CN102657871B - 一种口服缓释制剂、包载材料及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种口服缓释制剂、包载材料及制备方法。采用海藻酸钠-透明质酸钠混合物作为包载材料；制备的蛋白多肽类药物口服缓释制剂，以质量计，药物的含量为0.5%～10%，海藻酸钠-透明质酸钠混合物的含量为90～99.5%。本发明的口服缓释制剂不仅改变了蛋白多肽类药物的常规给药途径，而且延长了蛋白多肽类药物作用时间，以艾塞那肽口服微球为例，成功维持血糖正常水平达12小时，明显改善糖尿病患者用药的顺应性，提高治疗效果。

Description

一种口服缓释制剂、包载材料及制备方法

技术领域

本发明属于药物制剂领域，涉及口服缓释制剂的制备，尤其涉及以海藻酸钠-透明质酸钠组合为载体的蛋白多肽类药物的口服缓释制剂及其制备和应用。

背景技术

随着生物技术和基因工程的发展，蛋白多肽类药物用于临床治疗呈现上升趋势，但是制备工艺复杂、投递效率低、生物利用度差等原因成为了蛋白多肽类药物临床应用的瓶颈。其中蛋白多肽类药物给药途径问题尤为重要。与注射制剂相比，口服制剂对患者具有更好的顺应性且服用方便，但是蛋白多肽类药物的口服制剂研究困难较大：（1）蛋白多肽类药物的物理和化学性质不稳定易被胃酸降解；（2）蛋白多肽类药物易被胃肠道中各种消化酶分解；（3）蛋白多肽类药物水溶性高、分子量大和透过性低，在胃肠粘膜渗透性低，存在吸收障碍、肝脏首过代谢作用高、生物利用度低等问题。因此蛋白多肽类药物口服制剂的研究一直是科学界的难题和热点。

明胶、壳聚糖、琼脂糖、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、卡波姆、聚乳酸、PLGA（聚乳酸聚乙醇酸共聚物）、聚乙交酯丙交酯等材料常用作口服药物的载体。然而，在多数蛋白多肽类药物的口服制剂研究中，上述口服制剂材料存在许多缺陷：如无法有效的包载蛋白多肽类药物、难以保护药物不被蛋白酶或胃酸破坏、形成微球后药物不易释放等，不适用于蛋白多肽类药物口服制剂的制备。

与上述材料相比，海藻酸钠是一种天然多糖，其具备pH敏感性：在较低的pH环境中微球收缩，在较高的pH肠液中，快速溶解。海藻酸钠具有药物辅料所需的稳定性、溶解性、粘性和安全性，无慢性毒性或致癌性反应，其温和的溶胶过程、良好的生物相容性使海藻酸钠适于作为释放或包埋药物、蛋白与细胞的微胶囊，常用作消炎药、泌尿系统及蛋白类药物口服制剂的包载材料（Journal of Pharmacy Pharmacology，1999, 51: 141-149；Biomaterials，2010，31：9040-9047）。但是，以海藻酸钠为单一材料制备的蛋白类口服制剂的体外试验发现，海藻酸钠虽可有效保护蛋白多肽类药物免遭胃酸及消化酶降解，但是药物在模拟肠液的介质中突释，较短时间即可完全释放，难以起到缓释的作用。

同样具有pH敏感型溶解特征的透明质酸钠是一种水溶性高分子，具有作为药物载体的优良特性：生物相容性、非免疫原性、在体内可由酶催化降解等特性。透明质酸钠已成功应用于组织工程，医学敷料等生物医学领域，临床中常用作鼻腔粘膜给药的载体，较少应用于口服制剂的研究。在蛋白多肽类药物口服制剂材料筛选过程中，申请人单独采用透明质酸作为口服制剂的包裹材料时发现，制备的口服制剂无定形性且水溶性较高，在模拟胃酸环境中快速溶解，无法有效保护蛋白多肽类药物免受胃酸及胃蛋白酶降解。

大量试验结果表明，单一材料难以有效包载蛋白多肽类药物制备口服缓释制剂。以艾塞那肽为例说明如下：

艾塞那肽（Exenatide）是Exendin-4的人工合成物，与哺乳动物的胰高血糖素样肽-1（GLP-1）具有53%的同源性，是有效的GLP-1受体激动剂，具有葡萄糖依赖型控制血糖浓度。其药理作用包括：刺激胰岛素分泌，抑制胰高血糖素分泌；抑制胰岛β细胞凋亡；减缓胃排空，降低食欲。显著改善                                               型糖尿病患者的空腹及餐后血糖水平。

艾塞那肽注射剂已于2005年4月获美国FDA批准上市，商品名为Byetta^?，糖尿病治疗效果明显，且副反应较小，但由于艾塞那肽的半衰期较短，频繁注射使患者顺应性较差。与注射给药相比，口服制剂对患者具有更好的顺应性且服用方便，迄今为止，仅有中国发明专利申请CN102026646A（欧洲专利公开号为NZ589390A）公开了一种用艾塞那肽、鱼油和蛋白酶抑制剂的组合制备的口服制剂，但该口服制剂作用时间过短（仅130分钟），实用性低，已有的报道（Journal of Controlled Release，2009，133：172-177； Biomaterials，2011，32：2673-2682）虽成功制备了艾塞那肽的口服制剂，但是体内降血糖作用持续时间均较短，不能有效维持血糖值在正常水平，且制备方法繁琐。

如胰岛素、牛血清白蛋白（BSA）以及其它蛋白多肽类药物均存在上述问题。

为解决上述问题，发明人采用筛选两种材料的组合的方法寻找适应大多数蛋白多肽类药物口服制剂的研究。在众多材料组合的筛选过程中，根据常规思路，发明人采取“一种pH敏感材料+一种pH不敏感材料”（即海藻酸钠或透明质酸+一种常用口服制剂）的组合方式进行研究，筛选的组合材料均不能有效的达到蛋白多肽类药物口服或缓释的目的。

因此，如何突破常规思路，获得可用于蛋白多肽类药物口服或缓释的包载材料，是本领域急需解决的技术问题。

发明内容

本发明目的是提供一种蛋白多肽类口服缓释制剂，以及用于包载蛋白多肽类药物的包载材料，以解决现有技术中蛋白多肽类口服制剂作用持续时间短的问题；本发明的另一个目的是提供这种口服缓释制剂的制备方法。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种蛋白多肽类口服缓释药物的包载材料，主要由海藻酸钠-透明质酸钠混合物组成，以质量计，海藻酸钠∶透明质酸钠为3∶1～1∶3，海藻酸钠的分子量为32000-250000道尔顿，透明质酸钠的分子量为500000-5000000道尔顿。

一种蛋白多肽类口服缓释制剂，采用上述包载材料制备而成，主要由蛋白多肽类药物、海藻酸钠-透明质酸钠混合物组成，以质量计，药物的含量为0.5%～10%，海藻酸钠-透明质酸钠混合物的含量为90～99.5%。

上述蛋白多肽类口服缓释制剂的制备方法，包括以下步骤：

(a)按上述的含量比配制海藻酸钠-透明质酸钠混合物，溶于水，加入待加载蛋白类药物，制成所述海藻酸钠-透明质酸钠混合物浓度为5～100mg/ml的水相；

(b)在油相中加入乳化剂，将水相与油相在高速搅拌下混合形成乳化液，搅拌速度为200～2000rpm/min，水相与油相体积比为1∶5～1∶50；依靠机械剪切力将粘稠的溶液分散为颗粒均匀的微球；

(c)向步骤(b)获得的乳化液中加入交联剂和催化剂，水相与交联剂体积比为2∶1～1∶4，交联剂与催化剂体积比为2∶1～1∶3；继续搅拌，在20～50℃条件下反应5min～4h；

(d)反应完成后加入有机溶剂洗涤，然后静置分层后弃上层，抽滤得到包载蛋白类药物的微球。

采用有机溶剂洗涤时，可以进行搅拌。

上述技术方案中，由于海藻酸钠及透明质酸钠溶液较为粘稠，可以采用搅拌、超声等操作加速溶解。

所述油相选自二甲基硅油、石油醚、大豆油、液体石蜡或硬脂酸中的一种，优选地，水相与油相体积比为1∶5～1∶25。

所述乳化剂选自聚乙烯醇、油酸钠、硬脂酸钠、十二烷基硫酸钠、羧甲基纤维素、吐温或司盘中的一种或两种的组合物，乳化剂的体积为油相体积的1%～10%。

所述交联剂选自脂肪双酰肼（ADH）、戊二醛（GTA）、三磷酸三钠（STMP）、二乙烯基砜（SVS）或乙二醇缩水甘油醚（EX-810）中的一种。

所述催化剂为盐酸、硫酸、磷酸、乙酸或甲酸中的一种。优选1M盐酸。

所述用于洗涤微球的有机溶剂为甲醇、乙醇、异丙醇、正己烷、石油醚或正庚烷中的一种。

步骤(c)中，反应时间优选为10分钟到2小时。

海藻酸钠及透明质酸钠均有良好的生物相容性及安全性。但是目前，仅有报道（Tissue Engineering Part A，2009，15：3449-3459；Journal of Biomedial Materials Research，1999，44：149-155）和美国发明专利申请公开US20120088832介绍海藻酸钠和透明质酸钠的组合用于组织工程中植入材料和防止外科手术粘连的敷料的研究，国内外尚未有文献或专利报道将海藻酸钠和透明质酸钠组合用于制备蛋白类药物口服制剂的研究。

本发明克服了传统的采取“一种pH敏感材料+一种pH不敏感材料”（即海藻酸钠或透明质酸+一种常用口服制剂）的组合方式的研究模式，采用海藻酸钠和透明质酸两种pH敏感型材料组合作为包载蛋白多肽类药物口服制剂的载体，意外地发现该组合适合于蛋白多肽类药物口服制剂的制备。发明人的研究表明，将海藻酸钠和透明质酸钠进交联，二者交联形成的网络状微球可有效包载药物，且二者的溶解过程均具有pH敏感性，在较低的pH环境中微球收缩，抑制药物释放；在较高的pH肠液中，快速溶解促进药物释放。并且，二者交联后制得的微球载药微球表面孔径较小，溶解速度较慢，延缓了药物的释放，可以达到控释的目的。

此后，通过对这两种pH敏感型材料的组合的进一步筛选，得到这两种材料的最佳组合，所制备的蛋白多肽类药物口服制剂不仅适应胃肠道pH的变化，能保护蛋白类药物不受胃酸和胃肠道蛋白酶破坏，而且还有一定的缓释作用，且透明质酸钠可促进药物的吸收。

研究表明，该方法适合于大部分在胃肠道不稳定的蛋白多肽类和大分子药物的口服制剂的制备，如艾塞那肽、胰高血糖素样肽-1、胰岛素、降钙素、白介素-2（IL-2）、干扰素（IFN）、BSA、葡萄糖氧化酶、天门冬酰胺酶、卵白蛋白等，是一种应用前景十分广泛的口服药物组合，为蛋白多肽类及大分子口服制剂的研究提供了思路及基础。

由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1．本发明提供的蛋白多肽类药物口服缓释微球制剂，不仅改变了蛋白多肽类药物常规给药方式，而且能延长蛋白多肽类药物在体内的作用时间。以艾塞那肽口服药物为例，体内降血糖试验证实一次口服艾塞那肽微球，12小时内可有效维持血糖在正常水平，每天口服两次即可保持

型糖尿病患者血糖值回复正常，与已报道的口服艾塞那肽制剂相比，本发明制备的艾塞那肽微球降血糖作用更持久。

2．本发明采用的载体材料海藻酸钠及透明质酸钠安全，生物相容性高，成本较低，通过海藻酸钠与透明质酸钠的交联，所得载药微球表面孔径较小，溶解速度较慢，有效达到缓释的目的。

3．制备的蛋白多肽类药物微球制剂的给药途径为口服，方便有效，可明显改善糖尿病患者的顺应性。

4．本发明公开的方法适用于大部分蛋白多肽类药物口服缓释制剂的制备，且方法简便易行。

附图说明

图1是本发明实施例2所制备的艾塞那肽微球的体外释放曲线；

图2是本发明实施例5所制备的艾塞那肽微球的体外释放曲线；

图3是本发明实施例2和5所制备艾塞那肽微球体内降血糖试验结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述，以艾塞那肽、胰岛素和牛血清白蛋白（BSA）为例，具体说明此类以海藻酸钠-透明质酸钠混合材料为载体的蛋白多肽类口服缓释试剂的制备方法及艾塞那肽口服微球的应用。

实施例一

称取艾塞那肽5mg、海藻酸钠:透明质酸钠=2:3, 艾塞那肽、海藻酸钠和透明质酸钠混合物溶于三蒸水，浓度为25mg/ml，搅拌溶解后得到水相，20ml液体石蜡中加入2%司盘-80得到油相，将水相逐滴加入到油相中，磁力搅拌500rpm/min使水相在油相中均匀分散；向油相中加入2ml 25%的戊二醛溶液及10ml 1M稀盐酸，20℃反应；反应结束后加入20ml乙醇，室温下搅拌15分钟，静置分层后弃去上层，下层抽滤后用乙醇洗涤若干次，冷冻干燥后即制备完成。称取载药的艾塞那肽微球100mg，相同条件下制备的空白微球100mg，各置于20ml体系中测定包封率，前2h置于pH1.2 的盐酸溶液中，转速200rpm/min，温度37℃±0.5℃搅拌；2h后抽滤，将微球置于pH7.4 PBS中，转速500rpm/min，温度37℃±0.5℃搅拌，待微球完全溶解后取100μl用BCA试剂盒测定艾塞那肽含量，载药的艾塞那肽微球减去空白微球即为包载的艾塞那肽含量，艾塞那肽微球包封率为84%，粒径<220μm。

实施例二

称取艾塞那肽10mg、海藻酸钠:透明质酸钠=1:1, 艾塞那肽、海藻酸钠和透明质酸钠混合物溶于三蒸水，浓度为20mg/ml，搅拌溶解后得到水相，50ml液体石蜡中加入1%司盘-80得到油相，将水相逐滴加入到油相中，磁力搅拌700rpm/min使水相在油相中均匀分散；向油相中加入20ml 25%的戊二醛溶液及10ml 1M稀盐酸，50℃反应；反应结束后加入20ml无水乙醇，室温下搅拌15分钟，静置分层后弃去上层，下层抽滤后用乙醇洗涤若干次，冷冻干燥后即制备完成。BCA法测定的艾塞那肽微球包封率为78%，粒径<200μm。

实施例三

称取艾塞那肽10mg、海藻酸钠:透明质酸钠=1:3, 艾塞那肽、海藻酸钠和透明质酸钠混合物溶于三蒸水，浓度为40mg/ml，搅拌溶解后得到水相，20ml液体石蜡中加入1%司盘-80得到油相，将水相逐滴加入到油相中，磁力搅拌500rpm/min使水相在油相中均匀分散；向油相中加入5ml 25%戊二醛溶液及5ml 1M稀盐酸，25℃反应，反应结束后加入20ml乙醇，室温下搅拌15分钟，静置分层后弃去上层，下层抽滤后用乙醇洗涤若干次，冷冻干燥后即制备完成。BCA法测定的艾塞那肽微球包封率为86%，粒径<220μm。

实施例四

称取艾塞那肽10mg、海藻酸钠:透明质酸钠为2:1, 艾塞那肽、海藻酸钠和透明质酸钠混合物溶于三蒸水，浓度为30mg/ml，搅拌溶解后得到水相，50ml液体石蜡中加入2%司盘-80得到油相，将水相逐滴加入到油相中，磁力搅拌700rpm/min使水相在油相中均匀分散；向油相中加入20ml 25%戊二醛溶液和10ml 1M稀盐酸，30℃反应；反应结束后加入20ml乙醇，室温下搅拌15分钟，静置分层后弃去上层，下层抽滤后用乙醇洗涤若干次，冷冻干燥后即制备完成。BCA法测定的艾塞那肽微球包封率为76%，粒径<200μm。

实施例五

称取艾塞那肽7mg、海藻酸钠:透明质酸钠为3:2, 艾塞那肽、海藻酸钠和透明质酸钠混合物溶于三蒸水，浓度为25mg/ml，搅拌溶解后得到水相，20ml液体石蜡中加入1%司盘-80得到油相，将水相逐滴加入到油相中，磁力搅拌300rpm/min使水相在油相中均匀分散；向油相中加入15ml 25%戊二醛溶液及10ml 1M稀盐酸，50℃反应；反应结束后加入20ml乙醇，室温下搅拌15分钟，静置分层后弃去上层，下层抽滤后用乙醇洗涤若干次，冷冻干燥后即制备完成。BCA法测定的艾塞那肽微球包封率为87%，平均粒径<220μm。

实施例六

称取胰岛素10mg、海藻酸钠:透明质酸钠为2:3, 胰岛素、海藻酸钠和透明质酸钠混合物溶于三蒸水，浓度为30mg/ml，搅拌溶解后得到水相，50ml液体石蜡中加入1%司盘-80得到油相，将水相逐滴加入到油相中，磁力搅拌700rpm/min使水相在油相中均匀分散；向油相中加入10ml 25%戊二醛溶液及5ml 1M稀盐酸，40℃反应；反应结束后加入20ml乙醇，室温下搅拌15分钟，静置分层后弃去上层，下层抽滤后用乙醇洗涤若干次，冷冻干燥后即制备完成。BCA法测定的胰岛素微球包封率为79%，平均粒径<200μm。

实施例七

称取BSA 15mg、海藻酸钠:透明质酸钠为1:1, BSA、海藻酸钠和透明质酸钠混合物溶于三蒸水，浓度为20mg/ml，搅拌溶解后得到水相，20ml液体石蜡中加入2%司盘-80得到油相，将水相逐滴加入到油相中，磁力搅拌500rpm/min使水相在油相中均匀分散；向油相中加入15ml 25%戊二醛溶液及15ml 1M稀盐酸，30℃反应；反应结束后加入20ml乙醇，室温下搅拌15分钟，静置分层后弃去上层，下层抽滤后用乙醇洗涤若干次，冷冻干燥后即制备完成。BCA法测定的BSA微球包封率为82%，平均粒径<180μm。

实施例八

微球体外释放曲线的测定

将艾塞那肽口服缓释微球制剂进行释放曲线测定，方法如下：精密称取含药微球100mg置于烧杯中，0-2小时以pH1.2的盐酸溶液为释放介质，置于恒温搅拌器中，转速200rpm/min，温度37℃±0.5℃条件下进行微球体外释放，每小时取100μl，然后补加同温同质的溶液；2小时后将微球和pH1.2的释放介质抽滤，将微球加入到20ml pH7.4 PBS溶液中，转速200rpm/min，温度37℃±0.5℃条件下进行微球体外释放，3-8小时每小时取100μl，然后8,10,12,24小时取100μl，补加同温同质的溶液；最后用BCA法测定艾塞那肽微球的体外释放曲线。图1、2分别是实施例2、5所制备艾塞那肽微球制剂的体外释放曲线。由图1、2可知，两种艾塞那肽微球前2小时在模拟胃液的介质中释放率<20%，最终释放率均>80%，微球在介质中释放速度的快慢及最大释放率与所制备微球的条件及材料配比相关。，实验结果表明，两种微球都具有良好的缓释效果及pH响应的特征。

实施例九

动物试验

选取2个月鼠龄的雄性db/db小鼠28只，随机平均分为四组，分别为长效组，短效组，注射给药组和空载体组；长效组灌胃艾塞那肽微球（每只2.0mg，含艾塞那肽约32μg），短效组灌胃艾塞那肽微球（每只2.0mg，含艾塞那肽约32μg，短效组与长效组按本发明中的制备方法得到，制备过程略有不同），注射给药组皮下注射艾塞那肽生理盐水溶液（含艾塞那肽约3.2μg），空载体组灌胃不含艾塞那肽的空白载体加艾塞那肽水溶液（含艾塞那肽约32μg）；试验前对小鼠禁食12h，试验中禁食，水无限制，给药前先测定各只小鼠血糖值，然后分别按各组要求给药，每隔2小时测定血糖值，直至测定到第18小时，血糖值用强生one-touch 稳豪型血糖仪测定。图3为两种艾塞那肽微球制剂的降血糖试验结果，长效型为实施例二制备的艾塞那肽微球，短效型为实施例五制备的艾塞那肽微球。由图3可知，注射艾塞那肽溶液组可在8小时内有效维持db/db小鼠血糖值在正常范围（正常血糖值范围3.9mmol/L-10mmol/L），空载体组未显示明显降血糖作用，短效组药效可有效维持6小时，长效组艾塞那肽口服微球可在12小时内维持db/db小鼠血糖值在正常范围。长效组艾塞那肽口服微球不仅改变了传统艾塞那肽的给药方式，提高了糖尿病患者的顺应性，而且还延长了艾塞那肽的降血糖时间，本发明制备的艾塞那肽微球制剂同时具有可口服及缓释的作用。通过SPSS软件计算，长效组与短效组、注射组和空载体组相比，在各时间点均有显著性差异（p<0.05，图3），说明长效组对db小鼠的降血糖作用与其他组相比有显著性差异。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方法，是结合具体的优选实施方法对本发明所作的进一步详细说明，不能因此理解为本发明的具体实施只局限于这些说明。除此之外，实施例仅选取了艾塞那肽、胰岛素和BSA口服微球制备方法进行说明，然而大部分蛋白及大分子类药物均可采用上述制备方法制备口服微球，不能因此理解为本发明的方法仅适合于以上几种蛋白类药物。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，对实施例做出的若干简单推演或替换，都应视为属于本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种蛋白多肽类口服缓释制剂，其特征在于：采用蛋白多肽类口服缓释药物的包载材料制备而成，主要由蛋白多肽类药物、海藻酸钠-透明质酸钠混合物组成，以质量计，药物的含量为0.5%～10%，海藻酸钠-透明质酸钠混合物的含量为90～99.5%，海藻酸钠∶透明质酸钠为3∶1～1∶3，海藻酸钠的分子量为32000-250000道尔顿，透明质酸钠的分子量为500000-5000000道尔顿，将海藻酸钠和透明质酸钠进行交联，二者交联形成网络状微球；由以下步骤制备获得：

(a)按权利要求1的含量配制海藻酸钠-透明质酸钠混合物，溶于水，加入待加载药物，制成所述海藻酸钠-透明质酸钠混合物浓度为5～100mg/ml 的水相；

(b)在油相中加入乳化剂，将水相与油相在高速搅拌下混合形成乳化液，搅拌速度为200～2000rpm/min，水相与油相体积比为1∶5～1∶50；

(c)向步骤(b)获得的乳化液中加入交联剂和催化剂，水相与交联剂体积比为2∶1～1∶4，交联剂与催化剂体积比为2∶1～1∶3；继续搅拌，在20～50℃条件下反应5min～4h；

(d)反应完成后加入有机溶剂洗涤，然后静置分层后弃上层，抽滤得到包载待加载药物的微球。

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