选择性。本发明通过后续机制研究发现QNZ‑C通过促进胞内ROS生成将细胞周期阻滞在G2/M期进而诱导细胞凋亡。

Description

一种6-氨基-4-(4-苯氧基苯乙基氨基)喹唑啉衍生物及其制 备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及6-氨基-4-(4-苯氧基苯乙基氨基)喹唑啉(QNZ)衍生物及其制备方法和应用。

背景介绍

喹唑啉杂环是很多药物结构中重要的核心骨架，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等非常广谱的生理活性。近年来在基于喹唑啉骨架的药物优化设计工作中也发现了很多具有促氧化作用的喹唑啉类抗癌先导化合物。其中，6-氨基-4-(4-苯氧基苯乙基氨基)喹唑啉QNZ，由于其优异的NF-κB抑制活性而成为明星分子，最近的研究发现它同时具有抑制癌细胞增殖的活性,其化学结构式如下：

值得注意的是，基于ROS调控的癌症治疗药物中，有很多都具有Michael受体单元(ɑ,β-不饱和羰基结构单元)。Michael反应是Michael.A在1887年改进2，3-二溴丙酸乙酯与丙二酸二乙酯的反应时发现的。近年来，Michael加成反应不仅成为增加碳链的有效手段，而且已成为药物设计的研究热点。2013年，治疗成人复发型多发性硬化症(MS)的口服药富马酸二甲酯的上市，使Michael受体作为药效基团成为轰动。阿法替尼(Afatinib)等第二代EGFR靶向抗肿瘤药物的上市，无疑将基于Michael受体作为药效团的药物设计推上另一个高潮。通常情况下，Michael受体化合物通过巯基的烷基化(共价加成)反应靶向含巯基Michael亲核体，一般来说，Michael受体可以靶向含巯基的反应底物，与其发生共价加成(烷硫基化)反应。已知硫醇与α-氰基-ɑ,β-不饱和羰基化合物的迈克尔加成反应可以在生理pH下快速且可逆地进行。这些分子以可逆的共价方式通过选择性靶向蛋白质半胱氨酸残基表现出独特的生物学特性，避免药物脱靶。由于该反应具有可逆性，因此，通常与蛋白共价结合有关的组织毒性问题可以被最小化。

发明内容

本发明的目的是提供一种6-氨基-4-(4-苯氧基苯乙基氨基)喹唑啉(QNZ)衍生物及其制备方法和应用，该QNZ衍生物具有优异的肿瘤细胞增殖抑制活性并呈现出较好的选择性，具有作为抗癌药物的潜力。

一种6-氨基-4-(4-苯氧基苯乙基氨基)喹唑啉衍生物，结构如式(Ⅰ)所示：

式(Ⅰ)中：

R₁-R₄为羟基、氢或甲氧基。

6-氨基-4-(4-苯氧基苯乙基氨基)喹唑啉衍生物的制备方法，所述制备方法的化学反应式如下：

6-氨基-4-(4-苯氧基苯乙基氨基)喹唑啉衍生物的制备方法，包括如下步骤：

(1)首先将化合物1溶解于四氢呋喃中，并依次加入碳酸氢钠和二碳酸二叔丁酯，于室温下搅拌过夜；反应液过滤后得到浅棕色的化合物2，不再分离纯化，待用；

(2)将化合物2溶解于干燥的乙腈中，并在O₂氛下于室温中依次加入苯基硼酸、吡啶及无水醋酸铜；反应液在35℃下搅拌过夜，旋转蒸发除去溶剂；将得到的固体残渣重新溶于乙酸乙酯，搅拌后过滤，收集滤液，依次用氨水、纯水、盐酸溶液和饱和食盐水洗两次，用无水Na₂SO₄干燥，过滤后旋干；得到的固体粗产物再经过柱层析分离纯化得到化合物3；

(3)将化合物3溶于乙酸乙酯，并于室温下逐滴加入三氟乙酸，然后回流；旋转蒸发除去溶剂后，加入500mL二氯甲烷和200mL水溶解反应残渣，向此两相体系中缓慢加入碳酸钠直至无明显的气泡生成，此时pH≈10；水相用200mL二氯甲烷进行萃取，合并所有有机相，洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤后旋干；得到的固体粗产物再经过柱层析分离纯化得到化合物4；

(4)将化合物4、4-氯-6-硝基喹唑啉及三乙胺溶解于异丙醇，并分别搅拌，过滤得到反应沉淀物，依次用冷的异丙醇/水和异丙醇进行洗涤，真空干燥后得到化合物5；

(5)将化合物5溶解于四氢呋喃中，并在氢气氛下向溶液中添加Pd/C；反应液在室温下搅拌，过滤除去Pd/C，收集滤液并浓缩，得到的固体残余物在乙酸乙酯中进行重结晶，得到产物QNZ；

(6)将QNZ和氰基乙酸溶解于无水二甲基甲酰胺中，在氮气保护下加入EDCI和HCl，室温搅拌过夜；加入乙酸乙酯，继续搅拌40分钟后，过滤，滤饼依次用乙酸乙酯、水/甲醇、少量乙醚洗涤，减压烘干得化合物7；

(7)将化合物7溶解于二氯甲烷和甲醇的混合液中，加入相应的芳香醛化合物和三乙胺，室温搅拌过夜；可直接过滤后柱层析，得式(Ⅰ)所述化合物。

所述步骤(4)中异丙醇与水的质量比为5:1。

所述步骤(6)中水与甲醇的质量比为1:1。

所述步骤(7)中二氯甲烷与甲醇的质量比为10:1。

6-氨基-4-(4-苯氧基苯乙基氨基)喹唑啉衍生物应用于作为抗癌药物。

本发明通过在喹唑啉母环的6位引入倒置氰基丙烯酰胺的结构单元，构建了一系列基于与胞内巯基蛋白可逆的共价加成反应打破癌细胞内的氧化还原平衡，进而杀死癌细胞的QNZ类活性化合物。通过这种可逆的反应有望改善活性化合物与靶点在体内的接触时间，从而提高药效和选择性。本发明通过肿瘤细胞增殖抑制实验筛选出一个抗癌活性优异的6-氨基-4-(4-苯氧基苯乙基氨基)喹唑啉(QNZ)衍生物QNZ-C，其在人结肠癌细胞SW620中的IC50值只有74nM(作用48h),而在正常细胞株中的IC50值接近30μM,具有较优的增殖抑制活性和选择性。本发明通过后续机制研究发现QNZ-C通过促进胞内ROS生成将细胞周期阻滞在G2/M期进而诱导细胞凋亡。

同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

(1)通过在6-氨基-4-(4-苯氧基苯乙基氨基)喹唑啉(QNZ)母环上引入α-氰基-ɑ,β-不饱和羰基，增加了β-C的亲电性，使其非常容易受巯基蛋白硫负离子的亲核进攻，加成中间产物碳负离子可以稳定存在，同时双吸电子基的存在也导致加成终产物的ɑ-C上的氢酸性极强，支持一个快速的消除回传。如此快速的加成反应和快速的消除构建了一个可逆的共价加成反应。通过这种可逆的反应平衡有望改善抑制剂与靶点在体内的接触时间，从而提高药效，增加选择性。(2)通过肿瘤细胞生物活性测试发现，式(I)中芳环R1为羟基取代时活性及选择性最优。

(3)通过相关机制研究，一种6-氨基-4-(4-苯氧基苯乙基氨基)喹唑啉(QNZ)衍生物通过升高ROS水平将肿瘤细胞周期阻滞在G2/M期，进而诱导凋亡。

附图说明

图1为不同浓度的本实施例制备得到的不同化合物(不同QNZ衍生物)作用6h后的ROS水平；

其中图1具有4组不同的浓度组，每个浓度组具有7条矩形表示不同的化合物，从左到右分别为QNZ-C，QNZ-D，QNZ-E，QNZ-F，QNZ-G，QNZ-H和QNZ-I。图2为不同浓度的本实施例制备得到的不同化合物作用9h后的ROS水平；其中图1具有4组不同的浓度组，每个浓度组具有7条矩形表示不同的化合物，从左到右分别为QNZ-C，QNZ-D，QNZ-E，QNZ-F，QNZ-G，QNZ-H和QNZ-I。

图3不同浓度QNZ-C作用24h后SW620细胞周期的分布情况。

图4不同浓度QNZ-C作用48h后SW620细胞凋亡的情况。

具体实施方式

1、化合物的合成

1)QNZ的制备

(4-羟基苯乙基)氨基甲酸叔丁酯tert-butyl(4-hydroxyphenethyl)carbamate(化合物2)

首先将4-(2-氨基乙基)苯酚4-(2-aminoethyl)phenol(1，0.15mol)溶解于200mL四氢呋喃中，并依次加入碳酸氢钠(0.3mol)和二碳酸二叔丁酯(0.165mol)，于室温下搅拌过夜。反应液过滤后得到浅棕色的粗产物2，不再分离纯化，待用。

(4-苯氧基苯乙基)氨基甲酸叔丁酯tert-butyl(4-phenoxyphenethyl)carbamate(化合物3)

将化合物2(0.15mol)溶解于400mL干燥的乙腈中，并在O₂氛下于室温中依次加入苯基硼酸(0.225mol)、吡啶(1.5mol)及无水醋酸铜(0.15mol)。反应液在35℃下搅拌过夜，旋转蒸发除去溶剂。将得到的固体残渣重新溶于500mL乙酸乙酯，搅拌2小时后过滤，收集滤液，依次用氨水(33％，100mL)、纯水(200mL)、盐酸溶液(6N，150mL)和饱和食盐水(50mL)洗两次，用无水Na₂SO₄干燥，过滤后旋干。得到的固体粗产物再经过柱层析(石油醚/乙酸乙酯，100/1至10/1)分离纯化得到白色固体氨基甲酸酯3(产率86.7％)。

2-(4-苯氧基苯基)乙胺2-(4-phenoxyphenyl)ethanamine(化合物4)

将化合物3(0.10mol)溶于60mL乙酸乙酯，并于室温下逐滴加入60mL三氟乙酸，然后回流12小时。旋转蒸发除去溶剂后，加入500mL二氯甲烷和200mL水溶解反应残渣，向此两相体系中缓慢加入碳酸钠直至无明显的气泡生成，此时pH≈10。水相用200mL二氯甲烷进行萃取，合并所有有机相，洗涤(饱和食盐水)，无水Na₂SO₄干燥，过滤后旋干。得到的固体粗产物再经过柱层析(二氯甲烷/甲醇，50/1至30/1)分离纯化得到浅黄色油状产物4(产率91.3％)。

6-硝基-4-(4-苯氧基苯基乙基氨基)喹唑啉6-nitro-4-(4-phenoxyphenylethylamino)quinazolin(化合物5)

将化合物(0.09mol)、4-氯-6-硝基喹唑啉(0.086mol)及三乙胺(0.129mol)溶解于异丙醇，并分别在室温下搅拌4小时，在15℃下搅拌4小时。过滤得到反应沉淀物，依次用冷的异丙醇/水(5/1，100mL)和异丙醇(50mL)进行洗涤，真空干燥后得到黄色结晶状固体硝基喹唑啉5(产率84.8％)。

6-氨基-4-(4-苯氧基苯基乙基氨基)喹唑啉6-amino-4-(4-phenoxyphenylethylamino)quinazoline(QNZ)

将化合物5(0.073mol)溶解于400mL四氢呋喃中，并在氢气氛下向溶液中添加催化量的Pd/C(5％)。反应液在室温下搅拌5小时，过滤除去Pd/C，收集滤液并浓缩，得到的固体残余物在乙酸乙酯中进行重结晶，得到浅黄色粉末状固体，即产物QNZ(产率89.3％)。

2)QNZ衍生物的制备(QNZ-C---QNZ-I)

2-氰基-N-(4-((4-苯氧基苯乙基)氨基)喹唑啉-6-基)乙酰胺2-cyano-N-(4-((4-phenoxyphenethyl)amino)quinazolin-6-yl)acetamide(化合物7)

将QNZ(1.50g，4.21mmol，1eq)和氰基乙酸(3.6g，42.1mmol，10eq)溶解于无水二甲基甲酰胺(20mL)中，在氮气保护下加入EDCI.HCl(2.42g，12.63mmol，3eq)，室温搅拌过夜。加入乙酸乙酯，继续搅拌40分钟后，过滤，滤饼依次用乙酸乙酯(20mL)、水/甲醇(1：1，10mL)、少量乙醚洗涤，减压烘干得氰基乙酰胺7(1.64g，收率92％)。

7：1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ2.998-3.035(t,2H),3.920-3.971(m,2H),4.134(s,2H),6.945-6.966(m,4H),7.112-7.149(t,1H),7.289-7.310(d,2H),7.375-7.415(m,2H),7.962-7.973(m,2H),8.804-8.807(d,1H),8.866(s,1H),10.383(s,1H),11.392(br,1H).

(E)-2-氰基-N-(4-((4-苯氧基苯乙基)氨基)喹唑啉-6-基)-3-苯基丙烯酰胺(E)-2-cyano-N-(4-((4-phenoxyphenethyl)amino)quinazolin-6-yl)-3-phenylacrylamides(QNZ-C～QNZ-I)

将氰基乙酰胺7溶解于二氯甲烷和甲醇(10：1)的混合液中，加入相应的芳香醛化合物(1.2eq)和三乙胺(2eq)，室温搅拌过夜。可直接过滤后柱层析(二氯甲烷/甲醇，50/1)，得相应目标化合物。

QNZ-C：1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ2.950-2.978(t,2H),3.735-3.785(m,2H),6.932-6.963(m,4H),7.078-7.115(t,1H),7.249-7.308(m,3H),7.338-7.378(t,2H),7.574-7.617(m,1H),7.689-7.713(d,1H),7.812-7.831(d,1H),8.260(s,1H),8.432-8.454(d,2H),8.582-8.595(s,1H),9.335(s,1H),13.004(s,1H)；13CNMR(100MHz,DMSO-d6),δ33.81(1C),42.21(1C),111.99(1C),114.98(1C),115.19(1C),118.21(2C),118.46(1C),118.87(2C),119.93(2C),123.09(2C),124.24(1C),126.17(1C),128.34(1C),129.93(2C),130.21(1C),133.37(1C),134.82(1C),135.51(1C),141.81(1C),146.14(1C),153.54(1C),154.22(1C),154.78(1C),155.90(1C),157.01(1C),158.93(1C),159.90(1C).

QNZ-D：1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ2.976-3.012(t,2H),3.788-3.803(m,2H),6.823-7.027(m,6H),7.113-7.149(t,1H),7.305-7.414(m,4H),7.719-7.741(d,1H),7.861-7.880(d,1H),7.983-7.8005(d,2H),8.261(s,1H),8.406(s,1H),8.477-8.520(d,2H),10.498(br,1H)；10.751(br,1H).13C NMR(100MHz,DMSO-d6),δ34.27(1C),42.66(1C),102.15(1C),114.39(1C),115.35(1C),116.84(2C),117.46(1C),118.69(2C),119.28(2C),123.25(1C),123.57(1C),127.99(1C),128.47(1C),130.41(2C),130.68(2C),133.59(2C),135.29(1C),135.73(1C),146.82(1C),151.36(1C),154.88(1C),155.23(1C),157.49(1C),159.51(1C),161.71(1C),162.65(1C).

QNZ-E：1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ2.968(2H),3.755(2H),3.852(s,3H),6.949-7.015(m,5H),7.098(1H),7.277-7.361(m,4H),7.559-7.576(1H),7.700-7.753(d,2H),8.261(m,2H),7.862-7.880(s,1H),8.263(s,1H),8.463-8.511(2H),10.520(br,1H)；13CNMR(100MHz,DMSO-d6),δ34.24(1C),42.71(1C),56.03(1C),102.20(1C),113.75(1C),114.37(1C),115.30(1C),116.49(1C),117.62(1C),118.68(2C),119.28(2C),123.57(1C),123.61(1C),128.06(1C),128.20(1C),130.42(2C),130.69(2C),135.25(1C),135.86(1C),146.39(1C),148.28(1C),151.66(1C),152.30(1C),154.73(1C),155.23(1C),157.48(1C),159.54(1C),161.75(1C).

QNZ-F：1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ3.029-3.054(t,2H),3.858(s,6H),3.956-3.980(t,2H),6.952(m,4H),6.968(s,1H),7.126-7.301(m,2H),7.318-7.324(m,2H),7.392-7.398(m,2H),7.491-7.495(m,1H),7.950-7.969(m,1H),8.190-8.208(d,1H),8.872(s,2H),9.878(d,1H),10.337(s,1H),11.041(br,1H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6),δ33.25(1C),43.1(1C),56.02(1C),101.69(1C),108.71(2C),113.25(1C),114.21(1C),116.98(1C),118.16(2C),118.79(2C),120.69(1C),121.73(2C),123.11(2C),129.77(2C),129.91(1C),130.25(1C),133.82(1C),137.81(2C),141.12(2C),147.86(1C),150.09(1C),151.79(1C),154.93(1C),156.87(1C),159.92(1C),161.61(1C).

QNZ-G：1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ2.498-2.507(t,2H),3.743-3.792(m,2H),3.899(s,3H),3.930(s,3H),6.741-6.803(m,2H),6.931-6.967(m,4H),7.080-7.117(t,1H),7.275-7.296(d,2H),7.342-7.382(m,2H),7.678-7.701(d,1H),7.844-7.872(m,1H),8.185-8.207(d,1H),8.355-8.368(t,1H),8.499(s,1H),8.483-8.488(d,1H),8.515(s,1H),10.471(br,1H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6),δ34.27(1C),42.66(1C),56.32(1C),56.68(1C),98.89(1C),102.90(1C),107.35(1C),113.70(1C),114.67(1C),115.31(1C),117.47(1C),118.68(2C),119.28(2C),123.56(2C),128.15(1C),128.38(1C),130.29(1C),130.40(2C),130.68(2C),135.28(1C),135.68(1C),145.63(1C),146.80(1C),154.88(1C),155.24(1C),157.50(1C),159.52(1C),161.19(1C),161.53(1C),165.49(1C).

QNZ-H：1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ2.946-2.982(t,2H),3.758-3.789(t,2H),3.838(s,3H),3.885(s,3H),6.931-6.965(m,4H),7.083-7.120(m,1H),7.198-7.219(d,1H),7.275-7.296(d,2H),7.345-7.384(m,2H),7.659-7.745(m,3H),7.837-7.859(d,1H),8.287(s,1H),8.382(t,1H),8.447(s,1H),8.498(s,1H),10.539(br,1H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6),δ34.25(1C),42.67(1C),56.95(1C),56.30(1C),103.68(1C),112.36(1C),114.37(1C),115.35(1C),117.39(1C),118.68(2C),119.28(2C),123.57(2C),124.83(1C),126.33(1C),127.93(1C),128.51(1C),130.42(2C),130.69(2C),135.28(1C),135.68(1C),145.84(1C),149.19(1C),151.43(1C),153.26(1C),154.90(1C),155.22(1C),157.48(1C),159.50(1C),161.54(1C).

QNZ-I：1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ2.948-2.985(t,2H),3.760-3.779(t,2H),3.795(s,3H),3.859(s,3H),6.931-6.968(m,4H),7.082-7.119(m,1H),7.276-7.297(d,2H),7.343-7.383(m,2H),7.444(s,2H),7.702-7.724(m,3H),7.835-7.863(m,1H),8.301(s,1H),8.399(t,1H),8.454(s,1H),8.498-8.502(d,1H),10.610(br,1H)；13C NMR(100MHz,DMSO-d6),δ34.25(1C),42.67(1C),56.47(1C),60.79(1C),105.77(1C),108.47(1C),114.46(1C),115.36(1C),117.04(1C),118.67(2C),119.28(2C),123.57(2C),127.45(1C),127.93(1C),128.54(1C),130.41(2C),130.69(2C),135.27(2C),135.55(1C),141.74(1C),146.88(1C),151.55(1C),153.41(2C),154.95(1C),155.22(1C),157.48(1C),159.51(1C),161.20(1C).

2、生物活性测试：

1)本实施例采用MTT法测定了化合物QNZ-C---QNZ-I对不同瘤株的体外抑制作用，结果如下：

将化合物用DMSO溶解稀释，肿瘤细胞SW620(人结肠癌细胞)、A375(黑素瘤细胞)、NCI-H460(人大细胞肺癌细胞)、HepG2(肝癌细胞)和正常细胞HT-22(小鼠海马神经元细胞)、HUVEC(人脐静脉内皮细胞)在96孔板上种入4000个/100μL/孔，每孔加入化合物10μL，共同于37℃、5％CO₂细胞培养箱中孵育48小时(SW620无CO₂条件培养)，以DMSO(0.1％)为空白对照。48小时后，加入终浓度为0.5mg/mL的MTT，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中4小时，之后吸干溶剂，每孔加入100μL DMSO，用酶联免疫仪于570nm处测定吸光度(OD值)，所得数据用于计算IC50值。

不同浓度的受试化合物用96孔板进行粗筛，根据所得的抑制率，计算IC50值，结果见下表：

表1QNZ系列化合物对不同癌细胞和正常细胞的IC50值

SW620

A375

NCI-H460

HepG2

HT-22

HUVEC

QNZ-C

0.074μM

12.7μM

14μM

4.5μM

29.8μM

27.4μM

QNZ-D

1.18μM

>50μM

>200μM

64μM

>50μM

>50μM

QNZ-E

0.594μM

43μM

17μM

16μM

>50μM

40.5μM

QNZ-F

0.594μM

28.8μM

6.6μM

6.5μM

36μM

>50μM

QNZ-G

0.780μM

>50μM

73.5μM

73μM

>50μM

>50μM

QNZ-H

0.676μM

36μM

23.3μM

19μM

41.4μM

39.5μM

QNZ-I

0.967μM

>50μM

67.6μM

88μM

>50μM

>50μM

表1呈现了QNZ衍生物(QNZ-C---QNZ-I)对四种癌细胞和两种正常细胞的IC50值，说明化合物QNZ-C对人结肠癌细胞SW620有优异的肿瘤细胞增殖抑制活性，而对正常细胞(HT-22和HUVEC)增殖抑制活性差，进一步说明QNZ-C能较好地区别正常细胞和癌细胞，呈现出了较好的选择性。

2)化合物刺激后胞内ROS水平的变化：SW620(4×10⁵cells/well)细胞接种于6孔板，培养过夜；更换新鲜完全培养基，分别加入QNZ-C--QNZ-I(0.512μM)作用6h、9h；吸除含药物的培养基，PBS洗涤，胰酶消化，离心收集细胞(350g，5min)，再用PBS洗两遍；将细胞重悬于DHE染液(3.0μM，500μL)，于37℃恒温培养箱避光孵育30min；染色完成后，离心收集细胞(350g，5min)，PBS洗两遍后，再将细胞重悬于500μL PBS中，用流式细胞仪检测荧光强度的变化。

结果如说明书附图：

图1和图2分别呈现了不同浓度(0.5、1、2μM)的化合物作用不同时间(6h、9h)后SW620细胞内ROS的水平，结果显示QNZ-C诱导ROS产生的能力最强，这和表1中呈现的IC50值相吻合，进而说明化合物通过诱导ROS的产生达到抑制肿瘤细胞增殖的效果。

3)细胞周期的测定：将SW620细胞以4×10⁵个/孔的密度接种至六孔板中，细胞培养24小时后换液，加入化合物QNZ-C(0.05μM和0.1μM)孵育24小时，同时设定不加药处理的对照孔。药物处理后吸出培养基，加入胰蛋白酶消化，将细胞收集于2mL离心管中，300g离心6分钟，换PBS以相同转速离心并倒掉上清液，重复两次。用70％的甲醇在4℃下进行细胞固定。过夜后用4℃的PBS洗2次(300g离心7分钟/次)，去掉上清后每管加入500μL提前配制的PI溶液(0.05mg/mL PI，0.1mg/mL RNase A)，混匀后在室温下避光染色30分钟。最后通过FACSCanto流式细胞仪测定细胞周期分布并通过Modfit LT3.0软件进行定量分析。结果如下：

图3呈现了不同浓度QNZ-C(0.050.1μM)作用24后，SW620细胞周期的分布情况，说明QNZ-C可将细胞周期阻滞在G2/M期。

4)细胞凋亡的测定：SW620细胞(2×10⁵cells/mL)接种于6孔板，于5％CO2的37℃培养箱培养24h；更换新鲜培养液，加入不同浓度的QNZ-C孵育48h；去除培养基，用胰酶消化，收集细胞(包括上清液中漂浮细胞)，PBS洗涤两次(350g，9min)；先于每孔加入100μL 1×binding buffer重悬细胞，再每孔均加入5μLPI和5μLAnnexinV-FITC，并将其混匀；室温避光染色15min后加入400μL 1×bindingbuffer，立即用流式细胞仪检测。实验独立重复至少三次。结果如下：

图4呈现的是不同浓度的化合物QNZ-C(0.05、0.1、0.5μM)作用48h后，SW620细胞的凋亡情况。随着QNZ-C浓度的增大，晚凋和坏死的比例明显升高。以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明做出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (6)

1.一种6-氨基-4-(4-苯氧基苯乙基氨基)喹唑啉衍生物，其特征在于，结构如式(Ⅰ)所示：

式(Ⅰ)中：

R₁-R₄为羟基、氢或甲氧基。

2.一种如权利要求1所述6-氨基-4-(4-苯氧基苯乙基氨基)喹唑啉衍生物的制备方法，其特征在于，所述制备方法的化学反应式如下：

3.如权利要求2所述的6-氨基-4-(4-苯氧基苯乙基氨基)喹唑啉衍生物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)首先将化合物1溶解于四氢呋喃中，并依次加入碳酸氢钠和二碳酸二叔丁酯，于室温下搅拌过夜；反应液过滤后得到浅棕色的化合物2，不再分离纯化，待用；

(2)将化合物2溶解于干燥的乙腈中，并在O₂氛下于室温中依次加入苯基硼酸、吡啶及无水醋酸铜；反应液在35℃下搅拌过夜，旋转蒸发除去溶剂；将得到的固体残渣重新溶于乙酸乙酯，搅拌后过滤，收集滤液，依次用氨水、纯水、盐酸溶液和饱和食盐水洗两次，用无水Na₂SO₄干燥，过滤后旋干；得到的固体粗产物再经过柱层析分离纯化得到化合物3；

(3)将化合物3溶于乙酸乙酯，并于室温下逐滴加入三氟乙酸，然后回流；旋转蒸发除去溶剂后，加入500mL二氯甲烷和200mL水溶解反应残渣，向此两相体系中缓慢加入碳酸钠直至无明显的气泡生成，此时pH≈10；水相用200mL二氯甲烷进行萃取，合并所有有机相，洗涤，无水Na₂SO₄干燥，过滤后旋干；得到的固体粗产物再经过柱层析分离纯化得到化合物4；

(4)将化合物4、4-氯-6-硝基喹唑啉及三乙胺溶解于异丙醇，并分别搅拌，过滤得到反应沉淀物，依次用冷的异丙醇/水和异丙醇进行洗涤，真空干燥后得到化合物5；

(5)将化合物5溶解于四氢呋喃中，并在氢气氛下向溶液中添加Pd/C；反应液在室温下搅拌，过滤除去Pd/C，收集滤液并浓缩，得到的固体残余物在乙酸乙酯中进行重结晶，得到产物QNZ；

(6)将QNZ和氰基乙酸溶解于无水二甲基甲酰胺中，在氮气保护下加入EDCI和HCl，室温搅拌过夜；加入乙酸乙酯，继续搅拌40分钟后，过滤，滤饼依次用乙酸乙酯、水/甲醇、少量乙醚洗涤，减压烘干得化合物7；

(7)将化合物7溶解于二氯甲烷和甲醇的混合液中，加入相应的芳香醛化合物和三乙胺，室温搅拌过夜；可直接过滤后柱层析，得式(Ⅰ)所述化合物。

4.如权利要求3所述的6-氨基-4-(4-苯氧基苯乙基氨基)喹唑啉衍生物的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中异丙醇与水的质量比为5:1。

5.如权利要求3所述的6-氨基-4-(4-苯氧基苯乙基氨基)喹唑啉衍生物的制备方法，其特征在于：所述步骤(6)中水与甲醇的质量比为1:1。

6.如权利要求3所述的6-氨基-4-(4-苯氧基苯乙基氨基)喹唑啉衍生物的制备方法，其特征在于：所述步骤(7)中二氯甲烷与甲醇的质量比为10:1。

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