CN112206219B - 葡萄糖敏感型胰岛素给药系统的制备及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及葡萄糖敏感型胰岛素给药系统的制备方法和应用。所述的葡萄糖敏感型胰岛素的给药系统由内核和外层组成，以胰岛素、介孔二氧化硅为内核，以可对不同血糖浓度响应的葡萄糖敏感材料及促进体系跨黏液层吸收的阴离子聚合物为外层。所述的葡萄糖敏感材料选自：4‑甲酰苯硼酸接枝壳聚糖或4‑羧基‑3‑氟苯硼酸接枝壳聚糖；介孔二氧化硅：胰岛素：4‑甲酰苯硼酸接枝壳聚糖或4‑羧基‑3‑氟苯硼酸接枝壳聚糖的质量比为1‑2：0.5‑2：0.5‑2。所述的促进体系跨黏液层吸收的阴离子聚合物选自：磷酸丝氨酸。本发明所制备的葡萄糖敏感型胰岛素口服给药系统的粒径为90‑900nm，载药量可达25％以上，高于普通有机纳米粒给药系统。该系统具有明显的降血糖效果。

Description

葡萄糖敏感型胰岛素给药系统的制备及应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及新型葡萄糖敏感型胰岛素给药系统的制备方法和应用。
背景技术
糖尿病已成为危害人体健康的重要疾病，目前最有效的治疗手段仍为皮下注射胰岛素，但注射这一治疗方法往往存在疼痛、易感染、反复注射部位硬结、发炎等症状，长期注射胰岛素控制血糖时，病人的耐受性以及依从性减弱。相较于注射给药途径，口服给药途径更方便、患者依从性更高，但是在口服过程中由于胃肠道中大量蛋白水解酶的存在，导致胰岛素会被水解成小分子多肽或氨基酸从而失去活性，无法发挥药效。
此外，注射给药时，胰岛素的给药剂量往往仅凭患者经验，无法根据用药当时的血糖水平精确给药，因此给药剂量低时降血糖作用不明显，剂量高时会造成严重的低血糖反应、甚至休克，对患者健康造成严重危害。针对糖尿病治疗目前存在的问题，葡萄糖敏感型胰岛素给药系统因其能够根据血糖浓度变化，自动连续地控制药物释放而备受关注，有望取代常规注射给药途径，成为一种潜在的治疗方法。
基于苯硼酸(PBA)的葡萄糖敏感高分子是一种全合成体系.用于药物的自调式控制释放，具有体系稳定、可长期保存以及可逆葡萄糖响应的优势，成为近年来的研究热点之一。但目前葡萄糖敏感药物控制释放体系给药的精确性仍制约着药物传输体系的临床应用，控制药物载体按需释放药物仍是一大难题，即在糖尿病患者血糖水平高时，快速释放一定量的胰岛素，从而控制血糖浓度在正常水平；而在正常人体血糖浓度时不释放药物从而保持血糖水平稳定而不至过低。
介孔二氧化硅具有以下的优势：1.具有有序的孔道结构、较高的比表面积和孔容积，孔径可调节。这些特性既可实现蛋白药物的吸附装载，还可提高蛋白药物的稳定性。2.表面含有大量硅醇基，易实现功能化修饰，可广泛应用于药物控释、靶向治疗。3.毒性低、具有良好的生物相容性。
综上所述，理想的葡萄糖敏感型胰岛素给药系统应具备载药量高、可装载药物免受胃肠道酶降解，同时既可促进药物跨过黏液屏障，又可克服小肠上皮细胞吸收屏障，在生理条件下实现按需释放药物的功能。开发此种葡萄糖敏感的新型给药系统，对于糖尿病的治疗具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供葡萄糖敏感型胰岛素的给药系统，该系统具备载药量高、可装载药物免受胃肠道酶降解的作用。
本发明通过如下技术方案实现：
所述的葡萄糖敏感型胰岛素的给药系统由内核和外层组成，以胰岛素、介孔二氧化硅为内核，以可对不同血糖浓度响应的葡萄糖敏感材料及促进体系跨黏液层吸收的阴离子聚合物为外层。
所述的葡萄糖敏感材料选自：4-甲酰苯硼酸接枝壳聚糖或4-羧基-3-氟苯硼酸接枝壳聚糖；
介孔二氧化硅：胰岛素：4-甲酰苯硼酸接枝壳聚糖或4-羧基-3-氟苯硼酸接枝壳聚糖的质量比为1-2：0.5-2：0.5-2。
所述的促进体系跨黏液层吸收的阴离子聚合物选自：磷酸丝氨酸。
所述的葡萄糖敏感型胰岛素的给药系统为磷酸丝氨酸包覆的葡萄糖敏感体系或肠溶衣包覆的葡萄糖敏感体系。
本发明所述的两种葡萄糖敏感型胰岛素的给药系统通过如下方法制备：
(一)介孔二氧化硅纳米粒；
(1)在十六烷基三甲基溴化铵的水溶液中滴加正辛烷，搅拌配制形成水包油型乳液；
(2)将苯乙烯单体逐滴加入步骤(1)的体系中；
(3)在氮气保护条件下将赖氨酸，正硅酸乙酯及偶氮二异丁脒盐酸盐依次加入到步骤(2)的体系中；
(4)搅拌反应后将反应液自然冷却至室温，静置后离心分离；
(5)将沉淀物置于马弗炉中煅烧后研磨得到介孔二氧化硅纳米粒；
步骤(1)中十六烷基三甲基溴化铵水溶液的浓度为：1-5mg/mL；正辛烷：十六烷基三甲基溴化铵水溶液的体积比为0.3～0.8。
步骤(2)中苯乙烯与十六烷基三甲基溴化铵的体积比为1：9-1：19。
步骤(3)中正硅酸乙酯：赖氨酸：偶氮二异丁脒盐酸盐：十六烷基三甲基溴化铵的质量比为10：0.1-0.3：0.1-0.5：1。
步骤(4)中反应温度为20-80℃，反应时间为1-6小时。
(二)4-甲酰苯硼酸接枝壳聚糖的聚合物的制备；
在硼氢化钠存在下，将溶解在1％乙酸溶液中的壳聚糖(CTS)与溶解在甲醇中的4-甲酰苯硼酸(FPBA)搅拌反应3-48小时，离心取沉淀用甲醇、乙醇、水洗涤，冷冻干燥后即得4-甲酰苯硼酸接枝壳聚糖的聚合物(FBPA-CTS)；
壳聚糖与4-甲酰苯硼酸的质量比为1：1-8：1，优选为2：1-4：1，反应温度为10-30℃。
壳聚糖的分子量为10-100kD，优选10-50kD，更优选为50kD，脱乙酰度>95％。
(三)4-羧基-3-氟苯硼酸接枝壳聚糖的聚合物的制备；
将4-羧基-3-氟苯硼酸(FCPBA)溶于含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的蒸馏水中，然后将壳聚糖加入上述溶液中，并用盐酸调节溶液的pH，搅拌反应12-80小时超滤离心浓缩后冷冻干燥，即得4-羧基-3-氟苯硼酸接枝壳聚糖的聚合物(FCPBA-CTS)；
壳聚糖与4-羧基-3-氟苯硼酸的质量比为1：1-8：1，优选为2：1-4：1，EDC：NHS比例为1：3，活化羧基时间0.5-2小时，反应液pH值为4-6，反应温度为2-8℃。
壳聚糖的分子量为10-100kD，优选10-50kD，更优选为50kD，脱乙酰度>95％。
(四)葡萄糖敏感型胰岛素的给药系统的制备
将制备的介孔二氧化硅纳米粒、胰岛素与葡萄糖敏感材料4-甲酰苯硼酸接枝壳聚糖或4-羧基-3-氟苯硼酸接枝壳聚糖溶于缓冲液中反应5-24小时，离心获得葡萄糖敏感体系；
介孔二氧化硅：胰岛素：4-甲酰苯硼酸接枝壳聚糖或4-羧基-3-氟苯硼酸接枝壳聚糖的质量比为1-2：0.5-2：0.5-2。
所述的缓冲液为常用的醋酸盐缓冲液或其它缓冲液，其pH值为2-6，反应温度为2-8℃。
将如上制备的葡萄糖敏感体系加入到含有磷酸丝氨酸的缓冲液中，将混合液反应0.25-2小时，离心获得由磷酸丝氨酸包覆的葡萄糖敏感体系；缓冲液的pH值为2-6，磷酸丝氨酸浓度为0.5-2mg/100μL，反应温度为2-8℃。
将如上制备的葡萄糖敏感体系加入到含有尤特奇L100的95％乙醇中，将混合液反应0.25-2小时，并在氮气下吹干即获得由肠溶衣包覆的葡萄糖敏感体系。
反应温度为20-40℃。
本发明所述的胰岛素还可以以双胍类、磺脲类、噻唑烷二酮类降糖药物代替。
具体地，本发明包括如下步骤：
(1)称取CTAB溶于双蒸水中，制成1-5mg/mL水溶液。在20-60℃水浴下，以600rpm的转速搅拌0.5h，使其充分溶解，按照正辛烷/双蒸水的体积比为0.3-0.8的比例，逐滴滴加正辛烷至上述澄清溶液中，连接冷凝回流装置，继续搅拌2h，得到均匀乳液。
(2)向乳液中缓缓滴加苯乙烯单体，其中苯乙烯的体积应占反应液的5％-10％。
(3)在氮气保护下，将赖氨酸，正硅酸乙酯、及偶氮二异丁脒盐酸盐依次添加到反应液中。正硅酸乙酯：赖氨酸：偶氮二异丁脒盐酸盐：CTAB的质量比为10：0.1-0.3：0.1-0.5：1。
(4)于20-80℃搅拌反应1-6小时后，将混悬液自然冷却，静置约10h，加入等体积的无水乙醇，于10000rpm离心8min，并用无水乙醇洗涤沉淀3次。
(5)将沉淀于60℃干燥12h后，于550℃煅烧6h，除去扩孔剂及模板，获得介孔二氧化硅粉末。
(6)按壳聚糖与4-甲酰苯硼酸的质量比为1：1-8：1的比例，在硼氢化钠存在下，将溶解在1％乙酸溶液中的壳聚糖与溶解在甲醇中的4-甲酰苯硼酸反应，将反应于10-30℃，搅拌3-48小时，以10000rpm离心5min并用甲醇、乙醇、水洗涤，将所得4-甲酰苯硼酸接枝壳聚糖的聚合物冷冻干燥，并在2-8℃下储存备用。
(7)按壳聚糖与4-羧基-3-氟苯硼酸的质量比为1：1-8：1，EDC：NHS比例为1：3，将4-羧基-3-氟苯硼酸溶于含有EDC和NHS的蒸馏水中，活化羧基0.5-2小时，然后将壳聚糖加入上述溶液中，并用盐酸调节溶液的pH值至4-6，将反应于2-8℃搅拌12-80小时后用超滤离心管5000rpm离心5min进行浓缩，将所得4-羧基-3-氟苯硼酸接枝壳聚糖的聚合物冷冻干燥，并在2-8℃下储存备用。
(8)按介孔二氧化硅：胰岛素：4-甲酰苯硼酸接枝壳聚糖或4-羧基-3-氟苯硼酸接枝壳聚糖为1-2：0.5-2：0.5-2的质量比溶于醋酸盐缓冲液pH 2-6(优选4.5)，将反应于2-8℃中反应5-24小时，以8000rpm离心3min获得葡萄糖敏感体系。
(9)将制备的葡萄糖敏感体系2mg加入到含有磷酸丝氨酸的缓冲液pH 2-6(优选4.5)中，磷酸丝氨酸浓度为5-20mg/mL，将混合液于2-8℃反应0.25-2小时选，8000rpm离心3min获得磷酸丝氨酸包覆的葡萄糖敏感体系；
(10)将步骤(9)制备的体系加入到含有尤特奇L100的95％乙醇溶液中，于20-40℃反应0.25-2小时，并在氮气下吹干即获得由肠溶衣包覆的葡萄糖敏感体系。
本发明所制备的两种葡萄糖敏感型胰岛素口服给药系统的粒径为90-900nm(优选为300nm-450nm)，电位为-20至+20mv(优选15mV)，载药量可达25％以上，高于普通有机纳米粒给药系统。该系统具有明显的降血糖效果。
附图说明
图1为介孔二氧化硅载体的粒径(n＝3)及孔径测试图；
图2为FPBA-CTS的红外及核磁图；
图3为FCPBA-CTS的红外及核磁图；
图4为载药系统的粒径分布图；
图5为载药系统的Zeta电位图；
图6为载药系统对正常大鼠的降血糖药效图；
图7为载药系统对糖尿病大鼠的降血糖药效图。
具体实施方式
实例1介孔二氧化硅的制备
样品1
称取0.5g CTAB溶于500mL双蒸水中，在80℃水浴下，以600rpm的转速搅拌0.5h，使其充分溶解，将150mL正辛烷逐滴滴加至上述澄清溶液中，连接冷凝回流装置，继续搅拌2h，得到均匀乳液。向乳液中缓缓滴加26mL苯乙烯单体。在氮气保护下，将0.075g赖氨酸，5.0mL正硅酸乙酯、及0.125g偶氮二异丁脒盐酸盐依次添加到反应液中。反应2小时后，将混悬液自然冷却，静置约10h，加入等体积的无水乙醇，于10000rpm离心8min，并用无水乙醇洗涤沉淀3次。将沉淀于60℃干燥12h后，于550℃煅烧6h，除去扩孔剂及模板，获得介孔二氧化硅粉末(MSN)。
样品2
称取0.5g CTAB溶于160mL双蒸水中，在60℃水浴下，以600rpm的转速搅拌0.5h，使其充分溶解，将70mL正辛烷逐滴滴加至上述澄清溶液中，连接冷凝回流装置，继续搅拌2h，得到均匀乳液。向乳液中缓缓滴加18mL苯乙烯单体。在氮气保护下，将0.11g赖氨酸，5.0mL正硅酸乙酯、及0.181g偶氮二异丁脒盐酸盐依次添加到反应液中。反应3小时后，将混悬液自然冷却，静置约10h，加入等体积的无水乙醇，于10000rpm离心8min，并用无水乙醇洗涤沉淀3次。将沉淀于60℃干燥12h后，于550℃煅烧6h，除去扩孔剂及模板，获得介孔二氧化硅粉末(MSN)。
样品3
称取0.5g CTAB溶于100mL双蒸水中，在60℃水浴下，以600rpm的转速搅拌0.5h，使其充分溶解，将30mL正辛烷逐滴滴加至上述澄清溶液中，连接冷凝回流装置，继续搅拌2h，得到均匀乳液。向乳液中缓缓滴加11mL苯乙烯单体。在氮气保护下，将0.15g赖氨酸，5.0mL正硅酸乙酯、及0.25g偶氮二异丁脒盐酸盐依次添加到反应液中。反应4小时后，将混悬液自然冷却，静置约10h，加入等体积的无水乙醇，于10000rpm离心8min，并用无水乙醇洗涤沉淀3次。将沉淀于60℃干燥12h后，于550℃煅烧6h，除去扩孔剂及模板，获得介孔二氧化硅粉末(MSN)，对载体的粒径及孔径测试如附图1，经测定，该样品的粒径为203.1±8.39nm，表面孔道的孔径为10.2nm。
实例2 4-甲酰苯硼酸接枝壳聚糖葡萄糖敏感材料的制备
样品1
称取5mg 4-甲酰苯硼酸溶解于0.5mL甲醇中，称取10mg壳聚糖CTS(10kD)溶解于7mL1％的醋酸溶液中，将两种溶液混合，反应2小时，称取硼氢化钠7.2mg加入上述混合液中，将反应于25℃搅拌反应24小时，以10000rpm离心5min并用甲醇、乙醇、水洗涤，将所得4-甲酰苯硼酸接枝壳聚糖的聚合物冷冻干燥，并在2-8℃下储存备用(FPBA-CTS)。
样品2
称取2.5mg 4-甲酰苯硼酸溶解于0.5mL甲醇中，称取10mg壳聚糖(50kD)溶解于7mL1％的醋酸溶液中，将两种溶液混合，反应2小时，称取硼氢化钠7.2mg加入上述混合液中，将反应于30℃搅拌反应48小时，以10000rpm离心5min并用甲醇、乙醇、水洗涤，将所得4-甲酰苯硼酸接枝壳聚糖的聚合物冷冻干燥，并在2-8℃下储存备用(FPBA-CTS)(FPBA-CTS样品2的核磁及红外图如附图2)。
实例3 4-羧基-3-氟苯硼酸接枝壳聚糖葡萄糖敏感材料的制备
样品1
避光称取9.6mg EDC和17.3mg NHS，充分溶解于1.5mL蒸馏水中，0.5h后加入2mg的4-羧基-3-氟苯硼酸，待充分溶解后加入8mg壳聚糖，用0.01M盐酸调节pH值至4.7，在4℃下搅拌反应72小时，用超滤离心管5000rpm离心5min进行浓缩，将所得4-羧基-3-氟苯硼酸接枝壳聚糖的聚合物冷冻干燥，并在2-8℃下储存备用(FCPBA-CTS)。
样品2
避光称取9.6mg EDC和17.3mg NHS，充分溶解于1.5mL蒸馏水中，0.5h后加入4mg的4-羧基-3-氟苯硼酸，待充分溶解后加入8mg壳聚糖，用0.01M盐酸调节pH值至6，在8℃下搅拌反应24小时，用超滤离心管5000rpm离心5min进行浓缩，将所得4-羧基-3-氟苯硼酸接枝壳聚糖的聚合物冷冻干燥，并在2-8℃下储存备用(FCPBA-CTS)(FCPBA-CTS样品2的核磁及红外图如附图3)。
实例4包覆4-甲酰苯硼酸接枝壳聚糖葡萄糖敏感型递送系统的制备
样品1
称取2mg胰岛素(INS)分散于4mL的醋酸盐缓冲液(pH 4.5)中，于4℃和200rpm下搅拌1h使其完全溶解。加入4mg实例1制备的载体，在此条件下继续搅拌2h。称取4mg实例2中样品1制备的材料加入上述溶液中，200rpm搅拌12h后8000rpm离心3min，取沉淀即得糖敏感型介孔二氧化硅载胰岛素体系。
样品2
称取2mg胰岛素分散于4mL的醋酸盐缓冲液(pH 4.0)中，于4℃和200rpm下搅拌1h使其完全溶解。加入2mg实例1制备的载体，在此条件下继续搅拌2h。称取2mg实例2中样品1制备的材料加入上述溶液中，200rpm搅拌12h后8000rpm离心3min，取沉淀即得糖敏感型介孔二氧化硅载胰岛素体系。
实例5包覆4-羧基-3-氟苯硼酸接枝壳聚糖葡萄糖敏感型递送系统的制备
样品1
称取2mg胰岛素分散于4mL的醋酸盐缓冲液(pH 4.5)中，于4℃和200rpm下搅拌1h使其完全溶解。加入4mg实例1制备的载体，在此条件下继续搅拌2h。称取4mg实例2中样品2制备的材料加入上述溶液中，200rpm搅拌12h后8000rpm离心3min，取沉淀即得糖敏感型介孔二氧化硅载胰岛素体系。
样品2
称取2mg胰岛素分散于4mL的醋酸盐缓冲液(pH 4.0)中，于4℃和200rpm下搅拌1h使其完全溶解。加入2mg实例1制备的载体，在此条件下继续搅拌2h。称取2mg实例2中样品2制备的材料加入上述溶液中，200rpm搅拌12h后8000rpm离心3min，取沉淀即得糖敏感型介孔二氧化硅载胰岛素体系。
实例6磷酸丝氨酸包覆葡萄糖敏感体系的制备
样品1
称取2mg实例4或实例5中制备的样品1，加入到含有磷酸丝氨酸(pho)的pH值为4.5的缓冲液中，磷酸丝氨酸浓度10mg/mL，将混合液于4℃反应0.25小时，8000rpm离心3min获得磷酸丝氨酸包覆的葡萄糖敏感体系。对载药系统的粒径及Zeta电位测试结果如附图4-5。经测定，以实例4样品1制得的体系的粒径为316.5nm，载药量为24.73％；以实例5样品1制得的体系的粒径为374.3nm，载药量为20.29％。
样品2
称取2mg实例4或实例5中制备的样品1，加入到含有磷酸丝氨酸的pH值为4.0的缓冲液中，磷酸丝氨酸浓度5mg/mL，将混合液于4℃反应1小时，8000rpm离心3min获得磷酸丝氨酸包覆的葡萄糖敏感体系。
实例7肠溶衣尤特奇L100包覆葡萄糖敏感体系的制备
样品1
称取2mg实例6中制备的样品1，加入到含有尤特奇L100的95％乙醇中，于30℃反应0.25小时，并在氮气下吹干即获得由肠溶衣包覆的葡萄糖敏感体系。
样品2
称取2mg实例6中制备的样品1，加入到含有尤特奇L100的95％乙醇中，于40℃反应1小时，并在氮气下吹干即获得由肠溶衣包覆的葡萄糖敏感体系。
实例8葡萄糖敏感型递药系统的降血糖效果的考察
选取体重相近的正常(180-220g)SD大鼠30只，每组6只，分成5组，其中一组皮下注射3IU/kg的胰岛素溶液、一组灌胃30IU/kg的胰岛素溶液、一组口服空白载体，余下2组采用灌胃30IU/kg的载胰岛素的载药系统溶液(实例7样品1)，并于特定时间间隔利用血糖仪测定小鼠血糖浓度(实验结果如附图6)。
选取体重相近的(180-220g)SD大鼠，禁食12h后，腹腔注射65mg/kg的链脲佐菌素溶液，给药72h后利用血糖仪测定小鼠血糖浓度。根据造模标准，当血糖浓度大于16.7mmol/L，表明造模成功。选取造模成功的小鼠30只，每组6只，分成5组，其中一组皮下注射3IU/kg的胰岛素溶液、一组灌胃30IU/kg的胰岛素溶液，一组灌胃空白载体溶液，余下2组采用灌胃30IU/kg的载胰岛素的载药系统溶液(实例7样品1)，并于特定时间间隔利用血糖仪测定小鼠血糖浓度(实验结果如附图7)。
结果表明：口服载胰岛素的载药系统组的糖尿病大鼠的血糖同口服胰岛素溶液对照组相比，均有一定程度的降低，6h可分别使大鼠血糖降至26.2％和31.1％，且降糖作用可持续12h。而对于健康大鼠来说，口服载胰岛素的载药系统组的血糖基本没有显著变化。

Claims (7)

1.由肠溶衣包覆的葡萄糖敏感型胰岛素给药系统的制备方法，其特征在于：
（一）介孔二氧化硅纳米粒的制备；
（二）4-甲酰苯硼酸接枝壳聚糖的聚合物的制备；
（三）4-羧基-3-氟苯硼酸接枝壳聚糖的聚合物的制备；
（四）葡萄糖敏感型胰岛素给药系统的制备；
将制备的介孔二氧化硅纳米粒、胰岛素与葡萄糖敏感材料4-甲酰苯硼酸接枝壳聚糖或4-羧基-3-氟苯硼酸接枝壳聚糖溶于缓冲液中反应5-24小时，离心获得葡萄糖敏感体系；介孔二氧化硅：胰岛素：4-甲酰苯硼酸接枝壳聚糖或4-羧基-3-氟苯硼酸接枝壳聚糖的质量比为1-2：0.5-2：0.5-2;
将如上制备的葡萄糖敏感体系加入到含有磷酸丝氨酸的缓冲液中，将混合液反应0.25-2小时，离心获得由磷酸丝氨酸包覆的葡萄糖敏感型胰岛素给药系统；
将如上制备的葡萄糖敏感体系加入到含有尤特奇L100的95%乙醇中，将混合液反应0.25-2小时，并在氮气下吹干即获得由肠溶衣包覆的葡萄糖敏感型胰岛素给药系统。
2.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的介孔二氧化硅纳米粒的制备方法如下：
（1）在十六烷基三甲基溴化铵的水溶液中滴加正辛烷，搅拌配制形成水包油型乳液；
（2）将苯乙烯单体逐滴加入步骤（1）的体系中；
（3）在氮气保护条件下将赖氨酸，正硅酸乙酯及偶氮二异丁脒盐酸盐依次加入到步骤（2）的体系中；
（4）搅拌反应后将反应液自然冷却至室温，静置后离心分离；
（5）将沉淀物置于马弗炉中煅烧后研磨得到介孔二氧化硅纳米粒。
3. 权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
步骤（1）中十六烷基三甲基溴化铵水溶液的浓度为：1-5 mg/mL；正辛烷：十六烷基三
甲基溴化铵水溶液的体积比为0.3～0.8；步骤（4）中反应温度为20-80oC，反应时间为1-6小时。
4.权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
步骤（2）中苯乙烯与十六烷基三甲基溴化铵的体积比为1：9-1：19；
步骤（3）中正硅酸乙酯：赖氨酸：偶氮二异丁脒盐酸盐：十六烷基三甲基溴化铵的质量比为10：0.1-0.3：0.1-0.5：1。
5.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，4-甲酰苯硼酸接枝壳聚糖的聚合物的制备方法如下：
在硼氢化钠存在下，将溶解在1%乙酸溶液中的壳聚糖与溶解在甲醇中的4-甲酰苯硼酸搅拌反应3-48小时即得；壳聚糖与4-甲酰苯硼酸的质量比为1：1-8：1，反应温度为10-30℃。
6.权利要求1所述的制备方法，其特征在于，4-羧基-3-氟苯硼酸接枝壳聚糖的聚合物的制备方法如下；
将4-羧基-3-氟苯硼酸溶于含有1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺的蒸馏水中，然后将壳聚糖加入上述溶液中，并用盐酸调节溶液的pH，搅拌反应12-80小时超滤离心浓缩后冷冻干燥，即得；壳聚糖与4-羧基-3-氟苯硼酸的质量比为1：1-8：1，EDC：NHS比例为1：3，活化羧基时间0.5-2小时，反应液pH值为4-6，反应温度为2-8℃。
7.权利要求1所述的制备方法制备得到的由肠溶衣包覆的葡萄糖敏感型胰岛素给药系统在制备治疗糖尿病药物中的应用。
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