CN112203696A - 吡咯并苯并二氮杂*缀合物 - Google Patents

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Abstract

一种式I的缀合物：其中Ab是在每条重链上具有至少一个自由缀合位点的经修饰抗体并且RLL1和RLL2中的每一个包括以下基团：
Figure DDA0002799301720000011

Description

吡咯并苯并二氮杂䓬缀合物
本发明涉及包含吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002799301700000012
和相关二聚体(PBD)的缀合物。
背景技术
一些吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002799301700000013
(PBD)具有识别和键合于DNA的特定序列的能力；优选的序列是PuGPu。第一PBD抗肿瘤抗生素，安曲霉素(anthramycin)，发现于1965年(Leimgruber等，J.Am.Chem.Soc.,87,5793-5795(1965)；Leimgruber等，J.Am.Chem.Soc.,87,5791-5793(1965))。自那以后，已报道了许多天然存在的PBD，并且已开发了用于多种类似物的10种以上的合成路线(Thurston等，Chem.Rev.1994,433-465(1994))。家族成员包括修道院霉素(abbeymycin)(Hochlowski等，J.Antibiotics,40,145-148(1987))、契卡霉素(chicamycin)(Konishi等，J.Antibiotics,37,200-206(1984))、DC-81(日本专利58-180487；Thurston等，Chem.Brit.,26,767-772(1990)；Bose等，Tetrahedron,48,751-758(1992))、甲基氨茴霉素(Kuminoto等，J.Antibiotics,33,665-667(1980))、新茴霉素A和B(Takeuchi等，J.Antibiotics,29,93-96(1976))、porothramycin(Tsunakawa等，J.Antibiotics,41,1366-1373(1988))、prothracarcin(Shimizu等，J.Antibiotics,29,2492-2503(1982)；Langley和Thurston,J.Org.Chem.,52,91-97(1987))、西班米星(DC-102)(Hara等，J.Antibiotics,41,702-704(1988)；Itoh等，J.Antibiotics,41,1281-1284(1988))、矛霉素(sibiromycin)(Leber等，J.Am.Chem.Soc.,110,2992-2993(1988))以及托马霉素(tomamycin)(Arima等，J.Antibiotics,25,437-444(1972))。PBD具有以下通式结构：
Figure BDA0002799301700000021
它们的不同之处在于其芳香族A环和吡咯并C环两者中的取代基的数目、类型和位置以及C环的饱和度。在B环中，在N10-C11位置处存在亚胺(N＝C)、甲醇胺(NH-CH(OH))或甲醇胺甲基醚(NH-CH(OMe))，所述N10-C11位置为负责烷基化DNA的亲电中心。所有已知的天然产物在手性C11a位置处具有(S)-构型，当从C环朝向A环观察时，所述位置为其提供右手扭转。这给予它们适当的三维形状，用于与B型DNA的小沟的同螺旋性(isohelicity)，从而导致在结合位点处的滑动配合(snug fit)(Kohn,在Antibiotics III中.Springer-Verlag,New York,第3-11页(1975)；Hurley和Needham-VanDevanter,Acc.Chem.Res.,19,230-237(1986))。它们在小沟中形成加合物的能力使得它们能够干扰DNA加工，因此使其具有作为抗肿瘤剂的用途。
先前已经公开，此分子的生物活性可通过将两个PBD单元通过它们的C8/C’-羟基官能度经由柔性亚烷基接头接合在一起而加强(Bose,D.S.等，J.Am.Chem.Soc.,114,4939-4941(1992)；Thurston,D.E.等，J.Org.Chem.,61,8141-8147(1996))。PBD二聚体被认为形成序列选择性DNA损伤，如回文结构5’-Pu-GATC-Py-3’股间交联(Smellie,M.等，Biochemistry,42,8232-8239(2003)；Martin,C.等，Biochemistry,44,4135-4147)，被认为主要负责其生物活性。
PBD二聚体的一个实例是SG2000(SJG-136)：
Figure BDA0002799301700000022
(Gregson,S.等，J.Med.Chem.,44,737-748(2001)；Alley,M.C.等，CancerResearch,64,6700-6706(2004)；Hartley,J.A.等，Cancer Research,64,6693-6699(2004))，其已经作为独立药剂参与临床试验，例如，NCT02034227研究了其在治疗急性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞性白血病中的用途(参见：https://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02034227)。
携带C2芳基取代基的二聚PBD化合物，诸如SG2202(ZC-207)，公开于WO 2005/085251中：
Figure BDA0002799301700000031
以及WO2006/111759中，所述PBD化合物的亚硫酸氢盐，例如SG2285(ZC-423)：
Figure BDA0002799301700000032
这些化合物已经显示出为高度可用的细胞毒性药剂(Howard,P.W.等，Bioorg.Med.Chem.(2009),doi:10.1016/j.bmcl.2009.09.012)。
WO 2007/085930描述了具有用于连接至细胞结合剂(如抗体)的接头基团的二聚体PBD化合物的制备。接头存在于连接二聚体的单体PBD单元的桥中。
具有用于连接至细胞结合剂(如抗体)的接头基团的二聚体PBD化合物描述于WO2011/130598中。这些化合物中的接头连接于可用的N10位置中的一个，并且通常因酶对接头基团的作用而被切割。如果用封端基团保护未结合的N10位置，那么所例示的封端基团具有与连接至抗体的接头相同的切割触发物。
WO 2014/057074描述了两种特定的PBD二聚体缀合物，其通过N10位置结合在一个单体上，另一个PBD单体呈亚胺形式。所公开的药物-接头之一是SG3249，特司林(Tesirine)：
Figure BDA0002799301700000041
当与抗DLL3罗伐珠单抗(rovalpituzumab)缀合时，其被称为罗伐珠单抗-特司林(Rova-T)，目前正在进行用于治疗小细胞肺癌的评估(Tiberghien,A.C.等人,ACSMed.Chem.Lett.,2016,7(11),983–987；DOI：10.1021/acsmedchemlett.6b00062)。此药物-接头与曲妥珠单抗的工程化型式和针对人CD19的人源化抗体的另外的缀合物也在2017年初由ADC Therapeutics SA开始了试验(Proceedings of the American Association forCancer Research,第58卷,2017年4月中的Abstracts#51和#52)。
WO 2015/052322描述了一种特定的PBD二聚体缀合物，其通过N10位置结合在一个单体上，另一个PBD单体呈亚胺形式。它还描述了一种特定的PBD二聚体缀合物，其通过N10位置结合在一个单体上，另一个PBD单体具有封端基团，所述封端基团具有与连接至抗体的接头相同的切割触发物。
Figure BDA0002799301700000051
发明内容
在一个方面，本发明提供了PBD二聚体缀合物，其中PBD与被修饰以便在每条重链上具有至少一个自由缀合位点的抗体缀合，其中缀合是通过接头通过PBD的每个N10基团实现的，并且其中缀合反应是形成环己烯环的狄尔斯反应。
本发明人已经发现此类缀合物惊人的有效，尽管预期其不可通过两个接头将单个PBD或相关二聚体与单个抗体相连接。
在另一方面，本发明提供了PBD二聚体缀合物，其中PBD通过接头通过PBD的N10基团与抗体缀合，并且其中缀合反应是形成环己烯环的狄尔斯反应。
本发明的第一方面提供了一种式I的缀合物：
Figure BDA0002799301700000061
其中
Ab为在每条重链上具有至少一个自由缀合位点的经修饰抗体；
D代表基团D1或D2：
Figure BDA0002799301700000062
虚线指示C2与C3之间任选存在双键；
当C2与C3之间存在双键时，R2选自由以下组成的组：
(ia)C5-10芳基，其任选地被一个或多个选自包括以下的组的取代基取代：卤素、硝基、氰基、醚、羧基、酯、C1-7烷基、C3-7杂环基以及双-氧基-C1-3亚烷基；
(ib)C1-5饱和脂族烷基；
(ic)C3-6饱和环烷基；
(id)
Figure BDA0002799301700000063
其中R11、R12和R13中的每一个独立地选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基和环丙基，其中R2基团中碳原子的总数不超过5；
(ie)
Figure BDA0002799301700000071
其中R15a和R15b中的一个为H并且另一个选自：苯基，所述苯基任选地被选自卤素、甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基；以及
(if)
Figure BDA0002799301700000072
其中R14选自：H；C1-3饱和烷基；C2-3烯基；C2-3炔基；环丙基；苯基，所述苯基任选地被选自卤素、甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基；
当C2与C3之间存在单键时，
R2选自H、OH、F、diF和
Figure BDA0002799301700000073
其中R16a和R16b独立地选自H、F、C1-4饱和烷基、C2-3烯基，所述烷基和烯基任选地被选自C1-4烷基酰氨基和C1-4烷基酯的基团取代；或，当R16a和R16b中的一个是H时，另一个选自腈和C1-4烷基酯；
D’代表基团D’1或D’2：
Figure BDA0002799301700000074
其中虚线指示C2’与C3’之间任选存在双键；
当C2’与C3’之间存在双键时，R12选自由以下组成的组：
(iia)C5-10芳基，其任选地被一个或多个选自包括以下的组的取代基取代：卤素、硝基、氰基、醚、羧基、酯、C1-7烷基、C3-7杂环基以及双-氧基-C1-3亚烷基；
(iib)C1-5饱和脂族烷基；
(iic)C3-6饱和环烷基；
(iid)
Figure BDA0002799301700000081
其中R31、R32和R33中的每一个独立地选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基和环丙基，其中R12基团中碳原子的总数不超过5；
(iie)
Figure BDA0002799301700000082
其中R25a和R25b中的一个是H并且另一个选自：苯基，所述苯基任选地被选自卤素、甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基；以及
(iif)
Figure BDA0002799301700000083
其中R24选自：H；C1-3饱和烷基；C2-3烯基；C2-3炔基；环丙基；苯基，所述苯基任选地被选自卤素、甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基；
当C2’与C3’之间存在单键时，
R12选自H、OH、F、diF和
Figure BDA0002799301700000084
其中R26a和R26b独立地选自H、F、C1-4饱和烷基、C2-3烯基，所述烷基和烯基任选地被选自C1-4烷基酰氨基和C1-4烷基酯的基团取代；或，当R26a和R26b中的一个是H时，另一个选自腈和C1-4烷基酯；
R6和R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、硝基、Me3Sn以及卤素；
其中R和R’独立地选自任选取代的C1-12烷基、C3-20杂环基以及C5-20芳基；
R7选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、硝基、Me3Sn以及卤素；
R″为C3-12亚烷基，所述链可被一个或多个杂原子，例如O、S、NRN2(其中RN2为H或C1-4烷基)，和/或芳环，例如苯或吡啶中断；
Y和Y’选自O、S或NH；
R11a选自OH、ORA，其中RA为C1-4烷基；
R6’、R7’、R9’和R11a’分别选自与R6、R7、R9和R11a相同的基团；
并且
RLL1和RLL2是在不同位点与抗体连接的接头，其独立地选自：
Figure BDA0002799301700000091
其中
Q是：
Figure BDA0002799301700000092
其中QX是使得Q是氨基酸残基、二肽残基或三肽残基；
X是：
Figure BDA0002799301700000093
其中a＝0至5，b＝0至16，c＝0或1，d＝0至5；
GLL为连接至抗体的接头，其包括以下基团：
Figure BDA0002799301700000094
据认为，相比于由异质混合物组成的具有较高DAR的ADC而言，通过降低最小有效剂量需要，有效地具有1的药物抗体比率(DAR)的此类ADC可提供显著的优点，包括降低的脱靶毒性和增强的治疗窗口。
本发明的第二方面包括式II的缀合物：
Ab’-(DL)p(II)，其中DL具有式(III)
Figure BDA0002799301700000101
其中D、R2、R6、R7、R9、R11a、Y、R”、Y’、D’、R6’、R7’、R9’、R11a’和R12(包括相应地C2与C3之间以及C2’与C3’之间的双键的存在或不存在)如本发明的第一方面所定义；
Ab’为抗体；
以下三种情况之一：
(a)R10’为H，并且R11a’为OH或ORA，其中RA为C1-4烷基；
(b)R10’和R11a’在它们所结合的氮原子与碳原子之间形成氮-碳双键；或
(c)R10’为H并且R11a’为SOzM，其中z为2或3并且M为一价药学上可接受的阳离子；
p为1至20的整数。
本发明的第一和第二方面均具有以下基团：
Figure BDA0002799301700000102
其处于PBD二聚体与抗体之间的接头中。此基团可通过狄尔斯–阿尔德(Diels-Alder)反应形成于连接至PBD二聚体的马来酰亚胺基与下式的螺环丙基-环戊二烯之间：
Figure BDA0002799301700000111
此基团可通过添加接头或通过将非天然氨基酸并入多肽序列中而并入抗体中。
此基团利用桥接的环己烯环在抗体与PBD二聚体之间提供稳定的键。
本发明的第三方面提供了本发明的第一或第二方面的缀合物在制造用于治疗增殖性疾病的药物中的用途。第三方面还提供了用于治疗增殖性疾病的本发明的第一或第二方面的缀合物。第三方面还提供了一种治疗增殖性疾病的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的本发明的第一或第二方面的缀合物。
本领域的普通技术人员能够容易地确定候选缀合物是否治疗任何特定细胞类型的增殖性病状。例如，可以方便地用来评估由特定化合物提供的活性的测定描述于以下实施例中。
附图说明
图1.1.实施例4中描述的螺环戊二烯交联剂(A)和螺环戊二烯NNAA(B)的一般设计。
图2.1.示出与CP2-NHS反应之前(A)和之后(B)的完整去糖基化质谱。(B)中峰下方的数字指示引入mAb中的CP2-接头基团的数量。通过峰强度估算CP2-接头引入得到每个mAb3.29个CP2-接头。
图3.1.示出在包含突变或野生型tRS的哺乳动物细胞中表达后12G3H11 K274CP2-NNAA mAb的滴度和细胞活力。
图3.2.示出1C1 K274CP2-NNAA mAb的去糖基化质谱。
图3.3.示出1C1 S239CP2-NNAA mAb的去糖基化质谱分析。
图3.4.示出1C1野生型mAb的去糖基化质谱分析。
图3.5.示出1C1 K274CP2-NNAA mAb的SEC分析，表明获得单体产物。
图3.6.示出1C1 S239CP2-NNAA mAb的SEC分析，表明获得单体产物。
图3.7.示出通过SDS-PAGE进行的1C1-K274CP2-NNAA mAb和1C1-S239CP2-NNAAmAb的分析。
定义
药学上可接受的阳离子
药学上可接受的一价阳离子的实例论述于Berge等，J.Pharm.Sci.,66,1-19(1977)中，其以引用方式并入本文。
药学上可接受的阳离子可以是无机或有机的。
药学上可接受的一价无机阳离子的实例包括但不限于碱金属离子，如Na+和K+。药学上可接受的二价无机阳离子的实例包括但不限于碱土金属阳离子，如Ca2+和Mg2+。药学上可接受的有机阳离子的实例包括但不限于铵离子(即NH4 +)和取代的铵离子(例如NH3R+、NH2R2 +、NHR3 +、NR4 +)。一些合适的取代的铵离子的实例是衍生自以下的那些：乙胺、二乙胺、二环己胺、三乙胺、丁胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪、苄胺、苯基苄胺、胆碱、葡甲胺和氨基丁三醇以及氨基酸，如赖氨酸和精氨酸。常见季胺离子的实例为N(CH3)4 +。
取代基
如本文所用的短语“任选取代的”涉及可为未取代的或可为取代的亲本基团。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“取代的”涉及携带一个或多个取代基的亲本基团。术语“取代基”在本文中以常规意义使用并且是指共价连接至亲本基团或在适当时与亲本基团融合的化学部分。多种取代基是众所周知的，并且它们的形成和引入到各种亲本基团中的方法也是众所周知的。
取代基的实例在下面更详细地描述。
C1-12烷基：如本文所用的术语“C1-12烷基”涉及通过从具有1至12个碳原子的烃化合物的碳原子处移除氢原子获得的一价部分，其可以是脂族或脂环族的，并且可以是饱和或不饱和的(例如部分不饱和的、完全不饱和的)。如本文所用的术语“C1-4烷基”涉及通过从具有1至4个碳原子的烃化合物的碳原子处移除氢原子获得的一价部分，其可以是脂族或脂环族的，并且可以是饱和或不饱和的(例如部分不饱和的、完全不饱和的)。因此，术语“烷基”包括以下论述的亚类烯基、炔基、环烷基等。
饱和烷基的实例包括但不限于甲基(C1)、乙基(C2)、丙基(C3)、丁基(C4)、戊基(C5)、己基(C6)以及庚基(C7)。
饱和的直链烷基的实例包括但不限于甲基(C1)、乙基(C2)、正丙基(C3)、正丁基(C4)、正戊基(戊基)(C5)、正己基(C6)以及正庚基(C7)。
饱和的支链烷基的实例包括异丙基(C3)、异丁基(C4)、仲丁基(C4)、叔丁基(C4)、异戊基(C5)以及新戊基(C5)。
C2-12烯基：如本文所用的术语“C2-12烯基”涉及具有一个或多个碳-碳双键的烷基。
不饱和烯基的实例包括但不限于乙烯基(乙烯基，-CH＝CH2)、1-丙烯基(-CH＝CH-CH3)、2-丙烯基(烯丙基，-CH-CH＝CH2)、异丙烯基(1-甲基乙烯基，-C(CH3)＝CH2)、丁烯基(C4)、戊烯基(C5)以及己烯基(C6)。
C2-12炔基：如本文所用的术语“C2-12炔基”涉及具有一个或多个碳-碳三键的烷基。
不饱和炔基的实例包括但不限于乙炔基(-C≡CH)和2-丙炔基(炔丙基，-CH2-C≡CH)。
C3-12环烷基：如本文所用的术语“C3-12环烷基”涉及也是环基的烷基；即，通过从环状烃(碳环)化合物的脂环环原子处移除氢原子获得的一价部分，所述部分具有3至7个碳原子，包括3至7个环原子。
环烷基的实例包括但不限于衍生自以下的那些：
饱和的单环烃化合物：
环丙烷(C3)、环丁烷(C4)、环戊烷(C5)、环己烷(C6)、环庚烷(C7)、甲基环丙烷(C4)、二甲基环丙烷(C5)、甲基环丁烷(C5)、二甲基环丁烷(C6)、甲基环戊烷(C6)、二甲基环戊烷(C7)以及甲基环己烷(C7)；
不饱和的单环烃化合物：
环丙烯(C3)、环丁烯(C4)、环戊烯(C5)、环己烯(C6)、甲基环丙烯(C4)、二甲基环丙烯(C5)、甲基环丁烯(C5)、二甲基环丁烯(C6)、甲基环戊烯(C6)、二甲基环戊烯(C7)以及甲基环己烯(C7)；以及
饱和的多环烃化合物：
降蒈烷(norcarane)(C7)、降蒎烷(norpinane)(C7)、降莰烷(norbornane)(C7)。
C3-20杂环基：如本文所用的术语“C3-20杂环基”涉及通过从杂环化合物的环原子处移除氢原子获得的一价部分，所述部分具有3至20个环原子，其中1至10个为环杂原子。优选地，各环均具有3至7个环原子，其中1至4个环原子为环杂原子。
在上下文中，前缀(例如C3-20、C3-7、C5-6等)表示环原子的数目或环原子的数目的范围，无论为碳原子或杂原子。例如，如本文所用的术语“C5-6杂环基”涉及具有5或6个环原子的杂环基。
单环杂环基的实例包括但不限于衍生自以下的杂环基：
N1：氮丙啶(C3)、氮杂环丁烷(C4)、吡咯烷(四氢吡咯)(C5)、吡咯啉(例如，3-吡咯啉、2,5-二氢吡咯)(C5)、2H-吡咯或3H-吡咯(异吡咯、异唑)(C5)、哌啶(C6)、二氢吡啶(C6)、四氢吡啶(C6)、吖庚因(C7)；
O1：环氧乙烷(C3)、氧杂环丁烷(C4)、氧杂环戊烷(四氢呋喃)(C5)、氧杂环戊二烯(oxole)(二氢呋喃)(C5)、噁烷(四氢吡喃)(C6)、二氢吡喃(C6)、吡喃(C6)、氧杂环庚三烯(C7)；
S1：硫杂丙环(thiirane)(C3)、硫杂环丁烷(thietane)(C4)、硫杂环戊烷(thiolane)(四氢噻吩)(C5)、噻烷(四氢噻喃)(C6)、硫杂环庚烷(thiepane)(C7)；
O2：二氧戊烷(C5)、二噁烷(C6)和二氧杂环庚烷(C7)；
O3：三噁烷(C6)；
N2：咪唑烷(C5)、吡唑烷(二氮杂环戊烷(diazolidine))(C5)、咪唑啉(C5)、吡唑啉(二氢吡唑)(C5)、哌嗪(C6)；
N1O1：四氢噁唑(C5)、二氢噁唑(C5)、四氢异噁唑(C5)、二氢异噁唑(C5)、吗啉(C6)、四氢噁嗪(C6)、二氢噁嗪(C6)、噁嗪(C6)；
N1S1：噻唑啉(C5)、噻唑烷(C5)、硫代吗啉(C6)；
N2O1：噁二嗪(C6)；
O1S1：噁噻唑(oxathiole)(C5)和氧硫杂环己烷(oxathiane)(噻噁烷(thioxane))(C6)；以及
N1O1S1：噁噻嗪(C6)。
取代的单环杂环基的实例包括衍生自呈环状形式的糖类的杂环基，所述糖类例如呋喃糖(C5)，如阿拉伯呋喃糖、来苏呋喃糖、核呋喃糖和木呋喃糖；以及吡喃糖(C6)，如阿洛吡喃糖(allopyranose)、阿卓吡喃糖(altropyranose)、葡萄吡喃糖、甘露吡喃糖、古洛吡喃糖(gulopyranose)、艾杜吡喃糖(idopyranose)、半乳吡喃糖以及太洛吡喃糖(talopyranose)。
C5-20芳基：如本文所用的术语“C5-20芳基”涉及通过从芳族化合物的芳族环原子处移除氢原子获得的一价部分，所述部分具有3至20个环原子。如本文所用的术语“C5-7芳基”涉及通过从芳族化合物的芳族环原子处移除氢原子获得的一价部分，所述部分具有5至7个环原子并且如本文所用的术语“C5-10芳基”涉及通过从芳族化合物的芳族环原子处移除氢原子获得的一价部分，所述部分具有5至10个环原子。优选地，每个环具有5至7个环原子。
在上下文中，前缀(例如C3-20、C5-7、C5-6、C5-10等)表示环原子的数目或环原子的数目的范围，无论为碳原子或杂原子。例如，如本文所用的术语“C5-6芳基”涉及具有5或6个环原子的芳基。
环原子可以是全部碳原子，如在“碳芳基”中。
碳芳基的实例包括但不限于衍生自苯(即苯基)(C6)、萘(C10)、薁(azulene)(C10)、蒽(C14)、菲(C14)、萘并萘(C18)以及嵌二萘(C16)的那些。
包括其中至少一个为芳环的稠环的芳基的实例包括但不限于衍生自茚满(例如2,3-二氢-1H-茚)(C9)、茚(C9)、异茚(C9)、四氢化萘(1,2,3,4-四氢萘(C10)、二氢苊(C12)、芴(C13)、非那烯(phenalene)(C13)、醋菲(acephenanthrene)(C15)以及醋蒽(aceanthrene)(C16)的基团。
另选地，环原子可包括一个或多个杂原子，如在“杂芳基”中。单环杂芳基的实例包括但不限于衍生自以下的那些：
N1：吡咯(唑)(C5)、吡啶(吖嗪)(C6)；
O1：呋喃(氧杂环戊二烯)(C5)；
S1：噻吩(硫杂环戊二烯)(C5)；
N1O1：噁唑(C5)、异噁唑(C5)、异噁嗪(C6)；
N2O1：噁二唑(呋咱)(C5)；
N3O1：噁三唑(C5)；
N1S1：噻唑(C5)、异噻唑(C5)；
N2：咪唑(1,3-二唑)(C5)、吡唑(1,2-二唑)(C5)、哒嗪(1,2-二嗪)(C6)、嘧啶(1,3-二嗪)(C6)(例如，胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)、吡嗪(1,4-二嗪)(C6)；
N3：三唑(C5)、三嗪(C6)；以及，
N4：四唑(C5)。
包含稠环的杂芳基的实例包括但不限于：
C9(具有2个稠环)，其衍生自苯并呋喃(O1)、异苯并呋喃(O1)、吲哚(N1)、异吲哚(N1)、中氮茚(N1)、吲哚啉(N1)、异吲哚啉(N1)、嘌呤(N4)(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤)、苯并咪唑(N2)、吲唑(N2)、苯并噁唑(N1O1)、苯并异噁唑(N1O1)、苯并二噁茂(O2)、苯并呋咱(N2O1)、苯并三唑(N3)、苯并硫代呋喃(S1)、苯并噻唑(N1S1)、苯并噻二唑(N2S)；
C10(具有2个稠环)，其衍生自苯并吡喃(O1)、异苯并吡喃(O1)、苯并二氢吡喃(O1)、异苯并二氢吡喃(O1)、苯并噁烷(O2)、喹啉(N1)、异喹啉(N1)、喹嗪(N1)、苯并噁嗪(N1O1)、苯并二嗪(N2)、吡啶并吡啶(N2)、喹喔啉(N2)、喹唑啉(N2)、噌啉(N2)、酞嗪(N2)、二氮杂萘(N2)、蝶啶(N4)；
C11(具有2个稠环)，其衍生自苯并二氮杂
Figure BDA0002799301700000171
(N2)；
C13(具有3个稠环)，其衍生自咔唑(N1)、二苯并呋喃(O1)、二苯并噻吩(S1)、咔啉(N2)、萘嵌间二氮杂苯(N2)、吡啶并吲哚(N2)；以及，
C14(具有3个稠环)，其衍生自吖啶(N1)、呫吨(O1)、噻吨(S1)、二苯并对二噁英(oxanthrene)(O2)、氧硫杂蒽(O1S1)、吩嗪(N2)、吩噁嗪(N1O1)、吩噻嗪(N1S1)、噻蒽(S2)、菲啶(N1)、菲咯啉(N2)、吩嗪(N2)。
无论单独或为另一取代基的一部分的以上基团均可自身任选被一个或多个选自自身及以下列出的其他取代基的基团取代。
卤素：-F、-Cl、-Br和-I。
羟基：-OH。
醚：-OR，其中R是醚取代基，例如，C1-7烷基(也称为C1-7烷氧基，以下进行讨论)、C3-20杂环基(也称为C3-20杂环氧基)或C5-20芳基(也称为C5-20芳基氧基)，优选C1-7烷基。
烷氧基：-OR，其中R为烷基，例如，C1-7烷基。C1-7烷氧基的实例包括但不限于-OMe(甲氧基)、-OEt(乙氧基)、-O(nPr)(正丙氧基)、-O(iPr)(异丙氧基)、-O(nBu)(正丁氧基)、-O(sBu)(仲丁氧基)、-O(iBu)(异丁氧基)以及-O(tBu)(叔丁氧基)。
缩醛：-CH(OR1)(OR2)，其中R1和R2独立地为缩醛取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基，或在“环状”缩醛基团的情况下，R1和R2，与它们所连接的两个氧原子，和它们所连接的碳原子一起，形成具有4至8个环原子的杂环。缩醛基团的实例包括但不限于-CH(OMe)2、-CH(OEt)2和-CH(OMe)(OEt)。
半缩醛：-CH(OH)(OR1)，其中R1为半缩醛取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。半缩醛基团的实例包括但不限于-CH(OH)(OMe)和-CH(OH)(OEt)。
缩酮：-CR(OR1)(OR2)，其中R1和R2如对于缩醛所定义，并且R是除氢之外的缩酮取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。缩酮基团的实例包括但不限于-C(Me)(OMe)2、-C(Me)(OEt)2、-C(Me)(OMe)(OEt)、-C(Et)(OMe)2、-C(Et)(OEt)2以及-C(Et)(OMe)(OEt)。
半缩酮：-CR(OH)(OR1)，其中R1如对于半缩醛所定义，并且R是除氢之外的半缩酮取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。半缩醛基团的实例包括但不限于-C(Me)(OH)(OMe)、-C(Et)(OH)(OMe)、-C(Me)(OH)(OEt)以及-C(Et)(OH)(OEt)。
氧代基(酮、-酮)：＝O。
硫酮(Thione)(硫酮(thioketone))：＝S。
亚氨基(亚胺)：＝NR，其中R为亚氨基取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选氢或C1-7烷基。酯基的实例包括但不限于＝NH、＝NMe、＝NEt及＝NPh。
甲酰基(醛、甲醛)：-C(＝O)H。
酰基(酮基)：-C(＝O)R，其中R是酰基取代基，例如，C1-7烷基(也称为C1-7烷基酰基或C1-7烷酰基)、C3-20杂环基(也称为C3-20杂环酰基)或C5-20芳基(也称为C5-20芳基酰基)，优选C1-7烷基。酰基的实例包括但不限于-C(＝O)CH3(乙酰基)、-C(＝O)CH2CH3(丙酰基)、-C(＝O)C(CH3)3(叔丁酰基)和-C(＝O)Ph(苯甲酰基、酰苯基(phenone))。
羧基(羧酸)：-C(＝O)OH。
硫代羧基(硫代羧酸)：-C(＝S)SH。
硫醇羧基(硫醇羧酸)：-C(＝O)SH。
硫酮羧基(硫酮羧酸)：-C(＝S)OH。
亚胺酸：-C(＝NH)OH。
异羟肟酸：-C(＝NOH)OH。
酯(羧酸酯、羧酸的酯、氧羰基)：-C(＝O)OR，其中R是酯取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。酯基的实例包括但不限于-C(＝O)OCH3、-C(＝O)OCH2CH3、-C(＝O)OC(CH3)3和-C(＝O)OPh。
酰氧基(反酯)：-OC(＝O)R，其中R是酰氧基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。酰氧基的实例包括但不限于-OC(＝O)CH3(乙酰氧基)、-OC(＝O)CH2CH3、-OC(＝O)C(CH3)3、-OC(＝O)Ph和-OC(＝O)CH2Ph。
氧基羰基氧基：-OC(＝O)OR，其中R是酯取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。酯基的实例包括但不限于-OC(＝O)OCH3、-OC(＝O)OCH2CH3、-OC(＝O)OC(CH3)3和-OC(＝O)OPh。
氨基：-NR1R2，其中R1和R2独立地为氨基取代基，例如，氢、C1-7烷基(也称为C1-7烷基氨基或二-C1-7烷基氨基)、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选H或C1-7烷基，或，在“环状”氨基的情况下，R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成具有4至8个环原子的杂环。氨基可以是伯(-NH2)、仲(-NHR1)或叔(-NHR1R2)，并且在阳离子形式中，可以是季(-+NR1R2R3)。氨基的实例包括但不限于-NH2、-NHCH3、-NHC(CH3)2、-N(CH3)2、-N(CH2CH3)2和-NHPh。环状氨基的实例包括但不限于氮杂环丙烷基、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉代以及硫吗啉代。
酰氨基(氨基甲酰基、氨甲酰基、氨基羰基、羧基酰胺)：-C(＝O)NR1R2，其中R1和R2独立地为氨基取代基，如对于氨基所定义。酰氨基的实例包括但不限于-C(＝O)NH2、-C(＝O)NHCH3、-C(＝O)N(CH3)2、-C(＝O)NHCH2CH3和-C(＝O)N(CH2CH3)2，以及其中R1和R2与它们所连接的氮原子一起形成杂环结构的酰氨基，例如哌啶基羰基、吗啉代羰基、硫吗啉代羰基和哌嗪基羰基。
硫代酰氨基(硫代氨甲酰基)：-C(＝S)NR1R2，其中R1和R2独立地为氨基取代基，如对于氨基所定义。酰氨基的实例包括但不限于-C(＝S)NH2、-C(＝S)NHCH3、-C(＝S)N(CH3)2和-C(＝S)NHCH2CH3。
酰氨基(Acylamido)(酰基氨基(acylamino))：-NR1C(＝O)R2，其中R1是酰胺取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选氢或C1-7烷基，并且R2是酰基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选氢或C1-7烷基。酰基酰胺基团的实例包括但不限于-NHC(＝O)CH3、-NHC(＝O)CH2CH3和-NHC(＝O)Ph。R1和R2可一起形成环状结构，如例如在琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基和邻苯二甲酰亚胺基中：
Figure BDA0002799301700000201
氨基羰基氧基：-OC(＝O)NR1R2，其中R1和R2独立地为氨基取代基，如对于氨基所定义。氨基羰基氧基的实例包括但不限于-OC(＝O)NH2、-OC(＝O)NHMe、-OC(＝O)NMe2和-OC(＝O)NEt2。
脲基：-N(R1)CONR2R3，其中R2和R3独立地为氨基取代基，如对于氨基所定义，并且R1是脲基取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选氢或C1-7烷基。脲基的实例包括但不限于-NHCONH2、-NHCONHMe、-NHCONHEt、-NHCONMe2、-NHCONEt2、-NMeCONH2、-NMeCONHMe、-NMeCONHEt、-NMeCONMe2和-NMeCONEt2。
胍基：-NH-C(＝NH)NH2。
四唑基：具有四个氮原子和一个碳原子的五元芳环，
Figure BDA0002799301700000202
亚氨基：＝NR，其中R为亚氨基取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选H或C1-7烷基。亚氨基的实例包括但不限于＝NH、＝NMe和＝NEt。
脒(脒基)：-C(＝NR)NR2，其中每个R为脒取代基，例如，氢、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选H或C1-7烷基。脒基团的实例包括但不限于-C(＝NH)NH2、-C(＝NH)NMe2和-C(＝NMe)NMe2。
硝基：-NO2。
亚硝基：-NO。
叠氮基：-N3。
氰基(腈、甲腈)：-CN。
异氰基：-NC。
氰酰基：-OCN。
异氰酰基：-NCO。
氰硫基(硫氰酰基)：-SCN。
异氰硫基(异硫氰酰基)：-NCS。
硫氢基(Sulfhydryl)(硫醇(thiol)、巯基(mercapto))：-SH。
硫醚(Thioether)(硫醚(sulfide))：-SR，其中R为硫醚取代基，例如，C1-7烷基(也称为C1-7烷硫基)、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。C1-7烷硫基的实例包括但不限于-SCH3和-SCH2CH3。
二硫醚：-SS-R，其中R为二硫醚取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基(本文也称为C1-7烷基二硫醚)。C1-7烷基二硫醚基团的实例包括但不限于-SSCH3和-SSCH2CH3。
锍化物(亚磺酰基、亚砜)：-S(＝O)R，其中R为锍化物取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。锍化物基团的实例包括但不限于-S(＝O)CH3和-S(＝O)CH2CH3。
砜(磺酰基)：-S(＝O)2R，其中R为砜取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基，包括例如氟化或全氟化的C1-7烷基。砜基团的实例包括但不限于-S(＝O)2CH3(甲基磺酰基、甲磺酰基)、-S(＝O)2CF3(三氟甲磺酰基)、-S(＝O)2CH2CH3(乙磺酰基)、-S(＝O)2C4F9(九氟丁磺酰基)、-S(＝O)2CH2CF3(三氟乙磺酰基)、-S(＝O)2CH2CH2NH2(牛磺酰基)、-S(＝O)2Ph(苯基磺酰基、苯磺酰基)、4-甲基苯基磺酰基(甲苯磺酰基)、4-氯苯基磺酰基(氯苯磺酰基)、4-溴苯基磺酰基(溴苯磺酰基)、4-硝基苯基磺酰基(硝苯磺酰基)、2-萘磺酸酯(萘磺酰基)以及5-二甲基氨基-萘-1-基磺酸酯(丹磺酰基)。
亚磺酸(亚磺基)：-S(＝O)OH、-SO2H。
磺酸(磺基)：-S(＝O)2OH、-SO3H。
亚磺酸酯(亚磺酸的酯)：-S(＝O)OR，其中R为亚磺酸酯取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。亚磺酸酯基团的实例包括但不限于-S(＝O)OCH3(甲氧基亚磺酰基；甲基亚磺酸酯)和-S(＝O)OCH2CH3(乙氧基亚磺酰基；乙基亚磺酸酯)。
磺酸酯(磺酸的酯)：-S(＝O)2OR，其中R为磺酸酯取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。磺酸酯基团的实例包括但不限于-S(＝O)2OCH3(甲氧基磺酰基；甲基磺酸酯)和-S(＝O)2OCH2CH3(乙氧基磺酰基；乙基磺酸酯)。
亚磺酰氧基：-OS(＝O)R，其中R为亚磺酰氧基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。亚磺酰氧基的实例包括但不限于-OS(＝O)CH3和-OS(＝O)CH2CH3。
磺酰氧基：-OS(＝O)2R，其中R为磺酰氧基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。磺酰氧基的实例包括但不限于-OS(＝O)2CH3(甲磺酸酯)和-OS(＝O)2CH2CH3(乙磺酸酯)。
硫酸酯：-OS(＝O)2OR；其中R为硫酸酯取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。硫酸酯基团的实例包括但不限于-OS(＝O)2OCH3和-SO(＝O)2OCH2CH3。
氨磺酰基(氨磺酰；亚磺酸酰胺；亚磺酰胺)：-S(＝O)NR1R2，其中R1和R2独立地为氨基取代基，如对于氨基所定义。氨磺酰基的实例包括但不限于-S(＝O)NH2、-S(＝O)NH(CH3)、-S(＝O)N(CH3)2、-S(＝O)NH(CH2CH3)、-S(＝O)N(CH2CH3)2和-S(＝O)NHPh。
磺酰氨基(Sulfonamido)(氨亚磺酰基；磺酸酰胺；磺酰胺)：-S(＝O)2NR1R2，其中R1和R2独立地为氨基取代基，如对于氨基所定义。磺酰氨基的实例包括但不限于-S(＝O)2NH2、-S(＝O)2NH(CH3)、-S(＝O)2N(CH3)2、-S(＝O)2NH(CH2CH3)、-S(＝O)2N(CH2CH3)2和-S(＝O)2NHPh。
磺氨基：-NR1S(＝O)2OH，其中R1为氨基取代基，如对于氨基所定义。磺氨基的实例包括但不限于-NHS(＝O)2OH和-N(CH3)S(＝O)2OH。
磺氨基：-NR1S(＝O)2R，其中R1为氨基取代基，如对于氨基所定义，并且R为磺氨基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。磺氨基的实例包括但不限于-NHS(＝O)2CH3和-N(CH3)S(＝O)2C6H5。
亚磺氨基：-NR1S(＝O)R，其中R1为氨基取代基，如对于氨基所定义，并且R为亚磺氨基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基。亚磺氨基的实例包括但不限于-NHS(＝O)CH3和-N(CH3)S(＝O)C6H5。
膦基(膦)：-PR2，其中R为膦基取代基，例如，-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。膦基的实例包括但不限于-PH2、-P(CH3)2、-P(CH2CH3)2、-P(t-Bu)2和-P(Ph)2。
磷基：-P(＝O)2。
氧膦基(氧化膦)：-P(＝O)R2，其中R为氧膦基取代基，例如，C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选C1-7烷基或C5-20芳基。氧膦基的实例包括但不限于-P(＝O)(CH3)2、-P(＝O)(CH2CH3)2、-P(＝O)(t-Bu)2和-P(＝O)(Ph)2。
膦酸(膦酰基)：-P(＝O)(OH)2。
膦酸酯(膦酰基酯)：-P(＝O)(OR)2，其中R为膦酸酯取代基，例如，-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。膦酸酯基团的实例包括但不限于-P(＝O)(OCH3)2、-P(＝O)(OCH2CH3)2、-P(＝O)(O-t-Bu)2和-P(＝O)(OPh)2。
磷酸(膦酰基氧基)：-OP(＝O)(OH)2。
磷酸酯(膦酰基氧基酯)：-OP(＝O)(OR)2，其中R为磷酸酯取代基，例如，-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。磷酸酯基团的实例包括但不限于-OP(＝O)(OCH3)2、-OP(＝O)(OCH2CH3)2、-OP(＝O)(O-t-Bu)2和-OP(＝O)(OPh)2。
亚磷酸：-OP(OH)2。
亚磷酸酯：-OP(OR)2，其中R为亚磷酸酯取代基，例如，-H、C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。亚磷酸酯基团的实例包括但不限于-OP(OCH3)2、-OP(OCH2CH3)2、-OP(O-t-Bu)2和-OP(OPh)2。
亚磷酰胺：-OP(OR1)-NR2 2，其中R1和R2为亚磷酰胺取代基，例如，-H、(任选取代的)C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。亚磷酰胺基团的实例包括但不限于-OP(OCH2CH3)-N(CH3)2、-OP(OCH2CH3)-N(i-Pr)2和-OP(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2。
磷酰胺：-OP(＝O)(OR1)-NR2 2，其中R1和R2为磷酰胺取代基，例如，-H、(任选取代的)C1-7烷基、C3-20杂环基或C5-20芳基，优选-H、C1-7烷基或C5-20芳基。磷酰胺基团的实例包括但不限于-OP(＝O)(OCH2CH3)-N(CH3)2、-OP(＝O)(OCH2CH3)-N(i-Pr)2和-OP(＝O)(OCH2CH2CN)-N(i-Pr)2。
亚烷基
C3-12亚烷基：如本文所用的术语“C3-12亚烷基”涉及通过从具有3至12个碳原子(除非另外指出)的烃化合物上移除2个氢原子(从同一个碳原子处移除两个氢原子或从两个不同碳原子处各移除一个氢原子)而获得的双齿物部分，其可以是脂族的或脂环族的，并且可以是饱和的、部分不饱和的或完全不饱和的。因此，术语“亚烷基”包括以下论述的亚类亚烯基、亚炔基、亚环烷基等。
直链饱和C3-12亚烷基的实例包括但不限于-(CH2)n-，其中n为3至12的整数，例如，-CH2CH2CH2-(亚丙基)、-CH2CH2CH2CH2-(亚丁基)、-CH2CH2CH2CH2CH2-(亚戊基)和-CH2CH2CH2CH-2CH2CH2CH2-(亚庚基)。
支链饱和C3-12亚烷基的实例包括但不限于-CH(CH3)CH2-、-CH(CH3)CH2CH2-、-CH(CH3)CH2CH2CH2-、-CH2CH(CH3)CH2-、-CH2CH(CH3)CH2CH2-、-CH(CH2CH3)-、-CH(CH2CH3)CH2-和-CH2CH(CH2CH3)CH2-。
直链部分不饱和的C3-12亚烷基(C3-12亚烯基和亚炔基)的实例包括但不限于-CH＝CH-CH2-、-CH2-CH＝CH2-、-CH＝CH-CH2-CH2-、-CH＝CH-CH2-CH2-CH2-、-CH＝CH-CH＝CH-、-CH＝CH-CH＝CH-CH2-、-CH＝CH-CH＝CH-CH2-CH2-、-CH＝CH-CH2-CH＝CH-、-CH＝CH-CH2-CH2-CH＝CH-和-CH2-C≡C-CH2-。
支链部分不饱和的C3-12亚烷基(C3-12亚烯基和亚炔基)的实例包括但不限于-C(CH3)＝CH-、-C(CH3)＝CH-CH2-、-CH＝CH-CH(CH3)-和-C≡C-CH(CH3)-。
脂环族饱和的C3-12亚烷基(C3-12亚环烷基)的实例包括但不限于亚环戊基(例如亚环戊-1,3-基)和亚环己基(例如，亚环己-1,4-基)。
脂环族部分不饱和的C3-12亚烷基(C3-12亚环烷基)的实例包括但不限于亚环戊烯基(例如4-亚环戊烯-1,3-基)、亚环己烯基(例如2-亚环己烯-1,4-基；3-亚环己烯-1,2-基；2,5-亚环己二烯-1,4-基)。
配体单元
用于在本发明的第一方面中使用的配体单元是细胞结合剂，更具体地是在每条重链上具有包含螺环丙基-环戊二烯的至少一个缀合位点的经修饰抗体或其抗原结合片段。根据本发明适用的部分修饰抗体的实例公开于WO2012/064733(作为PCT/US2011/059775提交)中，其以引用方式并入本文。所公开的抗体将需要进一步修饰，以提供螺环丙基-环戊二烯部分，如以下实施例中所述。
用于在本发明的第二方面中使用的配体单元是细胞结合剂，更具体地是具有包含螺环丙基-环戊二烯的至少一个缀合位点的经修饰抗体或其抗原结合片段。
在第一和第二方面的一些实施方案中，PBD缀合至抗体的S239位置。
抗体
术语“抗体”在本文中是在最广泛的意义上加以使用并且具体地涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、以及抗体片段，只要它们显示所期望的生物活性(Miller等(2003)Jour.of Immunology 170:4854-4861)。抗体可以是鼠、人、人源化的、嵌合的、或来源于其他物种。抗体是由免疫系统生成的蛋白质，其能够识别并结合特定抗原。(Janeway,C.、Travers,P.、Walport,M.、Shlomchik(2001)ImmunoBiology,第5版,Garland Publishing,New York)。靶抗原通常具有通过多个抗体上的CDR识别的许多结合位点，也称为表位。特异性结合不同表位的各个抗体具有不同的结构。因此，一种抗原可具有多于一种的对应抗体。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性地结合目标靶标的抗原或其部分的抗原结合位点的分子，此类靶标包括但不限于产生与自身免疫疾病相关的自身免疫抗体的一种或多种癌细胞。免疫球蛋白可以属于免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。免疫球蛋白可以源自任何物种，包括人、鼠、或兔来源。
“抗体片段”包含全长抗体的一部分，通常为其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括F(ab’)2和scFv片段，以及以上任一者的免疫特异性地结合于癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的二聚体表位结合片段、单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
用于本发明的实施方案的肿瘤相关抗原和同源抗体在下文列出，并且更详细地描述于被并入本文的WO 2017/186894的第14页至第86页。
(1)BMPR1B(骨形态发生蛋白受体型IB)
(2)E16(LAT1、SLC7A5)
(3)STEAP1(前列腺的六跨膜上皮抗原)
(4)0772P(CA1 25、MUC16)
(5)MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核细胞增强因子、间皮素)
(6)Napi3b(NAPI-3B，NPTIIb，SLC34A2，溶质载体家族34(磷酸钠)，成员2，II型钠依赖性磷酸转运蛋白3b)
(7)Sema 5b(FLJ10372，KIAA1445，Mm.42015，SEMA5B，SEMAG，Semaphorin 5bHlog，25sema域，7血小板反应蛋白重复(1型和1型样)，跨膜域(TM)和短胞质域(semaphorin5B)
(8)PSCA hlg(2700050C12Rik,C530008O16Rik,RIKEN cDNA 2700050C12,RIKENcDNA 2700050C12基因)
(9)ETBR(内皮素B型受体)
(10)MSG783(RNF124，假定蛋白FLJ20315)
(11)STEAP2(HGNC_8639，IPCA-1，PCANAP1，STAMP1，STEAP2，STMP，前列腺癌相关基因1，前列腺癌相关蛋白1，前列腺的六跨膜上皮抗原2，六跨膜前列腺蛋白)
(12)TrpM4(BR22450，FLJ20041，TRPM4，TRPM4B，瞬时受体电位阳离子5通道，亚家族M，成员4)
(13)CRIPTO(CR，CR1，CRGF，CRIPTO，TDGF1，畸胎癌源性生长因子)
(14)CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/埃-巴二氏病毒受体(Epstein Barrvirus receptor))或Hs.73792)
(15)CD79b(CD79B，CD79β，IGb(免疫球蛋白相关β)，B29)
(16)FcRH2(IFGP4，IRTA4，SPAP1A(SH2域，包含磷酸酶锚定蛋白1a)，SPAP1B，SPAP1C)
(17)HER2(ErbB2)
(18)NCA(CEACAM6)
(19)MDP(DPEP1)
(20)IL20R-α(IL20Ra,ZCYTOR7)
(21)短蛋白聚糖(Brevican)(BCAN，BEHAB)
(22)EphB2R(DRT,ERK,Hek5,EPHT3,Tyro5)
(23)ASLG659(B7h)
(24)PSCA(前列腺干细胞抗原前体)
(25)GEDA
(26)BAFF-R(B细胞活化因子受体，BLyS受体3，BR3)
(27)CD22(B细胞受体CD22-B同种型，BL-CAM，Lyb-8，Lyb8，SIGLEC-2，FLJ22814)
(27a)CD22(CD22分子)
(28)CD79a(CD79A，CD79α)，免疫球蛋白相关的α、B细胞特异性蛋白，其共价相互作用于Igβ(CD79B)并在表面上形成与Ig M分子的复合物，转导涉及B细胞分化的信号，pI:4.84,MW:25028TM:2[P]基因染色体：19q13.2)。
(29)CXCR5(伯基特淋巴瘤受体1，G蛋白偶联受体，其被CXCL13趋化因子活化，在淋巴细胞迁移和体液性防御中起作用，10在HIV-2感染中以及也许在AIDS、淋巴瘤、骨髓瘤、和白血病的发展中起作用)；372aa,pI:8.54MW:41959TM:7[P]基因染色体：11q23.3，
(30)HLA-DOB(MHC II类分子的β亚基(Ia抗原)，其结合肽并20将它们呈递到CD4+T淋巴细胞)；273aa,pI:6.56,MW:30820.TM:1[P]基因染色体：6p21.3)
(31)P2X5(嘌呤能受体P2X配体门控离子通道5，由细胞外ATP门控的离子通道，可能涉及突触传递和神经发生，缺乏可能有助于特发性逼尿肌不稳定的病理生理学)；422aa),pI:7.63,MW:47206TM:1[P]基因染色体：17p13.3)。
(32)CD72(B细胞分化抗原CD72，Lyb-2)；359aa,pI:8.66,MW:40225,TM:15[P]基因染色体：9p13.3)。
(33)LY64(淋巴细胞抗原64(RP105)，富含亮氨酸重复(LRR)家族的I型膜蛋白，调节B细胞活化和细胞凋亡，在患有系统性红斑狼疮的患者中功能的丧失相关于增加的疾病活性)；661aa,pI:6.20,MW:74147TM:1[P]基因染色体：5q12)。
(34)FcRH1(Fc受体样蛋白1，假定受体，用于免疫球蛋白Fc域，其包含C2型Ig样和ITAM域，在B淋巴细胞20分化中可以具有作用)；429aa,pI:5.28,MW:46925TM:1[P]基因染色体：1q21-1q22)
(35)IRTA2(免疫球蛋白超家族受体易位相关的2，假定的免疫受体，其在B细胞的发育和淋巴瘤发生中具有可能的作用；在一些B细胞恶性疾病中发生基因的去调节(通过易位))；977aa,pI:6.88,MW:106468,TM:1[P]基因染色体：1q21)
(36)TENB2(TMEFF2，tomoregulin，TPEF，HPP1，TR，推定的跨膜35蛋白多糖，涉及到生长因子和卵泡抑素的EGF/调蛋白(heregulin)家族)；374aa)
(37)PSMA–FOLH1(叶酸水解酶(前列腺特异性膜抗原)1)
(38)SST(生长抑素受体；注意：存在5种亚型)
(38.1)SSTR2(生长抑素受体2)
(38.2)SSTR5(生长抑素受体5)
(38.3)SSTR1
(38.4)SSTR3
(38.5)SSTR4
AvB6–两种亚基(39+40)
(39)ITGAV(整联蛋白，αV)
(40)ITGB6(整联蛋白,β6)
(41)CEACAM5(癌胚抗原相关细胞粘附分子5)
(42)MET(met原癌基因；肝细胞生长因子受体)
(43)MUC1(粘蛋白1(Mucin 1)，细胞表面相关的)
(44)CA9(碳酸酐酶IX)
(45)EGFRvIII(表皮生长因子受体(EGFR)，转录变体3，
(46)CD33(CD33分子)
(47)CD19(CD19分子)
(48)IL2RA(白细胞介素2受体，α)；NCBI参考序列：NM_000417.2)；
(49)AXL(AXL受体酪氨酸激酶)
(50)CD30-TNFRSF8(肿瘤坏死因子受体超家族，成员8)
(51)BCMA(B细胞成熟抗原)-TNFRSF17(肿瘤坏死因子受体超家族，成员17)
(52)CT Ags–CTA(睾丸癌抗原(Cancer Testis Antigen))
(53)CD174(Lewis Y)-FUT3(岩藻糖基转移酶3(半乳糖苷3(4)-L-岩藻糖基转移酶，路易斯血型)
(54)CLEC14A(C型凝集素域家族14，成员A；Genbank登录号NM175060)
(55)GRP78–HSPA5(热休克70kDa蛋白5(葡萄糖调节蛋白，78kDa)
(56)CD70(CD70分子)L08096
(57)干细胞特异性抗原。例如：
·5T4(见以下条目(63))
·CD25(见以上条目(48))
·CD32
·LGR5/GPR49
·Prominin/CD133
(58)ASG-5
(59)ENPP3(外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶3)
(60)PRR4(富含脯氨酸4(泪腺的))
(61)GCC–GUCY2C(鸟苷酸环化酶2C(热稳定肠毒素受体)
(62)Liv-1–SLC39A6(溶质载体家族39(锌转运蛋白)，成员6)
(63)5T4，滋养层糖蛋白，TPBG–TPBG(滋养层糖蛋白)
(64)CD56–NCMA1(神经细胞粘附分子1)
(65)CanAg(肿瘤相关抗原CA242)
(66)FOLR1(叶酸盐受体1)
(67)GPNMB(糖蛋白(跨膜)nmb)
(68)TIM-1–HAVCR1(甲型肝炎病毒细胞受体1)
(69)RG-1/前列腺肿瘤靶Mindin–Mindin/RG-1
(70)B7-H4–VTCN1(包含T细胞活化抑制剂的V-set域1
(71)PTK7(PTK7蛋白酪氨酸激酶7)
(72)CD37(CD37分子)
(73)CD138-SDC1(多配体聚糖1(syndecan 1))
(74)CD74(CD74分子，主要组织相容性复合物，II类不变链)
(75)Claudins(整合膜连接蛋白)–CLs(Claudins)
(76)EGFR(表皮生长因子受体)
(77)Her3(ErbB3)–ERBB3(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物3(禽))
(78)RON-MST1R(巨噬细胞刺激1受体(c-met相关酪氨酸激酶))
(79)EPHA2(EPH受体A2)
(80)CD20–MS4A1(跨膜4域，亚家族A，成员1)
(81)肌腱蛋白C(Tenascin C)–TNC(肌腱蛋白C)
(82)FAP(成纤维细胞活化蛋白，α)
(83)DKK-1(Dickkopf 1同系物(光滑爪蟾，Xenopus laevis))
(84)CD52(CD52分子)
(85)CS1-SLAMF7(SLAM家族成员7)
(86)Endoglin-ENG(内皮糖蛋白)
(87)膜联蛋白A1-ANXA1(膜联蛋白A1)
(88)V-CAM(CD106)-VCAM1(血管细胞粘附分子1)
治疗方法
本发明的化合物可以用于治疗方法。还提供了一种治疗方法，其包括将治疗有效量的式I的缀合物施用给需要治疗的受试者。术语“治疗有效量”是足以对患者显示益处的量。这样的益处可以是至少改善至少一种症状。施用的实际量以及施用的速率和时程将取决于待治疗对象的特性和严重性。治疗处方，例如对剂量的决定，是在全科医生和其他医生的责任范围内。
可以单独地或与其他治疗组合施用缀合物(同时或相继地，其取决于待治疗的病状)。治疗和疗法的实例包括但不限于化疗(施用活性剂，包括，例如药物；手术；以及放射疗法。
根据本发明和根据本发明应用的药物组合物，除活性组分(即，式I的缀合物)之外，还可以包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其他材料(本领域技术人员众所周知的)。此类材料应为无毒的并且应不干扰活性成分的功效。载体或其他材料的确切性质将取决于施用途径，所述施用途径可以是口服、或通过注射，例如皮肤、皮下、或静脉内注射。
用于口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊剂、粉剂或液体形式。片剂可以包含固体载体或佐剂。液体药物组合物通常包含液体载体，如水、石油、动物油或植物油、矿物油或合成油。可包含生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖溶液或二醇类如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。胶囊剂可以包含固体载体如明胶。
对于静脉内、皮肤或皮下注射、或在痛苦部位处的注射，活性成分将具有肠胃外可接受的水性溶液的形式，所述水性溶液是无热原的并具有适宜的pH、等渗性和稳定性。本领域的相关技术人员使用例如等渗媒介物如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏注射液完全能够制备合适的溶液。根据需要，可以包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。
缀合物可用于治疗增殖性疾病和自身免疫疾病。术语“增殖性疾病”涉及过度或异常细胞的不需要的或不受控制的细胞增殖，这是不期望的，如赘生物或增生性生长(无论是在体外或体内)。
增殖性病状的实例包括但不限于良性、恶化前、和恶性细胞增殖，包括但不限于赘生物和肿瘤(例如组织细胞瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、骨瘤)、癌症(例如肺癌、小细胞肺癌、胃肠癌、肠癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、脑癌、肉瘤、骨肉瘤、卡波西肉瘤、黑素瘤)、白血病、银屑癣、骨疾病、纤维增殖性病症(例如结缔组织的纤维增殖性病症)、以及动脉粥样硬化。其他所关注的癌症包括但不限于血液学；恶性肿瘤，如白血病和淋巴瘤，如非霍奇金淋巴瘤、以及亚型如DLBCL、边缘区、外套层和滤泡、霍奇金淋巴瘤、AML、以及B或T细胞来源的其他癌症。
自身免疫疾病的实例包括以下：类风湿性关节炎、自身免疫性脱髓鞘疾病(例如，多发性硬化症、变态反应性脑脊髓炎)、银屑病性关节炎、内分泌眼病、葡萄膜视网膜炎、全身性红斑狼疮、重症肌无力、格雷夫斯病、肾小球肾炎、自身免疫性肝病、炎症性肠病(例如，克罗恩病)、过敏性反应、变态反应、舍格伦综合症、I型糖尿病、原发性胆汁性肝硬化、韦氏肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)、纤维肌痛症、多肌炎、皮肌炎、多发性内分泌衰竭、施密特氏综合征(Schmidt’s syndrome)、自身免疫性葡萄膜炎、爱迪生氏病(Addison’sdisease)、肾上腺炎、甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、自身免疫性甲状腺疾病、恶性贫血、胃萎缩、慢性肝炎、狼疮样肝炎、动脉粥样硬化、亚急性皮肤型红斑狼疮、甲状旁腺功能减退症、德雷斯勒综合征(Dressler’s syndrome)、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少性紫癜、溶血性贫血、寻常型天疱疮、天疱疮、疱疹样皮炎、斑秃、类天疱疮、硬皮病、进行性全身性硬化症、CREST综合征(钙质沉着、雷诺氏现象、食道运动功能障碍、指端硬化以及毛细管扩张)、男性和女性自身免疫性不孕、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎、混合性结蒂组织病、结节性多动脉炎、系统性坏死性血管炎、过敏性皮肤炎、特应性鼻炎、肺出血-肾炎综合征(Goodpasture’s syndrome)、查加斯病(Chagas’disease)、结节病、风湿热、哮喘、复发性流产、抗磷脂综合征、农民肺、多形性红斑、心脏切开后综合征、库欣综合征(Cushing’s syndrome)、自身免疫性慢性活动性肝炎、养鸟人肺(bird-fancier’slung)、中毒性表皮坏死松解症、Alport综合征、肺泡炎、过敏性肺泡炎、纤维性肺泡炎、间质性肺病、结节性红斑、坏疽性脓皮病、输血反应、大动脉炎、风湿性多肌痛、颞动脉炎、血吸虫病、巨细胞动脉炎、蛔虫病、曲霉病、阿司匹林三联症(Sampter’s syndrome)、湿疹、淋巴瘤样肉芽肿病、贝切特氏病(Behcet’s disease)、卡普兰综合征(Caplan’s syndrome)、川崎氏病(Kawasaki’s disease)、登革热、脑脊髓炎、心内膜炎、心内膜心肌纤维化、眼内炎、持久性隆起性红斑(erythema elevatum et diutinum)、银屑病、胎儿成红细胞增多症、嗜酸细胞性筋膜炎、舒尔曼综合征(Shulman’s syndrome)、费尔蒂氏综合征(Felty’ssyndrome)、丝虫病、睫状体炎、慢性睫状体炎、异时睫状体炎、富克斯氏睫状体炎、IgA肾病、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、移植物抗宿主病、移植排斥反应、心肌症、伊顿-兰伯特综合征(Eaton-Lambert syndrome)、复发性多软骨炎、冷沉球蛋白血症、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulemia)、埃文氏综合征(Evan’s syndrome)以及自身免疫性腺衰竭。
在一些实施方案中，自身免疫性疾病是B淋巴细胞的失调(例如，系统性红斑狼疮、肺出血-肾炎综合征、类风湿性关节炎以及I型糖尿病)、Th1淋巴细胞的失调(例如，类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病、干燥综合征、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯病、原发性胆汁性肝硬化、韦氏肉芽肿病、肺结核、或移植物抗宿主病)、或Th2淋巴细胞的失调(例如，特应性皮炎、系统性红斑狼疮、特应性哮喘、结膜炎、过敏性鼻炎、欧门氏综合征(Omenn’ssyndrome)、系统性硬化症、或慢性移植物抗宿主病)。一般而言，涉及树突状细胞的病症涉及Th1淋巴细胞或Th2淋巴细胞的失调。在一些实施方案中，自身免疫性病症是T细胞介导的免疫学病症。
在一些实施方案中，所施用的缀合物的量在约0.01mg/kg/剂量至约10mg/kg/剂量的范围内。在一些实施方案中，所施用的缀合物的量在约0.01mg/kg/剂量至约5mg/kg/剂量的范围内。在一些实施方案中，所施用的缀合物的量在约0.05mg/kg/剂量至约5mg/kg/剂量的范围内。在一些实施方案中，所施用的缀合物的量在约0.1mg/kg/剂量至约5mg/kg/剂量的范围内。在一些实施方案中，所施用的缀合物的量在约0.1mg/kg/剂量至约4mg/kg/剂量的范围内。在一些实施方案中，所施用的缀合物的量在约0.05mg/kg/剂量至约3mg/kg/剂量的范围内。在一些实施方案中，所施用的缀合物的量在约0.1mg/kg/剂量至约3mg/kg/剂量的范围内。在一些实施方案中，所施用的缀合物的量在约0.1mg/kg/剂量至约2mg/kg/剂量的范围内。
药物负载量
药物负载量(p)是每个细胞结合剂(例如抗体)的PBD药物的平均数量。
在本发明的第一方面，其通常为1。然而，任何组合物可包含其中PBD被缀合的抗体和其中PBD未被缀合的抗体。因此，对于组合物，药物负载量(或DAR)可小于1，例如0.75和更高、0.80和更高、0.85和更高、0.90和更高或0.95和更高。
在第二方面，药物负载量由p表示。药物负载量可在每个细胞结合剂1至8个药物(D)的范围内，其中1、2、3、4、5、6、7和8个药物部分与细胞结合剂共价连接。缀合物的组合物包括与一定范围的药物(1至8)缀合的细胞结合剂(例如，抗体)的集合。
可以通过常规方法如UV、反相HPLC、HIC、质谱法、ELISA测定和电泳来表征来自缀合反应的ADC的制剂中每个抗体的药物的平均数量。还可以确定就p而言ADC的数量分布。通过ELISA，可确定ADC的特定制剂中p的平均值(Hamblett等(2004)Clin.Cancer Res.10:7063-7070；Sanderson等(2005)Clin.Cancer Res.11:843-852)。然而，通过ELISA的抗体-抗原结合和检测限，无法辨别p(药物)值的分布。此外，用于检测抗体-药物缀合物的ELISA测定不确定在何处药物部分连接至抗体，如重链或轻链片段，或特定氨基酸残基。在一些情况下，可以通过如反相HPLC或电泳的手段来实现其中p是一定值的均质ADC与具有其他药物负载量的ADC的分离、纯化和表征。这样的技术也适用于其他类型的缀合物。
在一个实施方案中，每个细胞结合剂的二聚体吡咯并苯并二氮杂
Figure BDA0002799301700000351
基团的平均数量在1至20的范围内。在一些实施方案中，所述范围选自1至8、2至8、2至6、2至4以及4至8。
一般合成路线
PBD化合物的合成在以下参考文献中进行了广泛论述，论述内容以引用方式并入本文：
a)WO 00/12508(第14至30页)；
b)WO 2005/023814(第3至10页)；
c)WO 2004/043963(第28至29页)；以及
d)WO 2005/085251(第30至39页)。
合成路线
式1的用于制备本发明的第一方面的缀合物的药物-接头：
Figure BDA0002799301700000361
其中RL1和RL2是在与抗体缀合时形成RLL1和RLL2的基团，可以由式2的化合物合成：
Figure BDA0002799301700000362
其中R2、R6、R7、R9、R11a、R6’、R7’、R9’、R11a’、Y、Y’和R”如对于本发明的第一方面的缀合物所定义，Rpre-L1为RL1的前体并且Rpre-L2为RL2的前体–此方法尤其适用于其中RL1和RL2具有式IIIa的式I的化合物。对于这些化合物，Rpre-L1和Rpre-L2将通常是RL1和RL2的一部分，如式IIIa的基团：
Figure BDA0002799301700000363
在这种情况下，该反应涉及添加基团GL(在缀合时形成GLL的一部分的基团)。
式2的化合物可通过对式3的化合物去保护来制备：
Figure BDA0002799301700000371
其中R2、R6、R7、R9、R11a、R6’、R7’、R9’、R11a’、Y、Y’和R”如对于式I的化合物所定义，Rpre -L1Prot为Rpre-L1的受保护型式，Rpre-L2Prot为Rpre-L2的受保护型式，并且Prot代表适当的羧基/羟基保护基。
式3的化合物可通过式4的化合物的环闭合制备：
Figure BDA0002799301700000372
其中环闭合通过氧化(例如Swern)进行。
式4的化合物可由式5的化合物合成：
Figure BDA0002799301700000373
通过添加两个氨基保护基实现。如果所述基团不同，逐步添加可以通过简单保护一个氨基(例如通过Fmoc)，然后在另一个氨基上安装期望的保护基来实现。此后可以移除简单的保护基，并且接着安装其他期望的氨基保护基。
式5的化合物可以通过已知方法合成，如WO 2011/130598中公开的那些。
用于形成本发明的第二方面的缀合物的药物接头可以如本领域所述进行合成，如在WO2018/069490、WO2014/057074、WO2011/130598中。
药物缀合物的合成
可以将抗体缀合至通常如实施例中所述的药物接头化合物。
另外优选项
以下优选项可应用于如上所述的本发明的所有方面，或者可以涉及单个方面。优选项可以任何组合被组合在一起。
R6’、R7’、R9’、R11a’和Y’分别选自与R6、R7、R9、R11a和Y相同的基团。在一些实施方案中，R6’、R7’、R9’、R11a’和Y’分别与R6、R7、R9、R11a和Y相同。
在一些实施方案中，R12与R2相同。
二聚体连接
在一些实施方案中，Y和Y’均为O。
在一些实施方案中，R”是不具有取代基的C3-7亚烷基。在这些实施方案的一些中，R”是C3、C5或C7亚烷基。具体地讲，R”可以是C3或C5亚烷基。
在其他实施方案中，R”是下式的基团：
Figure BDA0002799301700000381
其中r为1或2。
R6至R9
在一些实施方案中，R9是H。
在一些实施方案中，R6选自H、OH、OR、SH、NH2、硝基和卤素，并且可选自H或卤素。在这些实施方案的一些中，R6是H。
在一些实施方案中，R7选自H、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’以及卤素。在这些实施方案的一些中，R7选自H、OH和OR，其中R选自任选取代的C1-7烷基、C3-10杂环基以及C5-10芳基。R可更优选地为C1-4烷基，它可以是或可以不是被取代的。感兴趣的取代基为C5-6芳基(例如苯基)。7位上特别优选的取代基为OMe和OCH2Ph。其他特别感兴趣的取代基为二甲氨基(即–NMe2)；-(OC2H4)qOMe，其中q为0至2；含氮C6杂环基，包括吗啉代、哌啶基和N-甲基-哌嗪基。
这些实施方案和优选项分别适用于R9’、R6’和R7’。
D和D’
在一些实施方案中，D和D’分别为D1和D’1。
在一些实施方案中，D和D’分别为D2和D’2。
R2
当C2与C3之间存在双键时，R2选自：
(a)C5-10芳基，其任选地被一个或多个选自包括以下的组的取代基取代：卤素、硝基、氰基、醚、C1-7烷基、C3-7杂环基以及双-氧基-C1-3亚烷基；
(b)C1-5饱和脂族烷基；
(c)C3-6饱和环烷基；
(d)
Figure BDA0002799301700000391
其中R11、R12和R13中的每一个独立地选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基和环丙基，其中R2基团中碳原子的总数不超过5；
(e)
Figure BDA0002799301700000392
其中R15a和R15b中的一个是H并且另一个选自：苯基，所述苯基任选地被选自卤素甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基；以及
(f)
Figure BDA0002799301700000393
其中R14选自：H；C1-3饱和烷基；C2-3烯基；C2-3炔基；环丙基；苯基，所述苯基任选地被选自卤素甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基。
当R2为C5-10芳基时，它可以是C5-7芳基。C5-7芳基可以是苯基或C5-7杂芳基，例如呋喃基、苯硫基和吡啶基。在一些实施方案中，R2优选为苯基。在其他实施方案中，R2优选为苯硫基，例如，苯硫-2-基和苯硫-3-基。
当R2为C5-10芳基时，它可以是C8-10芳基，例如喹啉基或异喹啉基。喹啉基或异喹啉基可通过任何可用环位置结合PBD核心。例如，喹啉基可为喹啉-2-基、喹啉-3-基、喹啉-4基、喹啉-5-基、喹啉-6-基、喹啉-7-基以及喹啉-8-基。在这些喹啉基中，喹啉-3-基和喹啉-6-基可为优选的。异喹啉基可为异喹啉-1-基、异喹啉-3-基、异喹啉-4基、异喹啉-5-基、异喹啉-6-基、异喹啉-7-基以及异喹啉-8-基。在这些异喹啉基中，异喹啉-3-基和异喹啉-6-基可为优选的。
当R2是C5-10芳基时，它可携带任何数目的取代基。优选携带1至3个取代基，更优选1和2个取代基，并且最优选单取代基。取代基可以是任何位置。
在R2为C5-7芳基的情况下，单个取代基优选地处于和连接化合物的其余部分的键不相邻的环原子上，即，它优选地在连接化合物的其余部分的键的β或γ位。因此，在C5-7芳基为苯基的情况下，取代基优选地处于间位或对位，并且更优选处于对位。
在R2为C8-10芳基(例如喹啉基或异喹啉基)的情况下，它可在喹啉或异喹啉环的任何位置上携带任何数目的取代基。在一些实施方案中，它具有一个、两个或三个取代基，并且这些取代基可以在近侧环或远侧环或两者(如果多于一个取代基)上。
R2取代基，当R2为C5-10芳基时
如果R2上的取代基在R2为C5-10芳基时为卤素，那么它优选为F或Cl，更优选Cl。
如果R2上的取代基在R2为C5-10芳基时为醚，那么在一些实施方案中它可以是烷氧基，例如，C1-7烷氧基(例如甲氧基、乙氧基)或在一些实施方案中它可以是C5-7芳氧基(例如苯氧基、吡啶氧基、呋喃氧基)。烷氧基本身可进一步被取代，例如被氨基(例如二甲氨基)取代。
如果R2上的取代基在R2为C5-10芳基时为C1-7烷基，那么它可优选为C1-4烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基)。
如果R2上的取代基在R2为C5-10芳基时为C3-7杂环基，那么它在一些实施方案中可以是C6含氮杂环基，例如吗啉代、硫吗啉代、哌啶基、哌嗪基。这些基团可以通过氮原子结合PBD部分的其余部分。这些基团可被例如C1-4烷基进一步取代。如果C6含氮杂环基是哌嗪基，则所述另外的取代基可在第二氮环原子上。
如果R2上的取代基在R2为C5-10芳基时为双-氧基-C1-3亚烷基，这优选为双-氧基-亚甲基或双-氧基-亚乙基。
如果R2上的取代基在R2为C5-10芳基时为酯，这优选为甲基酯或乙基酯。
当R2为C5-10芳基时特别优选的取代基包括甲氧基、乙氧基、氟、氯、氰基、双-氧基-亚甲基、甲基-哌嗪基、吗啉代以及甲基-苯硫基。R2的其他特别优选的取代基是二甲基氨基丙氧基和羧基。
当R2为C5-10芳基时特别优选的取代的R2基团包括但不限于4-甲氧基-苯基、3-甲氧基苯基、4-乙氧基-苯基、3-乙氧基-苯基、4-氟-苯基、4-氯-苯基、3,4-双氧基亚甲基-苯基、4-甲基苯硫基、4-氰基苯基、4-苯氧基苯基、喹啉-3-基和喹啉-6-基、异喹啉-3-基和异喹啉-6-基、2-噻吩基、2-呋喃基、甲氧基萘基以及萘基。另一种可能的取代的R12基团为4-硝基苯基。特别感兴趣的R12基团包括4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基和3,4-双氧基亚甲基-苯基。
当R2是C1-5饱和的脂族烷基时，它可以是甲基、乙基、丙基、丁基或戊基。在一些实施方案中，它可以是甲基、乙基或丙基(正戊基或异丙基)。在这些实施方案的一些中，它可以是甲基。在其他实施方案中，它可以是丁基或戊基，其可以是直链或支链的。
当R2是C3-6饱和环烷基时，它可以是环丙基、环丁基、环戊基或环己基。
在一些实施方案中，它可以是环丙基。
当R2为
Figure BDA0002799301700000421
时，R11、R12和R13中的每一个独立地选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基和环丙基，其中R2基团中碳原子的总数不超过5。在一些实施方案中，R2基团中碳原子的总数不超过4或不超过3。
在一些实施方案中，R11、R12和R13中的一个是H，并且其他两个基团选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基以及环丙基。
在其他实施方案中，R11、R12和R13中的两个是H，并且另一个基团选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基以及环丙基。
在一些实施方案中，不是H的基团选自甲基和乙基。在这些实施方案的一些中，不是H的基团是甲基。
在一些实施方案中，R11是H。
在一些实施方案中，R12是H。
在一些实施方案中，R13是H。
在一些实施方案中，R11和R12是H。
在一些实施方案中，R11和R13是H。
在一些实施方案中，R12和R13是H。
特别感兴趣的R2基团为：
Figure BDA0002799301700000422
当R2为
Figure BDA0002799301700000423
时，R15a和R15b中的一个是H并且另一个选自：苯基，所述苯基任选地被选自卤素、甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基。在一些实施方案中，不是H的基团是任选取代的苯基。如果苯基任选取代基为卤素，那么它优选是氟。在一些实施方案中，苯基是未取代的。
当R2为
Figure BDA0002799301700000424
时，R14选自：H；C1-3饱和烷基；C2-3烯基；C2-3炔基；环丙基；苯基，所述苯基任选地被选自卤素甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基。如果苯基任选取代基为卤素，那么它优选是氟。在一些实施方案中，苯基是未取代的。
在一些实施方案中，R14选自H、甲基、乙基、乙烯基和乙炔基。在这些实施方案的一些中，R14选自H和甲基。
当C2与C3之间存在单键时，
R2为H或
Figure BDA0002799301700000431
其中R16a和R16b独立地选自H、F、C1-4饱和烷基、C2-3烯基，所述烷基和烯基任选地被选自C1-4烷基酰氨基和C1-4烷基酯的基团取代；或，当R16a和R16b中的一个是H时，另一个选自腈和C1-4烷基酯。
在一些实施方案中，R2是H。
在一些实施方案中，R2为
Figure BDA0002799301700000432
在一些实施方案中，优选的是R16a和R16b均为H。
在其他实施方案中，优选的是R16a和R16b均为甲基。
在另外的实施方案中，优选的是R16a和R16b中的一个是H，并且另一个选自C1-4饱和烷基、C2-3烯基，所述烷基和烯基是任选取代的。在这些另外的实施方案中，可进一步优选的是，不是H的基团选自甲基和乙基。
R22
当C2’与C3’之间存在双键时，R22选自：
(a)C5-10芳基，其任选地被一个或多个选自包括以下的组的取代基取代：卤素、硝基、氰基、醚、C1-7烷基、C3-7杂环基以及双-氧基-C1-3亚烷基；
(b)C1-5饱和脂族烷基；
(c)C3-6饱和环烷基；
(d)
Figure BDA0002799301700000433
其中R31、R32和R33中的每一个独立地选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基和环丙基，其中R22基团中碳原子的总数不超过5；
(e)
Figure BDA0002799301700000441
其中R25a和R25b中的一个是H并且另一个选自：苯基，所述苯基任选地被选自卤素甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基；以及
(f)
Figure BDA0002799301700000442
其中R24选自：H；C1-3饱和烷基；C2-3烯基；C2-3炔基；环丙基；苯基，所述苯基任选地被选自卤素甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基。
当R22为C5-10芳基时，它可以是C5-7芳基。C5-7芳基可以是苯基或C5-7杂芳基，例如呋喃基、苯硫基和吡啶基。在一些实施方案中，R22优选为苯基。在其他实施方案中，R22优选为苯硫基，例如，苯硫-2-基和苯硫-3-基。
当R22为C5-10芳基时，它可以是C8-10芳基，例如喹啉基或异喹啉基。喹啉基或异喹啉基可通过任何可用环位置结合PBD核心。例如，喹啉基可为喹啉-2-基、喹啉-3-基、喹啉-4基、喹啉-5-基、喹啉-6-基、喹啉-7-基以及喹啉-8-基。在这些喹啉基中，喹啉-3-基和喹啉-6-基可为优选的。异喹啉基可为异喹啉-1-基、异喹啉-3-基、异喹啉-4基、异喹啉-5-基、异喹啉-6-基、异喹啉-7-基以及异喹啉-8-基。在这些异喹啉基中，异喹啉-3-基和异喹啉-6-基可为优选的。
当R22是C5-10芳基时，它可携带任何数目的取代基。优选携带1至3个取代基，更优选1和2个取代基，并且最优选单取代基。取代基可以是任何位置。
在R22为C5-7芳基的情况下，单个取代基优选地处于和连接化合物的其余部分的键不相邻的环原子上，即，它优选地在连接化合物的其余部分的键的β或γ位。因此，在C5-7芳基为苯基的情况下，取代基优选地处于间位或对位，并且更优选处于对位。
在R22为C8-10芳基(例如喹啉基或异喹啉基)的情况下，它可在喹啉或异喹啉环的任何位置上携带任何数目的取代基。在一些实施方案中，它具有一个、两个或三个取代基，并且这些取代基可以在近侧环或远侧环或两者(如果多于一个取代基)上。
R22取代基，当R22为C5-10芳基时
如果R22上的取代基在R22为C5-10芳基时为卤素，那么它优选为F或Cl，更优选Cl。
如果R22上的取代基在R22为C5-10芳基时为醚，那么在一些实施方案中它可以是烷氧基，例如，C1-7烷氧基(例如甲氧基、乙氧基)或在一些实施方案中它可以是C5-7芳氧基(例如苯氧基、吡啶氧基、呋喃氧基)。烷氧基本身可进一步被取代，例如被氨基(例如二甲氨基)取代。
如果R22上的取代基在R22为C5-10芳基时为C1-7烷基，那么它可优选为C1-4烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基)。
如果R22上的取代基在R22为C5-10芳基时为C3-7杂环基，那么它在一些实施方案中可以是C6含氮杂环基，例如吗啉代、硫吗啉代、哌啶基、哌嗪基。这些基团可以通过氮原子结合PBD部分的其余部分。这些基团可被例如C1-4烷基进一步取代。如果C6含氮杂环基是哌嗪基，则所述另外的取代基可在第二氮环原子上。
如果R22上的取代基在R22为C5-10芳基时为双-氧基-C1-3亚烷基，这优选为双-氧基-亚甲基或双-氧基-亚乙基。
如果R22上的取代基在R22为C5-10芳基时为酯，这优选为甲基酯或乙基酯。
当R22为C5-10芳基时特别优选的取代基包括甲氧基、乙氧基、氟、氯、氰基、双-氧基-亚甲基、甲基-哌嗪基、吗啉代以及甲基-苯硫基。R22的其他特别优选的取代基是二甲基氨基丙氧基和羧基。
当R22为C5-10芳基时特别优选的取代的R22基团包括但不限于4-甲氧基-苯基、3-甲氧基苯基、4-乙氧基-苯基、3-乙氧基-苯基、4-氟-苯基、4-氯-苯基、3,4-双氧基亚甲基-苯基、4-甲基苯硫基、4-氰基苯基、4-苯氧基苯基、喹啉-3-基和喹啉-6-基、异喹啉-3-基和异喹啉-6-基、2-噻吩基、2-呋喃基、甲氧基萘基以及萘基。另一种可能的取代的R22基团为4-硝基苯基。特别感兴趣的R22基团包括4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基和3,4-双氧基亚甲基-苯基。
当R22是C1-5饱和的脂族烷基时，它可以是甲基、乙基、丙基、丁基或戊基。在一些实施方案中，它可以是甲基、乙基或丙基(正戊基或异丙基)。在这些实施方案的一些中，它可以是甲基。在其他实施方案中，它可以是丁基或戊基，其可以是直链或支链的。
当R22是C3-6饱和环烷基时，它可以是环丙基、环丁基、环戊基或环己基。在一些实施方案中，它可以是环丙基。
当R22为
Figure BDA0002799301700000461
时，R31、R32和R33中的每一个独立地选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基和环丙基，其中R22基团中碳原子的总数不超过5。在一些实施方案中，R22基团中碳原子的总数不超过4或不超过3。
在一些实施方案中，R31、R32和R33中的一个是H，并且其他两个基团选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基以及环丙基。
在其他实施方案中，R31、R32和R33中的两个是H，并且另一个基团选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基以及环丙基。
在一些实施方案中，不是H的基团选自甲基和乙基。在这些实施方案的一些中，不是H的基团是甲基。
在一些实施方案中，R31是H。
在一些实施方案中，R32是H。
在一些实施方案中，R33是H。
在一些实施方案中，R31和R32是H。
在一些实施方案中，R31和R33是H。
在一些实施方案中，R32和R33是H。
特别感兴趣的R22基团为：
Figure BDA0002799301700000462
当R22为
Figure BDA0002799301700000471
时，R25a和R25b中的一个是H并且另一个选自：苯基，所述苯基任选地被选自卤素、甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基。在一些实施方案中，不是H的基团是任选取代的苯基。如果苯基任选取代基为卤素，那么它优选是氟。在一些实施方案中，苯基是未取代的。
当R22为
Figure BDA0002799301700000472
时，R24选自：H；C1-3饱和烷基；C2-3烯基；C2-3炔基；环丙基；苯基，所述苯基任选地被选自卤素甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基。如果苯基任选取代基为卤素，那么它优选是氟。在一些实施方案中，苯基是未取代的。
在一些实施方案中，R24选自H、甲基、乙基、乙烯基和乙炔基。在这些实施方案的一些中，R24选自H和甲基。
当C2’与C3’之间存在单键时，
R22为H或
Figure BDA0002799301700000473
其中R26a和R26b独立地选自H、F、C1-4饱和烷基、C2-3烯基，所述烷基和烯基任选地被选自C1-4烷基酰氨基和C1-4烷基酯的基团取代；或，当R26a和R26b中的一个是H时，另一个选自腈和C1-4烷基酯。
在一些实施方案中，R22是H。
在一些实施方案中，R22为
Figure BDA0002799301700000474
在一些实施方案中，优选的是R26a和R26b均为H。
在其他实施方案中，优选的是R26a和R26b均为甲基。
在另外的实施方案中，优选的是R26a和R26b中的一个是H，并且另一个选自C1-4饱和烷基、C2-3烯基，所述烷基和烯基是任选取代的。在这些另外的实施方案中，可进一步优选的是，不是H的基团选自甲基和乙基。
R11
在一些实施方案中，R11a是OH。
在一些实施方案中，R11a是ORA，其中RA是C1-4烷基。在这些实施方案的一些中，RA是甲基。
在第一方面的一些实施方案中，本发明的缀合物具有式Ia、Ib或Ic：
Figure BDA0002799301700000481
其中R2a和R22a相同并选自：
(a)
Figure BDA0002799301700000482
(b)
Figure BDA0002799301700000491
(c)
Figure BDA0002799301700000492
(d)
Figure BDA0002799301700000493
(e)
Figure BDA0002799301700000494
(f)
Figure BDA0002799301700000495
(g)
Figure BDA0002799301700000496
以及
(h)
Figure BDA0002799301700000497
R1a选自甲基和苄基；
RLL1、RLL2和R11a如上文所定义。
在第二方面的一些实施方案中，本发明的缀合物具有DL，其具有式IIIa、IIIb或IIIc：
Figure BDA0002799301700000498
Figure BDA0002799301700000501
其中R2a和R22a相同并选自：
(a)
Figure BDA0002799301700000502
(b)
Figure BDA0002799301700000503
(c)
Figure BDA0002799301700000504
(d)
Figure BDA0002799301700000505
(e)
Figure BDA0002799301700000506
(f)
Figure BDA0002799301700000507
(g)
Figure BDA0002799301700000508
以及
(h)
Figure BDA0002799301700000509
R1a选自甲基和苄基；
RLL1和RLL2如上文所定义。
在本发明的一些实施方案中，R2和R22均包括不超过3个碳原子。因此，在C2与C3之间存在双键的这些实施方案中，R2可选自：
(i)甲基；(v)
Figure BDA00027993017000005010
(ii)乙基；(vi)
Figure BDA00027993017000005011
以及
(iii)丙基；(vi)
Figure BDA0002799301700000511
(iv)环丙基；
因此，在C2与C3之间不存在双键的这些实施方案中，R2可选自：
(i)H；(iii)
Figure BDA0002799301700000512
以及
(ii)
Figure BDA0002799301700000513
(iv)
Figure BDA0002799301700000514
因此，在C2’与C3’之间存在双键的这些实施方案中，R22可选自：
(i)甲基；(v)
Figure BDA0002799301700000515
(ii)乙基；(vi)
Figure BDA00027993017000005112
以及
(iii)丙基；(vi)
Figure BDA0002799301700000517
(iv)环丙基；
因此，在C2’与C3’之间不存在双键的这些实施方案中，R22可选自：
(i)H；(iii)
Figure BDA00027993017000005113
以及
(ii)
Figure BDA0002799301700000519
(iv)
Figure BDA00027993017000005110
在这些实施方案的一些中，R2和R22均包括不超过2个碳原子。
因此，在C2与C3之间存在双键的这些实施方案中，R2可选自：
(i)甲基；(vi)
Figure BDA00027993017000005111
(ii)乙基；以及
因此，在C2与C3之间不存在双键的这些实施方案中，R2可选自：
(i)H；(iii)
Figure BDA0002799301700000521
(ii)
Figure BDA0002799301700000522
以及
因此，在C2’与C3’之间存在双键的这些实施方案中，R22可选自：
(i)甲基；(vi)
Figure BDA0002799301700000523
(ii)乙基；
以及
因此，在C2’与C3’之间不存在双键的这些实施方案中，R22可选自：
(i)H；(iii)
Figure BDA0002799301700000524
(ii)
Figure BDA0002799301700000525
以及
在另外的这些实施方案中，R2和R22均包括不超过1个碳原子。
因此，在C2与C3之间存在双键的这些实施方案中，R2可以是甲基。因此，在C2与C3之间不存在双键的这些实施方案中，R2可选自：
(i)H；以及(ii)
Figure BDA0002799301700000526
因此，在C2’与C3’之间存在双键的这些实施方案中，R22可以是甲基。因此，在C2’与C3’之间不存在双键的这些实施方案中，R22可选自：
(i)H；以(ii)
Figure BDA0002799301700000527
及
不受理论的束缚，在PBD二聚体的C2位置上的取代基小的情况下，据信在这些药物接头中使用葡糖醛酸苷封端单元是特别有利的，因为它显著增加了药物接头的亲水性，从而使药物接头更易缀合至配体单元。
这些实施方案和优选项在适当时也适用于本发明的第二方面。
R10’和R11a’
在第二方面的一个实施方案中，R10’为H，并且R11a’为OH或ORA，其中RA为C1-4烷基。在这些实施方案的一些中，RA是甲基。
在第二方面的另一实施方案中，R10’和R11a’在它们所结合的氮原子与碳原子之间形成氮-碳双键。
在第二方面的另一实施方案中，R10’为H并且R11a’为SOzM，其中z为2或3并且M为一价药学上可接受的阳离子。
M
优选的是M为Na+。
接头(RLL)
GLL
GLL可包括选自以下的基团：
Figure BDA0002799301700000531
Figure BDA0002799301700000541
其中Ar代表C5-6亚芳基，例如亚苯基。
在一些实施方案中，GLL包括选自GLL1-1和GLL1-2的基团。在这些实施方案的一些中，GLL包括GLL1-1。
在一些实施方案中，以上基团(GLL1-1、GLL1-2和GLL2)可与X直接连接。
以上基团(GLL1-1、GLL1-2和GLL2)可通过式IV的基团与CBA连接：
Figure BDA0002799301700000542
其中G指示，其中所述基团连接至GLL1-1、GLL1-2和GLL2；
nn为1至4；
Ra代表饱和或不饱和的(尤其是饱和的)支化或非支化的C1-6亚烷基链，其中至少一个碳(例如1、2或3个碳)被选自O、N、S(O)0-3的杂原子替代，其中所述链任选地被一个或多个独立地选自氧代基、卤素、氨基的基团取代；并且
Re代表H、饱和或不饱和的(尤其是饱和的)支化或非支化的C1-8亚烷基链，其中一个或多个碳任选地被-O-替代并且所述链任选地被一个或多个卤素原子(如碘)、N3或-C2-5炔基取代。
在一些实施方案中，Ra为-(CH2)mC(O)-、-CH2(CH3)C(O)-、-(CH2)mCH2OC(O)-、-CHCHCH2OC(O)-或-OCH2CH2COC(O)-并且m代表0或1。
在一些实施方案中，Re代表H或-CH2OCH2CH2N3。
在一些实施方案中，nn为1。在其他实施方案中，nn为2。在其他实施方案中，nn为3。在其他实施方案中，nn为4。
在一些实施方案中，所述基团通过非天然氨基酸的使用并入抗体中。这种非天然氨基酸可具有式AA：
Figure BDA0002799301700000551
其中G选自GLL1-1、GLL1-2和GLL2的前体。
在这些实施方案的一个中，非天然氨基酸为：
Figure BDA0002799301700000552
在另一实施方案中，所述基团通过式(BB)基团与抗体的缀合而并入。缀合的位点可以是天然氨基酸(如半胱氨酸或赖氨酸)或非天然氨基酸：
Figure BDA0002799301700000553
其中E为基团-C(O)OR55、R55’、–NC(O)R66、-C2-5亚烷基、CH2-O-NH2或卤素如碘；
R55代表C1-6烷基、琥珀酰亚胺、C6F4H(四氟己基)或H：
R55’代表硫桥接基团，例如二溴马来酰亚胺、二氯丙酮或其中任一者的衍生物，
R66代表：
Figure BDA0002799301700000561
其中
R77为任选地携带一个或多个(如一个、两个或三个)选自羟基、磺基、氨基和-(OCH2)vC2-6亚烷基的基团的C1-6亚烷基，和任选地携带一个或多个(如一个、两个或三个)选自羟基、磺基、氨基和-(OCH2)vC2-6亚烷基的基团的苯基，v为整数1、2、3、4或5
Figure BDA0002799301700000562
代表其中所述片段连接至分子的其余部分。
在一个实施方案中，式BB的化合物为：
Figure BDA0002799301700000563
X
X是：
Figure BDA0002799301700000564
其中a＝0至5，b＝0至16，c＝0或1，d＝0至5。
a可以是0、1、2、3、4或5。在一些实施方案中，a是0至3。在这些实施方案的一些中，a是0或1。在另外的实施方案中，a是0。
b可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些实施方案中，b是0至12。在这些实施方案的一些中，b是0至8，并且可以是0、2、4或8。
c可以是0或1。
d可以是0、1、2、3、4或5。在一些实施方案中，d是0至3。在这些实施方案的一些中，d是1或2。在另外的实施方案中，d是2。
在X的一些实施方案中，a是0，c是1且d是2，并且b可以是0至8。在这些实施方案的一些中，b是0、4或8。
QX
在一个实施方案中，QX是氨基酸残基。氨基酸可以是天然氨基酸或非天然氨基酸。
在一个实施方案中，QX选自：Phe、Lys、Val、Ala、Cit、Leu、Ile、Arg和Trp，其中Cit是瓜氨酸。
在一个实施方案中，QX包括二肽残基。二肽中的氨基酸可以是天然氨基酸和非天然氨基酸的任何组合。在一些实施方案中，二肽包含天然氨基酸。在接头是组织蛋白酶不稳定接头的情况下，二肽是组织蛋白酶介导的切割的作用位点。则二肽是组织蛋白酶的识别位点。
在一个实施方案中，QX选自：
CO-Phe-Lys-NH、
CO-Val-Ala-NH、
CO-Val-Lys-NH、
CO-Ala-Lys-NH、
CO-Val-Cit-NH、
CO-Phe-Cit-NH、
CO-Leu-Cit-NH、
CO-Ile-Cit-NH、
CO-Phe-Arg-NH，以及
CO-Trp-Cit-NH；
其中Cit是瓜氨酸。
优选地，QX选自：
CO-Phe-Lys-NH、
CO-Val-Ala-NH、
CO-Val-Lys-NH、
CO-Ala-Lys-NH、
CO-Val-Cit-NH。
最优选地，QX选自CO-Phe-Lys-NH、CO-Val-Cit-NH和CO-Val-Ala-NH。
感兴趣的其他二肽组合包括：
CO-Gly-Gly-NH、
CO-Pro-Pro-NH，以及
CO-Val-Glu-NH。
可使用其他二肽组合，包括Dubowchik等,Bioconjugate Chemistry,2002,13,855-869(其通过引用并入本文)所述的那些。
在一些实施方案中，QX是三肽残基。三肽中的氨基酸可以是天然氨基酸和非天然氨基酸的任何组合。在一些实施方案中，三肽包含天然氨基酸。当接头是组织蛋白酶不稳定接头时，三肽是组织蛋白酶介导的切割的作用位点。则三肽是组织蛋白酶的识别位点。
在一个实施方案中，在适当时，氨基酸侧链被化学保护。侧链保护基可以是如下文所论述的基团。受保护的氨基酸序列可被酶切割。例如，包含Boc侧链保护的Lys残基的二肽序列可被组织蛋白切割。
氨基酸侧链的保护基团是本领域熟知的，并且描述于Novabiochem目录中并且如上所述。
在一个特定实施方案中，本发明的第一方面包括式Id的缀合物：
Figure BDA0002799301700000591
其中m为2至8的整数。
在一些实施方案中，RLL1和RLL2是不同的。
在一些实施方案中，RLL1和RLL2是相同的。
具体地，在其中连接基团不同的实施方案中，差异可仅在G基团中，使得连接基团的其余部分是相同的(以使切割触发物是相同的)。
在一个特定实施方案中，本发明的第二方面包括缀合物，其中DL具有式IIId：
Figure BDA0002799301700000592
其中m是2至8的整数。
在本发明的一些实施方案中，C11取代基可相对于相邻基团处于以下立体化学布置：
Figure BDA0002799301700000601
在其他实施方案中，C11取代基可相对于相邻基团处于以下立体化学布置：
Figure BDA0002799301700000602
特别感兴趣的化合物包括实施例的那些化合物。
实施例
在压力下使用硅胶进行快速色谱。在铝板上利用荧光指示剂，使用MerckKieselgel 60F254硅胶，用薄层色谱(TLC)检查级分的纯度。除非另有说明，否则借助于UV光或碘蒸气来实现TLC的可视化。从VWR U.K.购买萃取和色谱溶剂且不经进一步纯化即使用。所有精细化学品购自Sigma-Aldrich，除非另行指出。聚乙二醇化试剂通过Stratech UK从Quanta biodesign US获得或通过Thermo Fisher从Pierce Scientific获得。
1H和13C NMR光谱在Bruker
Figure BDA0002799301700000603
400光谱仪上获得。耦合常数以赫兹(Hz)给出。化学位移是以从四甲基硅烷往低磁场的每百万分数(ppm)报道。自旋多重态描述为s(单峰)、bs(宽单峰)、d(双重峰)、t(三重峰)和m(多重峰)。
分析型LC/MS条件(用于反应监测和纯度确定)如下：使用Shimadzu
Figure BDA0002799301700000604
LCMS-2020进行阳性模式电喷雾质谱。使用的流动相是溶剂A(具有0.1％甲酸的H2O)和溶剂B(具有0.1％甲酸的CH3CN)。常规3分钟运行的梯度：初始组成5％B保持25秒，然后经1分钟35秒的时段从5％B增加至100％B。组成在100％B处保持50秒，然后在5秒内回到5％B且在此处保持5秒。梯度运行的总持续时间为3.0分钟。15分钟运行的梯度：初始组成5％B保持1.25分钟，然后经8.75分钟的时段从5％B增加至100％B。组成在100％B处保持2.5分钟，然后在30秒内回到5％B且在此处保持2分钟。梯度运行的总持续时间为15.0分钟。流速为0.8毫升/分钟(运行3分钟)和0.5毫升/分钟(运行15分钟)。在254nm下检测。柱：Waters Acquity
Figure BDA0002799301700000611
BEH Shield RP18 1.7μm 2.1x 50mm，在50℃下，配备有Waters Acquity
Figure BDA0002799301700000612
BEH Shield RP18VanGuard前置柱，130A，1.7μm，2.1mm x 5mm(常规3分钟运行)；以Waters Acquity UPLC CSH C18，1.7μ，2.1x 100mm，配备有WatersAcquity
Figure BDA0002799301700000613
BEH Shield RP18 VanGuard前置柱，130A，1.7μm，2.1mm x 5mm(15分钟运行)。
制备型HPLC条件如下：反相超快速高效液相色谱(UFLC)在Shimazdzu
Figure BDA0002799301700000614
机器上使用
Figure BDA0002799301700000615
Gemini NX 5μC18柱(在50℃下)150x 21.2mm进行。使用的洗脱液是溶剂A(具有0.05％甲酸的H2O)和溶剂B(具有0.05％甲酸的CH3CN)。所有UFLC实验均使用梯度条件进行：初始组成13％B，然后以适于实现期望分离的梯度经总共17分钟将组成增加至100％B，接着在100％B下保持1分钟，然后在0.1分钟内回到13％B并且在此处保持1.9分钟。梯度运行的总持续时间为20.0分钟。流速为20.0毫升/分钟并且在254nm和280nm下进行检测。
实施例1
Figure BDA0002799301700000621
Figure BDA0002799301700000631
(a)(S)-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-甲基-2,3-二氢-1H-吡咯-1-基)(4-羟基-5-甲氧基-2-硝基苯基)甲酮(2)
将乙酸锂二水合物(3.52g，34.5mmol，1.0当量)添加到TIPS醚(1)(19.96g，34.5mmol，1.0当量)在DMF/H2O(300mL/4mL)中的经搅拌溶液中。在室温下搅拌所得红色溶液3.5h。将反应混合物用EtOAc(600mL)稀释并且用1M柠檬酸溶液(2x 250mL)、H2O(2x250mL)、饱和盐水(300mL)洗涤并干燥(MgSO4)。在减压下蒸发溶剂，以得到为黄色固体的产物(14.57g，100％)。产物不经进一步纯化即使用。分析数据：LC/MS,RT 1.74min；MS(ES+)m/z(相对强度)423([M+H]+.,100)；445([M+Na])+.,75)。
(b)((戊烷-1,5-二基双(氧基))双(5-甲氧基-2-硝基-4,1-亚苯基))双(((S)-2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-甲基-2,3-二氢-1H-吡咯-1-基)甲酮)(3)
将碳酸钾(5.03g，36.44mmol，1.1当量)添加到苯酚(2)(14g，33.13mmol，1.0当量)和1,5二碘戊烷(21.46g，9.86mL，66.26mmol，2.0当量)在DMF(250mL)中的经搅拌溶液中。将溶液在70℃下加热3.5h。将溶液倒入冰/水的混合物(800mL)中并且用EtOAc(4x 500mL)萃取。合并的萃取物用H2O(2x 250mL)、饱和盐水(400mL)洗涤，干燥(MgSO4)并且在减压下蒸发以得到褐色油状物。通过快速柱色谱[正庚烷/EtOAc 40％至80％，增量为10％]进行纯化，得到为黄色泡沫的产物(12.7g，85％)。分析数据：LC/MS,RT 2.16min；MS(ES+)m/z(相对强度)913([M+H]+.,100)；935([M+Na])+.,100)。
(c)((戊烷-1,5-二基双(氧基))双(2-氨基-5-甲氧基-4,1-亚苯基))双(((S)-2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-甲基-2,3-二氢-1H-吡咯-1-基)甲酮)(4)
用1M HCl(100mL)处理锌粉(19.9g，304mmol，40当量)并在室温下搅拌10分钟。然后将混合物超声波处理10分钟并且通过真空过滤收集活化的锌，然后用1M HCl(50mL)、H2O(至pH 6至7)、MeOH洗涤并在过滤垫上真空干燥。在室温下将活化的锌添加到双硝基化合物(3)(6.94g，7.6mmol，1.0当量)在EtOH/H2O/EtOAc(60mL/4mL/60mL)中的经剧烈搅拌的溶液中。将反应混合物用5％v/v(体积/体积)HCO2H在MeOH(76mL)中的溶液逐滴处理。观察到从绿色到银灰色的颜色变化且放热至42℃。一旦放热已经减弱至30℃，LC/MS指示反应不完全。再添加一部分在MeOH(20mL)中的5％v/v HCO2H并且观察到另外的放热(34℃)。使反应混合物冷却至室温，此时LC/MS的分析显示完全转化为期望产物。将混合物通过
Figure BDA0002799301700000641
过滤并将垫用EtOAc洗涤。将滤液用饱和NaHCO3水溶液(2x 300mL)、水(300mL)、饱和盐水(300mL)洗涤，干燥(MgSO4)，过滤并真空蒸发以提供为黄色泡沫的双苯胺(6.22g，96％)。产物不经进一步纯化即使用。分析数据：LC/MS,RT2.12min；MS(ES+)m/z(相对强度)853([M+H]+.,15)。
(d)双(4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基)((戊烷-1,5-二基双(氧基))双(6-((S)-2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)-4-甲基-2,3-二氢-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-3,1-亚苯基))二氨基甲酸酯(6)
在氩气气氛下，通过注射器将三乙胺(0.171g，235μL，1.69mmol，4.4当量)添加到双苯胺(4)(0.33g，0.38mmol，1.0当量)和三光气(0.082g，0.28mmol，0.72当量)在无水THF中的经搅拌溶液中。将所得悬浮液加热至40℃并且在5min后，在MeOH中取样，以作为双(氨基甲酸甲酯)(bis methyl carbamate)用于LC/MS(MS(ES+)m/z(相对强度)969([M+H]+.,80)；992([M+Na])+.,100)。添加二月桂酸二丁基锡(0.024g，23μL，38μmol，0.1当量)，接着添加固体接头(5)(0.319g，0.85mmol，2.2当量)和三甲胺(0.085g，118μL，0.85mmol，2.2当量)并且将混合物在40℃下，在搅拌、氩气气氛下加热5h。将反应混合物冷却，过滤并且将THF减压蒸发。通过快速柱色谱[CHCl3/MeOH 0％、1％、1.5％、2％，梯度洗脱]纯化残余物，以得到为黄色泡沫的产物(0.42g，66％)。分析数据：LC/MS,RT 2.16min；MS(ES+)m/z(相对强度)1660([M+H]+.,60)；1682([M+Na])+.,65)。
(e)双(4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基)((戊烷-1,5-二基双(氧基))双(6-((S)-2-(羟甲基)-4-甲基-2,3-二氢-1H-吡咯-1-羰基)-4-甲氧基-3,1-亚苯基))二氨基甲酸酯(7)
将对甲苯磺酸(0.296g，1.7mmol，2.2当量)添加到双叔丁基二甲基甲硅烷基醚(6)(1.26g，0.76mmol，1.0当量)处于在THF中的10％v/v H2O中的经搅拌溶液中。将溶液在室温下搅拌18h。将反应混合物用EtOAc(100mL)稀释并且用饱和NaHCO3溶液(2x 100mL)、H2O(100mL)、饱和盐水(100mL)洗涤、干燥(MgSO4)并减压蒸发。通过快速柱色谱[CHCl3/MeOH0％至5％，增量为1％]纯化残余物，以得到为黄色泡沫的产物(0.896g，92％)。分析数据：LC/MS,RT 1.61min；MS(ES+)m/z(相对强度)1432([M+H]+.,5)；1454([M+Na])+.,5)。
(f)双(4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基)8,8’-(戊烷-1,5-二基双(氧基))(11S,11aS,11’S,11a’S)-双(11-羟基-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂
Figure BDA0002799301700000651
-10(5H)-羧酸酯)(8)
将Dess-Martin过碘烷(0.24g，0.57mmol，2.0当量)添加到双-醇(7)在无水DCM(20mL)中的经搅拌溶液中。将所得白色悬浮液在室温下搅拌24h。将反应混合物用DCM(100mL)稀释并且用饱和NaHCO3溶液(2x 100mL)、水(100mL)、饱和盐水(100mL)萃取、干燥(MgSO4)并减压蒸发。通过快速柱色谱[CHCl3/MeOH 0％至3％，增量为0.5％]进行纯化，得到为白色泡沫的产物(0.28g，69％)。分析数据：LC/MS,RT 1.58min；MS(ES+)m/z(相对强度)1428([M+H]+.,20)；1450([M+Na])+.,30)。
(g)双(4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基)8,8’-(戊烷-1,5-二基双(氧基))(11S,11aS,11’S,11a’S)-双(11-羟基-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂
Figure BDA0002799301700000662
-10(5H)-羧酸酯)(9)
将Pd(PPh3)4(8mg，7μmol，0.04当量)添加到双alloc衍生物(8)(0.25g，0.176mmol，1.0当量)和吡咯烷(31mg，36μL，0.44mmol，2.5当量)在无水DCM(10mL)中的经搅拌溶液中。将溶液在室温下搅拌2h。将反应混合物在NH4Cl饱和溶液(50mL)与DCM(50mL)之间分配。将DCM分离并用饱和盐水(100mL)洗涤、干燥(MgSO4)并减压蒸发。将固体残余物用Et2O(3x15mL)研磨/超声波处理并且真空干燥，以得到为白色固体的产物(0.207g，93％)。产物不经进一步纯化即使用。分析数据：LC/MS,RT 1.06min；MS(ES+)m/z(相对强度)630([M+2H]+.,100)。
(h)双(4-((2S,5S)-37-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基-2-甲基-4,7,35-三氧代-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧杂-3,6,34-三氮杂三十七烷酰氨基)苄基)8,8’-(戊烷-1,5-二基双(氧基))(11S,11aS,11’S,11a’S)-双(11-羟基-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂
Figure BDA0002799301700000661
-10(5H)-羧酸酯)(10)
将EDCI.HCl(56mg，0.29mmol，3当量)添加到双-胺(9)(0.123g，98μmol，1.0当量)和
Figure BDA0002799301700000663
OH(0.128g，0.22mmol，2.2当量)在CHCl3(15mL)中的经搅拌溶液中。将反应混合物在室温下搅拌30min，接着用CHCl3(50mL)稀释，用H2O(100mL)、饱和盐水(100mL)洗涤、干燥(MgSO4)并减压蒸发。通过制备型HPLC纯化，接着冻干得到为白色泡沫的产物(0.047g，20％)。分析数据：LC/MS,RT 6.61min；MS(ES+)m/z(相对强度)1205([M+2H]+.,55)。
实施例2
Figure BDA0002799301700000671
双(4-((2S,5S)-25-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基-2-甲基-4,7,23-三氧代-10,13,16,19-四氧杂-3,6,22-三氮杂二十五烷酰氨基)苄基)8,8’-(戊烷-1,5-二基双(氧基))(11S,11aS,11’S,11a’S)-双(11-羟基-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂
Figure BDA0002799301700000672
-10(5H)-羧酸酯)(11)
将DIPEA(30mg，42μL，0.23mmol，3当量)添加到双-胺(9)(98mg，78μmol，1.0当量)和MalPEG4OSu(88mg，0.17mmol，2.2当量)在CHCl3(10mL)中的经搅拌溶液中。将反应混合物在室温下搅拌72h，接着用CHCl3(50mL)稀释，用H2O(100mL)、饱和盐水(100mL)洗涤、干燥(MgSO4)并减压蒸发。通过制备型HPLC纯化，接着冻干得到为白色泡沫的产物(0.043g，25％)。分析数据：LC/MS,RT 6.11min；MS(ES+)m/z(相对强度)1028([M+2H]+.,80)。
实施例3
Figure BDA0002799301700000681
双(4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基)8,8’-(戊烷-1,5-二基双(氧基))(11S,11aS,11’S,11a’S)-双(11-羟基-7-甲氧基-2-甲基-5-氧代-11,11a-二氢-1H-吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮杂
Figure BDA0002799301700000682
-10(5H)-羧酸酯)(12)
将EDCI.HCl(50mg，0.26mmol，3当量)添加到双-胺(9)(0.109g，86.5μmol，1.0当量)和MCOSu(40mg，0.19mmol，2.2当量)在CHCl3(10mL)中的经搅拌溶液中。将反应混合物在室温下搅拌30min，接着用CHCl3(50mL)稀释，用H2O(100mL)、饱和盐水(100mL)洗涤、干燥(MgSO4)并减压蒸发。通过制备型HPLC纯化，接着冻干得到为白色泡沫的产物(0.045g，32％)。分析数据：LC/MS,RT 6.82min；MS(ES+)m/z(相对强度)1646([M+H]+.,20)；1667([M+Na])+.,30)。
实施例4
含螺环戊二烯交联剂和非天然氨基酸(NNAA)使用下文所示的通式结构制备：
图1.1.实施例4中描述的螺环戊二烯交联剂(A)和螺环戊二烯NNAA(B)的一般设计。
CP2-NNAA(16)的合成以可商购获得的NaCp溶液与表氯醇在卡雷拉氏反应(Carreira’s reaction)的修改型式中的反应开始(Ledford,B.E.；Carreira,E.M.,TotalSynthesis of(+)-Trehazolin:Optically Active Spirocycloheptadienes as UsefulPrecursors for the Synthesis of Amino Cyclopentitols.Journal of the AmericanChemical Society 1995,117,11811-11812)，使用外消旋表氯醇，但是可以使用对映异构纯的表氯醇以91％ee合成13。13与氯甲酸4-硝基苯基酯的反应产生活化的氨基甲酸酯14。14与Fmoc-Lys-OH的反应产生Fmoc保护的15，其可使用哌啶去保护，以获得NNAA 16。当储存于-20℃时，其合成中的任一中间体均不表现出二聚化或分解。
CP2官能化的NHS-酯18的合成以13与琥珀酸酐的反应开始，以产生酸17。使酸17与EDC·HCl和N-羟基琥珀酰亚胺反应，以得到NHS酯18。当在室温下储存若干天时，化合物18似乎并不二聚化。
材料和方法：除非另行指出，否则使用试剂级溶剂在N2的气氛下进行反应。经
Figure BDA0002799301700000691
分子筛储存DCM和甲苯。使THF通过活性氧化铝的柱。所有可商购获得的试剂按原样使用。薄层色谱(TLC)使用E.Merck硅胶60F254预涂布板(0.25mm)进行并且通过暴露于紫外光(254nm)可视化或使用对甲氧基苯甲醛、茚三酮或高锰酸钾染色。使用正相硅胶(
Figure BDA0002799301700000692
0.040–0.063mm，Geduran)进行快速柱色谱。在Varian光谱仪(400、500或600MHz)上记录1H NMR光谱并且相对于氘代溶剂信号进行报道。1H NMR光谱的数据报道如下：化学位移(δppm)、多重性、偶合常数(Hz)和积分。在Varian光谱仪(100、125或150MHz)上记录13C NMR光谱。13C NMR光谱的数据就化学位移(δppm)而言进行报道。质谱获自具有场解吸(FD)源的(WatersCorp.)GCT Premier高分辨率飞行时间质谱仪上的UC Santa Barbara质谱设施。
(i)CP2-NNAA(16)的合成
Figure BDA0002799301700000701
(a)螺[2.4]庚-4,6-二烯-1-基甲醇(13)
将环戊二烯化钠(在THF中的2M溶液，10mL，20mmol，4当量)添加至THF(40mL)并冷却至0℃。逐滴添加表氯醇(0.39mL，5.0mmol，1当量)并且将反应物在0℃搅拌1.5h，然后在室温再搅拌2h。将反应用H2O(40mL)淬灭，接着转移至分液漏斗。添加NaHCO3的饱和H2O溶液(40mL)和醚(40mL)并分离各层。将有机层用盐水(40mL)洗涤，经MgSO4干燥，过滤，并且接着移除溶剂。对残余物进行快速柱色谱(己烷:EtOAc，2:1)，得到为棕色油状物的13(0.48g，78％)。
Rf(己烷:EtOAc,2:1):0.22；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ6.64(td,J＝1.6,5.1Hz,1H),6.51(td,J＝1.7,5.1Hz,1H),6.27(tdd,J＝1.0,2.1,5.2Hz,1H),6.12(td,J＝1.7,5.1Hz,1H),4.08-3.88(m,1H),3.59(dd,J＝8.8,11.7Hz,1H),2.48-2.40(m,1H),1.87(dd,J＝4.3,8.7Hz,1H),1.69(dd,J＝4.4,7.0Hz,1H),1.57(br.s.,1H)ppm；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ139.4,133.9,131.7,128.6,64.9,41.9,30.0,17.6ppm。
(b)螺[2.4]庚-4,6-二烯-1-基甲基碳酸4-硝基苯基酯(14)
将13(2.80g，22.9mmol，1当量)添加至DCM(100mL)并冷却至0℃。添加吡啶(4.61mL，57.3mmol，2.5当量)，然后添加氯甲酸4-硝基苯基酯(5.08g，25.2mmol，1.1当量)。将反应物在0℃搅拌，直到起始材料耗尽(TLC，30min)。将反应物倒入分液漏斗中并用NH4Cl的饱和H2O溶液(100mL)洗涤。用DCM(50mL)萃取水层。将有机层合并，用盐水(50mL)洗涤，经Na2SO4干燥、过滤，并移除溶剂。对残余物进行快速柱色谱(己烷:EtOAc，6:1至4:1)，得到为琥珀色油状物的14(5.17g，79％)。
Rf(己烷:EtOAc,4:1):0.28；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.28(d,J＝9.0Hz,2H),7.37(d,J＝9.0Hz,2H),6.62(td,J＝1.7,5.2Hz,1H),6.53(td,J＝1.7,4.8Hz,1H),6.25(td,J＝1.8,5.5Hz,1H),6.11(td,J＝1.6,5.1Hz,1H),4.53(dd,J＝7.6,11.5Hz,1H),4.40(dd,J＝7.4,11.3Hz,1H),2.52(五重峰,J＝7.6Hz,1H),1.92(dd,J＝4.7,8.6Hz,1H),1.76(dd,J＝4.7,6.7Hz,1H)ppm；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ155.4,152.3,145.3,138.6,133.8,131.7,129.4,125.2,121.7,70.9,41.5,24.6,16.9ppm。
(c)Fmoc-Lys(螺[2.4]庚-4,6-二烯-1-基甲基碳酸酯)-OH(15)
将14(5.12g，17.8mmol，1当量)添加至DMF(40mL)，接着添加Fmoc-Lys-OH(7.87g，21.4mmol，1.2当量)和DIPEA(7.44mL，42.7mmol，2.4当量)。搅拌反应物，直到起始材料耗尽(NMR，3.5h)，然后倒入EtOAc(100mL)和H2O(140mL)。将水层用HCl(1M，100mL)酸化至pH 2-3，倒入分液漏斗中，并分离各层。用EtOAc(2x 100mL)萃取水层。将有机层合并，用盐水(100mL)洗涤，经Na2SO4干燥、过滤，并移除溶剂。对残余物进行快速柱色谱(己烷:EtOAc，3:1，接着是DCM:MeOH:AcOH，89:10:1)并移除溶剂。通过将产物悬浮于DCM中，用盐水洗涤，经Na2SO4干燥有机层，过滤，接着移除溶剂来移除残余的AcOH和DMF，得到为蛋壳样泡沫的15(7.43g，81％)。
Rf(DCM:MeOH,90:10):0.39；1H NMR(500MHz,CDCl3)δ8.62(br.s.,1H),7.75(d,J＝7.3Hz,2H),7.66-7.49(m,2H),7.39(t,J＝7.4Hz,2H),7.30(t,J＝7.3Hz,2H),6.54(br.s.,1H),6.47(br.s.,1H),6.21(br.s.,1H),6.04(br.s.,1H),5.74(d,J＝7.3Hz,1H),4.91(br.s.,1H),4.53-4.00(m,5H),3.21-3.00(m,2H),2.97(s,1H),2.90(d,J＝0.8Hz,1H),2.47-2.31(m,1H),1.95-1.27(m,6H)ppm；13C NMR(125MHz,CDCl3)163.2,156.7,143.6,141.2,138.9,134.5,130.9,128.9,127.6,127.0,125.1,119.9,115.6,67.0,66.5,53.5,47.1,41.6,40.4,36.8,31.8,29.2,25.7,22.2,21.4,17.1δppm。
(d)CP2-NNAA(16)
将9(5.50g，10.6mmol，1当量)添加至DMF(150mL)，接着添加哌啶(16.8mL)。搅拌反应物，直到起始材料耗尽(TLC，90min)，接着移除溶剂。将Et2O(100mL)添加至残余物，并且对悬浮液超声处理5min。将悬浮液过滤并用H2O(2x 100mL)和Et2O(100mL)冲洗。将固体悬浮于MeOH(10mL)中，在温和加热(～40℃)下搅拌10min，添加Et2O(40mL)，将悬浮液过滤并用Et2O(2x 50mL)冲洗。将化合物真空干燥，得到为白色粉末的10(2.24g，71％)。
Rf(DCM:MeOH,85:15):0.29；1H NMR(400MHz,DMSO-d6+1滴TFA)δ8.20(br.s.,3H),7.16(t,J＝5.5Hz,1H),6.48(td,J＝1.8,5.1Hz,1H),6.40(d,J＝5.1Hz,1H),6.32(d,J＝5.1Hz,1H),6.12(td,J＝1.9,4.9Hz,1H),4.24(dd,J＝6.7,11.7Hz,1H),3.99(dd,J＝7.6,11.5Hz,1H),3.88(d,J＝5.1Hz,1H),2.94(d,J＝5.9Hz,2H),2.37(五重峰,J＝7.5Hz,1H),1.83-1.63(m,4H),1.44-1.19(m,4H)ppm；13C NMR(100MHz,DMSO-d6+1滴TFA):
171.2,156.2,139.3,135.2,130.4,128.3,65.3,51.9,42.0,29.7,28.9,25.7,21.6,16.4；C15H22N2O4[M]+的MS(EI)准确质量计算值:294.1580,实测值:294.1571。
(ii)CP2-NHS(18)的合成
Figure BDA0002799301700000731
(a)4-氧代-4-(螺[2.4]庚-4,6-二烯-1-基甲氧基)丁酸(17)
将DCM(1.5mL)添加至含有13(0.37g，3.0mmol，1当量)的小瓶。添加Et3N(0.42mL，3.0mmol，1当量)、DMAP(37mg，0.30mmol，0.1当量)和琥珀酸酐(0.33g，3.3mmol，1.1当量)，在空气气氛下将反应物封盖并且在室温搅拌，直到起始材料耗尽(TLC，1.75h)。将反应混合物倒入具有DCM(50mL)的分液漏斗中并用HCl水溶液(1M，50mL)洗涤。用DCM(50mL)萃取水层，将有机层合并，经Na2SO4干燥，过滤并移除溶剂，得到足够纯度的17，以用于下一反应。
Rf(EtOAc):0.56；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ10.60(br.s.,1H),6.57(td,J＝1.9,5.3Hz,1H),6.50(td,J＝1.8,5.1Hz,1H),6.21(td,J＝1.7,5.2Hz,1H),6.07(td,J＝1.8,5.1Hz,1H),4.37(dd,J＝7.4,11.7Hz,1H),4.20(dd,J＝7.0,11.7Hz,1H),2.74-2.57(m,4H),2.42(五重峰,J＝7.8Hz,1H),1.85(dd,J＝4.5,8.4Hz,1H),1.69(dd,J＝4.3,7.0Hz,1H)ppm。
(b)CP2-NHS(18)
将THF(10mL)添加至含有17(理论上3.0mmol，1当量)的小瓶。添加NHS(0.48g，4.2mmol，1.4当量)、EDC·HCl(0.69g，3.6mmol，1.2当量)和DCM(5mL)，在空气气氛下将反应物封盖并在室温搅拌过夜。移除溶剂并且对残余物进行快速柱色谱(己烷:EtOAc，1:1)，得到为无色粘稠油状物的18(0.59g，62％，经两步)。
Rf(己烷:EtOAc,1:1):0.34；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.56(td,J＝1.8,5.1Hz,1H),6.48(td,J＝1.8,5.1Hz,1H),6.21(td,J＝1.6,3.4Hz,1H),6.06(td,J＝1.6,3.4Hz,1H),4.36(dd,J＝7.4,11.7Hz,1H),4.21(dd,J＝7.4,11.7Hz,1H),2.93(t,J＝7.0Hz,2H),2.83(s,4H),2.73(t,J＝7.4Hz,2H),2.42(五重峰,J＝7.6Hz,1H),1.83(dd,J＝4.3,8.6Hz,1H),1.68(dd,J＝4.5,6.8Hz,1H)ppm；13C NMR(100MHz,CDCl3)δ170.8,168.9,167.6,138.8,134.3,131.2,129.0,66.6,41.5,28.6,26.2,25.5,25.1,17.3ppm。
实施例5.用于通过交联剂修饰的mAb制备ADC的CP2二烯-马来酰亚胺缀合
评估用于生物缀合的螺环戊二烯-马来酰亚胺反应的可行性。通过胺反应性异双功能接头引入螺环戊二烯基团。
将CP2官能团引入mAb上：通过赖氨酸伯胺与NHS-酯活化的CP2二烯的反应将CP2二烯官能团安设到IgG1 mAb上。此方法产生随机缀合的酰胺连接的环戊二烯基团。所得抗体称为mAb-CP2-接头，但是在图中也可表示为mAb-CP2。为清晰起见，请参见附图标题。典型的mAb修饰反应如下所述。使用PBS pH 7.2将mAb溶液调节至5mg/mL(3mL，15mg mAb，100nmol，1当量)，接着添加10％v/v 1M NaHCO3。将此溶液在冰上冷却并且添加35μL CP2-NHS(10mM在DMAc中的储液，350nmol，3.5当量)。反应在冰上进行5分钟，接着在连续搅拌的同时在室温反应1h。通过在0℃下针对PBS、1mM EDTA，pH 7.4透析(Slide-A-Lyzer，10kDa MWCO)24h来纯化经反应的mAb。CP2引入如下所述通过完整去糖基化质谱进行定量并且发现在此实施例中为每个mAb 3.29个CP2-接头(以及因此二烯)，这与CP2-NHS至抗体缀合物的94％转化率相对应。
Figure BDA0002799301700000751
方案5.1.利用CP2-NHS修饰mAb
质谱分析：首先，用EndoS(New England BioLabs)将mAb或mAb缀合物去糖基化，这通过将50μL样品(1mg/mL mAb)与5μL glyco缓冲液1(New England BioLabs)和5μLRemove-iT EndoS(在PBS中的1:10稀释液，20,000单位/mL，New England BioLabs)混合，之后在37℃温育1h来实现。通过添加5μL Bond-Breaker TCEP溶液(0.5M，Thermo FisherScientific)并在37℃温育10min来制备还原样品。使用配备有RP-HPLC柱(ZORBAX 300二苯基RRHD，1.8微米，2.1mm x 50mm)的Agilent 6520B Q-TOF质谱仪进行质谱分析。高效液相色谱(HPLC)参数如下：流速，0.5ml/min；流动相A为在HPLC级H2O中的0.1％(v/v)甲酸，并且流动相B为在乙腈中的0.1％(v/v)甲酸。将柱在90％A/10％B中平衡，这也用于对mAb样品脱盐，之后在20％A/80％B中洗脱。收集100-3000m/z、正极性、350℃的气体温度、48lb/in2的雾化器压力和5,000V的毛细管电压的质谱数据。使用供应商提供的(Agilent v.B.04.00)MassHunter定性分析软件分析数据并且使用来自去卷积光谱的峰强度推导出各样品中物类的相对比例。
图2.1.与CP2-NHS反应之前(A)和之后(B)的完整去糖基化质谱。(B)中峰下方的数字指示引入mAb中的CP2-二烯基团的数量。通过峰强度估算CP2-接头引入得到每个mAb3.29个CP2-二烯。
表5.1 CP2-NHS mAb反应的汇总
Figure BDA0002799301700000752
Figure BDA0002799301700000761
实施例6.向抗体中并入CP2-NNAA
评估CP2-NNAA在抗EphA2(1C1)抗体的位置K274或S239中的并入、所表达的mAb的品质，以及在抗体并入后CP2-NNAA二烯的反应性。
制备CP2 NNAA储备溶液：将CP2 NNAA(0.5g，1.7mmol)与7.8mL在H2O中的0.2MNaOH混合。在室温下搅拌所得浆液，直到所有固体都溶解(10分钟)。完全溶解后，使淡黄色溶液通过0.2μm过滤器、等分并储存于-80℃直到使用。此程序产生8.2mL的216mM CP2 NNAA储备溶液。
Figure BDA0002799301700000762
CP2-NNAA的结构
抗体表达：将在Fc位置K274或S239处具有琥珀突变的12G3H11或1C1IgG1抗体基因克隆到专有pOE抗体表达载体中。通过PEImax将构建体，连同编码PylRS双突变体(Y306A/Y384F)或野生型PylRS的质粒和含有tRNA表达盒的串联重复序列的质粒(pORIP 9X tRNA)转染到CHO-G22中(1.5L的G22细胞)。转染之后四小时，向细胞中添加3.3％的补料F9(专有)和0.2％的补料F10(专有)并且将细胞在34度进一步温育。第二天，对于1C1 K274和1C1S239转染细胞，以0.26mM的最终浓度添加CP2-NNAA。在第3天和第7天用6.6％的补料F9和0.4％的补料F10再次喂饲细胞。在第11天将细胞自旋离心沉淀并收获上清液。通过IgSelect亲和柱(GE Health Care Life Science)纯化上清液。将抗体用50mM甘氨酸、30mMNaCl(pH 3.5)洗脱缓冲液洗脱，用1M Tris缓冲液pH 7.5中和并且透析到pH 7.2的PBS中。洗脱抗体的浓度通过280nm处的吸光度测量进行确定。反演计算的滴度为57mg/L(1C1K274CP2-NNAA)和76mg/L(1C1 S239CP2-NNAA)。以类似方式、以较小规模表达12G3H11 mAb，其中改变CP2-NNAA补料浓度。使用标准方法，通过SDS-PAGE对回收抗体进行分析。如下所述还通过尺寸排阻色谱和质谱对抗体进行分析。并入CP2-NNAA的抗体表示为mAb-CP1-NNAA，以将它们与mAb-CP2-接头构建体区分开，或表示为mAb-[位置]CP2-NNAA，其中[位置]指示突变为CP2-NNAA的氨基酸编号和氨基酸符号。
尺寸排阻色谱：使用配备有三重检测器阵列的Agilent 1100Capillary LC系统(Viscotek 301,Viscotek,Houson,TX)进行SEC分析；波长设定为280nm，并且使用pH 6.8的100mM磷酸钠缓冲液以1mL/min的流速在TSK-GEL G3000SWXL柱(Toso Bioscience LLC,Montgomeryville,PA)上跑样。
质谱分析：对于去糖基化的mAb分析，将EndoS(5μL Remove-iT EndoS(在PBS中的1:10稀释液，20,000单位/mL，New England BioLabs)与50μL样品(1mg/mL mAb)和5μLglyco缓冲液1(New England BioLabs)混合，并且之后在37℃温育1h。通过添加5μL Bond-Breaker TCEP溶液(0.5M，Thermo Fisher Scientific)并在37℃温育10min来制备还原样品。使用配备有RP-HPLC柱(ZORBAX 300二苯基RRHD，1.8微米，2.1mm x 50mm)的Agilent6520B Q-TOF质谱仪进行质谱分析。高效液相色谱(HPLC)参数如下：流速，0.5ml/min；流动相A为在HPLC级H2O中的0.1％(v/v)甲酸，并且流动相B为在乙腈中的0.1％(v/v)甲酸。将柱在90％A/10％B中平衡，这也用于对mAb样品脱盐，之后在20％A/80％B中洗脱。收集100-3000m/z、正极性、350℃的气体温度、48lb/in2的雾化器压力和5,000V的毛细管电压的质谱数据。使用供应商提供的(Agilent v.B.04.00)MassHunter定性分析软件分析数据并且使用来自去卷积光谱的峰强度推导出各样品中物类的相对比例。
图3.1.在包含突变或野生型tRS的哺乳动物细胞中表达后12G3H11 K274CP2-NNAAmAb的滴度和细胞活力。培养基中的CP2-NNAA最终浓度在图注说明中指出。具有突变tRS的12G3H11 K274CP2-NNAA mAb表达与具有野生型tRS的叠氮基-赖氨酸相当，具有最小毒性。
表6.1 1C1 K274CP2-NNAA和1C1 S239CP2-NNAA mAb生产的汇总
Figure BDA0002799301700000781
图3.2.去糖基化的1C1 K274CP2-NNAA mAb的质谱分析。A)完整mAb，B)还原mAb缩放以显示轻链(LC)和重链(HC)。观察得到的完整质量密切匹配计算得到的完整质量(147546.03)，从而推定两个CP2-NNAA并入完整的mAb结构中。观察得到的重链质量密切匹配计算得到的重链质量(50325.93)，从而推定一个CP2-NNAA并入抗体重链中。未观察到CP2-NNAA并入mAb轻链。1C1野生型mAb的类似光谱在图3.4中示出。
图3.3.去糖基化的1C1 S239CP2-NNAA mAb的质谱分析。A)完整mAb，B)还原mAb缩放以显示轻链(LC)和重链(HC)。观察得到的完整质量密切匹配计算得到的完整质量(147628.23)，从而推定两个CP2氨基酸并入完整的mAb结构中。观察得到的重链质量密切匹配计算得到的重链质量(50367.03)，从而推定CP2-NNAA并入抗体重链中。未观察到CP2-NNAA并入mAb轻链。1C1野生型mAb的类似光谱在图3.4中示出
图3.4.去糖基化的1C1野生型mAb的质谱分析。A)完整mAb，B)还原mAb缩放以显示轻链(LC)和重链(HC)。A)示出完整mAb的质量范围，B)示出轻链(LC)和重链(HC)的质量范围。
表6.2 1C1-K274CP2-NNAA和1C1-S239CP2-NNAA mAb的质谱数据的汇总
Figure BDA0002799301700000791
图3.5.1C1 K274CP2-NNAA mAb的SEC分析，表明获得单体产物。指示高分子量物类(HMWS)。
图3.6.1C1 S239CP2-NNAA mAb的SEC分析，表明获得单体产物。
图3.7.通过SDS-PAGE进行的1C1-K274CP2-NNAA mAb和1C1-S239CP2-NNAA mAb的分析。
通过质谱确认CP2-NNAA在位置K274和S239处并入抗体中。回收抗体具有高品质，不具有截短产物并且具有非常少的聚集体。对于1C1抗体，考虑到喂饲给细胞少量CP2-NNAA，在2L生产规模下实现的滴度相当高。
实施例7–具有化合物10的抗体-药物缀合物：ConjA
将化合物10以DMSO溶液(3摩尔当量/抗体，0.2微摩尔，在0.5mL DMSO中)的形式添加到4.0mL的在PBS、1mM EDTA，pH 7.4(10.0mg，66.7纳摩尔)中的1C1S239CP2抗体溶液和0.5mL的1M磷酸钠pH 6.0中，实现10％(v/v)最终DMSO浓度和6.0的最终pH。在轻柔振荡下，使溶液在室温下反应过夜。通过添加N-乙酰半胱氨酸(3.3微摩尔，33μL，100mM)淬灭缀合，并且使用FPLC和Superdex 200 26/600柱，利用PBS pH 7.4作为洗脱缓冲液，通过制备型尺寸排阻色谱进行纯化。将包含超过95％单体的级分汇集、浓缩、使用15mL AmiconUltracell 50kDa MWCO自旋过滤器通过自旋过滤缓冲液交换至25mM组氨酸、200mM蔗糖(pH6.0)，无菌过滤并分析。
在Shimadzu Prominence系统上，使用Proteomix HIC Butyl-NP5，5μm，无孔，4.6x35 mm(Sepax)柱，利用1.5M硫酸铵、25mM乙酸钠pH 7.4和25mM乙酸钠pH 7.4以及20％乙腈(v/v)的梯度洗脱，在214nm处对ConjA的纯净样品进行的UHPLC分析显示出未缀合抗体以及单缀合和双缀合的化合物10的混合物，这与每分子抗体0.95分子的化合物10的药物/抗体比率(DAR)相一致。
在Shimadzu Prominence系统上，使用Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAbHTP 4μm 4.6x 150mm柱(具有4μm 3.0x 20mm保护柱)，用含有200mM磷酸钾pH 6.95、250mM氯化钾和10％异丙醇(v/v)的0.3mL/分钟无菌过滤的SEC缓冲液洗脱，在280nm处对ConjA的纯净样品的UHPLC分析显示出99％的单体纯度。UHPLC SEC分析给出最终ConjA浓度为在3.9mL中的1.95mg/mL，获得的ConjA质量为7.6mg(76％收率)。
实施例8–具有化合物11的抗体-药物缀合物：ConjB
将化合物11以DMSO溶液(1.5摩尔当量/抗体，0.1微摩尔，在0.5mL DMSO中)的形式添加到4.0mL的在PBS、1mM EDTA，pH 7.4(10.0mg，66.7纳摩尔)中的1C1S239CP2抗体溶液和0.5mL的1M磷酸钠pH 6.0中，实现10％(v/v)最终DMSO浓度和6.0的最终pH。在轻柔振荡下，使溶液在室温下反应过夜。通过添加N-乙酰半胱氨酸(1.7微摩尔，17μL，100mM)淬灭缀合，并且使用FPLC和Superdex 200 26/600柱，利用PBS pH 7.4作为洗脱缓冲液，通过制备型尺寸排阻色谱进行纯化。将包含超过95％单体的级分汇集、浓缩、使用15mL AmiconUltracell 50kDa MWCO自旋过滤器通过自旋过滤缓冲液交换至25mM组氨酸、200mM蔗糖(pH6.0)，无菌过滤并分析。
在Shimadzu Prominence系统上，使用Proteomix HIC Butyl-NP5，5μm，无孔，4.6x35 mm(Sepax)柱，利用1.5M硫酸铵、25mM乙酸钠pH 7.4和25mM乙酸钠pH 7.4以及20％乙腈(v/v)的梯度洗脱，在214nm处对ConjB的纯净样品进行的UHPLC分析显示出未缀合抗体以及单缀合和双缀合的化合物11的混合物，这与每分子抗体0.97分子的化合物11的药物/抗体比率(DAR)相一致。
在Shimadzu Prominence系统上，使用Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAbHTP 4μm 4.6x 150mm柱(具有4μm 3.0x 20mm保护柱)，用含有200mM磷酸钾pH 6.95、250mM氯化钾和10％异丙醇(v/v)的0.3mL/分钟无菌过滤的SEC缓冲液洗脱，在280nm处对ConjB样品的UHPLC分析显示出99％的单体纯度。UHPLC SEC分析给出最终ConjB浓度为在4.0mL中的1.97mg/mL，并且获得的ConjB质量为7.9mg(79％收率)。
实施例9–具有化合物12的抗体-药物缀合物：ConjC
将化合物12以DMSO溶液(5摩尔当量/抗体，0.17微摩尔，在0.5mL DMSO中)的形式添加到1.75mL的在PBS、1mM EDTA，pH 7.4(5.0mg，33.3纳摩尔)中的1C1S239CP2抗体溶液和0.25mL的1M磷酸钠pH 6.0中，实现10％(v/v)最终DMSO浓度和6.0的最终pH。在轻柔振荡下，使溶液在37℃反应48h。通过添加N-乙酰半胱氨酸(1.67微摩尔，16.7μL，100mM)淬灭缀合，并且使用FPLC和HP-Butyl柱(5mL)，利用1M(NH4)2SO4、25mM磷酸钾pH 6.0和25mM磷酸钾pH6.0梯度运行，通过疏水性相互作用色谱进行纯化。将包含超过95％DAR1的级分汇集、浓缩、使用15mL Amicon Ultracell 50kDa MWCO自旋过滤器通过自旋过滤缓冲液交换至25mM组氨酸、200mM蔗糖(pH 6.0)，无菌过滤并分析。
在Shimadzu Prominence系统上，使用Proteomix HIC Butyl-NP5，5μm，无孔，4.6x35 mm(Sepax)柱，利用1.5M硫酸铵、25mM乙酸钠pH 7.4和25mM乙酸钠pH 7.4以及20％乙腈(v/v)的梯度洗脱，在214nm处对ConjC的纯净样品进行的UHPLC分析显示出一小部分未缀合抗体和大多数单缀合的化合物12，这与每分子抗体0.96分子的化合物12的药物/抗体比率(DAR)相一致。
在Shimadzu Prominence系统上，使用Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAbHTP 4μm 4.6x 150mm柱(具有4μm 3.0x 20mm保护柱)，用含有200mM磷酸钾pH 6.95、250mM氯化钾和10％异丙醇(v/v)的0.3mL/分钟无菌过滤的SEC缓冲液洗脱，在280nm处对ConjC样品的UHPLC分析显示出98％的单体纯度。UHPLC SEC分析给出最终ConjC浓度为在0.75mL中的1.20mg/mL，并且获得的ConjC质量为0.9mg(18％收率)。
实施例10–具有化合物X的抗体-药物缀合物：ConjD
化合物X：
Figure BDA0002799301700000821
是WO2014/057074的化合物B。
将化合物X以DMSO溶液(10摩尔当量/抗体，0.67微摩尔，在0.43mL DMSO中)的形式添加到4.5mL的在PBS、1mM EDTA，pH 7.4中的1C1S239CP2抗体溶液(10.0mg，66.7纳摩尔)中，实现10％(v/v)最终DMSO浓度。在轻柔振荡下，使溶液在室温下反应过夜。通过添加N-乙酰半胱氨酸(3.3微摩尔，33μL，100mM)淬灭缀合，并且使用FPLC和Superdex 200 26/600柱，利用PBS pH 7.4作为洗脱缓冲液，通过制备型尺寸排阻色谱进行纯化。将包含超过95％单体的级分汇集、浓缩、使用15mL Amicon Ultracell 50kDa MWCO自旋过滤器通过自旋过滤缓冲液交换至25mM组氨酸、200mM蔗糖(pH6.0)，无菌过滤并分析。
在Shimadzu Prominence系统上，使用Proteomix HIC Butyl-NP5，5μm，无孔，4.6x35 mm(Sepax)柱，利用1.5M硫酸铵、25mM乙酸钠pH 7.4和25mM乙酸钠pH 7.4以及20％乙腈(v/v)的梯度洗脱，在214nm处对ConjD的纯净样品进行的UHPLC分析显示出未缀合抗体以及单缀合和双缀合的化合物X的混合物，这与每分子抗体1.91分子的化合物X的药物/抗体比率(DAR)相一致。
在Shimadzu Prominence系统上，使用Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAbHTP 4μm 4.6x 150mm柱(具有4μm 3.0x 20mm保护柱)，用含有200mM磷酸钾pH 6.95、250mM氯化钾和10％异丙醇(v/v)的0.3mL/分钟无菌过滤的SEC缓冲液洗脱，在280nm处对ConjD的纯净样品的UHPLC分析显示出99％的单体纯度。UHPLC SEC分析给出最终ConjD浓度为在4.0mL中的1.49mg/mL，获得的ConjD质量为6.0mg(60％收率)。
实施例11-ADC的细胞毒性测定
从T75烧瓶中的亚汇合(80-90％汇合)PC3细胞中抽走培养基并且用PBS(约20ml)冲洗烧瓶并排空。添加胰蛋白酶-EDTA(5ml)，将烧瓶放回37℃充气培养箱，持续至多约5分钟，然后剧烈振打以将细胞从塑料上移去并解离。将细胞悬浮液转移到无菌的50ml螺旋盖离心管中，用生长培养基稀释至15ml的最终体积，然后离心(400g，5min)。抽走上清液并将沉淀物重悬于10ml培养基中。可能需要重复吸吹以产生单分散性的细胞悬浮液。使用LUNAII测量台盼蓝细胞染色细胞的细胞浓度和活力。将细胞稀释至1500个细胞/孔，分配(50μl/孔)到白色96孔平底板中并且在使用之前温育过夜。
通过将过滤灭菌的ADC稀释到细胞培养基中来制备抗体药物缀合物(ADC)(20μg/ml)的储备溶液(1ml)。通过连续转移100μl到900μl的细胞培养基上，在24孔板中制备储备ADC的一组8x 10倍稀释液。将ADC稀释液分配(50μl/孔)到96孔板的4个重复孔中，其含有前一天接种的50μl细胞悬浮液。对照孔接收50μl细胞培养基。在37℃下在CO2-充气培养箱中温育含有细胞和ADC的96孔板，持续6天。在温育期结束时，将板平衡至室温，持续30min，然后将CellTiter-Glo(Promega)分配(100μl/孔)到每个孔中。将板在轨道振荡器上放置2min，之后在室温下稳定化10min。测量孔发光并且细胞存活百分比计算自4个ADC处理孔中的平均发光，相比于4个对照未处理孔中的平均发光(100％)。使用GraphPad Prism，使用非线性曲线拟合算法由剂量-反应数据确定IC50：西格摩德(sigmoidal)剂量反应，X为log(浓度)。用于PC3的细胞生长培养基为：具有谷氨酰胺、10％(v/v)HyCloneTM胎牛血清的F12K。
Figure BDA0002799301700000841
上文提及的所有文档和其他参考文献均以引用方式并入本文。

Claims (113)

1.一种式I的缀合物：
Figure FDA0002799301690000011
其中
Ab为在每条重链上具有至少一个自由缀合位点的经修饰抗体
D代表基团D1或D2：
Figure FDA0002799301690000012
虚线指示C2与C3之间任选存在双键；
当C2与C3之间存在双键时，R2选自由以下组成的组：
(ia)C5-10芳基，其任选地被一个或多个选自包括以下的组的取代基取代：卤素、硝基、氰基、醚、羧基、酯、C1-7烷基、C3-7杂环基以及双-氧基-C1-3亚烷基；
(ib)C1-5饱和脂族烷基；
(ic)C3-6饱和环烷基；
(id)
Figure FDA0002799301690000013
其中R11、R12和R13中的每一个独立地选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基和环丙基，其中所述R2基团中碳原子的总数不超过5；
(ie)
Figure FDA0002799301690000021
其中R15a和R15b中的一个为H并且另一个选自：苯基，所述苯基任选地被选自卤素、甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基；以及
(if)
Figure FDA0002799301690000022
其中R14选自：H；C1-3饱和烷基；C2-3烯基；C2-3炔基；环丙基；苯基，所述苯基任选地被选自卤素、甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基；
当C2与C3之间存在单键时，
R2选自H、OH、F、diF和
Figure FDA0002799301690000023
其中R16a和R16b独立地选自H、F、C1-4饱和烷基、C2-3烯基，所述烷基和烯基任选地被选自C1-4烷基酰氨基和C1-4烷基酯的基团取代；或，当R16a和R16b中的一个是H时，另一个选自腈和C1-4烷基酯；
D’代表基团D’1或D’2：
Figure FDA0002799301690000024
其中虚线指示C2’与C3’之间任选存在双键；
当C2’与C3’之间存在双键时，R22选自由以下组成的组：
(iia)C5-10芳基，其任选地被一个或多个选自包括以下的组的取代基取代：卤素、硝基、氰基、醚、羧基、酯、C1-7烷基、C3-7杂环基以及双-氧基-C1-3亚烷基；
(iib)C1-5饱和脂族烷基；
(iic)C3-6饱和环烷基；
(iid)
Figure FDA0002799301690000031
其中R31、R32和R33中的每一个独立地选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基和环丙基，其中所述R22基团中碳原子的总数不超过5；
(iie)
Figure FDA0002799301690000032
其中R25a和R25b中的一个是H并且另一个选自：苯基，所述苯基任选地被选自卤素、甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基；以及
(iif)
Figure FDA0002799301690000033
其中R24选自：H；C1-3饱和烷基；C2-3烯基；C2-3炔基；环丙基；苯基，所述苯基任选地被选自卤素、甲基、甲氧基的基团取代；吡啶基；以及苯硫基；
当C2’与C3’之间存在单键时，
R22选自H、OH、F、diF和
Figure FDA0002799301690000034
其中R26a和R26b独立地选自H、F、C1-4饱和烷基、C2-3烯基，所述烷基和烯基任选地被选自C1-4烷基酰氨基和C1-4烷基酯的基团取代；或，当R26a和R26b中的一个是H时，另一个选自腈和C1-4烷基酯；
R6和R9独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、硝基、Me3Sn以及卤素；
其中R和R’独立地选自任选取代的C1-12烷基、C3-20杂环基以及C5-20芳基；
R7选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR’、硝基、Me3Sn以及卤素；
R″为C3-12亚烷基，所述链可被一个或多个杂原子，例如O、S、NRN2(其中RN2为H或C1-4烷基)，和/或芳环，例如苯或吡啶中断；
Y和Y’选自O、S或NH；
R11a选自OH、ORA，其中RA为C1-4烷基；
R6’、R7’、R9’和R11a’分别选自与R6、R7、R9和R11a相同的基团；
并且
RLL1和RLL2是在不同位点与所述抗体连接的接头，其独立地选自：
Figure FDA0002799301690000041
其中
Q是：
Figure FDA0002799301690000042
其中QX是使得Q是氨基酸残基、二肽残基或三肽残基；
X是：
Figure FDA0002799301690000043
其中a＝0至5，b＝0至16，c＝0或1，d＝0至5；
GLL为连接至所述抗体的接头，其包括以下基团：
Figure FDA0002799301690000044
2.根据权利要求1所述的缀合物，其中Y和Y’均为O。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的缀合物，其中R”为C3-7亚烷基。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的缀合物，其中R”为下式的基团：
Figure FDA0002799301690000051
其中r为1或2。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的缀合物，其中R9为H。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的缀合物，其中R6为H。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的缀合物，其中R7选自H、OH和OR。
8.根据权利要求7所述的缀合物，其中R7为C1-4烷氧基。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的缀合物，其中D为D1，在C2与C3之间存在双键，并且R2为C5-7芳基。
10.根据权利要求9所述的缀合物，其中R2为苯基。
11.根据权利要求1至8中任一项所述的缀合物，其中D为D1，在C2与C3之间存在双键，并且R2为C8-10芳基。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的缀合物，其中R2携带一至三个取代基。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的缀合物，其中所述取代基选自甲氧基、乙氧基、氟、氯、氰基、双-氧基-亚甲基、甲基-哌嗪基、吗啉代和甲基-苯硫基。
14.根据权利要求1至8中任一项所述的缀合物，其中D为D1，在C2与C3之间存在双键，并且R2为C1-5饱和脂族烷基。
15.根据权利要求14所述的缀合物，其中R2为甲基、乙基或丙基。
16.根据权利要求1至7中任一项所述的缀合物，其中在C2与C3之间存在双键，并且R2为C3-6饱和环烷基。
17.根据权利要求16所述的缀合物，其中R2为环丙基。
18.根据权利要求1至8中任一项所述的缀合物，其中D为D1，在C2与C3之间存在双键，并且R2为下式的基团：
Figure FDA0002799301690000061
19.根据权利要求18所述的缀合物，其中所述R2基团中碳原子的总数不超过4。
20.根据权利要求19所述的缀合物，其中所述R2基团中碳原子的总数不超过3。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的缀合物，其中R11、R12和R13中的一个是H，并且其他两个基团选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基以及环丙基。
22.根据权利要求18至20中任一项所述的缀合物，其中R11、R12和R13中的两个是H，并且另一个基团选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基以及环丙基。
23.根据权利要求1至8中任一项所述的缀合物，其中D为D1，在C2与C3之间存在双键，并且R2为下式的基团：
Figure FDA0002799301690000062
24.根据权利要求23所述的缀合物，其中R2为以下基团：
Figure FDA0002799301690000063
25.根据权利要求1至8中任一项所述的缀合物，其中D为D1，在C2与C3之间存在双键，并且R2为下式的基团：
Figure FDA0002799301690000064
26.根据权利要求25所述的缀合物，其中R14选自H、甲基、乙基、乙烯基以及乙炔基。
27.根据权利要求26所述的缀合物，其中R14选自H和甲基。
28.根据权利要求1至8中任一项所述的缀合物，其中D为D1，在C2与C3之间存在单键，并且R2为H。
29.根据权利要求1至8中任一项所述的缀合物，其中D为D1，在C2与C3之间存在单键，R2为
Figure FDA0002799301690000071
并且R16a和R16b均为H。
30.根据权利要求1至8中任一项所述的缀合物，其中D为D1，在C2与C3之间存在单键，R2为
Figure FDA0002799301690000072
并且R16a和R16b均为甲基。
31.根据权利要求1至8中任一项所述的缀合物，其中D为D1，在C2与C3之间存在单键，R2为
Figure FDA0002799301690000073
R16a和R16b中的一个为H，并且另一个选自C1-4饱和烷基、C2-3烯基，所述烷基和烯基是任选取代的。
32.根据权利要求1至31中任一项所述的缀合物，其中D’为D’1，在C2’与C3’之间存在双键，并且R22为C5-7芳基。
33.根据权利要求32所述的缀合物，其中R22为苯基。
34.根据权利要求1至31中任一项所述的缀合物，其中D’为D’1，在C2’与C3’之间存在双键，并且R22为C8-10芳基。
35.根据权利要求32至34中任一项所述的缀合物，其中R22携带一至三个取代基。
36.根据权利要求32至35中任一项所述的缀合物，其中所述取代基选自甲氧基、乙氧基、氟、氯、氰基、双-氧基-亚甲基、甲基-哌嗪基、吗啉代和甲基-苯硫基。
37.根据权利要求1至31中任一项所述的缀合物，其中D’为D’1，在C2’与C3’之间存在双键，并且R22为C1-5饱和脂族烷基。
38.根据权利要求37所述的缀合物，其中R22为甲基、乙基或丙基。
39.根据权利要求1至31中任一项所述的缀合物，其中D’为D’1，在C2’与C3’之间存在双键，并且R22为C3-6饱和环烷基。
40.根据权利要求39所述的缀合物，其中R22为环丙基。
41.根据权利要求1至31中任一项所述的缀合物，其中D’为D’1，在C2’与C3’之间存在双键，并且R22为下式的基团：
Figure FDA0002799301690000081
42.根据权利要求41所述的缀合物，其中所述R22基团中碳原子的总数不超过4。
43.根据权利要求42所述的缀合物，其中所述R22基团中碳原子的总数不超过3。
44.根据权利要求41至43中任一项所述的缀合物，其中R31、R32和R33中的一个是H，并且其他两个基团选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基以及环丙基。
45.根据权利要求41至43中任一项所述的缀合物，其中R31、R32和R33中的两个是H，并且另一个基团选自H、C1-3饱和烷基、C2-3烯基、C2-3炔基以及环丙基。
46.根据权利要求1至31中任一项所述的缀合物，其中D’为D’1，在C2’与C3’之间存在双键，并且R22为下式的基团：
Figure FDA0002799301690000082
47.根据权利要求46所述的缀合物，其中R22为以下基团：
Figure FDA0002799301690000083
48.根据权利要求1至31中任一项所述的缀合物，其中D’为D’1，在C2’与C3’之间存在双键，并且R22为下式的基团：
Figure FDA0002799301690000091
49.根据权利要求48所述的缀合物，其中R24选自H、甲基、乙基、乙烯基以及乙炔基。
50.根据权利要求49所述的缀合物，其中R24选自H和甲基。
51.根据权利要求1至31中任一项所述的缀合物，其中D’为D’1，在C2’与C3’之间存在单键，并且R22为H。
52.根据权利要求1至31中任一项所述的缀合物，其中D’为D’1，在C2’与C3’之间存在单键，R22为
Figure FDA0002799301690000092
并且R26a和R26b均为H。
53.根据权利要求1至31中任一项所述的缀合物，其中D’为D’1，在C2’与C3’之间存在单键，R22为
Figure FDA0002799301690000093
并且R26a和R26b均为甲基。
54.根据权利要求1至31中任一项所述的缀合物，其中D’为D’1，在C2’与C3’之间存在单键，R22为
Figure FDA0002799301690000094
R26a和R26b中的一个为H，并且另一个选自C1-4饱和烷基、C2-3烯基，所述烷基和烯基是任选取代的。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的缀合物，其中R11a为OH。
56.根据权利要求1至54中任一项所述的缀合物，其中R11a为ORA，其中RA为C1-4烷基。
57.根据权利要求56所述的缀合物，其中RA为甲基。
58.根据权利要求1至57中任一项所述的缀合物，其中R6’选自与R6相同的基团，R7’选自与R7相同的基团，R9’选自与R9相同的基团，R11a’选自与R11a相同的基团，并且Y’选自与Y相同的基团。
59.根据权利要求58所述的缀合物，其中R6’是与R6相同的基团，R7’是与R7相同的基团，R9’是与R9相同的基团，R11a’是与R11a相同的基团，并且Y’是与Y相同的基团。
60.根据权利要求1至59中任一项所述的缀合物，其中R22是与R2相同的基团。
61.根据权利要求1所述的缀合物，其具有式Ia-1、Ia-2或Ia-3：
Figure FDA0002799301690000101
其中R2a和R22a相同并选自：
(a)
Figure FDA0002799301690000102
(b)
Figure FDA0002799301690000111
(c)
Figure FDA0002799301690000112
(d)
Figure FDA0002799301690000113
(e)
Figure FDA0002799301690000114
(f)
Figure FDA0002799301690000115
(g)
Figure FDA0002799301690000116
以及
(h)
Figure FDA0002799301690000117
R1a选自甲基和苄基；
RLL1、RLL2和R11a如权利要求1中所定义。
62.根据前述权利要求中任一项所述的缀合物，其中在每条重链上具有至少一个自由缀合位点的所述经修饰抗体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
63.根据权利要求62所述的缀合物，其中在每条重链上具有至少一个自由缀合位点的所述经修饰抗体为人抗体。
64.根据权利要求62所述的缀合物，其中在每条重链上具有至少一个自由缀合位点的所述经修饰抗体为人源化抗体。
65.根据权利要求62至64中任一项所述的缀合物，其中所述天然链间半胱氨酸残基被取代为缺乏硫醇基团的氨基酸残基。
66.根据权利要求65所述的缀合物，其在每条重链中包括包含适用于与接头缀合的反应性基团的氨基酸残基的至少一个另外的取代。
67.根据权利要求66所述的缀合物，其中所述另外取代的氨基酸为半胱氨酸或非天然氨基酸。
68.一种式II的缀合物：
Ab’-(DL)p (II)，其中DL具有式(III)
Figure FDA0002799301690000121
其中D、R2、R6、R7、R9、R11a、Y、R”、Y’、D’、R6’、R7’、R9’、R11a’和R12(包括相应地C2与C3之间以及C2’与C3’之间的双键的存在或不存在)如权利要求1至60中任一项所定义；
Ab’为抗体；
以下三种情况之一：
(a)R10’为H，并且R11a’为OH或ORA，其中RA为C1-4烷基；
(b)R10’和R11a’在它们所结合的所述氮原子与所述碳原子之间形成氮-碳双键；或
(c)R10’为H并且R11a’为SOzM，其中z为2或3并且M为一价药学上可接受的阳离子；
p为1至20的整数。
69.根据权利要求68所述的缀合物，其中R10’为H，并且R11a’为OH或ORA，其中RA为C1-4烷基。
70.根据权利要求69所述的缀合物，其中RA为甲基。
71.根据权利要求68所述的缀合物，其中R10’和R11a’在它们所结合的所述氮原子与所述碳原子之间形成氮-碳双键。
72.根据权利要求68所述的缀合物，其中R10’为H并且R11a’为SOzM，其中z为2或3并且M为一价药学上可接受的阳离子。
73.根据权利要求68所述的缀合物，其中DL具有式IIIa、IIIb或IIIc：
Figure FDA0002799301690000131
其中R2a和R22a相同并选自：
(a)
Figure FDA0002799301690000132
(b)
Figure FDA0002799301690000133
(c)
Figure FDA0002799301690000134
(d)
Figure FDA0002799301690000135
(e)
Figure FDA0002799301690000136
(f)
Figure FDA0002799301690000137
(g)
Figure FDA0002799301690000138
以及
(h)
Figure FDA0002799301690000141
R1a选自甲基和苄基；
RLL1和RLL2如权利要求68中所定义。
74.根据权利要求68至73中任一项所述的缀合物，其中p为1至8的整数。
75.根据权利要求1至74中任一项所述的缀合物，其中GLL包括选自以下的基团：
Figure FDA0002799301690000142
76.根据权利要求75所述的缀合物，其中GLL包括选自GLL1-1和GLL1-2的基团。
77.根据权利要求76所述的缀合物，其中GLL包括GLL1-1。
78.根据权利要求75至77中任一项所述的缀合物，其中GLL1-1、GLL1-2或GLL2与X直接连接。
79.根据权利要求75至78中任一项所述的缀合物，其中GLL1-1、GLL1-2或GLL2通过式IV的基团与CBA连接：
Figure FDA0002799301690000151
其中G指示，其中所述基团连接至GLL1-1、GLL1-2和GLL2；
nn为1至4；
Ra代表饱和或不饱和的支化或非支化的C1-6亚烷基链，其中至少一个碳被选自O、N、S(O)0-3的杂原子替代，其中所述链任选地被一个或多个独立地选自氧代基、卤素、氨基的基团取代；并且
Re代表H、饱和或不饱和的支化或非支化的C1-8亚烷基链，其中一个或多个碳任选地被-O-替代并且所述链任选地被一个或多个卤素原子、N3或-C2-5炔基取代。
80.根据权利要求79所述的缀合物，其中Ra选自由以下组成的组：-(CH2)mC(O)-、-CH2(CH3)C(O)-、-(CH2)mCH2OC(O)-、-CHCHCH2OC(O)-和-OCH2CH2COC(O)-，并且m代表0或1。
81.根据权利要求79或权利要求80所述的缀合物，其中Re代表H或-CH2OCH2CH2N3。
82.根据权利要求79至81中任一项所述的缀合物，其中nn为1。
83.根据权利要求79至81中任一项所述的缀合物，其中nn为2。
84.根据权利要求79至81中任一项所述的缀合物，其中nn为3。
85.根据权利要求79至81中任一项所述的缀合物，其中nn为4。
86.根据权利要求79至84中任一项所述的缀合物，其中所述基团通过下式AA的非天然氨基酸的使用并入所述抗体中：
Figure FDA0002799301690000161
其中G选自GLL1-1、GLL1-2和GLL2的前体。
87.根据权利要求86所述的缀合物，其中所述非天然氨基酸为：
Figure FDA0002799301690000162
88.根据权利要求79至84中任一项所述的缀合物，其中所述基团通过式(BB)的基团与所述抗体的缀合并入：
Figure FDA0002799301690000163
其中E为基团-C(O)OR55、R55’、–NC(O)R66、-C2-5亚烷基、CH2-O-NH2或卤素如碘；
R55代表C1-6烷基、琥珀酰亚胺、C6F4H(四氟己基)或H：
R55’代表硫桥接基团，例如二溴马来酰亚胺、二氯丙酮或其中任一者的衍生物，
R66代表：
Figure FDA0002799301690000164
其中
R77为任选地携带一个或多个(如一个、两个或三个)选自羟基、磺基、氨基和-(OCH2)vC2-6亚烷基的基团的C1-6亚烷基，和任选地携带一个或多个(如一个、两个或三个)选自羟基、磺基、氨基和-(OCH2)vC2-6亚烷基的基团的苯基，
v为整数1、2、3、4或5
Figure FDA0002799301690000171
代表其中所述片段连接至所述分子的其余部分。
89.根据权利要求88所述的缀合物，其中式BB的所述化合物为：
Figure FDA0002799301690000172
90.根据权利要求1至89中任一项所述的缀合物，其中Qx是选自Phe、Lys、Val、Ala、Cit、Leu、Ile、Arg和Trp的氨基酸残基。
91.根据权利要求1至89中任一项所述的缀合物，其中Qx是选自以下的二肽残基：
CO-Phe-Lys-NH、
CO-Val-Ala-NH、
CO-Val-Lys-NH、
CO-Ala-Lys-NH、
CO-Val-Cit-NH、
CO-Phe-Cit-NH、
CO-Leu-Cit-NH、
CO-Ile-Cit-NH、
CO-Phe-Arg-NH，以及
CO-Trp-Cit-NH。
92.根据权利要求91所述的缀合物，其中QX选自CO-Phe-Lys-NH、CO-Val-Cit-NH和CO-Val-Ala-NH。
93.根据权利要求1至89中任一项所述的缀合物，其中Qx是三肽残基。
94.根据权利要求1至93中任一项所述的缀合物，其中a为0至3。
95.根据权利要求94所述的缀合物，其中a为0。
96.根据权利要求1至95中任一项所述的缀合物，其中b为0至12。
97.根据权利要求96所述的缀合物，其中b为0至8。
98.根据权利要求1至97中任一项所述的缀合物，其中d为0至3。
99.根据权利要求98所述的缀合物，其中d为2。
100.根据权利要求1至93中任一项所述的缀合物，其中a为0，c为1且d为2，并且b为0至8。
101.根据权利要求100所述的缀合物，其中b为0、4或8。
102.根据权利要求1所述的缀合物，其具有式Id：
Figure FDA0002799301690000181
其中m为2至8的整数。
103.根据权利要求68所述的缀合物，其中DL具有式IIId：
Figure FDA0002799301690000191
其中m为2至8的整数。
104.根据权利要求1至103中任一项所述的缀合物，其在治疗中使用。
105.一种药物组合物，其包含如权利要求1至103中任一项所述的缀合物以及药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
106.根据权利要求1至103中任一项所述的缀合物或根据权利要求105所述的药物组合物，其在治疗受试者的增殖性疾病中使用。
107.根据权利要求106所述所使用的缀合物，其中所治疗的所述疾病为癌症。
108.根据权利要求1至103中任一项所述的缀合物或根据权利要求105所述的药物在医学治疗的方法中的用途。
109.一种医学治疗的方法，其包括向患者施用如权利要求105所述的药物组合物。
110.根据权利要求109所述的方法，其中医学治疗的所述方法是用于治疗癌症。
111.根据权利要求110所述的方法，其中与所述缀合物组合地向所述患者施用化学治疗剂。
112.根据权利要求1至103中任一项所述的缀合物在制造用于治疗增殖性疾病的药物的方法中的用途。
113.一种治疗具有增殖性疾病的哺乳动物的方法，包括施用有效量的根据权利要求1至103中任一项所述的缀合物或根据权利要求105所述的药物组合物。
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