TW202308697A - 吡咯并苯并二氮呯共軛物 - Google Patents

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Abstract

一種式I之共軛物：
Figure 111113931-A0101-11-0001-1
其中 Ab為在每一重鏈上具有至少一個自由共軛位置之經修飾抗體 D表示基團D1或D2中之任一者：
Figure 111113931-A0101-11-0001-2
； D’表示基團D’1或D’2中之任一者：

Description

吡咯并苯并二氮呯共軛物
本揭示內容係關於共軛物及用於製造此類共軛物的前驅物藥物鏈接子，該等共軛物包含吡咯并苯并二氮呯(PBD)或相關組成二聚體，其中至少一個PBD相關部分係非烷基化的。
一些吡咯并苯并二氮呯(PBD)具有辨識且結合至特異性DNA序列的能力；較佳序列為PuGPu。第一PBD抗腫瘤抗生素安曲黴素(anthramycin)發現於1965年(Leimgruber 等人， J. Am. Chem. Soc., 87, 5793-5795 (1965)；Leimgruber 等人， J. Am. Chem. Soc., 87, 5791-5793 (1965))。自此之後，已報道了許多天然存在之PBD，且已經開發出用於各種類似物的超過10種合成路線(Thurston 等人， Chem. Rev. 1994, 433-465 (1994))。家族成員包括修道院黴素(abbeymycin) (Hochlowski 等人， J. Antibiotics, 40, 145-148 (1987))、契卡黴素(chicamycin) (Konishi 等人， J. Antibiotics, 37, 200-206 (1984))、DC-81 (Japanese Patent 58-180 487；Thurston 等人， Chem. Brit., 26, 767-772 (1990)；Bose 等人， Tetrahedron, 48, 751-758 (1992))、甲基胺茴黴素(mazethramycin) (Kuminoto 等人， J. Antibiotics, 33, 665-667 (1980))、新茴黴素(neothramycin) A及B (Takeuchi 等人， J. Antibiotics, 29, 93-96 (1976))、波羅茴黴素(porothramycin) (Tsunakawa 等人， J. Antibiotics, 41, 1366-1373 (1988))、普拉卡素(prothracarcin) (Shimizu 等人， J. Antibiotics, 29, 2492-2503 (1982)；Langley及Thurston， J. Org. Chem., 52, 91-97 (1987))、西班米星(DC-102)(Hara 等人， J. Antibiotics, 41, 702-704 (1988)；Itoh 等人， J. Antibiotics, 41, 1281-1284 (1988))、矛黴素(sibiromycin) (Leber 等人， J. Am. Chem. Soc., 110, 2992-2993 (1988))及托马黴素(tomamycin) (Arima 等人， J. Antibiotics, 25, 437-444 (1972))。PBD具有以下一般結構：
Figure 02_image011
它們的不同之處在於其芳香族A環及吡咯并C環兩者中之取代基的數目、類型及位置，以及C環之飽和度。在B環中，在N10-C11位置存在亞胺(N=C)、甲醇胺(NH-CH(OH))或甲醇胺甲基醚(NH-CH(OMe))，該N10-C11位置係負責將DNA烷基化之親電中心。所有已知的天然產物在手性C11a位置處具有( S)-組態，當自C環朝A環觀察時，該位置為該等產物提供右手扭轉。此給予該等產物適當的三維形狀，以達成與B形式DNA之小溝的異螺旋性，導致在結合部位處之適貼配合(Kohn，在 Antibiotics III. (Springer-Verlag, New York, 第3-11頁(1975))中；Hurley及Needham-VanDevanter， Acc. Chem. Res., 19, 230-237 (1986))。該等產物能夠在小溝中形成加合物使得它們能夠干擾DNA處理，因此使得它們能夠用作抗腫瘤劑。
先前已揭示，此分子之生物活性藉由經由其C8/C’-羥基官能性經由柔性伸烷基鏈接子將兩個PBD單元接合在一起而加強(Bose, D.S. 等人， J. Am. Chem. Soc., 114, 4939-4941 (1992)；Thurston, D.E. 等人， J. Org. Chem., 61, 8141-8147 (1996))。PBD二聚體被視為形成序列選擇性DNA損傷，諸如迴文5’-Pu-GATC-Py-3’股間交聯(Smellie, M. 等人， Biochemistry, 42, 8232-8239 (2003)；Martin, C. 等人， Biochemistry, 44, 4135-4147)，其被視為主要負責該等PBD二聚體之生物活性。
PBD二聚體之一個實例為SG2000 (SJG-136)：
Figure 02_image013
(Gregson, S. 等人， J. Med. Chem., 44, 737-748 (2001)；Alley, M.C. 等人， Cancer Research, 64, 6700-6706 (2004)；Hartley, J.A. 等人， Cancer Research, 64, 6693-6699 (2004))，其已作為獨立藥劑參與臨床試驗，例如，NCT02034227研究其在治療急性骨髓性白血病及慢性淋巴細胞性白血病中之用途(參見：https：//www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02034227)。
攜帶C2芳基取代基之二聚PBD化合物，諸如SG2202 (ZC-207)，揭示於WO 2005/085251中：
Figure 02_image015
， 及WO2006/111759中，此類PBD化合物亞硫酸氫鹽，例如SG2285 (ZC-423)：
Figure 02_image017
此等化合物已展示為高度可用之細胞毒性細胞毒性劑(Howard, P.W. 等人， Bioorg. Med. Chem.(2009), doi: 10.1016/j.bmcl.2009.09.012)。
WO 2007/085930描述具有用於連接至諸如抗體之細胞結合劑的鏈接子基團之二聚體PBD化合物的製備。鏈接子存在於將單體PBD單元鏈接至二聚體之橋中。
具有用於連接至諸如抗體之細胞結合劑的鏈接子基團之二聚體PBD化合物描述於WO 2011/130598中。此等化合物中之鏈接子附接至可用的N10位置中之一者，且通常藉由酶對鏈接子基團之作用而裂解。若用封端基保護未結合之N10位置，則例示之封端基具有與至抗體之鏈接子相同的裂解觸發物。
WO 2014/057074描述兩種特定PBD二聚體共軛物，該等共軛物經由一個單體上之N10位置結合，另一PBD單體呈亞胺形式。所揭示之藥物-鏈接子中之一者為SG3249，特司林(Tesirine)：
Figure 02_image019
當與抗DLL3洛伐妥珠單抗(rovalpituzumab)共軛時，其被稱為洛伐妥珠單抗-特司林(Rova-T)，目前正在進行用於治療小細胞肺癌之評估(Tiberghien, A.C. 等人， ACS Med. Chem. Lett., 2016, 7 (11), 983–987；DOI： 10.1021/acsmedchemlett.6b00062)。此藥物-鏈接子與曲妥珠單抗(tratuzumab)之工程化型式及針對人類CD19之人源化抗體的另外共軛物亦在2017年初藉由ADC Therapeutics SA開始試驗(Proceedings of the American Association for Cancer Research，第58卷，2017年4月中之摘要#51及#52)。
WO 2015/052322描述經由一個單體上之N10位置結合的特定PBD二聚體共軛物，另一PBD單體呈亞胺形式。它亦描述經由一個單體上之N10位置結合的特定PBD二聚體共軛物，另一PBD單體具有封端基，該封端基具有與至抗體之鏈接子相同的裂解觸發物：
Figure 02_image021
WO2019/034764揭示PBD二聚體共軛物，其中PBD與經修飾以在每一重鏈上具有至少一個自由共軛位置的抗體共軛，且其中共軛係經由鏈接子經由PBD之每一N10基團實現。
WO2014/096368揭示PBD二聚體共軛物，其中未鏈接至抗體之PBD部分係非烷基化的。
本揭示內容提供包含PBD二聚體之共軛物，其中至少一個PBD部分係非烷基化的(即釋放的部分在N10位置處具有二級胺，而非亞胺或等效基團)，該等PBD二聚體與經修飾以在每一重鏈上具有至少一個自由共軛位置的抗體共軛，且其中共軛係經由鏈接子經由PBD部分之每一N10基團實現。
本揭示內容亦提供適合與經修飾抗體共軛的PBD及相關的二聚體藥物鏈接子，其中至少一個部分係非烷基化的，其中N10基團均攜帶鏈接基團。
本揭示內容之第一態樣提供一種式I之共軛物：
Figure 02_image001
其中 Ab為在每一重鏈上具有至少一個自由共軛位置之經修飾抗體； D表示基團D1或D2中之任一者：
Figure 02_image003
； 虛線指示C2與C3之間可選地存在雙鍵； 當C2與C3之間存在雙鍵時，R 2係選自由以下各者組成之群組： (ia) C 5-10芳基，視情況由選自包含以下各者之群組的一或多個取代基取代：鹵素、硝基、氰基、醚、羧基、酯、C 1-7烷基、C 3-7雜環基及雙-氧基-C 1-3伸烷基； (ib) C 1-5飽和脂族烷基； (ic) C 3-6飽和環烷基； (id)
Figure 02_image025
，其中R 11、R 12及R 13中之每一者係獨立地選自H、C 1‑3飽和烷基、C 2-3烯基、C 2-3炔基及環丙基，其中R 2基團中之碳原子總數不大於5； (ie)
Figure 02_image027
，其中R 15a及R 15b中之一者為H且另一者係選自：苯基，該苯基視情況由選自鹵素、甲基、甲氧基之基團取代；吡啶基；及苯硫基；及 (if)
Figure 02_image029
，其中R 14係選自：H；C 1-3飽和烷基；C 2-3烯基；C 2-3炔基；環丙基；苯基，該苯基視情況由選自鹵素、甲基、甲氧基之基團取代；吡啶基；及苯硫基； 當C2與C3之間存在單鍵時， R 2係選自H、OH、F、diF及
Figure 02_image031
，其中R 16a及R 16b係獨立地選自H、F、C 1-4飽和烷基、C 2-3烯基，該烷基及該烯基視情況由選自C 1-4烷基醯胺基及C 1-4烷基酯之基團取代；或，當R 16a及R 16b中之一者為H時，另一者係選自腈及C 1-4烷基酯； D’表示基團D’1或D’2中之任一者：
Figure 02_image005
其中虛線指示C2’與C3’之間可選地存在雙鍵； 當C2’與C3’之間存在雙鍵時，R 22係選自由以下各者組成之群組： (iia) C 5-10芳基，視情況由選自包含以下各者之群組的一或多個取代基取代：鹵素、硝基、氰基、醚、羧基、酯、C 1-7烷基、C 3-7雜環基及雙-氧基-C 1-3伸烷基； (iib) C 1-5飽和脂族烷基； (iic) C 3-6飽和環烷基； (iid)
Figure 02_image034
，其中R 31、R 32及R 33中之每一者係獨立地選自H、C 1-3飽和烷基、C 2-3烯基、C 2-3炔基及環丙基，其中R 12基團中之碳原子總數不大於5； (iie)
Figure 02_image036
，其中R 25a及R 25b中之一者為H且另一者係選自：苯基，該苯基視情況由選自鹵素、甲基、甲氧基之基團取代；吡啶基；及苯硫基；及 (iif)
Figure 02_image038
，其中R 24係選自：H；C 1-3飽和烷基；C 2-3烯基；C 2-3炔基；環丙基；苯基，該苯基視情況由選自鹵素、甲基、甲氧基之基團取代；吡啶基；及苯硫基； 當C2’與C3’之間存在單鍵時， R 22係選自H、OH、F、diF及
Figure 02_image040
，其中R 26a及R 26b係獨立地選自H、F、C 1-4飽和烷基、C 2-3烯基，該烷基及該烯基視情況由選自C 1-4烷基醯胺基及C 1-4烷基酯之基團取代；或，當R 26a及R 26b中之一者為H時，另一者係選自腈及C 1-4烷基酯； R 6及R 9係獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH 2、NHR、NRR’、硝基、Me 3Sn及鹵素； 其中R及R’係獨立地選自視情況經取代之C 1-12烷基、C 3-20雜環基及C 5-20芳基； R 7係選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH 2、NHR、NRR’、硝基、Me 3Sn及鹵素； R″為C 3-12伸烷基，其鏈可由以下各者斷開：一或多個雜原子，例如O、S、NR N2(其中R N2為H或C 1-4烷基)，及/或芳環，例如苯或吡啶； Y及Y’係選自O、S及NH； R 11a為： (i) H；或 (ii) OH或OR A，其中R A為C 1-4烷基； R 6’、R 7’及R 9’分別選自與R 6、R 7及R 9相同之基團； 且 R LL1及R LL2為在不同位點連接至該抗體之鏈接子，該等鏈接子獨立地為：
Figure 02_image042
， 其中 Q為：
Figure 02_image044
，其中Q X使得Q為胺基酸殘基、二肽殘基、三肽殘基或四肽殘基； X為：
Figure 02_image046
， 其中a = 0至5，b = 0至16，c = 0或1，d = 0至5； G LL為連接至該抗體之鏈接子。
攜帶鏈接基團之N10位置中的至少一者釋放非烷基化PBD (即釋放之部分在N10位置處具有二級胺，而非亞胺或等效基團)。含至少一個二級胺部分之二聚體不能以共價方式交聯DNA，且毒性可低於具有兩個亞胺部分之二聚體(其能夠以共價方式交聯DNA)。
據認為，與由異質混合物組成的具有較高DAR之ADC相比，藉由降低最小有效劑量需求，有效地具有1的藥物抗體比率(DAR)之此類ADC可提供顯著優點，包括降低的脫靶毒性及增強的治療窗口。
不希望受理論限制，避免存在鄰近N10氮上之胺甲酸酯的C11羥基可提高胺甲酸酯之穩定性。羥基接近胺甲酸酯之羰基允許形成內部氫鍵，該內部氫鍵可促成對羰基之親核攻擊更輕率。
為免生懷疑，D1中標記為C3之碳鄰近環接合處之第三N。D’1中標記為C3’之碳鄰近環接合處之第三N。
本揭示內容之第二態樣包含一種具有式II之化合物：
Figure 02_image048
及其鹽及溶劑合物， 其中D、R 2、R 6、R 7、R 9、R 11a、Y、R”、Y’、D’、R 6’、R 7’、R 9’及R 22(包括C2與C3之間及C2’與C3’之間分別存在或不存在雙鍵)如揭示內容之第一態樣中所定義； R L1及R L2為用於連接至細胞結合劑之鏈接子，該等鏈接子獨立地為：
Figure 02_image050
， 其中Q及X如第一態樣中所定義且G L為用於連接至抗體之鏈接子。
本揭示內容之第三態樣提供揭示內容之第一態樣之共軛物在製造用於治療增生性疾病之藥物中的用途。第三態樣亦提供用於治療增生性疾病的揭示內容之第一態樣之共軛物。第三態樣亦提供一種治療增生性疾病之方法，該方法包含向有需要之患者施藥治療有效量的揭示內容之第一態樣之共軛物。
一般熟習此項技術者能夠容易地判定候選共軛物是否治療任何特定細胞類型之增生性病狀。舉例而言，可方便地用於評估由特定化合物提供之活性的測定描述於以下實例中。
本揭示內容之第四態樣提供揭示內容之第一態樣之共軛物的合成，該合成包含使揭示內容之第二態樣的化合物(藥物鏈接子)與如揭示內容之第一態樣中所定義的抗體共軛。
本揭示內容之第五態樣提供一種使用光延反應由式V之化合物製造式IV之化合物之方法：
Figure 02_image052
Figure 02_image054
； 其中R 8’係選自： (a) OMe、OCH 2Ph、OH及-Y’-R”-Hal； (b)
Figure 02_image056
(Vb) (c)
Figure 02_image058
(Vc) R 6、R 7、R 9、R 11a、R 6’、R 7’、R 9’、Y、R”、Y’、D及D’如揭示內容之第一態樣中所定義； Hal為鹵素，諸如Br； R L2pre為R L2的前驅物； R L1pre為R L1的前驅物；且 Prot O為羥基保護基。
前置N10上存在胺甲酸酯防止光延反應進行超過形成二級胺。
定義 取代基
如本文所用的片語「視情況經取代」係關於可為未取代的或可為經取代的親本基團。
除非另有規定，否則如本文所用的術語「經取代」係關於攜帶一或多個取代基之親本基團。術語「取代基」在本文中以習知意義使用且係指以共價方式附接至親本基團或在適當時融合至親本基團的化學部分。熟知廣泛多種取代基，且亦熟知其形成及引入至多種親本基團中之方法。
取代基之實例在下文更詳細地描述。
C 1-12烷基：如本文所用的術語「C 1-12烷基」係關於藉由自具有1至12個碳原子之碳氫化合物的碳原子移除氫原子獲得的一價部分，該一價部分可為脂族的或脂環族的，且可為飽和的或不飽和的(例如部分不飽和的、完全不飽和的)。如本文所用的術語「C 1-4烷基」係關於藉由自具有1至4個碳原子之碳氫化合物的碳原子移除氫原子獲得的一價部分，該一價部分可為脂族的或脂環族的，且可為飽和的或不飽和的(例如部分不飽和的、完全不飽和的)。因此，術語「烷基」包括下文論述之子類烯基、炔基、環烷基等。
飽和烷基之實例包括但不限於甲基(C 1)、乙基(C 2)、丙基(C 3)、丁基(C 4)、戊基(C 5)、己基(C 6)及庚基(C 7)。
飽和直鏈烷基之實例包括但不限於甲基(C 1)、乙基(C 2)、正‑丙基(C 3)、正‑丁基(C 4)、正‑戊基(戊烷基) (C 5)、正己基(C 6)及正庚基(C 7)。
飽和支鏈烷基之實例包括異‑丙基(C 3)、異‑丁基(C 4)、二級‑丁基(C 4)、三級‑丁基(C 4)、異戊基(C 5)及新‑戊基(C 5)。
C 2-12烯基：如本文所用的術語「C 2-12烯基」係關於具有一或多個碳-碳雙鍵之烷基。
不飽和烯基之實例包括但不限於乙烯基(ethenyl、vinyl，-CH=CH 2)、1-丙烯基(-CH=CH-CH 3)、2‑丙烯基(烯丙基，‑CH‑CH=CH 2)、異丙烯基(1-甲基乙烯基，‑C(CH 3)=CH 2)、丁烯基(C 4)、戊烯基(C 5)及己烯基(C 6)。
C 2-12炔基：如本文所用的術語「C 2-12炔基」係關於具有一或多個碳-碳三鍵之烷基。
不飽和炔基之實例包括但不限於乙炔基(-C≡CH)及2‑丙炔基(propynyl、propargyl，-CH 2‑C≡CH)。
C 3-12環烷基：如本文所用的術語「C 3-12環烷基」係關於亦為環基之烷基；即，藉由自環狀碳氫(碳環)化合物之脂環族環原子移除氫原子獲得的一價部分，該部分具有3至7個碳原子，包括3至7個環原子。
環烷基之實例包括但不限於衍生自以下各者之環烷基： 飽和的單環碳氫化合物：環丙烷(C 3)、環丁烷(C 4)、環戊烷(C 5)、環己烷(C 6)、環庚烷(C 7)、甲基環丙烷(C 4)、二甲基環丙烷(C 5)、甲基環丁烷(C 5)、二甲基環丁烷(C 6)、甲基環戊烷(C 6)、二甲基環戊烷(C 7)及甲基環己烷(C 7)； 不飽和的單環碳氫化合物：環丙烯(C 3)、環丁烯(C 4)、環戊烯(C 5)、環己烯(C 6)、甲基環丙烯(C 4)、二甲基環丙烯(C 5)、甲基環丁烯(C 5)、二甲基環丁烯(C 6)、甲基環戊烯(C 6)、二甲基環戊烯(C 7)及甲基環己烯(C 7)；及 飽和的多環碳氫化合物：降蒈烷(C 7)、降蒎烷(C 7)、降莰烷(C 7)。
C 3-20雜環基：如本文所用的術語「C 3-20雜環基」係關於藉由自雜環化合物之環原子移除氫原子獲得的一價部分，該部分具有3至20環原子，其中1至10個環原子為環雜原子。較佳地，每一環具有3至7環原子，其中1至4個環原子為環雜原子。
在此上下文中，前綴(例如C 3-20、C 3-7、C 5-6等)指示環原子之數目或環原子之數目範圍，無論為碳原子或雜原子。舉例而言，如本文所用的術語「C 5‑6雜環基」係關於具有5或6個環原子之雜環基。
單環雜環基之實例包括但不限於衍生自以下各者之單環雜環基： N 1：氮丙啶(C 3)、吖呾(C 4)、吡咯啶(四氫吡咯) (C 5)、二氫吡咯(例如，3‑二氫吡咯、2,5‑二氫吡咯) (C 5)、2H‑吡咯或3H‑吡咯(異吡咯、異唑) (C 5)、哌啶(C 6)、二氫吡啶(C 6)、四氫吡啶(C 6)、氮呯(C 7)； O 1：環氧乙烷(C 3)、氧雜環丁烷(C 4)、氧雜環戊烷(四氫呋喃) (C 5)、氧雜環戊二烯(oxole) (二氫呋喃) (C 5)、噁烷(oxane) (四氫哌喃) (C 6)、二氫哌喃(C 6)、哌喃(C 6)、氧呯(C 7)； S 1：硫環丙烷(C 3)、硫環丁烷(C 4)、硫雜環戊烷(thiolane) (四氫噻吩) (C 5)、噻烷(thiane) (四氫噻喃) (C 6)、硫雜環庚烷(thiepane) (C 7)； O 2：二氧戊環(C 5)、二氧雜環己環(C 6)及二氧雜環庚烷(C 7)； O 3：三噁烷(C 6)； N 2：咪唑啶(C 5)、吡唑啶(二氫噻唑) (C 5)、咪唑啉(C 5)、吡唑啉(二氫吡唑) (C 5)、哌嗪(C 6)； N 1O 1：四氫噁唑(C 5)、二氫噁唑(C 5)、四氫異噁唑(C 5)、二氫異噁唑(C 5)、嗎福林(C 6)、四氫噁嗪(C 6)、二氫噁嗪(C 6)、噁嗪(C 6)； N 1S 1：噻唑啉(C 5)、四氫噻唑(C 5)、硫代嗎福林(C 6)； N 2O 1：噁二嗪(C 6)； O 1S 1：氧硫雜環戊二烯(oxathiole) (C 5)及氧硫雜環己烷(oxathiane) (噻噁烷) (C 6)；及， N 1O 1S 1：噁噻嗪(C 6)。
經取代的單環雜環基之實例包括呈環狀形式的衍生自醣之單環雜環基，例如，呋喃醣(C 5)，諸如阿拉伯呋喃醣、來蘇呋喃醣、核呋喃醣及木呋喃醣；及哌喃醣(C 6)，諸如阿洛哌喃醣、阿卓哌喃醣、葡萄哌喃醣、甘露哌喃醣、古洛哌喃醣、艾杜哌喃醣、半乳哌喃醣及太洛哌喃醣。
C 5-20芳基：如本文所用的術語「C 5-20芳基」係關於藉由自芳香族化合物之芳環原子移除氫原子獲得的一價部分，該部分具有5至20個環原子。如本文所用的術語「C 5-7芳基」係關於藉由自芳香族化合物之芳環原子移除氫原子獲得的一價部分，該部分具有5至7個環原子，且如本文所用的術語「C 5-10芳基」係關於藉由自芳香族化合物之芳環原子移除氫原子獲得的一價部分，該部分具有5至10個環原子。較佳地，每一環具有5至7個環原子。
在此上下文中，前綴(例如C 3-20、C 5-7、C 5-6、C 5-10等)指示環原子之數目或環原子之數目範圍，無論為碳原子或雜原子。舉例而言，如本文所用的術語「C 5‑6芳基」係關於具有5或6個環原子之芳基。
環原子可全部為碳原子，如在「碳芳基」中。碳芳基之實例包括但不限於衍生自以下各者之碳芳基：苯(即苯基)(C 6)、萘(C 10)、薁(C 10)、蒽(C 14)、菲(C 14)、稠四苯(C 18)及芘(C 16)。
包含稠環(其中至少一個為芳環)的芳基之實例包括但不限於衍生自以下各者之基團：茚烷(例如2,3-二氫-1H-茚) (C 9)、茚(C 9)、異茚(C 9)、四氫化萘(1,2,3,4‑四氫萘(C 10)、乙烷合萘(C 12)、茀(C 13)、萉(C 13)、醋菲(acephenanthrene) (C 15)及醋蒽(aceanthrene) (C 16)。
替代地，環原子可包括一或多個雜原子，如在「杂芳基」中。單環杂芳基之實例包括但不限於衍生自以下各者之單環杂芳基： N 1：吡咯(唑) (C 5)、吡啶(嗪) (C 6)； O 1：呋喃(氧雜環戊二烯) (C 5)； S 1：噻吩(硫雜茂) (C 5)； N 1O 1：噁唑(C 5)、異噁唑(C 5)、異噁嗪(C 6)； N 2O 1：噁二唑(呋咱) (C 5)； N 3O 1：噁三唑(C 5)； N 1S 1：噻唑(C 5)、異噻唑(C 5)； N 2：咪唑(1,3‑二唑) (C 5)、吡唑(1,2‑二唑) (C 5)、哒嗪(1,2‑二嗪) (C 6)、嘧啶(1,3‑二嗪) (C 6) (例如，胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)、吡嗪(1,4‑二嗪) (C 6)； N 3：三唑(C 5)、三嗪(C 6)；及， N 4：四唑(C 5)。
包含稠環之雜芳基之實例包括但不限於： C 9(具有2個稠環)，其衍生自苯并呋喃(O 1)、異苯并呋喃(O 1)、吲哚(N 1)、異吲哚(N 1)、吲哚利嗪(N 1)、吲哚啉(N 1)、異吲哚啉(N 1)、嘌呤(N 4) (例如，腺嘌呤、鳥嘌呤)、苯并咪唑(N 2)、吲唑(N 2)、苯并噁唑(N 1O 1)、苯并異噁唑(N 1O 1)、苯并二氧呃(O 2)、苯并呋咱(N 2O 1)、苯并三唑(N 3)、苯并硫呋喃(S 1)、苯并噻唑(N 1S 1)、苯并噻二唑(N 2S)； C 10(具有2個稠環)，其衍生自色烯(O 1)、異色烯(O 1)、色滿(chroman) (O 1)、異色滿(O 1)、苯并二噁烷(O 2)、喹啉(N 1)、異喹啉(N 1)、喹嗪(N 1)、苯并噁嗪(N 1O 1)、苯并二嗪(N 2)、吡啶并吡啶(N 2)、喹噁啉(N 2)、喹唑啉(N 2)、辛啉(N 2)、呔嗪(N 2)、奈啶(N 2)、喋啶(N 4)； C 11(具有2個稠環)，其衍生自苯并二氮呯(N 2)； C 13(具有3個稠環)，其衍生自咔唑(N 1)、二苯并呋喃(O 1)、二苯并噻吩(S 1)、咔啉(N 2)、呸啶(N 2)、吡啶并吲哚(N 2)；及， C 14(具有3個稠環)，其衍生自吖啶(N 1)、二苯并哌喃(O 1)、硫代二苯并哌喃(S 1)、二苯并对二噁英(oxanthrene) (O 2)、氧硫雜蒽(O 1S 1)、啡嗪(N 2)、啡噁嗪(N 1O 1)、啡噻嗪(N 1S 1)、噻蒽(S 2)、啡啶(N 1)、啡啉(N 2)、啡嗪(N 2)。
無論單獨地或作為另一取代基之一部分，以上基團本身可視情況由選自它們及下面列出的額外取代基之一或多個基團取代。
鹵素：‑F、‑Cl、‑Br及‑I。
羥基：‑OH。
醚：‑OR，其中R為醚取代基，例如，C 1‑7烷基(亦被称为C 1‑7烷氧基，在下文論述)、C 3-20雜環基(亦被称为C 3‑20雜環氧基)或C 5‑20芳基(亦被称为C 5‑20芳氧基)，較佳為C 1‑7烷基。
烷氧基：‑OR，其中R為烷基，例如，C 1‑7烷基。C 1‑7烷氧基之實例包括但不限於‑OMe (甲氧基)、‑OEt (乙氧基)、-O(nPr) (正丙氧基)、-O(iPr) (異丙氧基)、‑O(nBu) (正丁氧基)、‑O(sBu) (二級-丁氧基)、‑O(iBu) (異丁氧基)及‑O(tBu) (三級-丁氧基)。
側氧基(酮、-酮)：=O。
醯基(酮基)：‑C(=O)R，其中R為醯基取代基，例如，C 1‑7烷基(亦被称为C 1‑7烷基醯基或C 1‑7鏈烷醯基)、C 3-20雜環基(亦被称为C 3‑20雜環醯基)或C 5‑20芳基(亦被称为C 5‑20芳基醯基)，較佳為C 1‑7烷基。醯基之實例包括但不限於‑C(=O)CH 3(乙醯基)、‑C(=O)CH 2CH 3(丙醯基)、‑C(=O)C(CH 3) 3(三級‑丁醯基)及‑C(=O)Ph (苯甲醯基、醯苯基)。
羧基(羧酸)：‑C(=O)OH。
酯(羧酸酯、羧酸的酯、氧羰基)：‑C(=O)OR，其中R為酯取代基，例如，C 1‑7烷基、C 3‑20雜環基或C 5‑20芳基，較佳為C 1‑7烷基。酯基之實例包括但不限於‑C(=O)OCH 3、‑C(=O)OCH 2CH 3、‑C(=O)OC(CH 3) 3及‑C(=O)OPh。
胺基：‑NR 1R 2，其中R 1及R 2獨立地為胺基取代基，例如，氫、C 1-7烷基(亦被称为C 1‑7烷基胺基或二-C 1‑7烷基胺基)、C 3‑20雜環基或C 5‑20芳基，較佳為H或C 1‑7烷基，或，在「環狀」胺基之情況下，R 1及R 2,與它們附接至的氮原子一起形成具有4至8個環原子之雜環。胺基可為一級的(-NH 2)、二級的(-NHR 1)或三級的(-NHR 1R 2)，且在陽離子形式中，可為四級的(- +NR 1R 2R 3)。胺基之實例包括但不限於‑NH 2、‑NHCH 3、‑NHC(CH 3) 2、‑N(CH 3) 2、‑N(CH 2CH 3) 2及‑NHPh。環狀胺基之實例包括但不限於氮丙啶環、吖呾基、吡咯啶基、哌啶基、哌嗪基、嗎啉基及硫代嗎啉基。
醯胺基(胺甲醯基、胺基甲醯基、胺基羰基、羧基醯胺)：‑C(=O)NR 1R 2，其中R 1及R 2獨立地為胺基取代基，如針對胺基所定義。醯胺基之實例包括但不限於‑C(=O)NH 2、‑C(=O)NHCH 3、‑C(=O)N(CH 3) 2、‑C(=O)NHCH 2CH 3及‑C(=O)N(CH 2CH 3) 2，以及其中R 1及R 2與它們附接的氮原子一起形成雜環結構的醯胺基，如在例如哌啶基羰基、嗎啉基羰基、硫代嗎啉基羰基及哌嗪基羰基中。
硝基：‑NO 2。
氰基(腈、甲腈)：‑CN。
羥基保護基：羥基保護基係此項技術中熟知的，例如，在Wuts & Greene 2007中。適合用於本揭示內容中之彼等基團包括經取代的甲基醚、經取代的乙基醚、甲氧基取代之苄基醚、矽烷基醚及乙酸酯。 三級-丁基二甲基矽烷基(TBS)及三異丙基矽烷基(TIPS)特別相關。
胺保護基：羥基保護基係此項技術中熟知的，例如，在Wuts & Greene 2007中。適合用於本揭示內容中之彼等基團包括胺甲酸酯。烯丙基胺甲酸酯(Alloc)特別相關。 伸烷基
C 3-12伸烷基：如本文所用的術語「C 3-12伸烷基」係關於藉由移除具有3至12個碳原子(除非另有規定)之碳氫化合物的兩個氫原子(均來自同一個碳原子，或來自兩個不同碳原子中之每一者)獲得之雙牙部分，其可為脂族的或脂環族的，且可為飽和的、部分不飽和的或完全不飽和的。因此，術語「伸烷基」包括下文論述之子類亞烯基、亞炔基、伸環烷基等。
直鏈飽和C 3‑12伸烷基之實例包括但不限於‑(CH 2) n-，其中n為3至12之整數，例如，‑CH 2CH 2CH 2- (伸丙基)、‑CH 2CH 2CH 2CH 2- (伸丁基)、‑CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2- (伸戊基)及‑CH 2CH 2CH 2CH‑ 2CH 2CH 2CH 2- (伸庚基)。
支鏈飽和C 3‑12伸烷基之實例包括但不限於‑CH(CH 3)CH 2‑、‑CH(CH 3)CH 2CH 2‑、‑CH(CH 3)CH 2CH 2CH 2‑、‑CH 2CH(CH 3)CH 2‑、‑CH 2CH(CH 3)CH 2CH 2‑、‑CH(CH 2CH 3)‑、‑CH(CH 2CH 3)CH 2‑及‑CH 2CH(CH 2CH 3)CH 2‑。
直鏈的部分不飽和C 3-12伸烷基(C 3-12亞烯基及亞炔基)之實例包括但不限於‑CH=CH‑CH 2‑、‑CH 2-CH=CH 2‑、‑CH=CH‑CH 2‑CH 2‑、‑CH=CH‑CH 2‑CH 2‑CH 2‑、‑CH=CH‑CH=CH-、‑CH=CH‑CH=CH-CH 2‑、-CH=CH-CH=CH-CH 2‑CH 2‑、‑CH=CH-CH 2‑CH=CH-、‑CH=CH‑CH 2‑CH 2‑CH=CH-及-CH 2-C≡C-CH 2-。
支鏈的部分不飽和C 3‑12伸烷基(C 3-12亞烯基及亞炔基)之實例包括但不限於‑C(CH 3)=CH-、‑C(CH 3)=CH‑CH 2‑、‑CH=CH‑CH(CH 3)‑及-C≡C-CH(CH 3)-。
脂環族的飽和C 3‑12伸烷基(C 3-12伸環烷基)之實例包括但不限於伸環戊基(例如伸環戊-1,3-基)及伸環己基(例如伸環己‑1,4‑基)。
脂環族的部分不飽和C 3-12伸烷基(C 3-12伸環烷基)之實例包括但不限於伸環戊基(例如4-伸環戊-1,3-基)、伸環己基(例如2‑伸環己-1,4-基；3‑伸環己-1,2-基；2,5‑伸環己-1,4-基)。 配體單元
用於本揭示內容中之配體單元為細胞結合劑，更確切地，在每一重鏈上具有至少一個共軛位置的經修飾抗體或其抗原結合片段。適合於根據本揭示內容之用途的特定經修飾抗體之實例揭示於以引用方式併入本文中的WO 2012/064733 (申請為PCT/US2011/059775)中。 抗體
本文中之術語「抗體」在最廣意義上使用且確切地涵蓋單株抗體、多株抗體、二聚體、多聚體、多特異性抗體( 例如，雙特異性抗體)及抗體片段，只要抗體展現期望之生物活性(Miller 等人(2003) Jour. of Immunology170：4854-4861)。抗體可為鼠、人、人源化、嵌合抗體，或源於其他物種。抗體為由免疫系統產生之蛋白質，其能夠辨識且結合至特異性抗原。(Janeway, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 第 5 版, Garland Publishing, New York)。靶抗原通常具有由多種抗體上之CDR辨識的眾多結合位置，亦稱作表位。特異性地結合至不同表位之每一抗體具有不同的結構。因此，一種抗原可具有多於一種的對應抗體。抗體包括全長免疫球蛋白分子或全長免疫球蛋白分子之免疫活性部分， 即，一種分子，其含有免疫特異性地結合感興趣之靶的抗原或其部分的抗原結合位置，此類標靶包括但不限於癌細胞或產生與自體免疫疾病相關聯之自體免疫抗體的細胞。免疫球蛋白可為任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD及IgA)、類別(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2)或子類的免疫球蛋白分子。免疫球蛋白可源於任何物種，包括人、鼠或兔起源。
「抗體片段」包含全長抗體之一部分，通常為其抗原結合或可變區域。抗體片段之實例包括F(ab') 2及scFv片段，以及以上任一者的免疫特異性地結合至癌細胞抗原、病毒抗原或微生物抗原的二聚體表位結合片段、單鏈抗體分子；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
適合用於本揭示內容中之經修飾抗體包括其中天然鏈間半胱胺酸殘基已由缺少硫醇基之胺基酸殘基取代的彼等經修飾抗體。抗體可在每一重鏈中包含對包含適合於接合至鏈接子之反應基的胺基酸殘基之至少一個額外取代。額外經取代之胺基酸可為半胱胺酸或非天然胺基酸。經取代之位置可選自以下陳述之彼等位置：
抗體 同型 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
位置(Kabat EU)及相應胺基酸 239 Ser Ser Ser Ser
282 Val Val Val Val
289 Thr Thr Thr Thr
297 Asn Asn Asn Asn
312 Asp Asp Asp Asp
324 Ser Ser Ser Ser
330 Ala Ala Ala Ser
335 Thr Thr Thr Thr
337 Ser Ser Ser Ser
339 Ala Thr Thr Ala
356 Glu Glu Glu Glu
359 Thr Thr Thr Thr
361 Asn Asn Asn Asn
383 Ser Ser Ser Ser
384 Asn Asn Ser Asn
398 Leu Leu Leu Leu
400 Ser Ser Ser Ser
422 Val Val Ile Val
440 Ser Ser Ser Ser
442 Ser Ser Ser Ser
適合用於本揭示內容中的經修飾抗體之實例包括在併入本文中之WO 2012/064733中揭示的Flexmab結構。此類Flexmab在抗體之鉸鏈區域中具有具自由硫醇基之半胱胺酸，其可用作用於經由本揭示內容之PBD之N10基團鏈接的共軛位置。
適合用於本揭示內容中的經修飾抗體之其他實例包括其中已經在每一重鏈中至少插入一個包含適合於接合至鏈接子之反應基的胺基酸殘基的彼等抗體。插入之胺基酸可為半胱胺酸或非天然胺基酸。此等抗體描述於Dimasi, N.等人的Molecular Pharmaceutics, 2017, 14, 1501-1516 (DOI: 10.1021/acs.molpharmaceut.6b00995)及WO2015/157595中。特別地，已經藉由在S239位置之後(即在位置239與位置240之間)插入半胱胺酸來修飾的抗體係有用的。
在一些實施例中，可使用已藉由在F241 (根據Kabat之EU編號)插入非天然胺基酸修飾之抗體。如本文所用之非天然胺基酸係指除二十一種天然存在之胺基酸中之一種以外的胺基酸。非天然胺基酸通常來源於天然胺基酸。來源天然胺基酸係指非天然胺基酸係基於(或合併)或類似於天然胺基酸之結構的事實，例如離胺酸中之伸烷基鏈可縮短以提供與天然4碳鏈相反之3碳鏈，但結構關係及與離胺酸之相似性仍存在。因此，天然胺基酸之衍生物包括多種修改，諸如合併官能基、加長或縮短伸烷基鏈、添加一或多個取代基至側鏈中之氮、氧、硫或將氮、氧、硫轉化成不同的官能基，或前述修改中之任一者的組合。通常，大部分修改將為在非天然胺基酸中添加結構。然而，修改可包括移除或替換在胺基酸中天然發現之原子。
在一些實施例中，非天然胺基具有式( AAII)： R X-X AA1-O 0-1C(O)- 胺基酸殘基( AAII) 其中： R X 表示選自以下各者之不飽和基團： i) C 4-9直鏈共軛二烯， ii) 包含共軛二烯之C 5-14碳環基，及 iii) 5至14員雜環基，其包含選自O、N及S之1、2或3個雜原子，及共軛二烯， 其中i)、ii)及iii)可攜帶至多五個取代基(諸如一個、兩個或三個取代基)，例如，該等取代基係獨立地選自C 1-3烷基、側氧基、鹵素、磺酸基、硫氫基、胺基、-C 1-3伸烷基N 3或-C 2-5炔基； 且 X AA1 表示 i)飽和或不飽和的分支或未分支C 1-8伸烷基鏈，至少一個碳(例如1個、2個或3個碳)由選自O、N、S(O) 0-3之雜原子替換，其中該鏈視情況由獨立地選自側氧基、鹵素、胺基、-C 1-3伸烷基N 3或-C 2-5炔基之一或多個基團取代；或 ii)與來自碳環基或雜環基之碳一起表示鏈接至飽和或不飽和(特別地，飽和)的分支或未分支C 1-6伸烷基鏈之環丙烷環，至少一個碳(例如1個、2個或3個碳)由選自O、N、S(O) 0-3之雜原子替換，其中該鏈視情況由獨立地選自側氧基、鹵素、胺基、-C 1-3伸烷基N 3或-C 2-5炔基之一或多個基團取代，且 -O 0-1C(O)- 經由胺基酸之側鏈來鏈接。
AAII中提及之胺基酸殘基如上文關於 AAI所定義。
在式 AAII之情況下，胺基酸殘基係指包含-NH 2及-COOH基團之胺基酸。式 AAII中之胺基酸殘基可另外包含天然胺基酸之R基團。替代地，式 AAII中之胺基酸殘基可衍生自天然胺基酸，但其天然R基團由 R X-X AA1-O 0-1C(O) 替換。
在一個實施例中，非天然胺基酸係具有式( AAIII)之結構的殘基：
Figure 02_image060
( AAIII) 其中 X 2 表示-C-、-C(R’)-、-CH 2或O； R’表示H或C 1-3烷基， R a 表示 i)飽和或不飽和的分支或未分支C 1-8伸烷基鏈，至少一個碳(例如1個、2個或3個碳)由選自O、N、S(O) 0-3之雜原子替換，其中該鏈視情況由獨立地選自側氧基、鹵素、胺基之一或多個基團取代；或 ii)與來自5員環之碳一起表示鏈接至飽和或不飽和(特別地，飽和)的分支或未分支C 1-6伸烷基鏈之環丙烷環，至少一個碳(例如1個、2個或3個碳)由選自O、N、S(O) 0-3之雜原子替換，其中該鏈視情況由獨立地選自側氧基、鹵素、胺基之一或多個基團取代； R b 表示H、-OC 1-3烷基、視情況攜帶羥基取代基之C 1-6烷基、-C 1-3伸烷基N 3或-C 2-5炔基； R c 表示H、-OC 1-3烷基、視情況攜帶羥基取代基之C 1-6烷基、-C 1-3伸烷基N 3或-C 2-5炔基； R d 表示H、-OC 1-3烷基、視情況攜帶羥基取代基之C 1-6烷基、-C 1-3伸烷基N 3或-C 2-5炔基； R e 表示H、飽和或不飽和(特別地，飽和)的分支或未分支C 1-8伸烷基鏈，其中一或多個碳視情況由-O-替換且該鏈視情況由一或多個鹵素原子(諸如碘基)、N 3或-C 2-5炔基取代。
在一個實施例中， R a 為-(CH 2)mC(O)-、-CH 2(CH 3)C(O)-、-(CH 2)mCH 2OC(O)-、-CHCHCH 2OC(O)-或-OCH 2CH 2COC(O)-且 m表示0或1。
在一個實施例中， R b 為H、-OC 1-3烷基、-CH 3、-CH(CH 3) 2、CH 2OH、-CH 2N 3或–CCH。
在一個實施例中， R c 為H、-OC 1-3烷基、-CH 3、-CH(CH 3) 2、CH 2OH、-CH 2N 3或–CCH。
在一個實施例中， R d 為H、-OC 1-3烷基、-CH 3、-CH(CH 3) 2、CH 2OH、-CH 2N 3或–CCH。
在一個實施例中， R e 表示H或-CH 2OCH 2CH 2N 3。
在一個實施例中，非天然胺基酸為具有式( AAIIIa)之結構的殘基：
Figure 02_image062
( AAIIIa) 其中 R a 、 R b 、 R c 、 R d 、 R e 及 X 2 已在上文定義。
在一個實施例中，非天然胺基酸具有式( AAIIIb)之結構：
Figure 02_image064
( AAIIIb) 其中 R a 、 R b 、 R c 、 R d 、 R e 及 X 2 已在上文定義。
在一個實施例中，非天然胺基酸具有式( AAIIIc)之結構：
Figure 02_image066
( AAIIIc) 其中 R a 、 R b 、 R c 、 R d 、 R e 已在上文定義且 X 2’ 為如上文定義之-C-或-CR’。
通常，例如式( AAIII)、( AAIIIa)、( AAIIIb)及( AAIIIc)之化合物將最多含有僅一個疊氮基。
在一個實施例中，非天然胺基酸係選自包含以下各者之群組：
Figure 02_image068
Figure 02_image070
在一些實施例中，非天然胺基酸係選自：
縮寫 名稱 結構
SCpHK (CP2-NNAA) N 6-((螺[2.4]七-4,6-二烯1-基甲氧基)羧基)-L-離胺酸
Figure 02_image072
CP1-NNAA 以下兩者之1:1混合物： (2S)-2-胺基-6-(2-環戊-2,4-二烯1-基乙氧羧基胺基)己酸；及 (2S)-2-胺基-6-(2-環戊-1,4-二烯1-基乙氧羧基胺基)己酸
Figure 02_image074
Figure 02_image076
已藉由插入CP2-NNAA修飾之抗體在本發明中特別有用。此等抗體描述於均以引用方式併入本文中的WO2019/224340及Roy等人的MAbs 12 (1): 1684749 (doi:10.1080/19420862.2019.1684749)中。特別地，可使用在F241 (根據Kabat之EU編號)具有此插入之抗體，例如經修飾赫賽汀(Herceptin)。
在一些實施例中，提供一種共軛至抗體之PBD二聚體或類PBD二聚體的共軛物，該抗體在一個或兩個F241位置處如上所述地經非天然胺基酸修飾。PBD二聚體或類PBD二聚體之間的一個或兩個鏈接子附接至該(該等)非天然胺基酸。
參考併入本文中之WO 2012/064733的第60頁至第62頁中所列之靶。在一些實施例中，抗體可為腫瘤相關抗原，例如：HER2 (ErbB2)；EPHA2 (EPH受體A2)；CD19；IL2RA (介白素2受體，α)。
用於本揭示內容之實施例的腫瘤相關抗原及同源抗體在下文列出，且更詳細地描述於併入本文中之WO 2017/186894的第14頁至第86頁中。 (1)BMPR1B (骨成形性蛋白質受體型IB) (2)E16 (LAT1, SLC7A5) (3)STEAP1 (前列腺之六跨膜上皮抗原) (4)0772P (CA125, MUC16) (5)MPF (MPF，MSLN，SMR，巨核細胞增效因子，間皮素) (6)Napi3b (NAPI-3B，NPTIIb，SLC34A2，溶質載體家族34 (磷酸鈉)， 成員2，II型鈉依賴性磷酸鹽轉運子3b) (7)Sema 5b (FLJ10372，KIAA1445，Mm.42015，SEMA5B，SEMAG，Semaphorin 5b Hlog，sema域，7血小板反應蛋白重複(1型及類1型)，跨膜域(TM)及短細胞質域(semaphorin) 5B) (8)PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008O16Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12基因) (9)ETBR (內皮素B型受體) (10)MSG783 (RNF124，假定蛋白FLJ20315) (11)STEAP2 (HGNC_8639，IPCA-1，PCANAP1，STAMP1，STEAP2，STMP，前列腺癌相關基因1，前列腺癌相關抗原1，前列腺的六跨膜上皮抗原2，六跨膜前列腺蛋白) (12)TrpM4 (BR22450，FLJ20041，TRPM4，TRPM4B，瞬時受體電位陽離子5通道，亞家族M，成員4) (13)CRIPTO (CR，CR1，CRGF，CRIPTO，TDGF1，畸胎上皮癌源性生長因子) (14)CD21 (CR2 (補體受體2)或C3DR (C3d/艾司坦-巴爾病毒受體)或Hs.73792) (15)CD79b (CD79B，CD79β，IGb (免疫球蛋白相關β)，B29) (16)FcRH2 (IFGP4，IRTA4，SPAP1A (SH2域，含磷酸酶錨蛋白1a)，SPAP1B，SPAP1C) (17)HER2 (ErbB2) (18)NCA (CEACAM6) (19)MDP (DPEP1) (20)IL20R-α (IL20Ra，ZCYTOR7) (21)短蛋白聚糖(BCAN，BEHAB) (22)EphB2R (DRT，ERK，Hek5，EPHT3，Tyro5) (23)ASLG659 (B7h) (24)PSCA (前列腺幹細胞抗原前驅物) (25)GEDA (26)BAFF-R (B細胞活化因子受體，BLyS受體3，BR3) (27)CD22 (B細胞受體CD22-B同種型，BL-CAM，Lyb-8，Lyb8，SIGLEC-2，FLJ22814) (27a)CD22 (CD22分子) (28)CD79a (CD79A，CD79α)，免疫球蛋白相關之α、B細胞特異性蛋白，其與Ig β (CD79B)共價相互作用且在表面上形成與Ig M分子之複合物，轉導B細胞分化所涉及之信號，pI: 4.84, MW: 25028 TM: 2 [P]基因染色體：19q13.2)。 (29)CXCR5 (柏基特氏淋巴瘤受體1，G蛋白偶聯受體，其由CXCL13趨化因子活化，在淋巴細胞遷移及體液防禦中起作用，在HIV-2感染中以及可能在AIDS、淋巴瘤、骨髓瘤及白血病之發展中起作用)；372 aa, pI: 8.54 MW:41959 TM: 7 [P]基因染色體：11q23.3， (30)HLA-DOB (MHC II類分子之β次單元(Ia抗原)，其結合肽且20將肽呈遞至CD4+ T淋巴細胞)；273 aa, pI: 6.56, MW: 30820.TM: 1 [P]基因染色體：6p21.3) (31)P2X5 (嘌呤能受體P2X配體閘控離子通道5，由細胞外ATP閘控之離子通道，可能涉及突觸傳導及神經新生，缺乏可能有助於特發性逼尿肌不穩定之病理生理學)；422 aa), pI: 7.63,MW: 47206 TM: 1 [P]基因染色體：17p13.3)。 (32)CD72 (B-細胞分化抗原CD72，Lyb-2)；359 aa, pI: 8.66, MW: 40225, TM: 15 [P]基因染色體：9p13.3)。 (33)LY64 (淋巴細胞抗原64 (RP105)，富含亮胺酸重複家族(LRR)之I型膜蛋白，調節B細胞活化及細胞凋亡，在患有全身性紅斑性狼瘡之患者中，功能之喪失與增加的疾病活性相關聯)；661 aa, pI: 6.20, MW: 74147 TM: 1 [P]基因染色體：5q12)。 (34)FcRH1 (Fc受體樣蛋白1，用於免疫球蛋白Fc域之假定受體，其含有C2型Ig樣及ITAM域，在B淋巴細胞分化中可能起作用)；429 aa, pI: 5.28, MW: 46925 TM: 1 [P]基因染色體：1q21-1q22) (35)IRTA2 (免疫球蛋白超家族受體易位相關聯的2，在B細胞發育及淋巴瘤生成中可能起作用的假定免疫受體；藉由易位對基因之去調節在一些B細胞 惡性腫瘤中發生)；977 aa, pI: 6.88, MW: 106468, TM: 1 [P]基因染色體：1q21) (36)TENB2 (TMEFF2，tomoregulin，TPEF，HPP1，TR，假定跨膜蛋白多醣，與生長因子及濾泡抑素之EGF/調蛋白家族有關)；374 aa) (37)PSMA – FOLH1 (葉酸水解酶(前列腺特異性膜抗原) 1) (38)SST (體抑素受體；注意，存在5種亞型) (38.1) SSTR2 (體抑素受體2) (38.2) SSTR5 (體抑素受體5) (38.3) SSTR1 (38.4) SSTR3 (38.5) SSTR4 AvB6 – 兩種亞基 (39+40) (39)ITGAV (整聯蛋白，α V) (40)ITGB6 (整聯蛋白，β 6) (41)CEACAM5 (癌胚抗原相關之細胞黏著分子5) (42)MET (met原癌基因；肝細胞生長因子受體) (43)MUC1 (黏蛋白1，細胞表面相關) (44)CA9 (碳酸酐酶IX) (45)EGFRvIII (表皮生長因子受體(EGFR)，轉錄變體3， (46)CD33 (CD33分子) (47)CD19 (CD19分子) (48)IL2RA (介白素2受體，α)；NCBI參考序列：NM_000417.2)； (49)AXL (AXL受體酪胺酸激酶) (50)CD30 - TNFRSF8 (腫瘤壞死因子受體超家族，成員8) (51)BCMA (B細胞成熟抗原) - TNFRSF17 (腫瘤壞死因子受體超家族，成員17) (52)CT Ags – CTA (睾丸癌抗原) (53)CD174 (Lewis Y) - FUT3 (岩藻醣轉移酶3 (半乳糖苷3(4)-L-岩藻醣轉移酶，Lewis血型) (54)CLEC14A (C型凝集素域家族14，成員A；Genbank登錄號NM175060) (55)GRP78 – HSPA5 (熱休克70kDa蛋白5 (葡萄糖調節蛋白，78kDa) (56)CD70 (CD70分子) L08096 (57)幹細胞特異性抗原。舉例而言： • 5T4 (參見以下條目(63)) • CD25 (參見上文條目(48)) • CD32 • LGR5/GPR49 • Prominin/CD133 (58)ASG-5 (59)ENPP3 (外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶3) (60)PRR4 (富含脯胺酸之4 (淚腺的)) (61)GCC – GUCY2C (鳥苷酸環化酶2C (熱穩定腸毒素受體) (62)Liv-1 – SLC39A6 (溶質載體家族39 (鋅轉運子)，成員6) (63)5T4，滋養層醣蛋白，TPBG – TPBG(滋養層醣蛋白) (64)CD56 – NCMA1 (神經細胞黏著分子1) (65)CanAg (腫瘤相關抗原CA242) (66)FOLR1 (葉酸受體1) (67)GPNMB (醣蛋白(跨膜) nmb) (68)TIM-1 – HAVCR1 (A型肝炎病毒細胞受體1) (69)RG-1/前列腺腫瘤靶Mindin – Mindin/RG-1 (70)B7-H4 – VTCN1 (V-set域，含有T細胞活化抑制劑1 (71)PTK7 (PTK7蛋白質酪胺酸激酶7) (72)CD37 (CD37分子) (73)CD138 – SDC1 (syndecan 1) (74)CD74 (CD74分子，主要組織相容性複合物，II類不變鏈) (75)密連蛋白 – CL (密連蛋白) (76)EGFR (表皮生長因子受體) (77)Her3 (ErbB3) – ERBB3 (v-erb-b2紅血球胚細胞白血病病毒致癌基因同系物3 (禽的)) (78)RON - MST1R (巨噬細胞刺激1受體(c-met相關酪胺酸激酶)) (79)EPHA2 (EPH受體A2) (80)CD20 – MS4A1 (跨膜4域，亞家族A，成員1) (81)肌腱蛋白C – TNC (肌腱蛋白C) (82)FAP (纖維母細胞活化蛋白，α) (83)DKK-1 (Dickkopf 1同系物(有爪蟾蜍) (84)CD52 (CD52分子) (85)CS1 - SLAMF7 (SLAM家族成員7) (86)內皮蛋白– ENG (內皮蛋白) (87)膜联蛋白A1 – ANXA1 (膜联蛋白A1) (88)V-CAM (CD106) - VCAM1 (血管細胞黏著分子1) 感興趣的額外腫瘤相關抗原及同源抗體為： ( 89) ASCT2 (ASC轉運子2，亦被稱為SLC1A5)。
ASCT2抗體描述於以引用方式併入本文中之WO 2018/089393中。 鏈接子單元至配體單元之連接
配體單元可經由二硫鍵連接至鏈接子單元。
在一個實施例中，配體單元與藥物鏈接子之間的連接在配體單元之半胱胺酸殘基的硫醇基與藥物鏈接子單元的馬來亞醯胺基團之間形成。用於鏈接之其他可能基團及所得的鏈接基團在下文展示。
配體單元之半胱胺酸殘基可用於與鏈接子單元之官能基反應以形成連接。在例如配體單元為抗體之其他實施例中，抗體之硫醇基可參與鏈間二硫鍵。此等鏈間鍵可藉由例如在與鏈接子單元之官能基反應之前用DTT處理抗體而轉化為自由硫醇基。
在一些實施例中，將半胱胺酸殘基引入至抗體之重鏈或輕鏈中。藉由取代將半胱胺酸插入抗體重鏈或輕鏈中之位置包括描述於併入本文中的公佈之美國申請案2007-0092940號及國際專利公開案WO2008/070593中之彼等位置。 治療方法
本揭示內容之化合物可在治療方法中使用。亦提供一種治療方法，該治療方法包含向有需要之受試者施藥治療有效量的具有式I之共軛物。術語「治療有效量」為足以對患者展示益處的量。此類益處可為至少改良至少一種症狀。施藥的實際量及施藥的速率及時程將取決於要治療的對象之性質及嚴重性。治療處方，例如對劑量之決定，在全科醫師及其他醫生之責任範圍內。
可單獨地或與其他治療組合地施藥共軛物，同時地或相繼地，此取決於待治療之病狀。治療及療法之實例包括但不限於化療(施藥活性劑，包括例如藥物；手術；及放射療法。
除活性成分(即式I之共軛物)外，根據本揭示內容之醫藥組合物及根據本揭示內容之用途亦可包含醫藥上可接受之賦形劑、載體、緩沖劑、穩定劑或熟習此項技術者熟知的其他材料。此類材料應為無毒的且應不干擾活性成分之功效。載體或其他材料之精確性質將取決於給藥途徑，其可為口服或藉由注射，例如皮膚、皮下或靜脈注射內注射。
口服給藥之醫藥組合物可呈片劑、膠囊、粉末或液體形式。片劑可包含固體載體或佐劑。液體醫藥組合物通常包含液體載體，諸如水、石油、動物油或植物油、礦物油或合成油。可包括生理鹽水溶液、葡萄糖或其他糖溶液或二醇類(諸如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇)。膠囊可包含如明膠之固體載體。
對於靜脈內、皮膚或皮下注射或在痛苦部位處之注射，活性成分將呈腸胃外可接受之水溶液的形式，該水溶液係無熱原的且具有合適之pH、等滲性及穩定性。相關的熟習此項技術者完全能夠使用例如諸如氯化鈉注射液、林格氏注射液、乳酸鹽林格氏注射液之等滲賦形劑來製備合適的溶液。視需要，可包括防腐劑、穩定劑、緩衝劑、抗氧化劑及/或其他添加劑。
共軛物可用於治療增生性疾病及自體免疫疾病。術語「增生性疾病」係關於過度或異常細胞之不需要或不受控制的細胞增殖，此並非期望的，諸如，腫瘤或增生性生長，無論在 體外或體內。
增生性病狀之實例包括但不限於良性、癌前‑及惡性的細胞增殖，包括但不限於贅瘤及腫瘤(例如，組織細胞瘤、神經膠質瘤、星形細胞瘤、骨瘤)、癌(例如肺癌、小細胞肺癌、胃腸癌、腸癌、結腸癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肝癌、腎癌、膀胱癌、胰臟癌、腦癌、肉瘤、骨肉瘤、卡波西氏肉瘤、黑色素瘤)、白血病、乾癬、骨病、(例如結締組織之)纖維增生病及動脈粥樣硬化。其他感興趣之癌包括但不限於：血液病；惡性腫瘤，諸如白血病及淋巴瘤，諸如非何杰金氏淋巴瘤，及子型，諸如DLBCL、緣帶、外套帶及濾泡、何杰金氏淋巴瘤；AML；及B或T細胞源之其他癌症。
自體免疫疾病之實例包括以下各者：風濕性關節炎、自體免疫性脫髓鞘疾病(例如，多發性硬化症、過敏腦脊髓炎)、乾癬性關節炎、內分泌眼病、葡萄膜視網膜炎、全身性紅斑狼瘡、重症肌無力、格雷氏病、腎絲球腎炎、自體免疫性肝病、發炎性腸道疾病(例如，克羅恩氏病)、嚴重過敏、過敏反應、休格倫氏症、I型糖尿病、原發性膽汁性肝硬化、華格納氏肉芽病、纖維肌痛症、多發性肌炎、皮肌炎、多發性內分泌衰竭、Schmidt氏症候群(Schmidt’s syndrome)、自體免疫性眼色素層炎、艾迪森氏病(Addison’s disease)、腎上腺炎、甲狀腺炎、橋本氏甲狀腺炎、自體免疫性甲狀腺疾病、惡性貧血、胃萎縮、慢性肝炎、類狼瘡性肝炎、動脈粥樣硬化、亞急性皮膚型紅斑狼瘡、副甲狀腺低能症、Dressler氏症候群(Dressler’s syndrome)、自體免疫性血小板減少症、特發性血小板減少性紫癲、溶血性貧血、尋常型天疱瘡、天疱瘡、疱疹性皮膚炎、斑禿、類天疱瘡、硬皮病、全身性硬化症、CREST症候群(鈣質沉著、Raynaud氏現象(Raynaud’s phenomenon)、食道功能異常、指硬化及微血管擴張)、男性及女性自體免疫性不孕症、僵直性脊柱炎、潰瘍性結腸炎、混合型結締組織疾病、結節性多動脈炎、全身壞死性脈管炎、異位性皮膚炎、異位性鼻炎、古巴士德氏症候群、卻格司氏病、類肉瘤病、風溼熱、氣喘病、復發性流產、抗磷脂症候群、農夫肺、多形性紅斑、心切開術後症候群、Cushing氏症候群(Cushing’s syndrome)、自體免疫性慢性活動性肝炎、養鳥人肺(bird-fancier’s lung)、中毒性表皮壞死鬆解、Alport症候群(Alport’s syndrome)、肺泡炎、過敏性肺泡炎、纖維性肺泡炎、間質性肺部疾病、結節性紅斑、壞疽性膿皮病、輸血反應、Takayasu動脈炎、風濕性多肌痛、顳動脈炎、血吸蟲病、巨細胞動脈炎、蛔蟲症、麴菌病、Sampter症候群、濕疹、淋巴瘤樣的肉芽腫病、Behcet氏病、Caplan症候群、川崎病(kawasaki’s disease)、登革熱、腦脊髓炎、心內膜炎、心肌內膜纖維化、眼內炎、持久性隆起性紅斑、乾癬、胎兒紅血球母細胞增多症、嗜酸性筋膜炎、Shulman氏症候群、Felty氏症候群、絲蟲病、睫狀體炎、慢性睫狀體炎、異時睫狀體炎、Fuch氏睫狀體炎、IgA腎病、Henoch-Schonlein二氏紫瘢病(Henoch-Schonlein purpura)、植體抗宿主病、移植排斥、心肌病、Eaton-Lambertt症候群、複發性多發性軟骨炎、冷凝球蛋白血症、華氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulemia)、伊凡氏症候群(Evan’s syndrome)及自體免疫性腺衰竭。
在一些實施例中，自體免疫疾病為B淋巴細胞的病症(例如，全身性紅斑狼瘡、古巴士德氏症候群、風濕性關節炎及I型糖尿病)、Th1-淋巴細胞的病症(例如，風濕性關節炎、多發性硬化症、乾癬、休格倫氏症、橋本氏甲狀腺炎、格雷氏病、原發性膽汁性肝硬化、華格納氏肉芽病、結核病或植體抗宿主病)或Th2-淋巴細胞病症(例如，異位性皮膚炎、全身性紅斑狼瘡、異位性氣喘、鼻結膜炎、過敏性鼻炎、Omenn氏症候群、全身性硬化症或慢性植體抗宿主病)。通常，涉及樹狀細胞之病症包括Th1-淋巴細胞或Th2-淋巴細胞之病症。在一些實施例中，自體免疫紊亂為T細胞媒介免疫紊亂。
在一些實施例中，施藥的共軛物之量在約0.01 mg/kg/劑量至約10 mg/kg/劑量之範圍內。在一些實施例中，施藥的共軛物之量在約0.01 mg/kg/劑量至約5 mg/kg/劑量之範圍內。在一些實施例中，施藥的共軛物之量在約0.05 mg/kg/劑量至約5 mg/kg/劑量之範圍內。在一些實施例中，施藥的共軛物之量在約0.1 mg/kg/劑量至約5 mg/kg/劑量之範圍內。在一些實施例中，施藥的共軛物之量在約0.1 mg/kg/劑量至約4 mg/kg/劑量之範圍內。在一些實施例中，施藥的共軛物之量在約0.05 mg/kg/劑量至約3 mg/kg/劑量之範圍內。在一些實施例中，施藥的共軛物之量在約0.1 mg/kg/劑量至約3 mg/kg/劑量之範圍內。在一些實施例中，施藥的共軛物之量在約0.1 mg/kg/劑量至約2 mg/kg/劑量之範圍內。 載藥量
載藥量(p)為每細胞結合劑(例如抗體)之PBD藥物的平均數目。在本揭示內容中，此始終為1。然而，任何組合物可包含其中PBD共軛的抗體及其中PBD未共軛的抗體。因此，對於組合物，載藥量(或DAR)可小於1，例如0.75及更高、0.80及更高、0.85及更高、0.90及更高或0.95或更高。 治療指數
特定藥物-鏈接子/共軛物之治療指數可藉由將大鼠中之非標靶ADC的最大耐受單次劑量(MTD)除以小鼠中之可比標靶ADC的最小有效單次劑量(MED)來計算。MED可為用28天達成體內模型中之腫瘤停滯所需之單次劑量。 一般合成路線 光延 (Mitsunobu)
合成式II之化合物(藥物-鏈接子) (及類似化合物)中的關鍵步驟為藉由使用光延反應以使環閉合由式V之化合物合成式IV之化合物：
Figure 02_image052
：
Figure 02_image054
。反應可在習知條件下使用三苯基膦及諸如偶氮二羧酸二乙酯(DEAD)或偶氮二羧酸二異丙酯(DIAD)的偶氮二羧酸酯實現。
特別地，為了合成式II之化合物，R 8’應選自： (a) OH及-Y’-R”-Hal； (b)
Figure 02_image056
(Vb) (c)
Figure 02_image058
(Vc) 進一步衍生當R 8’為(Vc)時，具有式II之化合物可藉由將R L1-pre轉化成R L1及將R L2-pre轉化成R L2由式IV之化合物合成。典型地，R L1及R L2的前驅物將包含：
Figure 02_image082
其中Prot N為胺保護基，諸如Alloc。轉化可藉由移除胺保護基及與R L1/R L2基團之其餘部分(即HO-C(=O)-X-G L)反應來實現。
當R 8’為(Vb)時，具有式IV之化合物，其中R 8’為(Vc)，可藉由以下操作來合成：移除諸如TBS的羥基保護基，接著進行氧化閉環，例如使用Cu/TEMPO催化劑系統(TEMPO = 2,2,6,6-四甲基哌啶-N-氧基)。
當R 8’為-Y’-R”-Hal時，其中R 8’為(Vc)的式IV之化合物可藉由當R 8’為-Y’-R”-Hal時將式VIa之化合物偶聯至式IV之化合物來合成：
Figure 02_image084
(VIa)。 當R 8’為-OH且Y’為O時，其中R 8’為(Vc)的式IV之化合物可藉由當R 8’為–OH時將式VIb之化合物偶聯至式IV之化合物來合成：
Figure 02_image086
(VIa)。 式V之化合物可藉由移除羥基保護基(Prot O)由式VII之化合物合成：
Figure 02_image088
其中R 8’係選自： (a) OMe、OCH 2Ph、OH及–Y’-R”-Hal； (b)
Figure 02_image056
(Vb) (c)
Figure 02_image058
(Vc) 且R 6、R 7、R 9、R 11a、R 6’、R 7’、R 9’、Y、R”、Y’、D及D’如揭示內容之第一態樣中所定義。
在R 8’為(Vb)之情況下，式VII之化合物可為對稱的，即藉由-Y’-R”-Y-鏈接之兩個部分可為等同的。移除僅一個Prot O基團可藉由統計方法來達成，如實例中所說明。 藥物共軛物之合成
抗體可接合至藥物鏈接子化合物，通常如Doronina等人的Nature Biotechnology (2003，21，778-784)中所描述。簡要地，在37℃下用參(羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)還原在pH 7.4的含50 mM硼酸鈉之PBS中之抗體(4-5 mg/mL)。還原鏈間二硫化物之反應的進展將藉由與5,5’-二硫雙(2-硝苯甲酸)反應來監測，且允許繼續進行，直至達到所要水平的硫醇基/mAb。接著將還原之抗體冷卻至0℃，且每抗體用3當量的藥物-鏈接子進行烷基化。1小時後，藉由添加5當量的N-乙醯基半胱胺酸將反應淬滅。藉由在PD-10柱上進行凝膠過濾來移除淬滅的藥物-鏈接子。接著經由0.22 μm注射器過濾器對ADC進行無菌過濾。蛋白質濃度可藉由分別在280 nm及329 nm下進行光譜分析來判定，其中對280 nm下之藥物吸光度的貢獻進行校正。粒徑篩析層析法可用於判定抗體聚集之程度，且RP-HPLC可用於判定剩餘的NAC-淬滅之藥物-鏈接子之水平。 其他偏好
以下偏好可適用於如上所述的揭示內容之所有態樣，或可與單一態樣有關。偏好可以任何組合而組合在一起。
R 6’、R 7’、R 9’及Y’分別選自與R 6、R 7、R 9及Y相同之基團。在一些實施例中，R 6’、R 7’、R 9’及Y’分別與R 6、R 7、R 9及Y相同。
在一些實施例中，R 22與R 2相同。 二聚體鏈接
在一些實施例中，Y及Y’均為O。
在一些實施例中，R’’為無取代基之C 3-7伸烷基。在此等實施例中之一些實施例中，R’’為C 3、C 5或C 7伸烷基。特別地，R’’可為C 3或C 5伸烷基。
在其他實施例中，R”為下式之基團：
Figure 02_image092
其中r為1或2。
在其他實施例中，R”為下式之基團：
Figure 02_image094
其中r為1或2。 R 6 至 R 9
在一些實施例中，R及R’係獨立地選自視情況經取代之C 1‑12烷基、C 3-20雜環基及C 5-20芳基，其中可選取代基係選自C 1-12烷基、C 3-20雜環基、C 5-20芳基、鹵素、羥基、醚、烷氧基、側氧基、醯基、羧基、酯、胺基、醯胺基、硝基及氰基。
在一些實施例中，R 9為H。
在一些實施例中，R 6係選自H、OH、OR、SH、NH 2、硝基及鹵素，且可選自H或鹵素。在此等實施例中之一些實施例中，R 6為H。
在一些實施例中，R 7係選自H、OH、OR、SH、SR、NH 2、NHR、NRR’及鹵素。在此等實施例中之一些實施例中，R 7係選自H、OH及OR，其中R係選自視情況經取代之C 1‑7烷基、C 3-10雜環基及C 5-10芳基。R更佳可為可經取代或未取代之C 1-4烷基。感興趣之取代基為C 5-6芳基(例如苯基)。7位置處的特別較佳取代基為OMe及OCH 2Ph。其他特別感興趣之取代基為二甲胺基(即–NMe 2)；-(OC 2H 4) qOMe，其中q為0至2；含氮的C 6雜環基，包括嗎啉基、哌啶基及N-甲基-哌嗪基。
此等實施例及偏好分別適用於R 9’、R 6’及R 7’。 D 及 D’
在一些實施例中，D及D’分別為D1及D’1。
在一些實施例中，D及D’分別為D2及D’2。 R 2
當C2與C3之間存在雙鍵時，R 2係選自： (a) C 5-10芳基，視情況由選自包含以下各者之群組的一或多個取代基取代：鹵素、硝基、氰基、醚、C 1-7烷基、C 3-7雜環基及雙-氧基-C 1-3伸烷基； (b) C 1-5飽和脂族烷基； (c) C 3-6飽和環烷基； (d)
Figure 02_image025
，其中R 11、R 12及R 13中之每一者係獨立地選自H、C 1-3飽和烷基、C 2-3烯基、C 2-3炔基及環丙基，其中R 2基團中之碳原子總數不大於5； (e)
Figure 02_image027
，其中R 15a及R 15b中之一者為H且另一者係選自：苯基，該苯基視情況由選自鹵甲基、甲氧基之基團取代；吡啶基；及苯硫基；及 (f)
Figure 02_image029
，其中R 14係選自：H；C 1-3飽和烷基；C 2-3烯基；C 2-3炔基；環丙基；苯基，該苯基視情況由選自鹵甲基、甲氧基之基團取代；吡啶基；及苯硫基。
當R 2為C 5-10芳基時，其可為C 5-7芳基。C 5-7芳基可為苯基或C 5-7杂芳基，例如呋喃基、苯硫基及吡啶基。在一些實施例中，R 2較佳為苯基。在其他實施例中，R 2較佳為苯硫基，例如，苯硫-2-基及苯硫-3-基。
當R 2為C 5-10芳基時，其可為C 8-10芳基，例如喹啉基或異喹啉基。喹啉基或異喹啉基可經由任何可用的環位置結合至PBD核心。舉例而言，喹啉基可為喹啉-2-基、喹啉-3-基、喹啉-4基、喹啉-5-基、喹啉-6-基、喹啉-7-基及喹啉-8-基。其中喹啉-3-基及喹啉-6-基可為較佳的。異喹啉基可為異喹啉-1-基、異喹啉-3-基、異喹啉-4基、異喹啉-5-基、異喹啉-6-基、異喹啉-7-基及異喹啉-8-基。其中異喹啉-3-基及異喹啉-6-基可為較佳的。
當R 2為C 5-10芳基時，其可攜帶任何數目個取代基。其較佳攜帶1至3個取代基，更佳攜帶1個及2個取代基，且最佳攜帶單取代之基團。該等取代基可為任何位置。
在R 2為C 5-7芳基之情況下，單個取代基較佳在與至化合物之其餘部分的鍵不相鄰的環原子上，即該取代基較佳在至化合物之其餘部分的鍵的β或γ位。因此，在C 5-7芳基為苯基之情況下，取代基較佳在間位或對位上，且更佳在對位上。
在R 2為C 8-10芳基(例如喹啉基或異喹啉基)之情況下，其可在喹啉環或異喹啉環之任何位置處攜帶任何數目個取代基。在一些實施例中，其攜帶一個、兩個或三個取代基，且此等取代基可在近側環及遠側環中之任一者或兩者上(若有多於一個的取代基)。 當 R 2 為 C 5-10 芳基時的 R 2 取代基
若R 2上之取代基在R 2為C 5-10芳基時為鹵素，則該取代基較佳為F或Cl，Cl更佳。
若R 2上之取代基在R 2為C 5-10芳基時為醚，則該取代基在一些實施例中可為烷氧基，例如，C 1-7烷氧基(例如甲氧基、乙氧基)，或該取代基在一些實施例中可為C 5-7芳氧基(例如苯氧基、吡啶氧基、呋喃氧基)。烷氧基本身可被例如胺基(例如二甲胺基)進一步取代。
若R 2上之取代基在R 2為C 5-10芳基時為C 1-7烷基，則該取代基較佳可為C 1-4烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基)。
若R 2上之取代基在R 2為C 5-10芳基時為C 3-7雜環基，則該取代基在一些實施例中可為C 6含氮雜環基，例如嗎啉基、硫代嗎啉基、哌啶基、哌嗪基。此等基團可經由氮原子結合至PBD部分之其餘部分。此等基團可進一步被例如C 1‑4烷基取代。若C 6含氮雜環基為哌嗪基，則該另外取代基可在該第二氮環原子上。
若R 2上之取代基在R 2為C 5-10芳基時為雙-氧基-C 1-3伸烷基，則此取代基較佳為雙-氧基-亞甲基或雙-氧基-伸乙基。
若R 2上之取代基在R 2為C 5-10芳基時為酯，此取代基較佳為甲酯或乙酯。
當R 2為C 5-10芳基時的特別較佳取代基包括甲氧基、乙氧基、氟、氯、氰基、雙-氧基-亞甲基、甲基-哌嗪基、嗎啉基及甲基-苯硫基。R 2之其他特別較佳取代基為二甲胺基丙氧基及羧基。
當R 2為C 5-10芳基時，特別較佳之經取代R 2基團包括但不限於4-甲氧基-苯基、3-甲氧苯基、4-乙氧基-苯基、3-乙氧基-苯基、4-氟-苯基、4-氯-苯基、3,4-雙氧亞甲基-苯基、4-甲基苯硫基、4-氰基苯基、4-苯氧基苯基、喹啉-3-基及喹啉-6-基、異喹啉-3-基及異喹啉-6-基、2-噻吩基、2-呋喃基、甲氧基萘基及萘基。另一可能的經取代R 2基團為4-硝苯基。特別感興趣之R 2基團包括4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基及3,4-雙氧亞甲基-苯基。 其他 R 2 基團
當R 2為C 1-5飽和脂族烷基時，其可為甲基、乙基、丙基、丁基或戊基。在一些實施例中，其可為甲基、乙基或丙基(正戊基或異丙基)。在此等實施例中之一些實施例中，其可為甲基。在其他實施例中，其可為丁基或戊基，丁基或戊基可為直鏈或支鏈的。
當R 2為C 3-6飽和環烷基時，其可為環丙基、環丁基、環戊基或環己基。在一些實施例中，其可為環丙基。
當R 2為
Figure 02_image025
時，R 11、R 12及R 13中之每一者係獨立地選自H、C 1-3飽和烷基、C 2-3烯基、C 2-3炔基及環丙基，其中R 2基團中之碳原子總數不大於5。在一些實施例中，R 2基團中之碳原子總數不大於4或不大於3。
在一些實施例中，R 11、R 12及R 13中之一者為H，而另外兩個基團係選自H、C 1-3飽和烷基、C 2-3烯基、C 2-3炔基及環丙基。
在其他實施例中，R 11、R 12及R 13中之兩者為H，而另一基團係選自H、C 1-3飽和烷基、C 2-3烯基、C 2-3炔基及環丙基。
在一些實施例中，非H之基團係選自甲基及乙基。在此等實施例中之一些實施例中，非H之基團為甲基。
在一些實施例中，R 11為H。
在一些實施例中，R 12為H。
在一些實施例中，R 13為H。
在一些實施例中，R 11及R 12為H。
在一些實施例中，R 11及R 13為H。
在一些實施例中，R 12及R 13為H。
特別感興趣之R 2基團為：
Figure 02_image098
。
當R 2為
Figure 02_image027
時，R 15a及R 15b中之一者為H且另一者係選自：苯基，該苯基視情況由選自鹵素、甲基、甲氧基之基團取代；吡啶基；及苯硫基。在一些實施例中，非H之基團為視情況經取代之苯基。若苯基可選取代基為鹵素，則其較佳為氟。在一些實施例中，苯基未經取代。
當R 2為
Figure 02_image029
時，R 14係選自：H；C 1-3飽和烷基；C 2-3烯基；C 2-3炔基；環丙基；苯基，該苯基視情況由選自鹵甲基、甲氧基之基團取代；吡啶基；及苯硫基。若苯基可選取代基為鹵素，則其較佳為氟。在一些實施例中，苯基未經取代。在一些實施例中，R 14係選自H、甲基、乙基、乙烯基及乙炔基。在此等實施例中之一些實施例中，R 14係選自H及甲基。
當C2與C3之間存在單鍵時，R 2為H或
Figure 02_image031
，其中R 16a及R 16b係獨立地選自H、F、C 1-4飽和烷基、C 2-3烯基、該烷基及該烯基視情況由選自C 1-4烷基醯胺基及C 1-4烷基酯之基團取代；或，當R 16a及R 16b中之一者為H時，另一者係選自腈及C 1-4烷基酯。
在一些實施例中，R 2為H。
在一些實施例中，R 2為
Figure 02_image031
。
在一些實施例中，R 16a及R 16b均為H係較佳的。
在其他實施例中，R 16a及R 16b均為甲基係較佳的。
在另外的實施例中，如下情況係較佳的：R 16a及R 16b中之一者為H，且另一者係選自C 1-4飽和烷基、C 2-3烯基，該烷基及該烯基視情況經取代。在此等另外實施例中，非H之基團係選自甲基及乙基可為更佳的。 R 22
當C2’與C3’之間存在雙鍵時，R 22係選自： (a) C 5-10芳基，視情況由選自包含以下各者之群組的一或多個取代基取代：鹵素、硝基、氰基、醚、C 1-7烷基、C 3-7雜環基及雙-氧基-C 1-3伸烷基； (b) C 1-5飽和脂族烷基； (c) C 3-6飽和環烷基； (d)
Figure 02_image034
，其中R 31、R 32及R 33中之每一者係獨立地選自H、C 1-3飽和烷基、C 2-3烯基、C 2-3炔基及環丙基，其中R 22基團中之碳原子總數不大於5； (e)
Figure 02_image036
，其中R 25a及R 25b中之一者為H且另一者係選自：苯基，該苯基視情況由選自鹵甲基、甲氧基之基團取代；吡啶基；及苯硫基；及 (f)
Figure 02_image038
，其中R 24係選自：H；C 1-3飽和烷基；C 2-3烯基；C 2-3炔基；環丙基；苯基，該苯基視情況由選自鹵甲基、甲氧基之基團取代；吡啶基；及苯硫基。
當R 22為C 5-10芳基時，其可為C 5-7芳基。C 5-7芳基可為苯基或C 5-7杂芳基，例如呋喃基、苯硫基及吡啶基。在一些實施例中，R 22較佳為苯基。在其他實施例中，R 22較佳為苯硫基，例如，苯硫-2-基及苯硫-3-基。
當R 22為C 5-10芳基時，其可為C 8-10芳基，例如喹啉基或異喹啉基。喹啉基或異喹啉基可經由任何可用的環位置結合至PBD核心。舉例而言，喹啉基可為喹啉-2-基、喹啉-3-基、喹啉-4基、喹啉-5-基、喹啉-6-基、喹啉-7-基及喹啉-8-基。其中喹啉-3-基及喹啉-6-基可為較佳的。異喹啉基可為異喹啉-1-基、異喹啉-3-基、異喹啉-4基、異喹啉-5-基、異喹啉-6-基、異喹啉-7-基及異喹啉-8-基。其中異喹啉-3-基及異喹啉-6-基可為較佳的。
當R 22為C 5-10芳基時，其可攜帶任何數目個取代基。其較佳攜帶1至3個取代基，更佳為1及2個取代基，且最佳為單取代之基團。該等取代基可在任何位置處。
在R 22為C 5-7芳基之情況下，單個取代基較佳在與至化合物之其餘部分的鍵不相鄰的環原子上，即該取代基較佳在至化合物之其餘部分的鍵的β或γ位。因此，在C 5-7芳基為苯基之情況下，取代基較佳在間位或對位上，且更佳在對位上。
在R 22為C 8-10芳基(例如喹啉基或異喹啉基)之情況下，其可在喹啉環或異喹啉環之任何位置處攜帶任何數目個取代基。在一些實施例中，其攜帶一個、兩個或三個取代基，且此等取代基可在近側環及遠側環中之任一者或兩者上(若有多於一個的取代基)。 當 R 22 為 C 5-10 芳基時的 R 22 取代基，
若R 22上之取代基在R 22為C 5-10芳基時為鹵素，則該取代基較佳為F或Cl，Cl更佳。
若R 22上之取代基在R 22為C 5-10芳基時為醚，則該取代基在一些實施例中可為烷氧基，例如，C 1-7烷氧基(例如甲氧基、乙氧基)，或該取代基在一些實施例中可為C 5-7芳氧基(例如苯氧基、吡啶氧基、呋喃氧基)。烷氧基本身可被例如胺基(例如二甲胺基)進一步取代。
若R 22上之取代基在R 22為C 5-10芳基時為C 1-7烷基，則該取代基較佳可為C 1-4烷基(例如甲基、乙基、丙基、丁基)。
若R 22上之取代基在R 22為C 5-10芳基時為C 3-7雜環基，則該取代基在一些實施例中可為C 6含氮雜環基，例如嗎啉基、硫代嗎啉基、哌啶基、哌嗪基。此等基團可經由氮原子結合至PBD部分之其餘部分。此等基團可進一步被例如C 1‑4烷基取代。若C 6含氮雜環基為哌嗪基，則該另外取代基可在該第二氮環原子上。
若R 22上之取代基在R 22為C 5-10芳基時為雙-氧-C 1-3伸烷基，則此取代基較佳為雙-氧-亞甲基或雙-氧-伸乙基。
若R 22上之取代基在R 22為C 5-10芳基時為酯，此取代基較佳為甲酯或乙酯。
當R 22為C 5-10芳基時的特別較佳取代基包括甲氧基、乙氧基、氟、氯、氰基、雙-氧-亞甲基、甲基-哌嗪基、嗎啉基及甲基-苯硫基。R 22之其他特別較佳取代基為二甲胺基丙氧基及羧基。
特別較佳的經取代R 22基團在R 22為C 5-10芳基時包括但不限於4-甲氧基-苯基、3-甲氧苯基、4-乙氧基-苯基、3-乙氧基-苯基、4-氟-苯基、4-氯-苯基、3,4-雙氧亞甲基-苯基、4-甲基苯硫基、4-氰基苯基、4-苯氧基苯基、喹啉-3-基及喹啉-6-基、異喹啉-3-基及異喹啉-6-基、2-噻吩基、2-呋喃基、甲氧基萘基及萘基。另一可能的經取代R 22基團為4-硝苯基。特別感興趣之R 22基團包括4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基及3,4-雙氧亞甲基-苯基。 其他 R 22 基團
當R 22為C 1-5飽和脂族烷基時，其可為甲基、乙基、丙基、丁基或戊基。在一些實施例中，其可為甲基、乙基或丙基(正戊基或異丙基)。在此等實施例中之一些實施例中，其可為甲基。在其他實施例中，其可為可為直鏈或支鏈的丁基或戊基。
當R 22為C 3-6飽和環烷基時，其可為環丙基、環丁基、環戊基或環己基。在一些實施例中，其可為環丙基。
當R 22為
Figure 02_image034
時，R 31、R 32及R 33中之每一者係獨立地選自H、C 1-3飽和烷基、C 2-3烯基、C 2-3炔基及環丙基，其中R 22基團中之碳原子總數不大於5。在一些實施例中，R 22基團中之碳原子總數不大於4或不大於3。
在一些實施例中，R 31、R 32及R 33中之一者為H，而另外兩個基團係選自H、C 1-3飽和烷基、C 2-3烯基、C 2-3炔基及環丙基。
在其他實施例中，R 31、R 32及R 33中之兩者為H，而另一基團係選自H、C 1-3飽和烷基、C 2-3烯基、C 2-3炔基及環丙基。
在一些實施例中，非H之基團係選自甲基及乙基。在此等實施例中之一些實施例中，非H之基團為甲基。
在一些實施例中，R 31為H。
在一些實施例中，R 32為H。
在一些實施例中，R 33為H。
在一些實施例中，R 31及R 32為H。
在一些實施例中，R 31及R 33為H。
在一些實施例中，R 32及R 33為H。
特別感興趣之R 22基團為：
Figure 02_image098
。
當R 22為
Figure 02_image036
時，R 25a及R 25b中之一者為H且另一者係選自：苯基，該苯基視情況由選自鹵素、甲基、甲氧基之基團取代；吡啶基；及苯硫基。在一些實施例中，非H之基團為視情況經取代之苯基。若苯基可選取代基為鹵素，則其較佳為氟。在一些實施例中，苯基未經取代。
當R 22為
Figure 02_image038
時，R 24係選自：H；C 1-3飽和烷基；C 2-3烯基；C 2-3炔基；環丙基；苯基，該苯基視情況由選自鹵甲基、甲氧基之基團取代；吡啶基；及苯硫基。若苯基可選取代基為鹵素，則其較佳為氟。在一些實施例中，苯基未經取代。在一些實施例中，R 24係選自H、甲基、乙基、乙烯基及乙炔基。在此等實施例中之一些實施例中，R 24係選自H及甲基。
當C2’與C3’之間存在單鍵時，R 22為H或
Figure 02_image040
，其中R 26a及R 26b係獨立地選自H、F、C 1-4飽和烷基、C 2-3烯基，該烷基及該烯基視情況由選自C 1-4烷基醯胺基及C 1-4烷基酯之基團取代；或，當R 26a及R 26b中之一者為H時，另一者係選自腈及C 1-4烷基酯。
在一些實施例中，R 22為H。
在一些實施例中，R 22為
Figure 02_image040
。
在一些實施例中，R 26a及R 26b均為H係較佳的。
在其他實施例中，R 26a及R 26b均為甲基係較佳的。
在另外的實施例中，如下情況係較佳的：R 26a及R 26b中之一者為H，且另一者係選自C 1-4飽和烷基、C 2-3烯基，該烷基及該烯基視情況經取代。在此等另外實施例中，非H之基團係選自甲基及乙基可為更佳的。 R 11a
在一些實施例中，R 11a為H。
在一些其他實施例中，R 11a為OH。
在一些其他實施例中，R 11a為OR A，其中R A為C 1-4烷基。在此等實施例中之一些實施例中，R A為甲基。
在本揭示內容之第一態樣之一些實施例中具有式Ia-1、Ia-2或Ia-3：
Figure 02_image108
Figure 02_image110
Figure 02_image112
其中虛線表示C2與C3之間及C2’與C3’之間可能存在雙鍵； 在C2與C3之間及C2’與C3’之間不存在雙鍵之情況下，R 2a及R 22a係相同的且選自： (a) H；及 (b)
Figure 02_image114
； 在C2與C3之間及C2’與C3’之間存在雙鍵之情況下，R 2a及R 22a係相同的且選自： (a)
Figure 02_image116
； (b)
Figure 02_image118
； (c)
Figure 02_image120
； (d)
Figure 02_image122
； (e)
Figure 02_image124
； (f)
Figure 02_image126
； (g)
Figure 02_image128
；及 (h)
Figure 02_image130
； R 1a係選自甲基及苄基； R LL1、R LL2及R 11a如上文所定義。
在本揭示內容之一些實施例中，R 2及R 22均包含不多於3個碳原子。
因此，在C2與C3之間存在雙鍵之此等實施例中，R 2可選自：
(i) 甲基； (v)
Figure 02_image098
；
(ii) 乙基； (vi)
Figure 02_image133
；及
(iii) 丙基； (vi)
Figure 02_image135
(iv) 環丙基；  
因此，在C2與C3之間不存在雙鍵之此等實施例中，R 2可選自：
(i) H； (iii)
Figure 02_image137
；及
(ii)
Figure 02_image139
； 		(iv)
Figure 02_image141
。
因此，在C2’與C3’之間存在雙鍵之此等實施例中，R 22可選自：
(i) 甲基； (v)
Figure 02_image098
；
(ii) 乙基； (vi)
Figure 02_image133
；及
(iii) 丙基； (vi)
Figure 02_image135
(iv) 環丙基；  
因此，在C2’與C3’之間不存在雙鍵之此等實施例中，R 22可選自：
(i) H； (iii)
Figure 02_image137
；及
(ii)
Figure 02_image139
； 		(iv)
Figure 02_image141
。
在此等實施例中之一些實施例中，R 2及R 22均包含不多於2個碳原子。 因此，在C2與C3之間存在雙鍵之此等實施例中，R 2可選自：
(i) 甲基； (vi)
Figure 02_image133
。
(ii) 乙基；且  
因此，在C2與C3之間不存在雙鍵之此等實施例中，R 2可選自：
(i) H； (iii)
Figure 02_image137
。
(ii)
Figure 02_image139
；且 		 
因此，在C2’與C3’之間存在雙鍵之此等實施例中，R 22可選自：
(i) 甲基； (vi)
Figure 02_image133
。
(ii) 乙基；且  
因此，在C2’與C3’之間不存在雙鍵之此等實施例中，R 22可選自：
(i) H； (iii)
Figure 02_image137
。
(ii)
Figure 02_image139
；且 		 
在此等實施例中之另外實施例中，R 2及R 22均包含不多於1個碳原子。
因此，在C2與C3之間存在雙鍵之此等實施例中，R 2可為甲基。因此，在C2與C3之間不存在雙鍵之此等實施例中，R 2可選自：
(i) H；及 (ii)
Figure 02_image139
。
因此，在C2’與C3’之間存在雙鍵之此等實施例中，R 22可為甲基。因此，在C2’與C3’之間不存在雙鍵之此等實施例中，R 22可選自：
(i) H；及 (ii)
Figure 02_image139
。
不希望受理論限制，在PBD二聚體之C2位置處的取代基小的情況下，相信在此等藥物鏈接子中使用葡萄糖醛酸封端單元係特別有利的，此係因為如此使藥物鏈接子之親水性明顯提高，從而使藥物鏈接子更容易共軛至配體單元。
此等實施例及偏好亦適用於揭示內容之第二態樣。 G L G L可選自
(G L1-1)
Figure 02_image148
 (G L6)
Figure 02_image150
(G L1-2)
Figure 02_image152
 (G L7)
Figure 02_image154
(G L2)
Figure 02_image156
 (G L8)
Figure 02_image158
(G L3-1)
Figure 02_image160
其中NO 2基團係可選的 		(G L9)
Figure 02_image162
(G L3-2)
Figure 02_image164
其中NO 2基團係可選的 		(G L10)
Figure 02_image166
(G L3-3)
Figure 02_image168
其中NO 2基團係可選的 		(G L11)
Figure 02_image170
(G L3-4)
Figure 02_image172
其中NO 2基團係可選的 		(G L12)
Figure 02_image174
(G L4)
Figure 02_image176
其中Hal = I, Br, Cl 		(G L13)
Figure 02_image178
(G L5)
Figure 02_image180
      
其中Ar表示C 5-6伸芳基，例如伸苯基，且X 1表示C 1-4烷基。
在一些實施例中，G L係選自G L1-1及G L1-2。在此等實施例中之一些實施例中，G L為G L1-1。 G LL G LL可選自：
(G LL1-1)
Figure 02_image182
 (G LL7)
Figure 02_image184
(G LL1-1A)
Figure 02_image186
 (G LL8 -1)
Figure 02_image188
(G LL 1-2)
Figure 02_image190
 (G LL 8-2)
Figure 02_image192
(G LL 2)
Figure 02_image194
 (G LL9 -1)
Figure 02_image196
(G LL3 -1)
Figure 02_image198
 (G LL 9-2)
Figure 02_image200
(G LL 3-2)
Figure 02_image202
 (G L L10)
Figure 02_image204
(G LL -4)
Figure 02_image206
 (G L 11)
Figure 02_image208
(G LL 5)
Figure 02_image210
 (G LL 12)
Figure 02_image212
(G LL 6)
Figure 02_image214
 (G LL 13)
Figure 02_image216
其中CBA表示至該經修飾抗體之連接點，Ar表示C 5-6伸芳基，例如伸苯基，且X 1表示C 1-4烷基。
在一些實施例中，G LL係選自G LL1-1及G LL1-2。在此等實施例中之一些實施例中，G LL為G LL1-1。在其他實施例中，G LL為G LL1-1A。
G LL1-1A可藉由G L1-1與式
Figure 02_image218
之螺環丙基-環戊二烯之間的狄耳士-阿德爾反應形成。此基團可經由添加鏈接子或藉由將非天然胺基酸併入至多肽序列中而併入至抗體中，如以引用方式併入本文中的WO2019/224340中所描述)。 X
X為：
Figure 02_image046
， 其中a = 0至5，b = 0至16，c = 0或1，d = 0至5。
a可為0、1、2、3、4或5。在一些實施例中，a為0至3。在此等實施例中之一些實施例中，a為0或1。在另外的實施例中，a為0。
b可為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些實施例中，b為0至12。在此等實施例中之一些實施例中，b為0至8，且可為0、2、4或8。
c可為0或1。
d可為0、1、2、3、4或5。在一些實施例中，d為0至3。在此等實施例中之一些實施例中，d為1或2。在另外的實施例中，d為2。
在X之一些實施例中，a為0，c為1且d為2，且b可為0至8。在此等實施例中之一些實施例中，b為0、4或8。 Q
在一個實施例中，Q為胺基酸殘基。胺基酸可為天然胺基酸或非天然胺基酸。
在一個實施例中，Q係選自：Phe、Lys、Val、Ala、Cit、Leu、Ile、Arg及Trp，其中Cit為瓜胺酸。
在一個實施例中，Q包含二肽殘基。二肽中之胺基酸可為天然胺基酸與非天然胺基酸之任何組合。在一些實施例中，二肽包含天然胺基酸。在鏈接子為組織蛋白酶不穩定的鏈接子之情況下，二肽為組織蛋白酶媒介之裂解的作用部位。二肽因而為組織蛋白酶之辨識部位。
在一個實施例中，Q係選自： CO-Phe-Lys- NH、 CO-Val-Ala- NH、 CO-Val-Lys- NH、 CO-Ala-Lys- NH、 CO-Val-Cit- NH、 CO-Phe-Cit- NH、 CO-Leu-Cit- NH、 CO-Ile-Cit- NH、 CO-Phe-Arg- NH及 CO-Trp-Cit- NH； 其中Cit為瓜胺酸。
較佳地，Q係選自： CO-Phe-Lys- NH、 CO-Val-Ala- NH、 CO-Val-Lys- NH、 CO-Ala-Lys- NH、 CO-Val-Cit- NH。
最佳地，Q係選自 CO-Phe-Lys- NH、 CO-Val-Cit- NH及 CO-Val-Ala- NH。 感興趣之其他二肽組合包括： CO-Gly-Gly- NH、 CO-Pro-Pro- NH及 CO-Val-Glu- NH。
可使用其他二肽組合，包括Dubowchik等人在以引用方式併入本文中之 Bioconjugate Chemistry(2002, 13,855-869)中描述之彼等二肽組合。
在一些實施例中，Q為三肽殘基。三肽中之胺基酸可為天然胺基酸與非天然胺基酸之任何組合。在一些實施例中，三肽包含天然胺基酸。在鏈接子為組織蛋白酶不穩定的鏈接子之情況下，三肽為組織蛋白酶媒介之裂解的作用部位。三肽因而為組織蛋白酶之辨識部位。特別感興趣之三肽鏈接子為： NH-Glu-Val-Ala- C=O NH-Glu-Val-Cit- C=O NH-αGlu-Val-Ala- C=O NH-αGlu-Val-Cit- C=O
在一些實施例中，Q為四肽殘基。四肽中之胺基酸可為天然胺基酸與非天然胺基酸之任何組合。在一些實施例中，四肽包含天然胺基酸。在鏈接子為組織蛋白酶不穩定的鏈接子之情況下，四肽為組織蛋白酶媒介之裂解的作用部位。四肽因而為組織蛋白酶之辨識部位。特別感興趣之四肽鏈接子為： NH-Gly-Gly-Phe-Gly C=O；及 NH-Gly-Phe-Gly-Gly C=O。
在一些實施例中，四肽為： NH-Gly-Gly-Phe-Gly C=O。
在肽殘基之以上表示中， NH-表示N端，且- C=O表示殘基之C端。 Glu表示麩胺酸之殘基，即：
Figure 02_image221
αGlu表示當經由α鏈結合時的麩胺酸之殘基，即：
Figure 02_image223
。
在一個實施例中，在適當情況下，胺基酸側鏈受化學保護。側鏈保護基可為如下文論述之基團。受保護的胺基酸序列可藉由酶而裂解。舉例而言，包含Boc側鏈受保護之Lys殘基的二肽序列可藉由組織蛋白酶而裂解。
用於胺基酸之側鏈的保護基係此項技術中熟知的，且描述於Novabiochem目錄中且如上所述。
在一個特定實施例中，揭示內容之第一態樣包含一種式Id之共軛物：
Figure 02_image225
其中m為2至8之整數，且X係選自： (a)
Figure 02_image227
； (b)
Figure 02_image229
；及 (c)
Figure 02_image231
。
在另一特定實施例中，本揭示內容之第一態樣包含一種式Ie之共軛物：
Figure 02_image233
其中m為2至8之整數，且X係選自： (a)
Figure 02_image227
； (b)
Figure 02_image229
；及 (c)
Figure 02_image231
。
在一個特定實施例中，揭示內容之第二態樣，藥物鏈接子(D L)具有式(IId)：
Figure 02_image238
其中m為2至8之整數，且X如上文所定義。
在一些實施例中，R L1與R L2不相同。
在一些實施例中，R LL1與R LL2不相同。
特別地，在鏈接基團不相同之實施例中，差別可僅在G基團中，使得鏈接基團之其餘部分係相同的(因此裂解觸發物係相同的)。
在本揭示內容之一些實施例中，C11取代基可相對於鄰基成以下的立體化學排列：
Figure 02_image240
在其他實施例中，C11取代基可相對於鄰基成以下的立體化學排列：
Figure 02_image242
特別感興趣之化合物包括實例中之彼等化合物。 實例
使用Biotage Isolera One™，自88%己烷/EtOAc或99.9% DCM/MeOH開始在SNAP Ultra™柱上使用梯度溶析來執行急速層析法，直至所有UV活性組份(在214 nm及254 nm下偵測)自塔溶析。每當觀測到UV活性材料之大量溶析時，手動保持梯度。使用Merck Kieselgel 60 F254矽凝膠使用薄層層析法(TLC)來檢查分餾物之純度，在鋁板上有螢光指示劑。用UV光或碘蒸汽來達成TLC之視覺化，除非另有說明。自VWR UK購買萃取及層析法溶劑且不經進一步純化即使用。所有精純化學品係購自Sigma-Aldrich或TCI Europe，除非另有說明。聚乙二醇化試劑係 經由Stratech UK自Quanta Biodesign US或自Purepeg獲得。LC-MS條件如下：使用裝有SQ2質量偵測器之Waters Acquity UPLC ®(超高性能液體層析法)來執行正模式電灑質譜測定法。所用之移動相為流動速率為0.8 mL/min的溶劑A (具有0.1%甲酸之H 2O)及溶劑B (具有0.1%甲酸之CH 3CN)。柱為Waters Acquity UPLC® BEH Shield RP18 1.7 µm 2.1 mm x 50 mm，在50℃下，每個柱裝有Waters Acquity UPLC® BEH Shield RP18 VanGuard前置柱，130 Å，1.7 µm，2.1 mm x 5 mm。
方法1：梯度自初始組成5% B開始，保持25秒，接著經過1分35秒的時段自5% B增加至100% B。組成在100% B下保持50秒，然後經過5秒返回5% B且在此處保持5秒。梯度運行之總持續時間為3.0分鐘，樣本注入體積為2 µL，且在223 nm及254 nm下進行偵測。
方法2：梯度自初始組成25% B開始，保持25秒，接著經過1分35秒的時段自25% B增大至100% B。組成在100% B下保持50秒，然後經過5秒返回5% B且在此處保持5秒。梯度運行之總持續時間為3.0分鐘，樣本注入體積為2 µL，且在223 nm及254 nm進行偵測。
方法3：梯度自初始組成5% B開始，保持1分25秒，然後經過9分35秒的時段自5% B增加至100% B。組成在100% B下保持50秒，然後在10秒內返回5% B且在此處保持2分鐘。梯度運行之總持續時間為15.0分鐘，樣本注入體積為2 µL，且在223 nm及254 nm下進行偵測。
製備型HPLC條件如下：反相UPLC係在Shimazdzu Prominence ®機器上在50℃下使用Phenomenex ®Gemini NX 5µm C18柱(150 mm x 21.2 mm，裝有Phenomenex ®Gemini SecurityGuard PREP筒NX C18 15 mm x 21.2 mm)實行。所用之溶析液為溶劑A (具有0.01%甲酸之H 2O)及溶劑B (具有0.01%甲酸之CH 3CN)。所有UPLC實驗係利用梯度條件來執行：初始組成15% B，經過15分鐘的時段增加至55% B，接著經過2分鐘增加至100% B，且在100% B下保持1分鐘，然後在0.1分鐘內返回13% B且在此處保持1.9分鐘。梯度運行之總持續時間為20.0分鐘。流動速率為20.0 mL/min且在254 nm及280 nm下進行偵測。 實例 1
Figure 02_image244
Figure 02_image246
化合物 1描述於Tiberghien等人的Journal of Organic Chemistry (2019 DOI： 10.1021/acs.joc.8b02876)中 (a) [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-( 烯丙氧基羰基胺基 )-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲基 N-[5-[5-[5-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-( 烯丙氧基羰基胺基 )-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲氧基羰基胺基 ]-4-[(2S)-2-[[ 三級 - 丁基 ( 二甲基 ) 矽烷基 ] 氧基甲基 ]-4- 甲基 -2,3- 二氫吡咯 -1- 羰基 ]-2- 甲氧基 - 苯氧基 ] 戊氧基 ]-2-[(2S)-2-[[ 三級 - 丁基 ( 二甲基 ) 矽烷基 ] 氧基甲基 ]-4- 甲基 -2,3- 二氫吡咯 -1- 羰基 ]-4- 甲氧基 - 苯基 ] 胺甲酸酯 (2)
將1,5-二溴戊烷(427 μL，3.14 mmol)添加至 1(5.00 g，6.28 mmol，1 eq)、碳酸鉀(0.955 g，6.91 mmol)及四丁基碘化銨(2.32 g，6.28 mmol)在丙酮(30.0 mL，410 mmol)中的混合物。將混合物在50℃下加熱20小時，此時LCMS展示反應中之大量產物。將混合物分配在乙酸乙酯(150 mL)與水(100 mL)之間。將有機相用硫酸鎂乾燥且在真空下濃縮。將殘餘物藉由層析法(100g ultra，梯度10%至40%，EtOAc/EtOH 4/1在異己烷中)純化。聚集最純的分餾物且在真空下移除揮發物以得到為淺黃色泡沫之產物 2(3.93 g，2.37 mmol，75.4%產率)。LC-MS (方法2) 2.39分鐘，ES + m/z1661.3 [M+H]。 (b) [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-( 烯丙氧基羰基胺基 )-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲基 N-[5-[5-[5-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-( 烯丙氧基羰基胺基 )-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲氧基羰基胺基 ]-4-[(2S)-2-[[ 三級 - 丁基 ( 二甲基 ) 矽烷基 ] 氧基甲基 ]-4- 甲基 -2,3- 二氫吡咯 -1- 羰基 ]-2- 甲氧基 - 苯氧基 ] 戊氧基 ]-2-[(2S)-2-( 羥甲基 )-4- 甲基 -2,3- 二氫吡咯 -1- 羰基 ]-4- 甲氧基 - 苯基 ] 胺甲酸酯 (3)
將化合物 2(3.80 g，2.29 mmol)溶解於四氫呋喃(19.0 mL)、乙酸(15.2 mL)、水(7.60 mL)及甲醇(3.80 mL)之混合物中，且在室溫下攪拌。反應之進展藉由LC/MS緊密跟踪，目標為在6小時內完成。當發現反應速率過慢時，將溫度升高至30℃，且偶爾添加乙酸。
在6小時後獲得1/2/1雙醇/半醇/雙tbs之正確分佈。將反應混合物用乙酸乙酯(200 mL)稀釋，且用水(200 mL)、然後用飽和的碳酸氫鹽水溶液(200 mL)及鹽水(50 mL)洗滌。將有機物用硫酸鎂乾燥。在真空下移除揮發物。將殘餘物用第一層析法(100 g ultra，乙酸乙酯/EtOH 4/1在己烷中；所要產物之溶析率為50%左右)純化。在第二層析法(100 g ultra，DCM/MeOH，用在DCM中之4.8 % MeOH在6 CV後溶析)期間移除單體苯酚雜質。聚集純分餾物且在真空下移除揮發物以得到為白色固體之 3(1.328 g，0.8591 mmol，37.5%產率)。LC-MS (方法2) 2.10分鐘，ES + m/z1547.1 [M+H]。 (c) [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-( 烯丙氧基羰基胺基 )-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲基 (6aS)-3-[5-[5-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-( 烯丙氧基羰基胺基 )-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲氧基羰基胺基 ]-4-[(2S)-2-[[ 三級 - 丁基 ( 二甲基 ) 矽烷基 ] 氧基甲基 ]-4- 甲基 -2,3- 二氫吡咯 -1- 羰基 ]-2- 甲氧基 - 苯氧基 ] 戊氧基 ]-2- 甲氧基 -8- 甲基 -11- 側氧 -6a,7- 二氫 -6H- 吡咯并 [2,1-c][1,4] 苯并二氮呯 -5- 羧酸酯 (4)
將偶氮二羧酸二異丙酯(0.372 mL，1.85 mmol)添加至 3(A，1.30 g，0.841 mmol，100質量%)及三苯基膦(0.665 g，2.52 mmol)在四氫呋喃(26.0 mL)中之溶液。將反應在40℃下加熱2h小時，此時，藉由LCMS形成令人滿意之量的產物。在真空下移除揮發物，且將殘餘物藉由層析法(50g Ultra, Biotage, EtOAc/EtOH 4/1在己烷中，梯度自20%至57%，在高於約45%時溶析)純化。聚集純分餾物，以得到 4(1.010 g，0.6611 mmol，78.6%產率)。LC-MS (方法2) 2.13分鐘，ES + m/z1528.8 [M+H]。 (d) [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-( 烯丙氧基羰基胺基 )-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲基 (6aS)-3-[5-[5-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-( 烯丙氧基羰基胺基 )-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲氧基羰基胺基 ]-4-[(2S)-2-( 羥甲基 )-4- 甲基 -2,3- 二氫吡咯 -1- 羰基 ]-2- 甲氧基 - 苯氧基 ] 戊氧基 ]-2- 甲氧基 -8- 甲基 -11- 側氧 -6a,7- 二氫 -6H- 吡咯并 [2,1-c][1,4] 苯并二氮呯 -5- 羧酸酯 (5)
將對甲苯磺酸(60.0 mg，0.345 mmol)添加至 4(980 mg，0.641 mmol)在四氫呋喃(4.0 mL)、乙酸(1.5 mL)、水(1.0 mL)及甲醇(1.5 mL)中之溶液，且在室溫下攪拌。藉由LCMS發現反應進展迅速且在15分鐘後完成。
將反應混合物用乙酸乙酯(100 mL)稀釋，且用水(100 mL)、然後用飽和的碳酸氫鹽水溶液(50 mL)及鹽水(50 mL)洗滌。將有機物用硫酸鎂乾燥。在真空下移除揮發物。將殘餘物藉由層析法(50 g ultra，在DCM中之4/1 DCM/MeOH，梯度自5%至32%，在24%至28%溶析)純化。聚集純分餾物，且在真空下移除揮發物，以得到為白色固體之 5(B，640 mg，0.453 mmol，100質量%，70.6%產率)。LC-MS (方法2) 1.71分鐘，ES + m/z1414.5 [M+H]。 (e) [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-( 烯丙氧基羰基胺基 )-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲基 (6S,6aS)-3-[5-[[(6aS)-5-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-( 烯丙氧基羰基胺基 )-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲氧基羰基 ]-2- 甲氧基 -8- 甲基 -11- 側氧 -6a,7- 二氫 -6H- 吡咯并 [2,1-c][1,4] 苯并二氮呯 -3- 基 ] 氧基 ] 戊氧基 ]-6- 羥基 -2- 甲氧基 -8- 甲基 -11- 側氧 -6a,7- 二氫 -6H- 吡咯并 [2,1-c][1,4] 苯并二氮呯 -5- 羧酸酯 (6)
在空氣氛圍下(氣球)，將四乙腈銅(I)三氟甲磺酸鹽(33.1 mg，0.0878 mmol)添加至 5(620 mg，0.439 mmol)及在乙腈(0.439 mL，0.0878 mmol，0.200 mol/L)中之Stahl tempo溶液在二氯甲烷(12.0 mL)中之溶液。當藉由LCMS觀測到完成時，在34℃下將溶液攪拌18小時。將溶液直接加載在biotage samplet上，乾燥，且在50g Ultra柱上溶析，在DCM中之4/1 DCM/MeOH，梯度自15%至30%，在20%左右溶析。聚集純分餾物，且在真空下移除揮發物，以得到為白色固體之 6(535 mg，0.379 mmol，86.4%產率)。LC-MS (方法2) 1.71分鐘，ES + m/z1412.5 [M+H]。 (f) [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5- 二側氧吡咯 -1- 基 ) 丙醯基胺基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 丙醯基胺基 ]-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲基 (6S,6aS)-3-[5-[[(6aS)-5-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5- 二側氧吡咯 -1- 基 ) 丙醯基胺基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 丙醯基胺基 ]-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲氧基羰基 ]-2- 甲氧基 -8- 甲基 -11- 側氧 -6a,7- 二氫 -6H- 吡咯并 [2,1-c][1,4] 苯并二氮呯 -3- 基 ] 氧基 ] 戊氧基 ]-6- 羥基 -2- 甲氧基 -8- 甲基 -11- 側氧 -6a,7- 二氫 -6H- 吡咯并 [2,1-c][1,4] 苯并二氮呯 -5- 羧酸酯 (7)
將化合物 6(520 mg，0.368 mmol)溶解於二氯甲烷(8.00 mL, 99.5質量%)與吡咯啶(77.3 μL，0.921 mmol)之混合物中。用氬氣沖洗氣氛。當LCMS展示反應完成時，添加催化量的四(三苯基膦)鈀(0) (8.56 mg，0.00737 mmol)且允許反應進行30分鐘。
將反應混合物分配在DCM (10 mL)、1M氯化銨水溶液(10 mL)之間。經由isolera筒倒出有機層，且在真空下移除揮發物。將一半的此材料(229 mg，0.184 mmol)溶解於DCM (5.00 mL)及甲醇(0.2 mL)中，接著溶解於mal-amido-peg8-酸(245 mg，0.405 mmol)及1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺氯化氫(78.0 mg，0.407 mmol)。當藉由LCMS觀測到反應完成時，允許反應在室溫下進行45分鐘。將反應混合物濃縮(2 mL)，加載在3g biotage氧化矽samplet上且在真空下乾燥。將samplet加載在25g Ultra Biotage柱上，且溶析(梯度15/90至60/40的在DCM中之20% MeOH / DCM，在12CV中；在40/60左右溶析；允許增大梯度以避免條紋)。藉由TLC (在DCM中之15% MeOH)對所有分餾物進行分析。聚集純分餾物.將溶劑藉由蒸發移除，以得到 7(390 mg，0.163 mmol， 88.5%產率)。純度為94.5%。LC-MS (方法3) 6.89分鐘，ES + m/z1197.4 [(M+2H)/2]，(方法1) 1.71分鐘，ES + m/z1197.5 [(M+2H)/2]。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.90 (s, 2H), 8.16 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 7.99 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 7.86 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.66 – 7.44 (m, 4H), 7.40 – 7.23 (m, 1H), 7.23 – 7.09 (m, 3H), 7.08 – 7.01 (m, 2H), 6.99 (s, 4H), 6.93 (s, 1H), 6.75 (s, 1H), 6.71 – 6.57 (m, 3H), 5.64 – 5.49 (m, 1H), 5.18 – 4.98 (m, 3H), 4.93 – 4.76 (m, 2H), 4.45 – 4.31 (m, 2H), 4.21 (dd, J = 8.6, 6.7 Hz, 2H), 4.07 – 3.88 (m, 5H), 3.88 – 3.71 (m, 8H), 3.70 – 3.62 (m, 2H), 3.62 – 3.55 (m, 8H), 3.55 – 3.43 (m, 56H), 3.36 (t, J = 5.9 Hz, 4H), 3.20 – 3.10 (m, 4H), 2.98 – 2.76 (m, 2H), 2.45 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 2.39 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 2.33 (dt, J = 8.1, 5.4 Hz, 4H), 1.96 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 1.83 – 1.66 (m, 10H), 1.61 – 1.48 (m, 2H), 1.29 (d, J = 7.1 Hz, 6H), 0.84 (dd, J = 15.4, 6.7 Hz, 12H)。 實例 2
Figure 02_image248
Figure 02_image250
(a) [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-( 烯丙氧基羰基胺基 )-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲基 N-[5-[[3-[[5-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-( 烯丙氧基羰基胺基 )-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲氧基羰基胺基 ]-4-[(2S)-2-[[ 三級 - 丁基 ( 二甲基 ) 矽烷基 ] 氧基甲基 ]-4- 甲基 -2,3- 二氫吡咯 -1- 羰基 ]-2- 甲氧基 - 苯氧基 ] 甲基 ] 苯基 ] 甲氧基 ]-2-[(2S)-2-[[ 三級 - 丁基 ( 二甲基 ) 矽烷基 ] 氧基甲基 ]-4- 甲基 -2,3- 二氫吡咯 -1- 羰基 ]-4- 甲氧基 - 苯基 ] 胺甲酸酯 (8)
將1,3-雙(溴甲基)苯(829 mg，3.14 mmol)添加至 1(5.00 g，6.28 mmol)、碳酸鉀(955 mg，6.91 mmol)及四丁基碘化銨(2.32 g，6.28 mmol)在丙酮(30.0 mL)中之混合物。在40℃下將混合物加熱1.5小時，然後在23℃下攪拌18小時，此時，LCMS展示反應完成。將混合物分配在乙酸乙酯(150 mL)與水(100 mL)之間。將有機相用硫酸鎂乾燥且在真空下濃縮。將殘餘物乾燥加載且藉由層析法(100g ultra，梯度10%至41%，EtOAc/EtOH 4/1在異己烷中，41%溶析率)純化。聚集分餾物且在真空下移除揮發物以得到為淺黃色固體之產物 8(3.81 g，2.25 mmol， 71.6 %產率)。LC-MS (方法2) 2.41分鐘，ES + m/z1695.8 [M+H]。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.98 (s, 2H), 9.07 (s, 2H), 8.14 (d, J = 7.1 Hz, 2H), 7.65 – 7.54 (m, 5H), 7.49 – 7.43 (m, 3H), 7.39 (s, 2H), 7.33 – 7.26 (m, 4H), 7.22 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 6.82 (s, 2H), 6.04 (s, 2H), 5.96 – 5.83 (m, 2H), 5.29 (dt, J = 17.2, 1.8 Hz, 2H), 5.20 – 5.13 (m, 2H), 5.10 (s, 4H), 5.02 (d, J = 3.0 Hz, 4H), 4.54 – 4.36 (m, 8H), 3.90 (dd, J = 8.8, 6.8 Hz, 2H), 3.82 (s, 2H), 3.74 (s, 6H), 3.67 (s, 2H), 2.67 (d, J = 1.8 Hz, 2H), 2.43 – 2.32 (m, 2H), 1.99 (d, J = 1.8 Hz, 2H), 1.60 (s, 6H), 1.30 (d, J = 7.1 Hz, 6H), 0.92 – 0.78 (m, 30H), 0.02 (d, J = 11.6 Hz, 12H)。 (b) [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-( 烯丙氧基羰基胺基 )-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲基 N-[5-[[3-[[5-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-( 烯丙氧基羰基胺基 )-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲氧基羰基胺基 ]-4-[(2S)-2-[[ 三級 - 丁基 ( 二甲基 ) 矽烷基 ] 氧基甲基 ]-4- 甲基 -2,3- 二氫吡咯 -1- 羰基 ]-2- 甲氧基 - 苯氧基 ] 甲基 ] 苯基 ] 甲氧基 ]-2-[(2S)-2-( 羥甲基 )-4- 甲基 -2,3- 二氫吡咯 -1- 羰基 ]-4- 甲氧基 - 苯基 ] 胺甲酸酯 (9)
將化合物 8(3.80 g，2.24 mmol)溶解於四氫呋喃(19.0 mL)、乙酸(7.6 mL, 130 mmol)、水(7.60 mL)及甲醇(3.80 mL)之混合物中，且在30℃下攪拌3至4小時。反應之進展藉由LC/MS緊密跟踪。在4小時後獲得1/2/1 雙醇/半醇/雙tbs之所要分佈。將反應混合物用乙酸乙酯(200 mL)稀釋，且用水(200 mL)、然後用飽和的碳酸氫鹽水溶液(200 mL)及鹽水(50 mL)洗滌。將有機物用硫酸鎂乾燥。在真空下移除揮發物。將殘餘物藉由層析法(100 g ultra，乙酸乙酯/EtOH 4/1在己烷中；梯度自25%至最高100%，在24CV中；所要產物之溶析率在50%左右)純化，以得到為白色固體之 9(1.51 g，0.956 mmol，42.6%產率)。LC-MS (方法2) 2.10分鐘，ES + m/z1581.3 [M+H]。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.99 (s, 2H), 9.06 (s, 2H), 8.14 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 7.65 – 7.54 (m, 5H), 7.49 – 7.43 (m, 3H), 7.42 – 7.26 (m, 6H), 7.22 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 6.89 (s, 1H), 6.82 (s, 1H), 6.05 (s, 1H), 5.98 (s, 1H), 5.95 – 5.83 (m, 2H), 5.30 (dq, J = 17.1, 1.8 Hz, 2H), 5.16 (dt, J = 10.4, 1.6 Hz, 2H), 5.12 – 4.95 (m, 8H), 4.83 (s, 1H), 4.56 – 4.35 (m, 8H), 3.94 – 3.86 (m, 2H), 3.85 – 3.79 (m, 1H), 3.78 – 3.71 (m, 6H), 3.66 (s, 2H), 3.52 (s, 1H), 2.75 – 2.59 (m, 2H), 2.46 – 2.29 (m, 2H), 1.99 (d, J = 1.8 Hz, 2H), 1.59 (d, J = 5.7 Hz, 6H), 1.30 (d, J = 7.0 Hz, 6H), 0.92 – 0.79 (m, 21H), 0.02 (d, J = 11.4 Hz, 6H)。 (c) [4-[[(2S)-2-[[(2S)-210( 烯丙氧基羰基胺基 )-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲基 (6aS)-3-[[3-[[5-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-( 烯丙氧基羰基胺基 )-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲氧基羰基胺基 ]-4-[(2S)-2-[[ 三級 - 丁基 ( 二甲基 ) 矽烷基 ] 氧基甲基 ]-4- 甲基 -2,3- 二氫吡咯 -1- 羰基 ]-2- 甲氧基 - 苯氧基 ] 甲基 ] 苯基 ] 甲氧基 ]-2- 甲氧基 -8- 甲基 -11- 側氧 -6a,7- 二氫 -6H- 吡咯并 [2,1-c][1,4] 苯并二氮呯 -5- 羧酸酯 (10)
將偶氮二羧酸二異丙酯(0.406 mL, 2.02 mmol， 98質量%)添加至 9(1.45 g，0.918 mmol)及三苯基膦(0.726 g，2.75 mmol)在四氫呋喃(26.0 mL)中之溶液。將反應在40℃下加熱2小時，此時藉由LCMS形成令人滿意之量的產物。在真空下移除揮發物，且將殘餘物藉由層析法(50g Ultra, Biotage, EtOAc/EtOH 4/1在己烷中，梯度自20%至57%，溶析率高於約45%)純化。聚集最純的分餾物且在真空下濃縮，以得到為白色固體之 10(739 mg，0.473 mmol，51.6%產率)。LC-MS (方法2) 2.13分鐘，ES + m/z1563.1 [M+H]。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.09 – 9.85 (m, 2H), 9.07 (s, 1H), 8.23 – 8.02 (m, 2H), 7.67 – 7.50 (m, 5H), 7.49 – 7.34 (m, 4H), 7.30 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.26 – 7.14 (m, 3H), 7.09 (d, J = 11.0 Hz, 2H), 6.82 (s, 1H), 6.67 – 6.59 (m, 1H), 6.05 (s, 1H), 5.96 – 5.82 (m, 2H), 5.36 – 5.23 (m, 2H), 5.20 – 5.13 (m, 2H), 5.13 – 4.98 (m, 6H), 4.97 – 4.79 (m, 2H), 4.54 – 4.34 (m, 6H), 4.11 – 3.94 (m, 2H), 3.93 – 3.86 (m, 2H), 3.86 – 3.71 (m, 6H), 3.68 (s, 1H), 3.54 (s, 1H), 2.91 – 2.75 (m, 1H), 2.74 – 2.61 (m, 1H), 2.45 – 2.21 (m, 2H), 2.05 – 1.90 (m, 2H), 1.74 (s, 3H), 1.60 (s, 3H), 1.37 – 1.22 (m, 6H), 0.93 – 0.75 (m, 21H), 0.11 – -0.09 (m, 6H)。 (d) [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-( 烯丙氧基羰基胺基 )-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲基 (6aS)-3-[[3-[[5-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-( 烯丙氧基羰基胺基 )-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲氧基羰基胺基 ]-4-[(2S)-2-( 羥甲基 )-4- 甲基 -2,3- 二氫吡咯 -1- 羰基 ]-2- 甲氧基 - 苯氧基 ] 甲基 ] 苯基 ] 甲氧基 ]-2- 甲氧基 -8- 甲基 -11- 側氧 -6a,7- 二氫 -6H- 吡咯并 [2,1-c][1,4] 苯并二氮呯 -5- 羧酸酯 (11)
將對甲苯磺酸(60.0 mg，0.345 mmol)添加至 10(720 mg，0.461 mmol)在四氫呋喃(4.0 mL)、乙酸(1.5 mL)、水(1.0 mL)及甲醇(1.5 mL)中之溶液，且在室溫下攪拌。藉由LCMS發現反應快速地進行且在20分鐘後完成。
將反應混合物用乙酸乙酯(100 mL)稀釋，且用水(100 mL)、然後用飽和的碳酸氫鹽水溶液(50 mL)及鹽水(50 mL)洗滌。將有機物用硫酸鎂乾燥。在真空下移除揮發物。將殘餘物用第一層析法(50 g ultra，在DCM中之4/1 DCM/MeOH，梯度自5%至25%，在24%至25%溶析)純化；聚集純分餾物且在真空下移除揮發物以得到為白色固體之 11(544 mg，0.376 mmol，81.5%產率)。LC-MS (方法2) 1.74分鐘，ES + m/z1448.7 [M+H]。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.12 – 9.82 (m, 2H), 9.05 (s, 1H), 8.22 – 8.04 (m, 2H), 7.64 – 7.49 (m, 5H), 7.48 – 7.34 (m, 4H), 7.31 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.22 (dd, J = 8.9, 3.5 Hz, 3H), 7.09 (d, J = 11.9 Hz, 2H), 6.89 (s, 1H), 6.67 – 6.59 (m, 1H), 5.97 (s, 1H), 5.96 – 5.84 (m, 2H), 5.30 (ddt, J = 16.9, 3.3, 1.7 Hz, 2H), 5.16 (ddd, J = 10.4, 3.5, 1.8 Hz, 2H), 5.12 – 4.97 (m, 6H), 4.96 – 4.78 (m, 2H), 4.53 – 4.35 (m, 7H), 4.09 – 3.95 (m, 2H), 3.89 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 3.78 (s, 3H), 3.75 (s, 3H), 3.64 (s, 1H), 3.53 (s, 2H), 2.83 (d, J = 16.2 Hz, 1H), 2.71 – 2.58 (m, 1H), 2.40 (d, J = 16.8 Hz, 1H), 2.28 (d, J = 16.7 Hz, 1H), 2.06 – 1.89 (m, 2H), 1.74 (s, 3H), 1.59 (s, 3H), 1.35 – 1.21 (m, 6H), 0.95 – 0.75 (m, 12H)。 (e) [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-( 烯丙氧基羰基胺基 )-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲基 (6S,6aS)-3-[[3-[[(6aS)-5-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-( 烯丙氧基羰基胺基 )-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲氧基羰基 ]-2- 甲氧基 -8- 甲基 -11- 側氧 -6a,7- 二氫 -6H- 吡咯并 [2,1-c][1,4] 苯并二氮呯 -3- 基 ] 氧基甲基 ] 苯基 ] 甲氧基 ]-6- 羥基 -2- 甲氧基 -8- 甲基 -11- 側氧 -6a,7- 二氫 -6H- 吡咯并 [2,1-c][1,4] 苯并二氮呯 -5- 羧酸酯 (12)
在空氣氛圍下(氣球)，將四乙腈銅(I)三氟甲磺酸鹽(27.1 mg，0.0719 mmol)添加至 11(520 mg，0.359 mmol)及在乙腈(0.359 mL，0.0718 mmol，0.2 mol/L)中之Stahl TEMPO溶液在二氯甲烷(8.00 mL)中之溶液。當藉由LCMS觀測到完成時，將溶液在34℃下攪拌18小時。將溶液直接加載在50g Ultra柱上(在DCM中之4/1 DCM/MeOH，梯度自15%至30%，在20至22%左右溶析)，且溶析。聚集純分餾物，且在真空下移除揮發物，以得到為白色固體之 12(410 mg，0.284 mmol，79.0%產率)。LC-MS (方法2) 1.72分鐘，ES + m/z1446.8 [M+H]。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.94 (s, 2H), 8.12 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 7.69 – 7.49 (m, 5H), 7.49 – 7.37 (m, 3H), 7.32 (s, 1H), 7.25 – 7.13 (m, 5H), 7.13 – 7.04 (m, 3H), 6.94 (s, 1H), 6.71 (s, 1H), 6.63 (p, J = 1.9 Hz, 2H), 6.03 – 5.81 (m, 2H), 5.59 (s, 1H), 5.40 – 5.21 (m, 2H), 5.18 – 4.76 (m, 10H), 4.58 – 4.28 (m, 6H), 4.02 (s, 2H), 3.89 (dd, J = 8.8, 6.7 Hz, 2H), 3.83 – 3.73 (m, 6H), 3.69 (td, J = 9.7, 3.6 Hz, 1H), 3.55 (s, 1H), 3.02 – 2.75 (m, 2H), 2.38 – 2.18 (m, 1H), 2.05 – 1.85 (m, 2H), 1.79 – 1.66 (m, 6H), 1.27 (s, 6H), 0.85 (dd, J = 18.4, 6.7 Hz, 12H)。 (f) [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5- 二側氧吡咯 -1- 基 ) 丙醯基胺基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 丙醯基胺基 ]-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲基 (6S,6aS)-3-[[3-[[(6aS)-5-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5- 二側氧吡咯 -1- 基 ) 丙醯基胺基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 丙醯基胺基 ]-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲氧基羰基 ]-2- 甲氧基 -8- 甲基 -11- 側氧 -6a,7- 二氫 -6H- 吡咯并 [2,1-c][1,4] 苯并二氮呯 -3- 基 ] 氧基甲基 ] 苯基 ] 甲氧基 ]-6- 羥基 -2- 甲氧基 -8- 甲基 -11- 側氧 -6a,7- 二氫 -6H- 吡咯并 [2,1-c][1,4] 苯并二氮呯 -5- 羧酸酯 (13)
將化合物 12(200 mg，0.138 mmol，100質量%)溶解於DCM (6.00 mL)及吡咯啶 (77.3 μL，0.921 mmol)之混合物中。用氬氣沖洗氣氛。當LCMS展示完成時，添加催化量的四(三苯基膦)鈀(0) (3.21 mg，0.00276 mmol，99.5質量%)且允許反應進行30分鐘。
將反應混合物分配在DCM (10 mL)、1M氯化銨水溶液(10 mL)之間。將有機層經由isolera筒倒出，且在真空下移除揮發物，以得到粗的去保護胺(177 mg，0.139 mmol)，將該胺再溶解於二氯甲烷(5.00 mL)及甲醇(0.2 mL)中，然後添加mal-amido-peg8-酸(245 mg，0.405 mmol， 98質量%)及1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺氯化氫(78.0 mg，0.407 mmol，100質量%)。當藉由LCMS觀測到反應完成時，允許反應在室溫下進行45分鐘。將反應混合物濃縮(2 mL)，加載在3g biotage氧化矽samplet上，且在真空下乾燥。
將samplet加載在25g Ultra Biotage柱上，且溶析(梯度為15/90至60/40，在DCM中之20% MeOH / DCM，在12CV中；在50至60%左右溶析；梯度避免條紋)。藉由TLC (在DCM中之15% MeOH)對所有分餾物進行分析。聚集純分餾物。藉由蒸發將溶劑移除，以得到 (B，274 mg，0.113 mmol，100質量%，81.5%產率)。純度為95.6%。LC-MS (方法3) 7.00分鐘，ES + m/z1214.4 [(M+2H)/2]，(方法2) 1.48分鐘，ES + m/z1214.5 [(M+2H)/2]。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.88 (s, 2H), 8.14 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.99 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 7.85 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.55 (s, 5H), 7.49 – 7.36 (m, 3H), 7.17 (s, 3H), 7.13 – 7.04 (m, 3H), 6.99 (s, 4H), 6.94 (s, 1H), 6.70 (s, 1H), 6.62 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 5.59 (s, 1H), 5.04 (dd, J = 33.8, 16.4 Hz, 8H), 4.37 (s, 2H), 4.26 – 4.15 (m, 2H), 4.01 (s, 2H), 3.79 (d, J = 3.8 Hz, 6H), 3.72 – 3.64 (m, 2H), 3.59 (dd, J = 7.9, 6.6 Hz, 8H), 3.53 – 3.41 (m, 56H), 3.36 (t, J = 5.9 Hz, 4H), 3.14 (q, J = 5.8 Hz, 4H), 2.87 (s, 2H), 2.47 – 2.36 (m, 4H), 2.35 – 2.29 (m, 6H), 1.95 (q, J = 6.7 Hz, 2H), 1.78 – 1.69 (m, 6H), 1.27 (s, 6H), 0.84 (dd, J = 15.4, 6.7 Hz, 12H)。 實例 3
Figure 02_image252
Figure 02_image254
Figure 02_image256
化合物 14描述於Tiberghien等人的Org. Process Res. Dev. (2018, 22, 9, 1241-1256)中。 a) [(2S)-2-[[ 三級 - 丁基 ( 二甲基 ) 矽烷基 ] 氧基甲基 ]-4-(4- 甲氧苯基 )-2,3- 二氫吡咯 -1- 基 ]-(5- 甲氧基 -2- 硝基 -4- 三異丙基矽烷氧基 - 苯基 ) 甲酮 (15)
在-40℃下，在氬氣中，將三氟甲磺酸酐(8.87 mL，51.7 mmol)添加至 14(20.0 g，34.4 mmol)及2,6-二甲基吡啶(8.1 mL，69 mmol)在乾燥甲苯(120 mL)中之溶液。將溶液在-35℃下攪拌30分鐘，藉由LCMS及TLC (EtOAc/己烷 1/3)指示完成。將溶液用乙酸乙酯(100 mL)及水(100 mL)稀釋。將有機層用0.02 N HCl (100 mL)、接著飽和的碳酸氫鹽(100 mL)及鹽水(50 mL)進一步洗滌。將有機物用硫酸鎂乾燥且在真空下濃縮至50 mL左右。將溶液用甲苯(100 mL)稀釋。溶液經過兩個真空/氬氣循環，然後添加二鹽基性的磷酸鉀(36.7 g, 206 mmol，98.0質量%)、4-甲氧苯基硼酸(7.01 g, 44.7 mmol)、四(三苯基膦)鈀(0) (800 mg，0.689 mmol)及水(30 mL)。將反應在室溫下在氬氣中攪拌1小時，TLC及LCMS指示反應完成。將混合物用乙酸乙酯(100 mL)稀釋且用水(100 mL)及鹽水(50 mL)洗滌。將有機物乾燥用硫酸鎂乾燥且在真空下濃縮。
將殘餘物乾燥加載在氧化矽上且藉由在氧化矽床(梯度EtOAc/己烷10/90，至多25/75)上過濾來純化。聚集較純的分餾物且在真空下濃縮，以得到為深黃色泡沫之 15(20.0 g，29.8 mmol，86.6%產率)。
LC-MS (方法2) 2.66分鐘，ES + m/z672.0 [M+H]。 b) (2- 胺基 -5- 甲氧基 -4- 三異丙基矽烷氧基 - 苯基 )-[(2S)-2-[[ 三級 - 丁基 ( 二甲基 ) 矽烷基 ] 氧基甲基 ]-4-(4- 甲氧苯基 )-2,3- 二氫吡咯 -1- 基 ] 甲酮 (16)
將鋅(39.7 g，606 mmol)在0℃下添加至水(5.50 mL)、乙酸(5.50 mL，95.9 mmol)及乙醇(88.0 mL)之混合物。在5℃下緩慢地添加 15(A，11.0 g，16.4 mmol)在乙醇(60 mL)中之溶液，接著在5℃下進一步攪拌。在1小時30分鐘後，觀測到約20%之羥胺副產物。將另外的20g鋅與另外5 mL酸及水一起添加。允許反應經過3小時緩慢地溫熱至室溫，此時，觀測到完成。將固體在矽藻土床上藉由過濾移除。將溶液分配在水(300 mL)與乙酸乙酯(300 mL)之間，分離，且在此用用水(300 mL)、然後用碳酸氫鈉水溶液(150 mL)洗滌。將有機相經由硫酸鎂乾燥，且在真空下移除揮發物。將殘餘物藉由急速層析法(340g Ultra Biotage，梯度乙酸乙酯/己烷 8/92至24/76，在6 CV中，在24/76左右溶析)純化，以得到為淺黃色泡沫之 16(9.3 g，15 mmol，89%產率)。
LC-MS (方法2) 2.49分鐘，ES + m/z642.5 [M+H]。 c) [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-( 烯丙氧基羰基胺基 )-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲基 N-[2-[(2S)-2-[[ 三級 - 丁基 ( 二甲基 ) 矽烷基 ] 氧基甲基 ]-4-(4- 甲氧苯基 )-2,3- 二氫吡咯 -1- 羰基 ]-4- 甲氧基 -5- 三異丙基矽烷氧基 - 苯基 ] 胺甲酸酯 (17)
將三光氣(1.46 g，4.87 mmol，99質量%)在-10℃下添加至 16(8.70 g，13.6 mmol)在乾燥二氯甲烷(87.0 mL，99.5質量%)、然後乾燥的三乙胺(4.18 mL，29.8 mmol，99.5質量%)中之經攪拌溶液。允許將混合物溫熱至室溫。在一個部分中添加固體烯丙基N-[(1S)-1-[[(1S)-2-[4-(羥甲基)苯胺基]-1-甲基-2-側氧-乙基]胺甲醯基]-2-甲基-丙基]胺甲酸酯(5.38 g，14.3 mmol)，然後添加三乙胺(2.85 mL，20.3 mmol)及二氯甲烷(87.0 mL)。允許在室溫下將反應混合物攪拌4小時。觀測到開始材料之完全溶解。藉由LCMS及TLC (乙酸乙酯/己烷1/2)觀測到反應完成。將溶液用0.15 N HCl (500 mL)、然後用飽和的碳酸氫鹽(200 mL)洗滌。將有機層用硫酸鎂乾燥，然後濃縮。將殘餘物在真空下乾燥隔夜，得到為純橙色泡沫之 17(13.87 g，13.28 mmol，97.8%產率)。
LC-MS (方法2) 2.47分鐘，ES + m/z1045.4 [M+H]。 d) [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-( 烯丙氧基羰基胺基 )-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲基 N-[2-[(2S)-2-( 羥甲基 )-4-(4- 甲氧苯基 )-2,3- 二氫吡咯 -1- 羰基 ]-4- 甲氧基 -5- 三異丙基矽烷氧基 - 苯基 ] 胺甲酸酯 (18)
將對甲苯磺酸(2.24 g，12.7 mmol)添加至 17(13.3 g，12.7 mmol)在乙酸(2.66 mL)、甲醇(13.3 mL)、水(4.00 mL)及2-甲基四氫呋喃(80.0 mL)中之混合物的溶液，且在室溫下攪拌。藉由LCMS發現反應進展迅速且在1小時後完成。
將反應混合物用乙酸乙酯(100 mL)稀釋，且用水(100 mL)、然後用飽和的碳酸氫鹽水溶液(50 mL)及鹽水(50 mL)洗滌。將有機物用硫酸鎂乾燥。在真空下移除揮發物。將殘餘物用第一層析法(340 g ultra，EtOAc/己烷35/65至最高100/0，在6 CV中，自90/10溶析)純化；聚集純分餾物，且在真空下移除揮發物，以得到為黃色固體之 18(11.8 g，12.7 mmol，99.6%產率)。
LC-MS (方法2) 2.12分鐘，ES + m/z931.1 [M+H]。 e) [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-( 烯丙氧基羰基胺基 )-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲基 (6aS)-2- 甲氧基 -8-(4- 甲氧苯基 )-11- 側氧 -3- 三異丙基矽烷氧基 -6a,7- 二氫 -6H- 吡咯并 [2,1-c][1,4] 苯并二氮呯 -5- 羧酸酯 (19)
將偶氮二羧酸二異丙酯(5.70 mL，28.4 mmol)添加至 18(12.0 g，12.9 mmol)及三苯基膦(9.00 g，34.1 mmol)在四氫呋喃(200 mL)中之溶液。將反應在40℃下加熱2h小時，此時藉由LCMS形成令人滿意之量的產物。在真空下移除揮發物，且將殘餘物藉由層析法(340g Ultra, Biotage, EtOAc/己烷，梯度自 35%至75%，在約65%以上時溶析)純化。聚集純分餾物且在真空下濃縮，以得到為淺黃色固體(純度85%，根據LC)之 19(8.50 g，9.32 mmol，72.2%產率)。
LC-MS (方法2) 2.15分鐘，ES + m/z913.1 [M+H]。 f) [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-( 烯丙氧基羰基胺基 )-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯 基 ] 甲基 (6aS)-3- 羥基 -2- 甲氧基 -8-(4- 甲氧苯基 )-11- 側氧 -6a,7- 二氫 -6H- 吡咯并 [2,1-c][1,4] 苯并二氮呯 -5- 羧酸酯 (20)
將乙酸鋰(1.3 g, 20 mmol)添加至 19(8.40 g，9.21 mmol)在DMF (42.0 mL，543 mmol)及水(1.7 mL，94 mmol)中之溶液。將溶液在40℃下攪拌1小時，然後分配在2-MeTHF (250 mL)與水(400 mL)之間。將有機物用鹽水(150 mL)洗滌，然後用硫酸鎂乾燥。在真空下將溶液濃縮。將殘餘物藉由層析法(100g Ultra，梯度自50/50 EtOAc /己烷至最高100% EtOAc)純化。濃縮純分餾物且在真空下乾燥。在二乙醚(100 mL)中取得固體，藉由過濾收集且進行乾燥，以得到為灰白色粉末之 20(5.0 g，6.6 mmol，72%產率)。
LC-MS (方法2) 1.53分鐘，ES + m/z756.7 [M+H]。 g) [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-( 烯丙氧基羰基胺基 )-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲基 (6aS)-3-[[3-( 溴甲基 ) 苯基 ] 甲氧基 ]-2- 甲氧基 -8-(4- 甲氧苯基 )-11- 側氧 -6a,7- 二氫 -6H- 吡咯并 [2,1-c][1,4] 苯并二氮呯 -5- 羧酸酯 (21)及 [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-( 烯丙氧基羰基胺基 )-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲基 (6aS)-3-[[3-[[(6aS)-5-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-( 烯丙氧基羰基胺基 )-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲氧基羰基 ]-2- 甲氧基 -8-(4- 甲氧苯基 )-11- 側氧 -6a,7- 二氫 -6H- 吡咯并 [2,1-c][1,4] 苯并二氮呯 -3- 基 ] 氧基甲基 ] 苯基 ] 甲氧基 ]-2- 甲氧基 -8-(4- 甲氧苯基 )-11- 側氧 -6a,7- 二氫 -6H- 吡咯并 [2,1-c][1,4] 苯并二氮呯 -5- 羧酸酯 (22)
將1,3-雙(溴甲基)苯(0.698 g，2.64 mmol)添加至 20(1.00 g，1.32 mmol)及碳酸鉀(603 mg，4.36 mmol)在丙酮(10.0 mL)中之混合物。
將混合物在50℃下加熱1.5小時，此時，LCMS展示苯酚轉化為單烷基化及雙烷基化之產物。倒出混合物，且將上澄液蒸發至乾燥。將殘餘物加載在10g silica samplet上，在真空下乾燥，且加載在50g Ultra Biotage柱上。藉由層析法(梯度自EtOAc/己烷 25/75至最高100% EtOAc，接著為EtOAc / EtOH 90/10)將混合物純化。聚集分餾物且在真空下移除揮發物以得到為淺黃色固體之產物 21(462 mg，0.492 mmol，37.2%產率)及 22(531 mg，0.329 mmol，49.8%產率)。
21LC-MS (方法2) 1.85分鐘，ES + m/z940.6 [M+H]。
22LC-MS (方法2) 1.93分鐘，ES + m/z1615.3 [M+H]。 h) [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2- 胺基 -3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲基 (6aS)-3-[[3-[[(6aS)-5-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2- 胺基 -3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲氧基羰基 ]-2- 甲氧基 -8-(4- 甲氧苯基 )-11- 側氧 -6a,7- 二氫 -6H- 吡咯并 [2,1-c][1,4] 苯并二氮呯 -3- 基 ] 氧基甲基 ] 苯基 ] 甲氧基 ]-2- 甲氧基 -8-(4- 甲氧苯基 )-11- 側氧 -6a,7- 二氫 -6H- 吡咯并 [2,1-c][1,4] 苯并二氮呯 -5- 羧酸酯 (23)
將化合物 22(500 mg，0.30983 mmol)溶解於二氯甲烷(6.00 mL)及吡咯啶(65.0 μL，0.775 mmol)之混合物中。用氬氣沖洗氣氛。當LCMS展示反應完成時，添加催化量的四(三苯基膦)鈀(0) (7.20 mg，0.00620 mmol)且允許反應進行30分鐘。
將反應混合物分配在DCM (10 mL)、1M氯化銨水溶液(10 mL)之間。經由isolera筒倒出有機層，且在真空下移除揮發物以得到粗 23(448 mg，0.310 mmol，100%產率)
LC-MS (方法1) 1.44分鐘，ES + m/z1446.9 [M+H]。 i) [4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5- 二側氧吡咯 -1- 基 ) 丙醯基胺基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 丙醯基胺基 ]-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲基 (6aS)-3-[[3-[[(6aS)-5-[[4-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[3-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[2-[3-(2,5- 二側氧吡咯 -1- 基 ) 丙醯基胺基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 乙氧基 ] 丙醯基胺基 ]-3- 甲基 - 丁醯基 ] 胺基 ] 丙醯基 ] 胺基 ] 苯基 ] 甲氧基羰基 ]-2- 甲氧基 -8-(4- 甲氧苯基 )-11- 側氧 -6a,7- 二氫 -6H- 吡咯并 [2,1-c][1,4] 苯并二氮呯 -3- 基 ] 氧基甲基 ] 苯基 ] 甲氧基 ]-2- 甲氧基 -8-(4- 甲氧苯基 )-11- 側氧 -6a,7- 二氫 -6H- 吡咯并 [2,1-c][1,4] 苯并二氮呯 -5- 羧酸酯 (24)
將mal-amido-peg8-酸(161 mg，0.266 mmol)及1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺氯化氫(51.6 mg，0.266 mmol)添加至在室溫下 23(175 mg，0.121 mmol)在二氯甲烷(4 mL)中之溶液。當藉由LCMS觀測到反應完成時，將反應混合物攪拌3小時。用水洗滌溶液且經由相分離器倒出。藉由蒸發移除DCM，且將殘餘物藉由急速層析法(25g Ultra，DCM / DCM/MeOH 80/20；梯度自15/85至最高60/40，在20 CV中)純化。聚集純分餾物且蒸發。藉由製備逆相層析法進行另外的純化，然後冷凍乾燥，得到為黃色固體之 24(202.63 mg，0.078085 mmol，64.5%產率)。純度98.1%。
LC-MS (方法1) 1.89分鐘，ES + m/z1298.6 [(M+2H)/2]；(方法3) 7.64分鐘，ES + m/z1298.6 [(M+2H)/2]； 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.89 (s, 2H), 8.15 (d, J = 6.9 Hz, 2H), 8.00 (t, J = 5.5 Hz, 2H), 7.87 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.62 – 7.52 (m, 5H), 7.52 – 7.38 (m, 9H), 7.28 – 7.09 (m, 8H), 7.00 (s, 4H), 6.95 – 6.87 (m, 4H), 5.19 – 4.83 (m, 8H), 4.38 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 4.27 – 3.98 (m, 6H), 3.81 (s, 6H), 3.77 (s, 6H), 3.70 – 3.54 (m, 10H), 3.53 – 3.42 (m, 56H), 3.36 (t, J = 5.9 Hz, 4H), 3.28 – 3.18 (m, 2H), 3.15 (q, J = 5.8 Hz, 4H), 2.75 (d, J = 16.4 Hz, 2H), 2.48 – 2.36 (m, 4H), 2.34 (dt, J = 8.2, 5.5 Hz, 4H), 2.07 – 1.88 (m, 2H), 1.28 (d, J = 6.9 Hz, 6H), 0.85 (dd, J = 15.3, 6.8 Hz, 12H)。 實例 4 – 13 之替代合成 此實例之分析條件 高效能液相層析法 (HPLC)方法1
在40℃的溫度下，在1.0 mL/min之流動速率下，將Agilent 1260 II系統與Poroshell 120 PFP (4.6 x 150 mm，2.7 μm)柱一起使用。所用之移動相為溶劑A (具0.05% TFA之H 2O)及溶劑B (具0.05% TFA之CH 3CN)。將樣本加載於CH 3CN中。
梯度自初始組成50% B開始，保持4分鐘時段，經過另外的7分鐘時段增加至95% B。如此保持6分鐘，然後經過5秒返回30% B且在此處保持4分鐘。梯度運行之總持續時間為22分鐘，樣本注入體積為1 µL且在220 nm下進行偵測。 方法2
在40℃的溫度下，在1.0 mL/min之流動速率下，將Agilent 1260 II系統與Poroshell 120 PFP (4.6 x 150 mm，2.7 μm)柱一起使用。所用之移動相為溶劑A (具0.05% TFA之H 2O)及溶劑B (具0.05% TFA之CH 3CN)。將樣本加載於DMF中。
梯度自初始組成50% B開始，保持4分鐘時段，經過另外的7分鐘時段增加至95% B。如此保持6分鐘，然後經過5秒返回30% B且在此處保持4分鐘。梯度運行之總持續時間為22分鐘，樣本注入體積為1 µL且在220 nm下進行偵測。 方法3
在40℃的溫度下，在0.5 mL/min之流動速率下，將Agilent 1260 II系統與YMC-Triart (50 x 3.0 mm，D. S-3 μm，12 nm)柱一起使用。所用之移動相為溶劑A (具0.05% TFA之H 2O)及溶劑B (具0.05% TFA之CH 3CN)。將樣本加載於CH 3CN中。
梯度自初始組成10% B開始，經過6分鐘時段增加至50% B，接著經過2分鐘時段進一步增加至95%，然後經過5秒返回10% B且在此處保持2分鐘。梯度運行之總持續時間為10分鐘，樣本注入體積為0.1 µL且在220 nm下進行偵測。 方法4
在40℃的溫度下，在1.0 mL/min之流動速率下，將Agilent 1260 II系統與Atlantis T3 (4.6 x 150 mm，3 μm)柱一起使用。所用之移動相為溶劑A (H 2O)及溶劑B (CH 3CN)。將樣本加載於CH 3CN中。
梯度自初始組成30% B開始，經過4分鐘時段增加至60% B，接著經過11分鐘時段進一步增加至95%。如此保持8分鐘，然後經過5秒返回30% B且在此處保持4分鐘。梯度運行之總持續時間為27分鐘，樣本注入體積為1 µL且在220 nm下進行偵測。 超高效能液相層析法 (UPLC)
在50℃的溫度下，在0.5 mL/min之流動速率下，將Agilent 1260 II系統與Waters Acquity (UPLC CSH C18，1.7µ，2.1 x 100 mm)柱一起使用。所用之移動相為溶劑A (具0.05%乙酸之H 2O)及溶劑B (具0.05%乙酸之CH 3CN)。將樣本加載於含0.05%乙酸的CH 3CN:H 2O之1:1混合物中。 方法1
梯度自初始組成20% B開始，保持2分鐘時段，經過另外的14分鐘時段增加至46% B。此經過5分鐘時段進一步增加至100% B，然後保持5分鐘，接著經過30秒返回20% B且在此處保持4.5分鐘。梯度運行之總持續時間為30分鐘，樣本注入體積為0.5 µL且在223 nm下進行偵測。 方法2
梯度自初始組成10% B開始，保持4分鐘時段，經過另外的4分鐘時段增加至30% B。此經過10分鐘時段進一步增加至90% B，然後保持3分鐘。梯度運行之總持續時間為21分鐘，樣本注入體積為0.3 µL且在223 nm下進行偵測。 方法3
梯度自初始組成10% B開始，保持4分鐘時段，經過另外的4分鐘時段增加至30% B。此經過10分鐘時段進一步增加至90% B，然後保持3分鐘，接著經過3分鐘返回10% B。梯度運行之總持續時間為24分鐘，樣本注入體積為1 µL且在223 nm下進行偵測。 此實例之純化條件 超臨界流體層析法 (SFC)方法1
在35℃的溫度下，在100巴的壓力下，在60 mL/min之流動速率下使用GreenSep Basic (3 x 15 cm，5 μm)柱。所用之移動相為A (CO 2)及B (具0.1% 2 M NH 3-MeOH之MeOH)。使用35% B之等度梯度，總梯度持續時間為9分鐘且在220 nm下進行偵測。 製備高效能液相層析法 (Prep-HPLC)方法1
在100 mL/min之流動速率下使用350 g (3-25 μm, 100 Å)柱。所用之移動相為溶劑A (具0.01%甲酸之H 2O)及溶劑B (具0.01%甲酸之CH 3CN)。
梯度自初始組成30% B開始，保持5分鐘時段，經過另外的15分鐘時段增加至45% B。此經過7分鐘時段再次增加至50%，然後經過5分鐘時段上升至100% B，接著經過5分鐘返回30% B。梯度運行之總持續時間為37分鐘且在220 nm及254 nm下進行偵測。
Figure 02_image258
(a) ( S)-(2- 胺基 -5- 甲氧基 -4-(( 三異丙基矽烷基 ) 氧基 ) 苯基 )(2-((( 三級 - 丁基二甲基矽烷基 ) 氧基 ) 甲基 )-4- 甲基 -2,3- 二氫 -1 H- 吡咯 -1- 基 ) 甲酮 (15)
在20-30℃下將乙醇(8.0 V)、水(0.5 V)及乙酸 (0.5 V)添加至燒瓶，然後冷卻至-5至0℃之間。在-10至0℃下添加鋅(37.0當量)，然後在5℃下將混合物攪拌30分鐘。在0℃至5℃之間逐滴添加化合物 14(1.0當量)在乙醇(2.0 V)中之溶液，然後在5℃下攪拌30分鐘，此時，LCMS展示反應完成。過濾反應混合物且將濾餅用EtOAc (20 V)洗滌。將有機相用NHCO 3飽和水溶液(10%, 40 V)及鹽水(20 V)洗滌，然後用Na 2SO 4乾燥。然後對此進行過濾且濃縮至乾燥，以得到 15。積垢為70 g，產率為94%。保持時間：12.06分鐘(HPLC方法1)。 (b) 4-(( S)-2-(( S)-2-((( 烯丙氧基 ) 羧基 ) 胺基 )-3- 甲基丁醯胺基 ) 丙醯胺基 ) 苄基 (2-(( S)-2-((( 三級 - 丁基二甲基矽烷基 ) 氧基 ) 甲基 )-4- 甲基 -2,3- 二氫 -1 H- 吡咯 -1- 羧基 )-4- 甲氧基 -5-(( 三異丙基矽烷基 ) 氧基 ) 苯基 ) 胺甲酸酯 (16)
在氬氣下，將化合物 15(1.0當量)溶解於DCM (10 V)中。將溶液冷卻至-25℃與-15℃之間，然後順序地添加三光氣(0.36當量)及三乙胺(1.2當量)。將反應在此溫度下攪拌30分鐘，然後添加活化的4A 分子篩 (2.0 w/w)，接著添加丙烯基N-[(1S)-1-[[(1S)-2-[4-(羥甲基)苯胺基]-1-甲基-2-側氧-乙基]胺甲醯基]-2-甲基-丙基]胺甲酸酯(1.2當量)及三乙胺(1.5當量)。10分鐘後，將反應溫熱至20℃與30℃之間且攪拌16小時，此時，LCMS展示反應完成。過濾反應混合物且將濾餅用DCM (20 V)洗滌。將有機相用水(15 V)及鹽水(15 V)洗滌，然後用Na 2SO 4乾燥。然後對此進行過濾且濃縮至乾燥，且將所得殘餘物藉由管柱層析法(在石油醚中之0-50% EtOAc)純化。聚集純分餾物且在真空下移除揮發物，以得到 16。積垢為65 g，產率為89%。保持時間：12.19分鐘(HPLC方法1)。 (c) 4-(( S)-2-(( S)-2-((( 烯丙氧基 ) 羧基 ) 胺基 )-3- 甲基丁醯胺基 ) 丙醯胺基 ) 苄基 (2-(( S)-2-( 羥甲基 )-4- 甲基 -2,3- 二氫 -1 H- 吡咯 -1- 羧基 )-4- 甲氧基 -5-(( 三異丙基矽烷基 ) 氧基 ) 苯基 ) 胺甲酸酯 (17)
將化合物 16(1.0當量)在THF (6 V)及水(0.3 V)中之溶液冷卻至15℃。添加對甲苯磺酸(0.6當量)，且將反應溫熱至20℃與30℃之間且攪拌30分鐘，此時，LCMS展示反應完成。添加EtOAc (10 V)且將所得混合物用水(5 V)、飽和NaHCO 3(5 V)及鹽水(5 V)洗滌，然後用Na 2SO4乾燥。然後對此進行過濾且濃縮至乾燥，且將所得殘餘物藉由管柱層析法(在石油醚中之0-70% EtOAc)純化。聚集純分餾物且在真空下移除揮發物，以得到 17。積垢為90 g，產率為78%。保持時間：9.37分鐘(HPLC方法1)。 (d) 4-(( S)-2-(( S)-2-((( 烯丙氧基 ) 羧基 ) 胺基 )-3- 甲基丁醯胺基 ) 丙醯胺基 ) 苄基 ( S)-7- 甲氧基 -2- 甲基 -5- 側氧 -8-(( 三異丙基矽烷基 ) 氧基 )-11,11a- 二氫 -1 H- 苯并 [e] 吡咯并 [1,2-a][1,4] 二氮呯 -10(5 H)- 羧酸酯 (18)
在20℃下，在氮氣氣氛下，將二異丙基偶氮二羧酸酯(2.2當量)添加至化合物 17(1.0當量)及三苯膦 (3.0當量)在THF (20 V)中之溶液。將反應溫熱至25℃保持兩小時，此時，LCMS展示反應完成。將溶液濃縮以得到粗製品，將粗製品藉由管柱層析法(0-80% 在石油醚中之EtOAc)純化。聚集純分餾物且在真空下移除揮發物，以得到 18。積垢為55 g，產率為61%。保持時間：9.59分鐘(HPLC方法1)。 (e) 4-(( S)-2-(( S)-2-((( 烯丙氧基 ) 羧基 ) 胺基 )-3- 甲基丁醯胺基 ) 丙醯胺基 ) 苄基 ( S)-8- 羥基 -7- 甲氧基 -2- 甲基 -5- 側氧 -11,11a- 二氫 -1 H- 苯并 [e] 吡咯并 [1,2-a][1,4] 二氮呯 -10(5 H)- 羧酸酯 (19)
在20℃與30℃之間，在氮氣氣氛下，將LiOAc (0.8當量)添加至化合物 18(1.0當量)在DMF (5 V)及水(0.1 V)中之溶液。將反應在此溫度下攪拌8小時，此時，LCMS展示反應完成。將溶液用EtOAc (20 V)稀釋且冷卻至0℃與10℃之間。緩慢添加檸檬酸水溶液(0.2 M, 10 V)且將所得層分離。將水相用EtOAc (10 V × 2)進一步萃取。將組合的有機層用鹽水(5 V)洗滌，然後將鹽水相用EtOAc (5 V)萃取。將有機層組合且濃縮至乾燥。將所得固體再溶解於MTBE (15 V)中且攪拌15分鐘，然後過濾。將濾餅用MTBE (5 V)洗滌且在40℃下在真空下將溶液濃縮且乾燥，以得到 19。積垢為33 g，產率為90%。保持時間：2.67分鐘(HPLC方法2)。 (f) 4-(( S)-2-(( S)-2-((( 烯丙氧基 ) 羧基 ) 胺基 )-3- 甲基丁醯胺基 ) 丙醯胺基 ) 苄基 ( S)-8-((3-( 溴甲基 ) 苄基 ) 氧基 )-7- 甲氧基 -2- 甲基 -5- 側氧 -11,11a- 二氫 -1 H- 苯并 [e] 吡咯并 [1,2-a][1,4] 二氮呯 -10(5 H)- 羧酸酯 (20)
在20℃與30℃之間，在氮氣氣氛下，將碳酸鉀(4.0當量)添加至化合物 19(1.0當量)及α,α′-二溴-間-二甲苯(5.8當量)在丙酮(6.5 V)中之溶液。將反應在此溫度下攪拌8小時，此時，LCMS展示反應完成。過濾反應混合物且將濾餅用丙酮(5 V)及DCM (5 V)洗滌。將溶液濃縮以得到粗製品，將粗製品藉由管柱層析法(在石油醚中之0-50% EtOAc)純化。聚集純分餾物且在真空下移除揮發物，以得到 20。
積垢為10 g，產率為61%。保持時間：5.27分鐘(HPLC方法3)。
Figure 02_image260
(g) 4-(( S)-2-(( S)-2-((( 烯丙氧基 ) 羧基 ) 胺基 )-3- 甲基丁醯胺基 ) 丙醯胺基 ) 苄基 (2-(( S)-2-((( 三級 - 丁基二甲基矽烷基 ) 氧基 ) 甲基 )-4- 甲基 -2,3- 二氫 -1 H- 吡咯 -1- 羧基 )-5- 羥基 -4- 甲氧苯基 ) 胺甲酸酯 (21)
在20℃與30℃之間，在氮氣氣氛下，將LiOAc (0.8當量)添加至化合物 16(1.0當量)在DMF (5 V)及水(0.1 V)中之溶液。將反應在此溫度下攪拌8小時，此時，LCMS展示反應完成。將溶液用MTBE (5 V)稀釋且用水(5 V × 2)洗滌。將水相用MTBE (5 V)萃取且將組合的有機層經由氧化矽凝膠墊過濾且濃縮。將庚烷(10 V)添加至粗製品，且在30分鐘後，在25℃下，將漿液過濾且將濾餅用庚烷(1.5 V)洗滌，以得到 21。積垢為35 g，產率為90%。保持時間：8.26分鐘(HPLC方法1)。 (h) 4-(( S)-2-(( S)-2-((( 烯丙氧基 ) 羧基 ) 胺基 )-3- 甲基丁醯胺基 ) 丙醯胺基 ) 苄基 ( S)-8-((3-((5-((((4-(( S)-2-(( S)-2-((( 烯丙氧基 ) 羧基 ) 胺基 )-3- 甲基丁醯胺基 ) 丙醯胺基 ) 苄基 ) 氧基 ) 羧基 ) 胺基 )-4-(( S)-2-((( 三級 - 丁基二甲基矽烷基 ) 氧基 ) 甲基 )-4- 甲基 -2,3- 二氫 -1H- 吡咯 -1- 羧基 )-2- 甲氧苯氧基 ) 甲基 ) 苄基 ) 氧基 )-7- 甲氧基 -2- 甲基 -5- 側氧 -11,11a- 二氫 -1H- 苯并 [ e] 吡咯并 [1,2-a][1,4] 二氮呯 -10(5 H)- 羧酸酯 (10)
在20℃與30℃之間，將碳酸鉀(2.0當量)添加至化合物 20(1.0當量)、化合物 21(1.0當量)及TBAI (0.1當量)在丙酮(10 V)中之溶液。將反應在50℃下攪拌2小時，此時，LCMS展示反應完成。添加水(6.5 V) 及EtOAc (10 V)且將所得層分離。將有機相另外用NaHCO 3飽和水溶液(2.5 V)及鹽水(2 V)洗滌，用Na 2SO 4乾燥且濃縮。將所得材料藉由管柱層析法(在石油醚中之0-80% EtOAc)純化。聚集純分餾物且在真空下移除揮發物，以得到 10。積垢為10 g，產率為78%。保持時間：16.40分鐘(HPLC方法4)。 (i) 4-(( S)-2-(( S)-2-((( 烯丙氧基 ) 羧基 ) 胺基 )-3- 甲基丁醯胺基 ) 丙醯胺基 ) 苄基 ( S)-8-((3-((5-((((4-(( S)-2-(( S)-2-((( 烯丙氧基 ) 羧基 ) 胺基 )-3- 甲基丁醯胺基 ) 丙醯胺基 ) 苄基 ) 氧基 ) 羧基 ) 胺基 )-4-(( S)-2-( 羥甲基 )-4- 甲基 -2,3- 二氫 -1H- 吡咯 -1- 羧基 )-2- 甲氧苯氧基 ) 甲基 ) 苄基 ) 氧基 )-7- 甲氧基 -2- 甲基 -5- 側氧 -11,11a- 二氫 -1H- 苯并 [ e] 吡咯并 [1,2-a][1,4] 二氮呯 -10(5H)- 羧酸酯 (11)
在0℃下，在氮氣氣氛下，將HF.吡啶(70%，2V)之溶液添加至化合物 10(1.0當量)在THF (20 V)中之溶液。將反應在此溫度下攪拌1小時，此時，LCMS展示反應完成。添加NaHCO 3飽和水溶液(150 V)以將pH調整至7，同時將溫度維持在0℃與5℃之間。將溶液用DCM (20 V × 3)萃取且將組合的有機層用水(10 V × 2)洗滌，用Na 2SO 4乾燥，過濾且濃縮。將所得材料藉由SFC (方法1)純化。聚集純分餾物且在真空下移除揮發物，以得到 11。積垢為11 g，產率為86%。保持時間：5.55分鐘(HPLC方法4)。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 10.12 - 9.82 (m, 2H), 9.05 (s, 1H), 8.22 - 8.04 (m, 2H), 7.64 - 7.49 (m, 5H), 7.48 - 7.34 (m, 4H), 7.31 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.22 (dd, J = 8.9, 3.5 Hz, 3H), 7.09 (d, J = 11.9 Hz, 2H), 6.89 (s, 1H), 6.67 - 6.59 (m, 1H), 5.97 (s, 1H), 5.96 - 5.84 (m, 2H), 5.30 (ddt, J = 16.9, 3.3, 1.7 Hz, 2H), 5.16 (ddd, J = 10.4, 3.5, 1.8 Hz, 2H), 5.12 - 4.97 (m, 6H), 4.96 - 4.78 (m, 2H), 4.53 - 4.35 (m, 7H), 4.09 - 3.95 (m, 2H), 3.89 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 3.78 (s, 3H), 3.75 (s, 3H), 3.64 (s, 1H), 3.53 (s, 2H), 2.83 (d, J = 16.2 Hz, 1H), 2.71 - 2.58 (m, 1H), 2.40 (d, J = 16.8 Hz, 1H), 2.28 (d, J = 16.7 Hz, 1H), 2.06 - 1.89 (m, 2H), 1.74 (s, 3H), 1.59 (s, 3H), 1.35 - 1.21 (m, 6H), 0.95 - 0.75 (m, 12H)。
Figure 02_image262
(j) 4-(( S)-2-(( S)-2-((( 烯丙氧基 ) 羧基 ) 胺基 )-3- 甲基丁醯胺基 ) 丙醯胺基 ) 苄基 (11 S,11a S)-8-((3-(((( S)-10-(((4-(( S)-2-(( S)-2-((( 烯丙氧基 ) 羧基 ) 胺基 )-3- 甲基丁醯胺基 ) 丙醯胺基 ) 苄基 ) 氧基 ) 羧基 )-7- 甲氧基 -2- 甲基 -5- 側氧 -5,10,11,11a- 四氫 -1 H- 苯并 [ e] 吡咯并 [1,2- a][1,4] 二氮呯 -8- 基 ) 氧基 ) 甲基 ) 苄基 ) 氧基 )-11- 羥基 -7- 甲氧基 -2- 甲基 -5- 側氧 -11,11a- 二氫 -1 H- 苯并 [e] 吡咯并 [1,2- a][1,4] 二氮呯 -10(5 H)- 羧酸酯 (12)
在空氣氛圍下，將四乙腈銅(i)三氟甲磺酸鹽(1.0當量)添加至Stahl TEMPO溶液(0.2 M/L， 0.4當量)及化合物 11(1.0當量)在DCM (15.5 V)中之溶液。將反應在34℃下攪拌48小時，此時，LCMS展示反應完成。將反應混合物濃縮且將所得材料藉由管柱層析法(在DCM中之0-10% MeOH)純化。聚集純分餾物且在真空下移除揮發物，以得到 12。
積垢為9.4 g，產率為86%。保持時間：17.30 (UPLC方法1)。 (k) 4-(( S)-2-(( S)-2- 胺基 -3- 甲基丁醯胺基 ) 丙醯胺基 ) 苄基 (11 S,11a S)-8-((3-(((( S)-10-(((4-(( S)-2-(( S)-2- 胺基 -3- 甲基丁醯胺基 ) 丙醯胺基 ) 苄基 ) 氧基 ) 羧基 )-7- 甲氧基 -2- 甲基 -5- 側氧 -5,10,11,11a- 四氫 -1 H- 苯并 [ e] 吡咯并 [1,2- a][1,4] 二氮呯 -8- 基 ) 氧基 ) 甲基 ) 苄基 ) 氧基 )-11- 羥基 -7- 甲氧基 -2- 甲基 -5- 側氧 -11,11a- 二氫 -1 H- 苯并 [ e] 吡咯并 [1,2-a][1,4] 二氮呯 -10(5 H)- 羧酸酯 (12A)
在20℃與25℃之間，在氬氣氛圍下，將化合物 12(1.0當量)添加至吡咯啶(6.7當量)在DCM (30 V)中之溶液。添加Pd(PPh 3) 4(0.02當量)，且在30分鐘後，LCMS展示反應完成。添加DCM (50 V)且用NH 4Cl飽和水溶液(50 V)及鹽水(20 V)對溶液進行萃取。將有機相濃縮且將所得材料藉由管柱層析法(DCM中之0-10% MeOH)純化。聚集純分餾物且在真空下移除揮發物，以得到 12A。積垢為2.0 g，產率為90%。保持時間：8.53分鐘(UPLC方法2)。 (l) 4-((2 S,5 S)-37-(2,5- 二側氧 -2,5- 二氫 -1 H- 吡咯 -1- 基 )-5- 異丙基 -2- 甲基 -4,7,35- 三側氧 -10,13,16,19,22,25,28,31- 八氧雜 -3,6,34- 三氮雜七三十烷醯胺基 ) 苄基 (11 S,11a S)-8-((3-(((( S)-10-(((4-((2 S,5 S)-37-(2,5- 二側氧 -2,5- 二氫 -1 H- 吡咯 -1- 基 )-5- 異丙基 -2- 甲基 -4,7,35- 三側氧 -10,13,16,19,22,25,28,31- 八氧雜 -3,6,34- 三氮雜七三十烷醯胺基 ) 苄基 ) 氧基 ) 羧基 )-7- 甲氧基 -2- 甲基 -5- 側氧 -5,10,11,11a- 四氫 -1 H- 苯并 [ e] 吡咯并 [1,2- a][1,4] 二氮呯 -8- 基 ) 氧基 ) 甲基 ) 苄基 ) 氧基 )-11- 羥基 -7- 甲氧基 -2- 甲基 -5- 側氧 -11,11a- 二氫 -1 H- 苯并 [e] 吡咯并 [1,2- a][1,4] 二氮呯 -10(5 H)- 羧酸酯 (13)
在黑暗中，在20℃與25℃之間，在氬氣氛圍下，將MAL-dPEG ® 8-酸(2.93當量)及EDCI (2.95當量)添加至化合物 12A(1.0當量)在DCM (25 V)及MeOH (1 V)中之溶液。將反應在50℃下攪拌2小時，此時，LCMS展示反應完成。將反應濃縮且將所得材料藉由管柱層析法(DCM中之0-20% MeOH)純化。聚集純分餾物且在真空下移除揮發物。將材料藉由prep-HPLC (方法1)進行第二次純化，且聚集純分餾物且在高真空下，在＜20℃的溫度下且在完全黑暗中將揮發物移除，以得到 13。積垢為1.0 g，產率為46%。保持時間：12.12分鐘(UPLC方法3)。 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.88 (s, 2H), 8.14 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.99 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 7.85 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.55 (s, 5H), 7.49 - 7.36 (m, 3H), 7.17 (s, 3H), 7.13 - 7.04 (m, 3H), 6.99 (s, 4H), 6.94 (s, 1H), 6.70 (s, 1H), 6.62 (d, J = 2.4 Hz, 2H), 5.59 (s, 1H), 5.04 (dd, J = 33.8, 16.4 Hz, 8H), 4.37 (s, 2H), 4.26 - 4.15 (m, 2H), 4.01 (s, 2H), 3.79 (d, J = 3.8 Hz, 6H), 3.72 - 3.64 (m, 2H), 3.59 (dd, J = 7.9, 6.6 Hz, 8H), 3.53 - 3.41 (m, 56H), 3.36 (t, J = 5.9 Hz, 4H), 3.14 (q, J = 5.8 Hz, 4H), 2.87 (s, 2H), 2.47 - 2.36 (m, 4H), 2.35 - 2.29 (m, 6H), 1.95 (q, J = 6.7 Hz, 2H), 1.78 - 1.69 (m, 6H), 1.27 (s, 6H), 0.84 (dd, J = 15.4, 6.7 Hz, 12H)。 實例 5
按照描述於Dimasi, N.等人的Molecular Pharmaceutics, 2017, 14, 1501-1516 (DOI： 10.1021/acs.molpharmaceut.6b00995)中之方法來生產經工程化以在239位置與240位置之間插入半胱胺酸的赫賽汀(Herceptin)、R347及1c1抗體。 HerC239i- 7ADC (Conj A)
將DL-二硫蘇糖醇(DTT)在pH 7.4磷酸鹽緩衝液(PBS)中的50 mM溶液(100莫耳當量/抗體，13.3微莫耳，267 μL)添加至9.73 mL的抗體(20 mg，133奈莫耳)在含PBS及1 mM乙二胺四乙酸(EDTA)之還原緩衝液中的溶液，且最終抗體濃度為2.0 mg/mL。允許還原混合物在軌道式搖動器中在輕柔(60 rpm)搖動下，在室溫下反應持續17小時(或直至藉由UHPLC觀測到完全還原為止)。將還原之抗體使用15 mL Amicon Ultracell 50 kDa MWCO自旋過濾器經由自旋過濾器離心緩衝交換至含PBS及1 mM EDTA之再氧化緩衝液中，以移除所有過量的還原劑。添加去氫抗壞血酸(DHAA，15莫耳當量/抗體，2.0微莫耳，40 µL)在DMSO中的50 mM溶液，且允許再氧化混合物在輕柔(60 rpm)搖動下在室溫下反應持續4小時，得到抗體濃度2 mg/mL (或添加更多DHAA而使反應持續更久，直至藉由UHPLC觀測到半胱胺酸硫醇完全再氧化以改良鏈間半胱胺酸二硫化物)。接著將再氧化混合物無菌過濾且在含PBS及1 mM EDTA之共軛緩衝液中稀釋，得到1.0 mg/mL之最終抗體濃度。將化合物 7作為DMSO溶液(2.5莫耳當量/抗體，333奈莫耳，在2.0 mL DMSO中)添加至18 mL的此再氧化之抗體溶液(20 mg，133奈莫耳)，得到10% (v/v)之最終DMSO濃度。溶液繼續在室溫下在輕柔搖動下在室溫下反應持續20小時，然後藉由在室溫下添加 N-乙醯基半胱胺酸(1.67微莫耳，16.7 μL，100 mM)持續30分鐘對共軛進行淬滅，然後使用15 mL Amicon Ultracell 50 kDa MWCO自旋過濾器藉由自旋過濾純化，無菌過濾且分析。
在Shimadzu Prominence系統上，使用Thermo Scientific MAbPac 50 mm x 2.1 mm柱，利用水及乙腈的梯度溶析，在280 nm及330 nm下(化合物 7特異性)對Conj A之還原樣本的UHPLC分析展示未共軛輕鏈，及未共軛重鏈與藉由化合物 7之單個分子鏈接或附接至該分子的重鏈之混合物，與每抗體1.08個分子之化合物 7的藥物抗體比率(DAR)一致。
在Shimadzu Prominence系統上，使用Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAb HTP 4 µm 4.6 x 150 mm柱(具有4 µm 3.0 x 20 mm保護柱)，利用含200 mM磷酸鉀pH 6.95、250 mM氯化鉀及10%異丙醇( v/v)之0.3 mL/分鐘無菌過濾SEC緩衝液溶析，在280 nm下對Conj A之樣本的UHPLC分析展示高於98%之單體純度。UHPLC SEC分析給出最終Conj A濃度為在9.8 mL中的1.48 mg/mL，獲得的Conj A質量為14.5 mg (73%產率)。 HerC239i- 13ADC (Conj B)
將DL-二硫蘇糖醇(DTT)在pH 7.4磷酸鹽緩衝液(PBS)中的50 mM溶液(100莫耳當量/抗體，20微莫耳，400 μL)添加至14.6 mL的抗體(30 mg，200奈莫耳)在含PBS及1 mM乙二胺四乙酸(EDTA)之還原緩衝液中的溶液，且最終抗體濃度為2.0 mg/mL。允許還原混合物在軌道式搖動器中在輕柔(60 rpm)搖動下，在室溫下反應持續17小時(或直至藉由UHPLC觀測到完全還原為止)。將還原之抗體使用15 mL Amicon Ultracell 50 kDa MWCO自旋過濾器經由自旋過濾器離心緩衝交換至含PBS及1 mM EDTA之再氧化緩衝液中，以移除所有過量的還原劑。添加去氫抗壞血酸(DHAA，15莫耳當量/抗體，3.0微莫耳，60 µL)在DMSO中的50 mM溶液，且允許再氧化混合物在輕柔(60 rpm)搖動下在室溫下反應持續4小時，得到抗體濃度2 mg/mL (或添加更多DHAA而使反應持續更久，直至藉由UHPLC觀測到半胱胺酸硫醇完全再氧化以改良鏈間半胱胺酸二硫化物)。接著將再氧化混合物無菌過濾且在含PBS及1 mM EDTA之共軛緩衝液中稀釋，得到1.0 mg/mL之最終抗體濃度。將化合物 13作為DMSO溶液(2.5莫耳當量/抗體，0.5微莫耳，在3.0 mL DMSO中)添加至27 mL的此再氧化之抗體溶液(30 mg，200奈莫耳)，得到10% (v/v)之最終DMSO濃度。溶液繼續在室溫下在輕柔搖動下在室溫下反應持續20小時，然後藉由在室溫下添加 N-乙醯基半胱胺酸(2.5微莫耳，25 μL，100 mM)持續30分鐘對共軛進行淬滅。然後將共軛混合物用1 M硫酸銨、25 mM磷酸鉀pH 6.0 HIC緩衝液A稀釋3倍，且加載至5 mL疏水性交互作用層析(HIC) HiTrap丁基HP柱上，利用5 mL/min的超過100 mL (20 CV)的0à25%，然後25à100%的25 mM磷酸鉀pH 6.0 HIC緩衝液B溶析。將藥物抗體比率= 1 (DAR 1)之分餾物聚集，且使用15 mL Amicon Ultracell 50 kDa MWCO自旋過濾器經由自旋過濾緩衝液交換至PBS中，無菌過濾且分析。
在Shimadzu Prominence系統上，使用Thermo Scientific MAbPac 50 mm x 2.1 mm柱，利用水及乙腈的梯度溶析，在280 nm及330 nm下(化合物 13特定的)對Conj B之還原樣本的UHPLC分析展示未共軛輕鏈，及未共軛重鏈與藉由化合物 13之單個分子鏈接或附接至該分子的重鏈之混合物，與每抗體1.07個分子之化合物 13的藥物抗體比率(DAR)一致。
在Shimadzu Prominence系統上，使用Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAb HTP 4 µm 4.6 x 150 mm柱(具有4 µm 3.0 x 20 mm保護柱)，利用含200 mM磷酸鉀pH 6.95、250 mM氯化鉀及10%異丙醇( v/v)之0.3 mL/分鐘無菌過濾SEC緩衝液溶析，在280 nm下對Conj B之樣本的UHPLC分析展示98.5%之單體純度。UHPLC SEC分析給出最終Conj B濃度為在15 mL中的0.73 mg/mL，獲得的Conj B質量為10.9 mg (36%產率)。 R347C239i- 7ADC (Conj C)
將參(2-羧乙基)膦(TCEP)在pH 7.4磷酸鹽緩衝液(PBS)中的50 mM溶液(40莫耳當量/抗體，107微莫耳，2.13 mL)添加至133 mL的R347C239i (400 mg，2.67微莫耳)在含PBS及1 mM乙二胺四乙酸(EDTA)之還原緩衝液中的溶液，且最終抗體濃度為3.0 mg/mL。允許還原混合物在軌道式搖動器中在輕柔(60 rpm)搖動下，在室溫下反應持續17小時(或直至藉由UHPLC觀測到完全還原為止)。將還原之抗體使用具有115 cm 2表面積之mPES, MidiKros ®30 kDa纖維過濾器經由切向流過濾單元(TFF)緩衝液交換至含PBS及1 mM EDTA之再氧化緩衝液中，以移除所有過量的還原劑。添加去氫抗壞血酸(DHAA, 20莫耳當量/抗體， 53.3微莫耳，1.07 mL)在DMSO中的50 mM溶液，且允許再氧化混合物在輕柔(60 rpm)搖動下在室溫下反應持續4小時，得到抗體濃度3 mg/mL (或添加更多DHAA而使反應持續更久，直至藉由UHPLC觀測到半胱胺酸硫醇完全再氧化以改良鏈間半胱胺酸二硫化物)。接著將再氧化混合物無菌過濾且在含PBS及1 mM EDTA之共軛緩衝液中稀釋，得到2.0 mg/mL之最終抗體濃度。將化合物 7作為DMSO溶液(2.5莫耳當量/抗體，3.33微莫耳，在10 mL DMSO中)添加至90 mL的此再氧化之抗體溶液(200 mg，1.33微莫耳)，得到10% (v/v)之最終DMSO濃度。溶液繼續在室溫下在輕柔搖動下在室溫下反應持續20小時，然後藉由在室溫下添加 N-乙醯基半胱胺酸(10微莫耳，100 μL，100 mM)持續30分鐘對共軛進行淬滅。然後將共軛混合物無菌過濾，用1 M硫酸銨、25 mM磷酸鉀pH 6.0 HIC緩衝液A稀釋3倍，且加載至2個5 mL疏水性交互作用層析(HIC) HiTrap丁基HP柱上，利用mL/min的超過120 mL (12 CV)的 0à20%、然後20à100% 25 mM磷酸鉀pH 6.0 HIC緩衝液B溶析。將藥物抗體比率= 1 (DAR 1)之分餾物聚集，且使用具有115 cm 2表面積的mPES, MidiKros ®30 kDa 纖維過濾器經由TFF緩衝液交換至25 mM組胺酸、205 mM蔗糖pH 6.0中，無菌過濾且分析。
在Shimadzu Prominence系統上，使用Thermo Scientific MAbPac 50 mm x 2.1 mm柱，利用水及乙腈的梯度溶析， 在280 nm及330 nm下(化合物 7特異性)對Conj C之還原樣本的UHPLC分析展示未共軛輕鏈，及未共軛重鏈與藉由化合物 7之單個分子鏈接或附接至該分子的重鏈之混合物，與每抗體1.10個分子之化合物 7的藥物抗體比率(DAR)一致。
在Shimadzu Prominence系統上，使用Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAb HTP 4 µm 4.6 x 150 mm柱(具有4 µm 3.0 x 20 mm保護柱)，利用含200 mM磷酸鉀pH 6.95、250 mM氯化鉀及10%異丙醇( v/v)之0.3 mL/分鐘無菌過濾SEC緩衝液溶析，在280 nm下對Conj C之樣本的UHPLC分析展示97%之單體純度。Nanodrop UV-Vis分析給出最終Conj C濃度為在28.0 mL中的3.80 mg/mL，獲得的Conj C質量為106.4 mg (53%產率)。 R347C239i- 13ADC (Conj D)
將參(2-羧乙基)膦(TCEP)在pH 7.4磷酸鹽緩衝液(PBS)中的50 mM溶液(40莫耳當量/抗體，107微莫耳，2.13 mL)添加至133 mL的R347C239i (400 mg，2.67微莫耳)在含PBS及1 mM乙二胺四乙酸(EDTA)之還原緩衝液中的溶液，最終抗體濃度為3.0 mg/mL。允許還原混合物在軌道式搖動器中在輕柔(60 rpm)搖動下，在室溫下反應持續17小時(或直至藉由UHPLC觀測到完全還原為止)。將還原之抗體使用具有115 cm 2表面積之mPES, MidiKros ®30 kDa纖維過濾器經由切向流過濾單元(TFF)緩衝液交換至含PBS及1 mM EDTA之再氧化緩衝液中，以移除所有過量的還原劑。添加去氫抗壞血酸(DHAA, 20莫耳當量/抗體， 53.3微莫耳，1.07 mL)在DMSO中的50 mM溶液，且允許再氧化混合物在輕柔(60 rpm)搖動下在室溫下反應持續4小時，得到抗體濃度3 mg/mL (或添加更多DHAA而使反應持續更久，直至藉由UHPLC觀測到半胱胺酸硫醇完全再氧化以改良鏈間半胱胺酸二硫化物)。接著將再氧化混合物無菌過濾且在含PBS及1 mM EDTA之共軛緩衝液中稀釋，得到2.0 mg/mL之最終抗體濃度。將化合物 13作為DMSO溶液(2.0莫耳當量/抗體，2.67微莫耳，在10 mL DMSO中)添加至90 mL的此再氧化之抗體溶液(200 mg，1.33微莫耳)，得到10% (v/v)之最終DMSO濃度。溶液繼續在室溫下在輕柔搖動下在室溫下反應持續20小時，然後藉由在室溫下添加 N-乙醯基半胱胺酸(8微莫耳，80 μL，100 mM)持續30分鐘對共軛進行淬滅。然後將共軛混合物無菌過濾，用1 M硫酸銨、25 mM磷酸鉀pH 6.0 HIC緩衝液A稀釋3倍，且加載至2個5 mL疏水性交互作用層析(HIC) HiTrap丁基HP柱上，利用5 mL/min的超過150 mL (15 CV)的0à100% 25 mM磷酸鉀pH 6.0 HIC緩衝液B溶析。將藥物抗體比率= 1 (DAR 1)之分餾物聚集，且使用具有115 cm 2表面積的mPES, MidiKros ®30 kDa 纖維過濾器經由TFF緩衝液交換至25 mM組胺酸、205 mM蔗糖pH 6.0中，無菌過濾且分析。
在Shimadzu Prominence系統上，使用Thermo Scientific MAbPac 50 mm x 2.1 mm柱，利用水及乙腈的梯度溶析，在280 nm及330 nm下(化合物 13特異性)對Conj D之還原樣本的UHPLC分析展示未共軛輕鏈，及未共軛重鏈與藉由化合物 13之單個分子鏈接或附接至該分子的重鏈之混合物，與每抗體1.11個分子之化合物 13的藥物抗體比率(DAR)一致。
在Shimadzu Prominence系統上，使用Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAb HTP 4 µm 4.6 x 150 mm柱(具有4 µm 3.0 x 20 mm保護柱)，利用含200 mM磷酸鉀pH 6.95、250 mM氯化鉀及10%異丙醇( v/v)之0.3 mL/分鐘無菌過濾SEC緩衝液溶析，在280 nm下對Conj D之樣本的UHPLC分析展示98.5%之單體純度。Nanodrop UV-Vis分析給出最終Conj D濃度為在27.5 mL中的3.59 mg/mL，獲得的Conj D質量為98.8 mg (49%產率)。 1c1C239i- 7ADC (Conj E)
將DL-二硫蘇糖醇(DTT)在pH 7.4磷酸鹽緩衝液(PBS)中之1 M溶液(100莫耳當量/抗體，33.3微莫耳，33.3 μL)添加至25 mL的抗體(50 mg，333奈莫耳)在含PBS及1 mM乙二胺四乙酸(EDTA)之還原緩衝液中的溶液，且最終抗體濃度為2.0 mg/mL。允許還原混合物在軌道式搖動器中在輕柔(60 rpm)搖動下，在室溫下反應持續17小時(或直至藉由UHPLC觀測到完全還原為止)。將還原之抗體使用15 mL Amicon Ultracell 50 kDa MWCO自旋過濾器經由自旋過濾器離心緩衝交換至含PBS及1 mM EDTA之再氧化緩衝液中，以移除所有過量的還原劑。添加去氫抗壞血酸(DHAA，15莫耳當量/抗體，5.0微莫耳，100 µL)在DMSO中的50 mM溶液，且允許再氧化混合物在輕柔(60 rpm)搖動下在室溫下反應持續3.5小時，得到抗體濃度2 mg/mL (或添加更多DHAA而使反應持續更久，直至藉由UHPLC觀測到半胱胺酸硫醇完全再氧化以改良鏈間半胱胺酸二硫化物)。接著將再氧化混合物無菌過濾且在含PBS及1 mM EDTA之共軛緩衝液中稀釋，得到1.0 mg/mL之最終抗體濃度。將化合物 7作為DMSO溶液(2.5莫耳當量/抗體，417奈莫耳，在2.5 mL DMSO中)添加至22.5 mL的此再氧化之抗體溶液(25 mg，167奈莫耳)，得到10% (v/v)之最終DMSO濃度。溶液繼續在室溫下在輕柔搖動下在室溫下反應持續20小時，然後藉由在室溫下添加 N-乙醯基半胱胺酸(2.08微莫耳，20.8 μL，100 mM)持續30分鐘對共軛進行淬滅。然後將共軛混合物用1 M硫酸銨、25 mM磷酸鉀pH 6.0 HIC緩衝液A稀釋3倍，且加載至5 mL疏水性交互作用層析(HIC) HiTrap丁基HP柱上，利用4 mL/min的超過100 mL (20 CV)的0à100% 25 mM磷酸鉀pH 6.0 HIC緩衝液B溶析。將藥物抗體比率= 1 (DAR 1)之分餾物聚集，且使用15 mL Amicon Ultracell 50 kDa MWCO自旋過濾器經由自旋過濾緩衝液交換至PBS中，無菌過濾且分析。
在Shimadzu Prominence系統上，使用Thermo Scientific MAbPac 50 mm x 2.1 mm柱，利用水及乙腈的梯度溶析，在280 nm及330 nm下(化合物 7特異性)對Conj E之還原樣本的UHPLC分析展示未共軛輕鏈，及未共軛重鏈與藉由化合物 7之單個分子鏈接或附接至該分子的重鏈之混合物，與每抗體0.97個分子之化合物 7的藥物抗體比率(DAR)一致。
在Shimadzu Prominence系統上，使用Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAb HTP 4 µm 4.6 x 150 mm柱(具有4 µm 3.0 x 20 mm保護柱)，利用含200 mM磷酸鉀pH 6.95、250 mM氯化鉀及10%異丙醇( v/v)之0.3 mL/分鐘無菌過濾SEC緩衝液溶析，在280 nm下對Conj E之樣本的UHPLC分析展示99.5%之單體純度。UHPLC SEC分析給出最終Conj E濃度為在3.4 mL中的1.32 mg/mL，獲得的Conj E質量為4.5 mg (18%產率)。 1c1C239i- 13ADC (Conj F)
將DL-二硫蘇糖醇(DTT)在pH 7.4磷酸鹽緩衝液(PBS)中的50 mM溶液(100莫耳當量/抗體，20微莫耳，400 μL)添加至14.6 mL的抗體(30 mg，200奈莫耳)在含PBS及1 mM乙二胺四乙酸(EDTA)之還原緩衝液中的溶液，且最終抗體濃度為2.0 mg/mL。允許還原混合物在軌道式搖動器中在輕柔(60 rpm)搖動下，在室溫下反應持續17小時(或直至藉由UHPLC觀測到完全還原為止)。將還原之抗體使用15 mL Amicon Ultracell 50 kDa MWCO自旋過濾器經由自旋過濾器離心緩衝交換至含PBS及1 mM EDTA之再氧化緩衝液中，以移除所有過量的還原劑。添加去氫抗壞血酸(DHAA，15莫耳當量/抗體，3.0微莫耳，60 µL)在DMSO中的50 mM溶液，且允許再氧化混合物在輕柔(60 rpm)搖動下在室溫下反應持續4小時，得到抗體濃度2 mg/mL (或添加更多DHAA而使反應持續更久，直至藉由UHPLC觀測到半胱胺酸硫醇完全再氧化以改良鏈間半胱胺酸二硫化物)。接著在含PBS及1 mM EDTA之共軛緩衝液中對再氧化混合物進行無菌過濾及稀釋，達到1.0 mg/mL的最終抗體濃度。將化合物 13作為DMSO溶液(2.5莫耳當量/抗體，0.5微莫耳，在3.0 mL DMSO中)添加至27 mL的此再氧化之抗體溶液(30 mg，200奈莫耳)，得到10% (v/v)之最終DMSO濃度。溶液繼續在室溫下在輕柔搖動下在室溫下反應持續20小時，然後藉由在室溫下添加 N-乙醯基半胱胺酸(2.5微莫耳，25 μL，100 mM)持續30分鐘對共軛進行淬滅。然後將共軛混合物用1 M硫酸銨、25 mM磷酸鉀pH 6.0 HIC緩衝液A稀釋3倍，且加載至5 mL疏水性交互作用層析(HIC) HiTrap丁基HP柱上，利用5 mL/min的超過100 mL (20 CV)的0à100% 25 mM磷酸鉀pH 6.0 HIC緩衝液B溶析。將藥物抗體比率= 1 (DAR 1)之分餾物聚集，且使用15 mL Amicon Ultracell 50 kDa MWCO自旋過濾器經由自旋過濾緩衝液交換至PBS中，無菌過濾且分析。
在Shimadzu Prominence系統上，使用Thermo Scientific MAbPac 50 mm x 2.1 mm柱，利用水及乙腈的梯度溶析，在280 nm及330 nm下(化合物 13特異性)對Conj F之還原樣本的UHPLC分析展示未共軛輕鏈，及未共軛重鏈與藉由化合物 13之單個分子鏈接或附接至該分子的重鏈之混合物，與每抗體1.19個分子之化合物 13的藥物抗體比率(DAR)一致。
在Shimadzu Prominence系統上，使用Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAb HTP 4 µm 4.6 x 150 mm柱(具有4 µm 3.0 x 20 mm保護柱)，利用含200 mM磷酸鉀pH 6.95、250 mM氯化鉀及10%異丙醇( v/v)之0.3 mL/分鐘無菌過濾SEC緩衝液溶析，在280 nm下對Conj F之樣本的UHPLC分析展示99%之單體純度。UHPLC SEC分析給出最終Conj F濃度為在2.5 mL中的3.10 mg/mL，獲得的Conj F質量為7.7 mg (26%產率)。 HerC239i- 24ADC (Conj G)
將參(2-羧乙基)膦(TCEP)在pH 7.4磷酸鹽緩衝液(PBS)中的50 mM溶液(40莫耳當量/抗體，10.7微莫耳，213 µL)添加至13.3 mL的抗體(40 mg，267奈莫耳)在含PBS及1 mM乙二胺四乙酸(EDTA)之還原緩衝液中的溶液，且最終抗體濃度為3.0 mg/mL。允許還原混合物在軌道式搖動器中在輕柔(60 rpm)搖動下，在室溫下反應持續17小時(或直至藉由UHPLC觀測到完全還原為止)。使用15 mL Amicon Ultracell 30 kDa MWCO自旋過濾器經由自旋過濾器離心將還原之抗體緩衝交換至含30 mM組胺酸、30 mM精胺酸pH 6.8及1 mM EDTA的再氧化緩衝液中，以移除所有過量的還原劑。添加去氫抗壞血酸(DHAA，30莫耳當量/抗體，8.0微莫耳，160 µL)在DMSO中的50 mM溶液，且允許再氧化混合物在輕柔(60 rpm)搖動下在室溫下反應持續3.75小時，得到抗體濃度3 mg/mL (或添加更多DHAA而使反應持續更久，直至藉由UHPLC觀測到半胱胺酸硫醇完全再氧化以改良鏈間半胱胺酸二硫化物)。接著將再氧化混合物無菌過濾且在含PBS及1 mM EDTA之共軛緩衝液中稀釋，得到0.5 mg/mL之最終抗體濃度。將化合物 24作為DMSO溶液(3.0莫耳當量/抗體，0.8微莫耳，在8 mL DMSO中)添加至72 mL的此再氧化之抗體溶液(40 mg，267奈莫耳)，得到10% (v/v)之最終DMSO濃度。溶液繼續在+37℃下在輕柔搖動下在室溫下反應持續20小時，然後藉由在室溫下添加 N-乙醯基半胱胺酸(2.4微莫耳，24 μL，100 mM)持續30分鐘對共軛進行淬滅。然後將共軛混合物無菌過濾，濃縮至30 mL，用10 mM磷酸鈉pH 6.0 CHT緩衝液A稀釋4倍，且加載至5 mL Bio-Scale迷你CHT陶瓷羥磷石灰40 µm II型筒上，利用3.5 mL/min的超過100 mL (20 CV)的0à100% 10 mM磷酸鈉、1 M氯化鈉pH 6.0 CHT緩衝液B溶析。聚集高單體純度分餾物，用1 M硫酸銨、25 mM磷酸鉀pH 6.0 HIC緩衝液A稀釋3倍，且加載至5 mL疏水性交互作用層析(HIC) HiTrap丁基HP柱上，利用5 mL/min的超過100 mL (20 CV)的0à100% 25 mM磷酸鉀pH 6.0 HIC緩衝液B溶析。將藥物抗體比率= 1 (DAR 1)之分餾物聚集，且使用15 mL Amicon Ultracell 30 kDa MWCO自旋過濾器經由自旋過濾緩衝液交換至PBS中，無菌過濾且分析。
在Shimadzu Prominence系統上，使用Thermo Scientific MAbPac 50 mm x 2.1 mm柱，利用水及乙腈的梯度溶析，在280 nm及330 nm下(化合物 24特定的)對Conj G之還原樣本的UHPLC分析展示未共軛輕鏈，及未共軛重鏈與藉由化合物 24之單個分子鏈接或附接至該分子的重鏈之混合物，與每抗體1.27個分子之化合物 24的藥物抗體比率(DAR)一致。
在Shimadzu Prominence系統上，使用Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAb HTP 4 µm 4.6 x 150 mm柱(具有4 µm 3.0 x 20 mm保護柱)，利用含200 mM磷酸鉀(pH 6.95)、250 mM氯化鉀及10%異丙醇( v/v)之0.3 mL/分鐘無菌過濾SEC緩衝液溶析，在280 nm下對Conj G之樣本的UHPLC分析展示99%之單體純度。SEC-UHPLC分析給出最終Conj G濃度為在4.9 mL中的1.29 mg/mL，獲得的Conj G質量為6.3 mg (16%產率)。 R347C239i- 24ADC (Conj H)
將參(2-羧乙基)膦(TCEP)在pH 7.4磷酸鹽緩衝液(PBS)中的50 mM溶液(40莫耳當量/抗體，10.7微莫耳，213 µL)添加至13.3 mL的R347C239i (40 mg，267奈莫耳)在含PBS及1 mM乙二胺四乙酸(EDTA)之還原緩衝液中的溶液，且最終抗體濃度為3.0 mg/mL。允許還原混合物在軌道式搖動器中在輕柔(60 rpm)搖動下，在室溫下反應持續17小時(或直至藉由UHPLC觀測到完全還原為止)。使用15 mL Amicon Ultracell 30 kDa MWCO自旋過濾器經由自旋過濾器離心將還原之抗體緩衝交換至含30 mM組胺酸、30 mM精胺酸pH 6.8及1 mM EDTA的再氧化緩衝液中，以移除所有過量的還原劑。添加去氫抗壞血酸(DHAA，30莫耳當量/抗體，8.0微莫耳，160 µL)在DMSO中之50 mM溶液，且允許再氧化混合物在輕柔(60 rpm)搖動下在室溫下反應3.75小時，得到抗體濃度3 mg/mL (或添加更多DHAA而使反應持續更久，直至藉由UHPLC觀測到半胱胺酸硫醇完全再氧化以改良鏈間半胱胺酸二硫化物)。接著在含PBS及1 mM EDTA之共軛緩衝液中對再氧化混合物進行無菌過濾及稀釋，達到0.5 mg/mL的最終抗體濃度。將化合物 24作為DMSO溶液(3.0莫耳當量/抗體，0.8微莫耳，在8 mL DMSO中)添加至72 mL的此再氧化之抗體溶液(40 mg，267奈莫耳)，達到10% (v/v)的最終DMSO濃度。溶液繼續在+37℃下在輕柔搖動下在室溫下反應持續20小時，然後藉由在室溫下添加 N-乙醯基半胱胺酸(2.4微莫耳，24 μL，100 mM)持續30分鐘對共軛進行淬滅。然後將共軛混合物無菌過濾，濃縮至30 mL，用10 mM磷酸鈉pH 6.0 CHT緩衝液A稀釋4倍，且加載至5 mL Bio-Scale迷你CHT陶瓷羥磷石灰40 µm II型筒上，利用3.5 mL/min的超過100 mL (20 CV)的0à100% 10 mM磷酸鈉、1 M氯化鈉pH 6.0 CHT緩衝液B溶析。聚集高單體純度分餾物，用1 M硫酸銨、25 mM磷酸鉀pH 6.0 HIC緩衝液A稀釋3倍，且加載至5 mL疏水性交互作用層析(HIC) HiTrap丁基HP柱上，利用5 mL/min的超過100 mL (20 CV)的0à100% 25 mM磷酸鉀pH 6.0 HIC緩衝液B溶析。將藥物抗體比率= 1 (DAR 1)之分餾物聚集，且使用15 mL Amicon Ultracell 30 kDa MWCO自旋過濾器經由自旋過濾緩衝液交換至PBS中，無菌過濾且分析。
在Shimadzu Prominence系統上，使用Thermo Scientific MAbPac 50 mm x 2.1 mm柱，利用水及乙腈的梯度溶析，在280 nm及330 nm下(化合物 24特異性)對Conj H之還原樣本的UHPLC分析展示未共軛輕鏈，及未共軛重鏈與藉由化合物 24之單個分子鏈接或附接至該分子的重鏈之混合物，與每抗體1.30個分子之化合物 24的藥物抗體比率(DAR)一致。
在Shimadzu Prominence系統上，使用Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAb HTP 4 µm 4.6 x 150 mm柱(具有4 µm 3.0 x 20 mm保護柱)，利用含200 mM磷酸鉀pH 6.95、250 mM氯化鉀及10%異丙醇( v/v)之0.3 mL/分鐘無菌過濾SEC緩衝液溶析，在280 nm下對Conj H之樣本的UHPLC分析展示99%之單體純度。SEC-UHPLC分析給出最終Conj H濃度為在4.5 mL中的1.84 mg/mL，獲得的Conj H質量為8.3 mg (21%產率)。 HER-F241CP2 之合成
根據Roy等人的MAbs 12 (1): 1684749 (doi:10.1080/19420862.2019.1684749)中所描述之方法，將抗HER2曲妥珠單抗衍生之抗體表達為在F241 (根據Kabat之EU編號)含有攜帶作為反應基(SCpHK/CP2)之環戊二烯的離胺酸結構類似物。
縮寫 名稱 結構
SCpHK (CP2) N 6-((螺[2.4]七-4,6-二烯-1-基甲氧基)羧基)-L-離胺酸
Figure 02_image072
Her-F241CP2- 13ADC (ConjJ)
將 13作為DMSO溶液(1莫耳當量/抗體，0.67微莫耳，在2.458 mL DMSO中)添加至22.72 mL在PBS、1 mM EDTA中的pH 7.4赫賽汀-F241CP2抗體溶液(100.0 mg，666.67奈莫耳)中，得到10% (v/v)最終DMSO濃度。溶液繼續在室溫下在輕柔搖動下反應隔夜。然後藉由添加 N-乙醯基半胱胺酸(3.33微莫耳，33.3 μL，100 mM)對共軛進行淬滅，然後使用HiTrap丁基HP 5 mL柱，利用緩衝液A (1M硫酸銨、25 mM 磷酸鉀，pH 6.0)及緩衝液B (25 mM 磷酸鉀，pH 6.0)作為溶析緩衝液，藉由製備HIC層析法純化。進行純化，在20CV後得到30-70% B。藉由RP-HPLC分別對分餾物進行分析，且聚集含＞ 90%的具1個分子之 13的已橋聯重鏈、＜ 5%的未共軛重鏈及＜ 5%的共軛至1個分子之 13的重鏈的分餾物，然後濃縮且使用15 mL Amicon Ultracell 50 kDa MWCO自旋過濾器藉由自旋過濾在20 mM His/His HCl、240 mM 蔗糖pH 6.0中配製，無菌過濾且分析。
在Shimadzu Prominence系統上，使用Thermo Scientific MAbPac 50 mm x 2.1 mm柱，利用水及乙腈的梯度溶析，在214 nm及330 nm下對ADC之還原樣本的UHPLC分析展示未共軛輕鏈、輕鏈二聚體、未共軛重鏈、藉由一個分子之 13橋聯之重鏈及共軛至一個分子之 13的未橋聯重鏈的混合物，與每抗體0.95個分子之 13的藥物抗體比率(DAR)一致。
在Shimadzu Prominence系統上，使用Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAb HTP 4 µm 4.6 x 150 mm柱(具有4 µm 3.0 x 20 mm保護柱)，利用含200 mM磷酸鉀pH 6.95、250 mM氯化鉀及10%異丙醇( v/v)之0.3 mL/分鐘無菌過濾SEC緩衝液溶析，在280 nm下對ADC之樣本的UHPLC分析展示99.5%之單體純度。UV分析給出最終ADC濃度為在11.0 mL中的3.34 mg/mL，獲得的質量為36.7 mg (37%產率)。
在連接至Dionex 3000 HPLC設備之Exactive Plus EMR質譜儀上，使用Thermo Scientific MAbPac 50 mm x 2.1 mm柱，利用水及乙腈的梯度溶析，對ADC的去醣化還原樣本的LC-MS分析展示未共軛輕鏈與藉由一個分子之 13橋聯之重鏈的混合物，與每抗體1.0個分子之 13的藥物抗體比率(DAR)一致。
在Shimadzu Prominence系統上，使用Proteomix HIC丁基-NP5, 5 um, 無孔之4.6x35 mm (Sepax)柱，利用1.5 M硫酸銨、25 mM磷酸鈉(pH 7.4)及具20%乙腈(v/v)之25 mM磷酸鈉(pH 7.4)的梯度溶析，在214 nm下對ADC之純樣本的UHPLC分析展示單共軛之 13，與每抗體1.0個分子之13的藥物抗體比率(DAR)一致。 實例 6 體外 MTS 測定
ADC的體外活性將在Her2表達細胞系NCI-N87及Her2陰性細胞系MDA-MB-468中量測。
來自近融合(80-90%融合) T75燒瓶的細胞之濃度及活力係藉由台盼藍染色來量測，且使用LUNA-II™自動細胞計數器來計數。將細胞稀釋至2x10 5/ml，分配(每個孔50 µl)至96孔平底板中。
藉由將過濾無菌之ADC稀釋至細胞培養基中來製備抗體藥物共軛物(ADC)之儲備溶液(1 mL) (20 µg/ml)。藉由連續轉移100 µl至900 µl的細胞培養基中，在24孔板中進行儲備ADC的一組8x 10倍稀釋。將ADC稀釋液分配(每孔50 µl)至96孔板的4個重複孔中，該等孔含有先前接種之50 µl細胞懸浮液。對照孔接收50 µl細胞培養基。將含有細胞及ADC之96孔板在CO 2充氣之培育器中在37℃下培育，持續暴露時間。
在培育期結束時，藉由MTS測定來量測細胞活力。將MTS (Promega)分配(每孔20 µl)至每個孔中，且在CO 2充氣之培育器中在37℃下培育4小時。量測在490 nm下之孔吸光度。與4個對照的未處理孔中之平均吸光度(100%)相比，根據4個經ADC處理之孔中的平均吸光度來計算細胞存活百分比。使用GraphPad Prism，使用非線性曲線擬合演算法根據劑量-反應資料來判定IC 50：具有可變斜率之S形劑量-反應曲線。
ADC培育時間對於MDA-MB-468為4天且對於NCI-N87為7天。在具有Glutamax + 10% (v/v) HyClone™胎牛血清之RPMI 1640中培養MDA-MB-468及NCI-N87。
EC50 (µg/ml) NCI-N87 MDA-MB-468
ConjA 0.008307 -
ConjB 0.002408 -
ConjG 0.1241 ＞10
體外 CellTiterGlo® 測定
ADC的體外活性將在Her2表達細胞系NCI-N87中量測。
來自近融合(80-90%融合) T75燒瓶的細胞之濃度及活力係使用Vi-Cell BLU自動細胞活力分析儀來量測及計數。將細胞稀釋至2.5x10 5/ml，分配(每個孔80 µl)至96孔白璧平底板中。
藉由將抗體藥物共軛物(ADC)稀釋至細胞培養基中來製備ADC之5x儲備溶液(200 µg/ml)。藉由連續轉移75 µl至225 µl的細胞培養基中，在96孔U形底部板中進行儲備ADC的一組4倍稀釋。將ADC稀釋液分配(每個孔20 µl)至96孔板的2個重複孔中，該等孔含有先前接種之80 µl細胞懸浮液。對照孔接收20 µl細胞培養基。將含有細胞及ADC之96孔板在CO 2充氣之培育器中在37℃下培育，持續暴露時間。
在培育期結束時，藉由CellTiterGlo®測定來量測細胞活力。將CellTiterGlo® (Promega)根據製造商說明書(每個孔100 µl)製備至每個孔中且在4℃下在板搖動器上培育15分鐘。使用Envision板讀取器來量測孔發光度。與6個對照的未處理孔中之平均吸光度(100%)相比，根據2個經ADC處理之孔中的平均發光度來計算細胞存活百分比。使用GraphPad Prism，使用非線性曲線擬合演算法根據劑量-反應資料來判定IC 50：具有可變斜率之S形劑量-反應曲線。
ADC培育時間對於NCI-N87為6天。在具有D-葡萄糖、HEPES、L-麩醯胺、碳酸氫鈉、丙酮酸鈉 + 10% (v/v) Gibco™ HI胎牛血清之RPMI 1640中培養NCI-N87。
EC50 (µg/ml) NCI-N87
ConjJ 0.0061
實例 7NCI-N87異體移植之小鼠
雌性嚴重聯合免疫缺陷小鼠(Fox Chase SCID®，C.B-17/Icr- Prkdcscid， Charles River)為： A.在研究的第1天，十週齡，具有16.9至21.9克之體重(BW)範圍； B. 在研究的第1天，十週齡，具有15.7至21.7克之體重(BW)範圍。
給動物不限量地餵飼水(反滲透，1 ppm Cl)，及由18.0%粗蛋白、5.0%粗脂肪及5.0%粗纖維組成的NIH 31 Modified and Irradiated Lab Diet®。採用12小時光照循環，在20–22℃ (68–72℉)及40–60%濕度下，將小鼠飼養在靜態微型隔離器中的經照射之Enricho’cobs ™ Laboratory Animal Bedding上。CR Discovery Services特別按照 實驗室動物護理及使用指南( Guide for Care and Use of Laboratory Animals)中有關約束、飼養、手術步驟、飼料及流體規章以及獸醫護理的建議進行。CR Discovery Services上之動物護理及使用程序為國際實验動物護理評估及認可管理委員會(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International) (AAALAC)所认可，此確保符合實验動物之護理及使用的公認標準。 腫瘤細胞培養
在補充具有10%胎牛血清、2 mM麩醯胺、100單位/mL 青黴素鈉、100 μg/mL硫酸鏈黴素及25 μg/mL建它黴素的RPMI-1640培養基中培養人類NCI-N87胃癌淋巴瘤細胞。使細胞在5% CO 2及95%空氣之氣氛中在37℃下在濕潤培育器中的組織培養燒瓶中生長。 體內植入及腫瘤生長
將用於植入之NCI-N87細胞在對數期生長期間收穫且重懸浮於含50% Matrigel™ (BD Biosciences)之磷酸鹽緩衝液(PBS)中。在腫瘤植入當天，每只測試小鼠在右側腹部經皮下注射1 x 10 7個細胞(0.1 mL細胞懸浮液)，且在平均大小達到100至150 mm 3之目標範圍時，對腫瘤生長進行監測。二十五天後，指定為研究的第1天，將小鼠根據計算之腫瘤大小分類成多組，每組由個體腫瘤體積範圍如下的十只動物組成： A. 108至172 mm 3，且組平均腫瘤體積為131 mm 3； B. 100至144 mm 3，且組平均腫瘤體積為110-115 mm 3。
使用卡尺在兩個維度上量測腫瘤，且使用下式來計算體積： 腫瘤體積 (mm 3) =
Figure 02_image265
w2xl2 其中 w= 腫瘤寬度且 l= 腫瘤長度，單位為mm。假設1 mg等於1 mm 3之腫瘤體積，可估計腫瘤重量。 治療
在已確定皮下NCI-N87腫瘤後，在第1天開始對10只小鼠(n=10)的組進行治療。 A. 在第1天將ConjA (2 mg/kg)及ConjG (5 mg/kg)靜脈內施藥一次(qd x 1)。經賦形劑治療的組充當對照組，用於療效分析。每週兩次地對腫瘤進行量測，直至研究在第51天結束。 B. 在第1天將ConjB (2 mg/kg及6 mg/kg)靜脈內施藥一次(qd x 1)。將經賦形劑治療的組充當對照組，用於療效分析。每週兩次地對腫瘤進行量測，直至研究在第93天結束。
每只小鼠在其腫瘤達到800 mm 3之終點體積時或在最後一天被實施安樂死，無論哪個先到。計算每只小鼠之終點時間(TTE)。 終點及腫瘤生長延遲 (TGD) 分析
每週兩次使用卡尺對腫瘤進行量測，且每個動物在其腫瘤達到800 mm 3之終點體積時或在研究結束時被實施安樂死，無論哪個先到。將由於達到腫瘤體積終點而退出研究之動物按安樂死日期記錄為由於腫瘤進程(TP)被實施安樂死。藉由以下方程式來計算每只小鼠之終點時間(TTE)：
Figure 02_image267
其中TTE用天表示，終點體積用mm 3表示，b為截距，且m為藉由經對數變換之腫瘤生長資料集之線性回歸獲得的線之斜率。資料集由超出分析所使用之終點體積的第一觀測及緊接在達到此終點體積前的三個順序觀測組成。計算之TTE通常少於TP日期，TP日期為動物由於腫瘤大小而被實施安樂死的當天。腫瘤未達到終點體積之動物經指派等於研究之最後一天的TTE值。在經對數變換的計算之TTE在達到終點的當日之前或超過達到腫瘤體積終點的當日的例子中，執行線性內插以近似TTE。將分類為由於由意外(NTRa)引起或由未知病因(NTRu)引起之NTR (非治療相關)原因死亡的任何動物自TTE計算(及所有進一步分析)排除。分類為TR (治療相關)死亡或NTRm (由腫瘤轉移引起之非治療相關死亡)的動物被指派等於死亡當日之TTE值。治療結果將根據腫瘤生長延遲(TGD)來評估，TGD係定義為治療組對比對照組的中位數時間至終點(TTE)之增加： TGD = T – C， 以天表示，或作為對照組之中位數TTE的百分比：
Figure 02_image269
其中： T = 治療組之中位數TTE，且 C = 指定對照組之中位數TTE。 腫瘤生長抑制
腫瘤生長抑制(TGI)分析評估經治療小鼠及對照小鼠之中位數腫瘤體積(MTV)的差異。對於此研究，用於判定TGI之終點為： A. 第51天 B. 第43天 。研究A在第51天完成。關於每一組判定MTV (n)，在TGI分析時的動物數目(n)之中位數腫瘤體積。腫瘤生長抑制百分比(%TGI)被定義為指定對照組之MTV與經藥物治療的組之MTV之間的差，表示為對照組之MTV的百分比：
Figure 02_image271
TGI分析之資料集包括組中之所有動物，在TGI分析之前由於治療相關(TR)或非治療相關(NTR)原因死去之動物除外。 MTV 及消退反應之基準
治療效率可根據研究中剩餘之動物在研究最後一天時之腫瘤體積來判定。MTV (n)被定義為腫瘤未達到終點體積之多個(n)剩餘動物在研究最後一天時的中位數腫瘤體積。治療效率亦可根據在研究期間觀測到的發病率及消退反應之量值來判定。治療可導致動物之腫瘤部分消退(PR)或完全消退(CR)。在PR反應中，腫瘤體積為研究過程中之三次順序量測的第1天體積之的50%或更小，且等於或大於此等三次量測中之一或多者的13.5 mm 3。在CR反應中，腫瘤體積小於研究過程中之三次順序量測之13.5 mm 3。動物在關於PR或CR事件之研究期間僅被評估一次，且僅在滿足PR及CR基準兩者之情況下被評分為CR。在研究結束時具有CR反應之動物被另外分類為無腫瘤倖存者(TFS)。針對消退反應對動物進行監測。 毒性
在第1至5天，每日對動物稱重，然後每週兩次，直至研究完成為止。關於任何有害的治療相關(TR)副作用之明顯症狀頻繁地觀測小鼠，且在觀測到時記錄臨床症狀。根據規程對個體體重進行監測，且重量損失在一次量測超過30%或在三次順序量測超過25%之任何動物被實施安樂死以作為TR死亡。亦根據CR Discovery Services規程對組平均體重損失進行監測。可接受毒性被定義為在研究期間小於20%且不大於10% TR死亡之組平均體重(BW)損失。在平均重量損失超過可接受極限之任何組中停止加藥。若組平均體重恢復至可接受水平，則將劑量修改至較低水平及/或以降低之頻率繼續。將死亡分類為TR，若死亡由治療副作用造成，如臨床症狀及/或驗屍所證明。TR分類亦被指派給在加藥時段期間或在最後一次加藥14天內的由未知原因造成之死亡。死亡被分類為非治療相關(NTR)的，若沒有證據表明死亡與治療副作用有關。NTR死亡進一步分類如下：NTRa描述由意外或人為錯誤引起的死亡；NTRm被指派給基於驗屍結果而認為由侵入及/或轉移導致之腫瘤播散引起的死亡；NTRu描述未知原因的死亡，該等原因缺乏關於與轉移、腫瘤進程、意外或認為錯誤有關之死亡的可用證明。應注意，治療副作用不能自分類為NTRu之死亡排除。 統計及圖形分析
將用於Windows之GraphPad Prism 8.0用於所有統計分析及圖形顯示。經歷毒性超過可接受水平(＞20%組平均體重損失或大於10%治療相關死亡)或具有少於五次有價值之觀測的研究組不包括在統計分析中。採用logrank測試來評估兩個組之總生存體驗之間的差的顯著性。logrank測試分析組中之所有動物的個體TTE，由於NTR死亡而無法研究之動物除外。對照組及經治療組的第19天中位數腫瘤體積(MTV)之間的差的統計分析將使用曼－惠特尼 U檢定來完成。關於統計分析，在顯著性水平 P= 0.05下進行雙尾測試。Prism將檢定結果概括為在 P＞ 0.05下不明顯(ns)，在0.01 ＜ P≤ 0.05下明顯(用「*」標記)，在0.001 ＜ P≤ 0.01下非常明顯(「**」)，及在 P≤ 0.001下極端明顯(「***」)。因為統計顯著性之測試未提供對組之間的差之量值的估計，所以所有顯著性水平被描述為明顯或不明顯。 測定 A
      n 中位數TTE T-C %TGI MTV (n)，第51天
賦形劑 - 10 51.0       575 (10)
ConjA 2 mg/kg 10 51.0 0.0 50 288 (10)
ConjG 5 mg/kg 10 51.0 0.0 34 379 (10)
   PR CR TFS TR NTRm NTR
賦形劑 0 0 0 0 0 0
ConjA 0 0 0 0 0 0
ConjG 0 0 0 0 0 00
在第51天，給藥ConjA及ConjG之組之MTV為288 mm 3及379 mm 3，分別對應於50%及34%之顯著TGI ( P＜ 0.001，曼－惠特尼 U檢定)。 測定 B
      n 中位數TTE T-C %TGI MTV (n)，第43天
賦形劑 - 10 67.6 - - 451 (10)
ConjB 2 mg/kg 10 93.0 25.4 72 126 (10)
ConjB 6 mg/kg 10 93.0 25.4 93 32 (10)
   PR CR TFS TR NTR
賦形劑 0 0 0 0 0
ConjB (2mg/kg) 0 1 0 0 0
ConjB (6mg/kg) 0 10 10 0 0
以2 mg/kg及6 mg/kg給藥之組具有93.0天之中位數TTE，此對應於25.4天之最大TGD (38%)。以2mg/kg給藥之組具有單一CR反應，且全部為93天倖存者，MTV為267 mm 3(表2及附錄A)。以6mg/kg給藥之組具有由十個CR組成的100%消退反應，全部CR在第93天保持為TFS。兩種方案導致對比對照組( P＜ 0.001, logrank)的顯著總生存差異。
在第43天，以2mg/kg及6 mg/kg給藥之組之MTV為126 mm 3及32 mm 3，分別此對應於72%及93%之顯著TGI ( P＜ 0.001, 曼－惠特尼 U檢定)，兩者達到潛在療效之60%臨限。 實例 8JIMT-1異體移植之小鼠
在研究的第1天，雌性嚴重聯合免疫缺陷小鼠(Fox Chase SCID®，CB17/Icr- Prkdcscid/IcoIcrCrl，Charles River)為九週齡，具有17.2至24.3 g之體重(BW)範圍。給動物不限量地餵飼水(反滲透，1 ppm Cl)及由18.0%粗蛋白、5.0%粗脂肪及5.0%粗纖維組成的NIH 31 Modified and Irradiated Lab Diet®。採用12小時光照循環，在20–22℃ (68–72℉)及40–60%濕度下，將小鼠飼養在靜態微型隔離器中的經照射之Enrich-o’cobs™ Laboratory Animal Bedding上。CR Discovery Services特別按照 實驗室動物護理及使用指南( Guide for Care and Use of Laboratory Animals)中有關約束、飼養、手術步驟、飼料及流體規章以及獸醫護理的建議進行。CR Discovery Services上之動物護理及使用程序為國際實验動物護理評估及認可管理委員會(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International) (AAALAC)所认可，此確保符合實验動物之護理及使用的公認標準。 腫瘤細胞培養
JIMT-1人乳腺癌細胞在含有10%胎牛血清、100單位/mL青黴素鈉、100 μg/mL硫酸鏈黴素、25 μg/mL建它黴素及2 mM麩醯胺之杜爾改良伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) (DMEM)中生長。細胞培養保持在37℃下，在5% CO 2及95%空氣之氛圍中在濕潤培育器中之組織培養燒瓶中。 體內 植入及腫瘤生長
將用於植入之JIMT-1細胞在對數期生長期間收穫且重懸於含有50% Matrigel® Matrix (Corning®)之冷的磷酸鹽緩衝液(PBS)中。在腫瘤植入當天，每只測試小鼠在右側腹部經皮下注射1 x 10 7個細胞(0.1 mL細胞懸浮液)，且在平均大小達到100至150 mm 3之目標範圍時，對腫瘤生長進行監測。十四天後，指定為研究的第1天，將小鼠根據計算之腫瘤大小分類成多組，每組由具有範圍在108 mm 3至144 mm 3的個體腫瘤體積及122 mm 3的組平均腫瘤體積之十只動物。將腫瘤使用卡尺在兩個維度上量測，且使用下式來計算體積： 腫瘤體積(mm 3) =
Figure 02_image265
w2xl2 其中 w= 腫瘤寬度且 l= 腫瘤長度，單位為mm。假設1 mg等於1 mm 3之腫瘤體積，可估計腫瘤重量。 治療
在確定皮下JIMT-1腫瘤後，治療在第1天按每組10只小鼠(n=10)開始。經由尾部靜脈注射，將試劑體內施藥。劑量體積為每20克體重0.2 mL (10 mL/kg)，且根據每個動物之體重按比例縮放。
在第1天，ConjA (4 mg/kg)、ConjB (1 mg/kg及2 mg/kg)及ConjG (10 mg/kg)靜脈內施藥一次(qd x 1)。經賦形劑治療的組充當對照組，用於療效分析。每週兩次地對腫瘤進行量測，直至研究在第81天結束。
每只小鼠在其腫瘤達到1000 mm 3之終點體積時或在最後一天被實施安樂死，無論哪個先到。計算每只小鼠之終點時間(TTE)。
對終點、腫瘤生長延遲(TGD)、腫瘤生長抑制(TGI)、MTV、消退反應、毒性的分析及統計及圖形分析全部針對實例5來計算。對於此研究，用於判定TGI之終點為第36天。
      n 中位數TTE T-C %TGI MTV (n)，第36天
賦形劑 - 10 42.9 - - 726(10)
ConjA 4 mg/kg 10 65.4 22.5 55 327(10)
ConjB 1 mg/kg 10 81.0 38.1 74 188(10)
ConjB 2 mg/kg 10 81.0 38.1 81 135(10)
ConjG 10 mg/kg 10 59.9 17.0 44 405(10)
   PR CR TFS BW Nadir TR NTR
賦形劑 0 0 0 -3.0% 第2天 0 0
ConjA (4mg/kg) 0 0 0 -0.4% 第4天 0 0
ConjB (1mg/kg) 0 0 0 - 0 0
ConjB (2mg/kg) 3 0 0 - 0 0
ConjG (10mg/kg) 0 0 0 - 0 0
以4 mg/kg經ConjA治療的組具有65.4天之中位數TTE，此對應於22.5天之TGD (52%)。所有動物在第81天達到腫瘤體積終點。ConjA方案導致對比對照組的顯著總生存差異( P＜ 0.001，logrank)。在第36天，組之MTV為327 mm 3，此對應於55%之顯著TGI ( P＜ 0.001，曼－惠特尼 U檢定測試)，但未達成潛在療效之60%臨限。
以1 mg/kg及2 mg/kg經ConjB治療的組均具有81.0天之中位數TTE，此對應於38.1天之TGD (89%)。用1 mg/kg治療的組中的三個在研究結束時達到腫瘤體積終點，剩下七個存活81天，MTV為847 mm 3。三種PR反應被記錄在以2 mg/kg治療的組中。此組中的兩個在第81天達到1000 mm 3終點，剩下八個存活至研究結束，MTV為500 mm 3。兩種方案導致對比對照組( P＜ 0.001)的顯著總生存差異。在第36天，1 mg/kg及2 mg/kg組之MTV為188 mm 3及135 mm 3，此對應於74%及81%之顯著TGI ( P＜ 0.001，曼－惠特尼 U檢定)且達成潛在療效之60%臨限。
以10 mg/kg經ConjG治療的組具有59.9天之中位數TTE，此對應於17.0天之TGD (40%)。九個經治療動物在研究結束時達成腫瘤體積終點，剩下一個存活至研究結束，腫瘤體積為936 mm 3。ConjG方案導致對比對照組( P＜ 0.001, logrank)的顯著總生存差異。在第36天，組之MTV為405 mm 3，此對應於44%之顯著TGI ( P＜ 0.001，曼－惠特尼 U檢定)。 實例 9PC-3異體移植之小鼠
雌性無胸腺裸鼠(Crl：NU(NCr)- Foxn1nu, Charles River)在研究的第1天為八週齡且具有18.5至25.8 g之BW範圍。給動物不限量地餵飼水(反滲透，1 ppm Cl)及由18.0%粗蛋白、5.0%粗脂肪及5.0%粗纖維組成的NIH 31 Modified and Irradiated Lab Diet®。採用12小時光照循環，在20–22℃ (68–72℉)及40–60%濕度下，將小鼠飼養在靜態微型隔離器中的經照射之Enrich-o’cobs™ bedding上。CR Discovery Services特別按照 實驗室動物護理及使用指南( Guide for Care and Use of Laboratory Animals)中有關約束、飼養、手術步驟、飼料及流體規章以及獸醫護理的建議進行。CR Discovery Services上之動物護理及使用程序為國際實验動物護理評估及認可管理委員會(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International) (AAALAC)所认可，此確保符合實验動物之護理及使用的公認標準。 腫瘤細胞培養
雄激素依賴之PC-3腫瘤系衍生自至骨的人前列腺癌轉移，且顯示分化不良之腺癌的形態(Kaighn, ME, 等人，Invest Urol, 1979；17(1)： 16-23)。PC-3細胞在補充具有10%胎牛血清、10 mM HEPES、0.075%碳酸氫鈉、2 mM麩醯胺、100單位/mL青黴素、100 µg/mL硫酸鏈黴素及25 µg/mL建它黴素的RPMI-1640培養基中培養。使細胞在5% CO 2及95%空氣之氣氛中在37℃下在濕潤培育器中的組織培養燒瓶中生長。 體內植入及腫瘤生長
用於植入之PC-3細胞在對數期生長期間收穫且重懸浮於含50% Matrigel™ (BDBiosciences)之磷酸鹽緩衝液(PBS)中。在腫瘤植入當天，每只測試小鼠在右側腹部經皮下注射1 x 10 7個細胞(0.2 mL細胞懸浮液)，且在平均大小達到100至150 mm 3之目標範圍時，對腫瘤生長進行監測。八天後，指定為研究的第1天，將小鼠根據計算之腫瘤大小分類成十組，每組由個體腫瘤體積在100 mm 3至162 mm 3的範圍內且組平均腫瘤體積為126 mm 3至128 mm 3之十只動物組成。將腫瘤使用卡尺在兩個維度上量測，且使用下式來計算體積： 腫瘤體積(mm 3) =
Figure 02_image265
w2xl2 其中 w= 腫瘤寬度且 l= 腫瘤長度，單位為mm。假設1 mg等於1 mm 3之腫瘤體積，可估計腫瘤重量。 治療
在已確定皮下PC-3異體移植物後，在第1天開始對10只小鼠(n=10)的組進行治療。經由尾部靜脈注射，將試劑體內施藥。劑量體積為每20克體重0.2 mL (10 mL/kg)，且根據每個動物之體重按比例縮放。
在第1天將ConjE (6 mg/kg)及ConjF (6 mg/kg)靜脈內施藥一次(qd x 1)。經賦形劑治療的組充當對照組，用於療效分析。每週兩次地對腫瘤進行量測，直至研究在第80天結束。
每只小鼠在其腫瘤達到800 mm 3之終點體積時或在最後一天被實施安樂死，無論哪個先到。計算每只小鼠之終點時間(TTE)。
對終點、腫瘤生長延遲(TGD)、腫瘤生長抑制(TGI)、MTV、消退反應、毒性的分析及統計及圖形分析全部針對實例5來計算。對於此研究，用於判定TGI之終點為第28天。
      n 中位數TTE T-C %TGI MTV (n)，第28天
賦形劑 - 10 30.4 - - 713 (10)
ConjE 6 mg/kg 10 74.4 44.0 99 6 (10)
ConjF 6 mg/kg 10 80.0 49.6 99 6 (10)
   PR CR TFS BW Nadir TR NTR
賦形劑 0 0 0 - 0 0
ConjE 3 7 2 - 0 0
ConjF 0 10 10 - 0 0
以6 mg/kg經ConjE治療的組具有74.4天之中位數TTE，此對應於44.0天之TGD (145%)。組具有由三個PR及七個CR組成的100%消退反應，其中兩個CR在第80天保持為TFS。六只動物達到800 mm 3腫瘤體積終點，剩下四只存活至研究結束，MTV為123 mm 3。與經賦形劑治療之對照組( P＜ 0.001)相比，治療產生顯著的存活益處。
在第28天，組之MTV為6 mm 3，此對應於99%之TGI。此結果明顯不同於對照組( P＜ 0.001，曼－惠特尼檢定)且達到潛在療效之臨限。
以6 mg/kg經ConjF治療的組具有80.0天之中位數TTE，此對應於49.6天之TGD (163%)。組具有由十個CR組成之100%消退反應，所有CR在第80天為TFS.研究結束倖存者具有1 mm 3之80天MTV。與經賦形劑治療之對照組( P＜ 0.001)相比，治療產生顯著的存活益處。
在第28天，組之MTV為6 mm 3，此對應於99%之TGI。此結果明顯不同於對照組( P＜ 0.001，曼－惠特尼檢定)且達到潛在療效之臨限。 實例 10 NCI-N87 異體移植研究
雌性無胸腺裸鼠(Hsd:Athymic Nude-Foxn1 nu，Envigo)在研究開始時為5-7週齡且具有20.1至26.6克之體重(BW)範圍。給動物 不限量地餵飼水(反滲透，1 ppm Cl)，及由18.0%粗蛋白、5.0%粗脂肪及5.0%粗纖維組成的Envigo Teklad 2918 Global Protein Rodent Diet。採用12小時光照循環，在20–22℃ (68–72℉)及40–60%濕度下，將小鼠飼養在Envigo Teklad 7097 ¼吋玉米芯墊料上及Techniplast Greenline GM500籠中。所有動物實驗係根據機構動物護理及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee) (IACUC)指南及恰當的動物研究批准在為實驗室動物護理評估委員會(Association for Assessment of Laboratory Animal Care) (AALAC)認可的設施中進行。 腫瘤細胞培養
在補充具有10%胎牛血清及0.3g/L L-麩醯胺之RPMI-1640培養基中培養人類NCI-N87胃癌細胞。使細胞在5% CO 2及95%空氣之氣氛中在37℃下在濕潤培育器中的組織培養燒瓶中生長。 體內 植入及腫瘤生長
將用於植入之NCI-N87細胞在對數期生長期間收穫且重懸浮於含50% Cultrex基底膜提取物BME3 (Bio-Techne)之亨克氏(Hank’s)平衡鹽溶液(HBSS)中。在腫瘤植入當天，每只測試小鼠在右側腹部經皮下注射5 x 10 6個細胞(0.2 mL細胞懸浮液)。在十天後，當腫瘤大小為大約155mm 3時，根據計算之腫瘤大小將小鼠分類成多組，每組由6只動物(未治療組)或3只動物(經治療組)組成。使用內建至研究紀錄套裝軟體(Studylog Systems, Inc., South San Francisco, CA)中之確定性隨機化方法來執行隨機化。
使用卡尺在兩個維度上對腫瘤進行量測，且使用下式來計算體積： 腫瘤體積(mm 3) =
Figure 02_image265
w2xl2 其中 w= 腫瘤寬度且 l= 腫瘤長度，單位為mm。假設1 mg等於1 mm 3之腫瘤體積，可估計腫瘤重量。 治療
在確定皮下NCI-N87腫瘤後，治療在第10天開始。
在隨機化後，在ADC緩衝液(20mM組胺酸，240mM蔗糖，pH6)中施藥單次靜脈劑量為0.25 mg/kg、0.5 mg/kg、0.75 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg或4 mg/kg之ConjJ。未治療組充當對照組，用於療效分析。劑量體積為每20克體重0.2 mL (10 mL/kg)，且根據每個動物之體重進行調整。每週兩次地對腫瘤進行量測，直至研究在第55天結束。 腫瘤生長抑制
腫瘤生長抑制(TGI)分析評估經治療小鼠及對照小鼠之平均腫瘤體積(MTV)的差異。對於此研究，用於判定TGI之終點為第55天。腫瘤生長抑制百分比(%TGI)被定義為指定對照組之MTV與經藥物治療的組之MTV之間的差，表示為對照組之MTV的百分比：
Figure 02_image273
TGI分析之資料集包括組中之所有動物，在TGI分析之前由於治療相關(TR)或非治療相關(NTR)原因死去之動物除外。 MTV 及消退反應之基準
治療效率可根據研究中剩餘之動物在最後一天時之腫瘤體積來判定。MTV (n)被定義為腫瘤未達到終點體積之多個(n)剩餘動物在研究最後一天時的平均腫瘤體積。治療效率亦可根據在研究期間觀測到的發病率及消退反應之量值來判定。治療可導致動物之腫瘤部分消退(PR)或完全消退(CR)。在PR反應中，腫瘤體積為研究過程中之三次順序量測的初始體積之50%或更小，且對於此等三次量測中之一或多者而言等於或大於13.5 mm 3。在CR反應中，腫瘤體積小於研究過程中之三次順序量測之13.5 mm 3。動物在關於PR或CR事件之研究期間僅被評估一次，且僅在滿足PR及CR基準兩者之情況下被評估為CR。在研究結束時具有CR反應之動物被另外分類為無腫瘤倖存者(TFS)。針對消退反應對動物進行監測。 毒性
每週兩次對動物稱重，直至研究完成為止。關於任何有害的治療相關(TR)副作用之明顯症狀頻繁地觀測小鼠，且在觀測到時記錄臨床症狀。根據規程對組及個體體重進行監測，且重量損失在一次量測超過20%之任何動物被實施安樂死以作為TR死亡。可接受毒性被定義為在研究期間小於20%且不大於10% TR死亡之組平均體重(BW)損失。在平均重量損失超過可接受極限之任何組中停止加藥。若組平均體重恢復至可接受水平，則將劑量修改至較低水平及/或以降低之頻率繼續。將死亡分類為TR，若死亡由治療副作用造成，如臨床症狀及/或驗屍所證明。TR分類亦被指派給在加藥時段期間或在最後一次加藥14天內的由未知原因造成之死亡。死亡被分類為非治療相關(NTR)的，若沒有證據表明死亡與治療副作用有關。NTR死亡進一步分類如下：NTRa描述由意外或人為錯誤引起的死亡；NTRu描述未知原因的死亡，該等原因缺乏關於與轉移、腫瘤進程、意外或認為錯誤有關之死亡的可用證明。應注意，治療副作用不能自分類為NTRu之死亡排除。 統計及圖形分析
將用於GraphPad Prism 8.0及Microsoft Excel用於所有統計分析及圖形顯示。經歷毒性超過可接受水平(＞20%組平均體重損失或大於10%治療相關死亡)或具有少於五次有價值之觀測的研究組不包括在統計分析中。關於統計分析，在顯著性水平 P= 0.05下進行雙尾t-測試。Prism將檢定結果概括為在 P＞ 0.05下不明顯(ns)，在0.01 ＜ P≤ 0.05下明顯(用「*」標記)，在0.001 ＜ P≤ 0.01下非常明顯(「**」)，及在 P≤ 0.001下極端明顯(「***」)。因為統計顯著性之測試未提供對組之間的差之量值的估計，所以所有顯著性水平被描述為明顯或不明顯。 N87 異體移植結果
ConjJ n %TGI MTV， 第55天 T-測試 顯著性 PR CR TFS TR NTR
未治療 6    661.72    0 0 0 0 0
0.25 mg/kg 3 48.52 353.53 1.94E-02* 0 0 0 0 0
0.50 mg/kg 3 66.26 227.29 1.33E-03** 0 0 0 0 0
0.75 mg/kg 3 72.03 155.13 5.94E-05*** 0 0 0 0 0
1 mg/kg 3 80.29 104.94 1.94E-05*** 0 0 0 0 0
2 mg/kg 3 91.17 45.34 2.07E-05*** 3 0 0 0 0
3 mg/kg 3 90.34 59.78 3.24E-05*** 2 0 0 0 0
4 mg/kg 3 90.63 58.03 3.93E-05*** 3 0 0 0 0
觀測到ConjJ在所有劑量水平下具有顯著的腫瘤生長抑制(TGI)。在3個最高劑量水平(2 mg/kg、3 mg/kg及4mg/kg)下觀測到部分反應(PR)。 實例 11 JIMT-1 異體移植研究
雌性無胸腺裸鼠(Hsd:Athymic Nude-Foxn1 nu, Envigo)在研究開始時為5-7週齡且具有20.8至26.9克之體重(BW)範圍。給動物 不限量地餵飼水(反滲透，1 ppm Cl)，及由18.0%粗蛋白、5.0%粗脂肪及5.0%粗纖維組成的Envigo Teklad 2918 Global Protein Rodent Diet。採用12小時光照循環，在20–22℃ (68–72℉)及40–60%濕度下，將小鼠飼養在Envigo Teklad 7097 ¼吋玉米芯墊料上及Techniplast Greenline GM500籠中。所有動物實驗係根據機構動物護理及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee) (IACUC)指南及恰當的動物研究批准在為實驗室動物護理評估委員會(Association for Assessment of Laboratory Animal Care) (AALAC)認可的設施中進行。 腫瘤細胞培養
JIMT-1人乳癌細胞在含有10%胎牛血清、1g/L D-葡萄糖、0.3g/L L-麩醯胺、25mM HEPES及110mg/L丙酮酸鈉之杜爾改良伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) (DMEM)中生長。細胞培養保持在37℃下，在5% CO 2及95%空氣之氛圍中在濕潤培育器中之組織培養燒瓶中。 體內植入及腫瘤生長
將用於植入之JIMT-1細胞在對數期生長期間收穫且重懸浮於含50% Cultrex基底膜提取物BME3 (Bio-Techne)之冷磷酸鹽緩衝液(PBS)中。在腫瘤植入當天，每只測試小鼠在右側腹部經皮下注射5 x 10 6個細胞(0.2 mL細胞懸浮液)。七天後，當腫瘤大小為大約190mm 3時，根據計算之腫瘤大小將小鼠分類成多組，每組由6只動物(未治療組)或3只動物(經治療組)組成。使用內建至研究紀錄套裝軟體(Studylog Systems, Inc., South San Francisco, CA)中之確定性隨機化方法來執行隨機化。每週兩次地對腫瘤進行量測。
使用卡尺在兩個維度上對腫瘤進行量測，且使用下式來計算體積： 腫瘤體積(mm 3) =
Figure 02_image265
w2xl2 其中 w= 腫瘤寬度且 l= 腫瘤長度，單位為mm。假設1 mg等於1 mm 3之腫瘤體積，可估計腫瘤重量。 治療
在確定皮下JIMT-1腫瘤後，治療在第7天開始。
在隨機化後，在ADC緩衝液(20mM組胺酸，240mM蔗糖，pH6)中施藥單次靜脈劑量為0.25 mg/kg、0.5 mg/kg、0.75 mg/kg、1 mg/kg、2 mg/kg、3 mg/kg或4 mg/kg之ConjJ。未治療組充當對照組，用於療效分析。劑量體積為每20克體重0.2 mL (10 mL/kg)，且根據每個動物之體重進行調整。
對終點、腫瘤生長抑制(TGI)、MTV、消退反應、毒性的分析及統計及圖形分析全部針對實例5來計算。對於此研究，用於判定TGI之終點為第42天，此係因為一些未治療腫瘤隨著研究進行由於潰瘍或體積過大而被移除。 JIMT-1 異體移植結果
ConJ n %TGI MTV， 第42天 T-測試 顯著性 PR CR TFS TR NTR
未治療 6    848.56    0 0 0 0 0
0.25 mg/kg 3 N/A N/A N/A 0 0 0 0 0
0.50 mg/kg 3 30.99 585.61 2.72E-01 0 0 0 0 0
0.75 mg/kg 3 -0.13 849.64 9.96E-01 0 0 0 0 0
1 mg/kg 3 19.82 680.34 4.71E-01 0 0 0 0 0
2 mg/kg 3 48.07 440.70 8.87E-02 0 0 0 0 0
3 mg/kg 3 39.64 512.17 1.60E-01 0 0 0 0 0
4 mg/kg 3 68.83 264.48 2.50E-02* 0 0 0 0 0
統計地，觀測到ConjJ 在4mg/kg之高劑量下具有顯著的TGI，但是沒有產生基於確定之基準的任何PR或CR。
上文提及之所有文件及其他參考文獻係以引用方式併入本文中。 揭示內容之實施例1. 一種式I之共軛物：
Figure 02_image001
其中 Ab為在每一重鏈上具有至少一個自由共軛位置之經修飾抗體 D表示基團D1或D2中之任一者：
Figure 02_image003
； 虛線指示C2與C3之間可選地存在雙鍵； 當C2與C3之間存在雙鍵時，R 2係選自由以下各者組成之群組： (ia) C 5-10芳基，視情況由選自包含以下各者之群組的一或多個取代基取代：鹵素、硝基、氰基、醚、羧基、酯、C 1-7烷基、C 3-7雜環基及雙-氧基-C 1-3伸烷基； (ib) C 1-5飽和脂族烷基； (ic) C 3-6飽和環烷基； (id)
Figure 02_image025
，其中R 11、R 12及R 13中之每一者係獨立地選自H、C 1‑3飽和烷基、C 2-3烯基、C 2-3炔基及環丙基，其中R 2基團中之碳原子總數不大於5； (ie)
Figure 02_image027
，其中R 15a及R 15b中之一者為H且另一者係選自：苯基，該苯基視情況由選自鹵素、甲基、甲氧基之基團取代；吡啶基；及苯硫基；及 (if)
Figure 02_image029
，其中R 14係選自：H；C 1-3飽和烷基；C 2-3烯基；C 2-3炔基；環丙基；苯基，該苯基視情況由選自鹵素、甲基、甲氧基之基團取代；吡啶基；及苯硫基； 當C2與C3之間存在單鍵時， R 2係選自H、OH、F、diF及
Figure 02_image031
，其中R 16a及R 16b係獨立地選自H、F、C 1-4飽和烷基、C 2-3烯基，該烷基及該烯基視情況由選自C 1-4烷基醯胺基及C 1-4烷基酯之基團取代；或，當R 16a及R 16b中之一者為H時，另一者係選自腈及C 1-4烷基酯； D’表示基團D’1或D’2中之任一者：
Figure 02_image005
其中虛線指示C2’與C3’之間可選地存在雙鍵； 當C2’與C3’之間存在雙鍵時，R 22係選自由以下各者組成之群組： (iia) C 5-10芳基，視情況由選自包含以下各者之群組的一或多個取代基取代：鹵素、硝基、氰基、醚、羧基、酯、C 1-7烷基、C 3-7雜環基及雙-氧基-C 1-3伸烷基； (iib) C 1-5飽和脂族烷基； (iic) C 3-6飽和環烷基； (iid)
Figure 02_image034
，其中R 31、R 32及R 33中之每一者係獨立地選自H、C 1-3飽和烷基、C 2-3烯基、C 2-3炔基及環丙基，其中R 22基團中之碳原子總數不大於5； (iie)
Figure 02_image036
，其中R 25a及R 25b中之一者為H且另一者係選自：苯基，該苯基視情況由選自鹵素、甲基、甲氧基之基團取代；吡啶基；及苯硫基；及 (iif)
Figure 02_image038
，其中R 24係選自：H；C 1-3飽和烷基；C 2-3烯基；C 2-3炔基；環丙基；苯基，該苯基視情況由選自鹵素、甲基、甲氧基之基團取代；吡啶基；及苯硫基； 當C2’與C3’之間存在單鍵時， R 22係選自H、OH、F、diF及
Figure 02_image040
，其中R 26a及R 26b係獨立地選自H、F、C 1-4飽和烷基、C 2-3烯基，該烷基及該烯基視情況由選自C 1-4烷基醯胺基及C 1-4烷基酯之基團取代；或，當R 26a及R 26b中之一者為H時，另一者係選自腈及C 1-4烷基酯； R 6及R 9係獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH 2、NHR、NRR’、硝基、Me 3Sn及鹵素； 其中R及R’係獨立地選自視情況經取代之C 1-12烷基、C 3-20雜環基及C 5-20芳基； R 7係選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH 2、NHR、NRR’、硝基、Me 3Sn及鹵素； R″為C 3-12伸烷基，其鏈可由以下各者斷開：一或多個雜原子，例如O、S、NR N2(其中R N2為H或C 1-4烷基)，及/或芳環，例如苯或吡啶； Y及Y’係選自O、S及NH； R 11a為： (i) H；或 (ii) OH或OR A，其中R A為C 1-4烷基； R 6’、R 7’及R 9’分別選自與R 6、R 7及R 9相同之基團； 且 R LL1及R LL2為在不同位點連接至該抗體之鏈接子，該等鏈接子獨立地為
Figure 02_image042
， 其中 Q為：
Figure 02_image044
，其中Q X使得Q為胺基酸殘基、二肽殘基、三肽殘基或四肽殘基； X為：
Figure 02_image046
， 其中a = 0至5，b = 0至16，c = 0或1，d = 0至5； G LL為連接至該抗體之鏈接子。 2. 根據敘述1之共軛物，其中Y及Y’均為O。 3. 根據敘述1或敘述2中任一項之共軛物，其中R’’為C 3-7伸烷基。 4. 根據敘述1或敘述2中任一項之共軛物，其中R”為具有下式之基團：
Figure 02_image092
其中r為1或2。 5. 根據敘述1至4中任一項之共軛物，其中R 9為H。 6. 根據敘述1至5中任一項之共軛物，其中R 6為H。 7. 根據敘述1至6中任一項之共軛物，其中R 7係選自H、OH及OR。 8. 根據敘述7之共軛物，其中R 7為C 1-4烷氧基。 9. 根據敘述8之共軛物，其中R 7為甲氧基。 10. 根據敘述1至9中任一項之共軛物，其中D為D1，C2與C3之間存在雙鍵，且R 2為C 5-7芳基。 11. 根據敘述10之共軛物，其中R 2為苯基。 12. 根據敘述1至9中任一項之共軛物，其中D為D1，C2與C3之間存在雙鍵，且R 2為C 8-10芳基。 13. 根據敘述10至12中任一項之共軛物，其中R 2攜帶一個至三個取代基。 14. 根據敘述10至13中任一項之共軛物，其中該等取代基係選自甲氧基、乙氧基、氟、氯、氰基、雙-氧基-亞甲基、甲基-哌嗪基、嗎啉基及甲基-苯硫基。 15. 根據敘述1至9中任一項之共軛物，其中D為D1，C2與C3之間存在雙鍵，且R 2為C 1-5飽和脂族烷基。 16. 根據敘述15之共軛物，其中R 2為甲基、乙基或丙基。 17. 根據敘述1至9中任一項之共軛物，其中D為D1，C2與C3之間存在雙鍵，且R 2為C 3-6飽和環烷基。 18. 根據敘述17之共軛物，其中R 2為環丙基。 19. 根據敘述1至9中任一項之共軛物，其中D為D1，C2與C3之間存在雙鍵，且R 2為具有下式之基團：
Figure 02_image025
。 20. 根據敘述19之共軛物，其中R 2基團中之碳原子總數不大於4。 21. 根據敘述20之共軛物，其中R 2基團中之碳原子總數不大於3。 22. 根據敘述19至21中任一項之共軛物，其中R 11、R 12及R 13中之一者為H，而另外兩個基團係選自H、C 1-3飽和烷基、C 2-3烯基、C 2-3炔基及環丙基。 23. 根據敘述19至21中任一項之共軛物，其中R 11、R 12及R 13中之兩者為H，而另一基團係選自H、C 1-3飽和烷基、C 2-3烯基、C 2-3炔基及環丙基。 24. 根據敘述1至9中任一項之共軛物，其中D為D1，C2與C3之間存在雙鍵，且R 2為具有下式之基團：
Figure 02_image027
。 25. 根據敘述24之共軛物，其中R 2為基團：
Figure 02_image292
。 26. 根據敘述1至9中任一項之共軛物，其中D為D1，C2與C3之間存在雙鍵，且R 2為具有下式之基團：
Figure 02_image029
。 27. 根據敘述26之共軛物，其中R 14係選自H、甲基、乙基、乙烯基及乙炔基。 28. 根據敘述27之共軛物，其中R 14係選自H及甲基。 29. 根據敘述1至9中任一項之共軛物，其中D為D1，C2與C3之間存在單鍵，且R 2為H。 30. 根據敘述1至9中任一項之共軛物，其中D為D1，C2與C3之間存在單鍵，R 2為
Figure 02_image031
且R 16a及R 16b均為H。 31. 根據敘述1至9中任一項之共軛物，其中D為D1，C2與C3之間存在單鍵，R 2為
Figure 02_image031
，且R 16a及R 16b均為甲基。 32. 根據敘述1至9中任一項之共軛物，其中D為D1，C2與C3之間存在單鍵，R 2為
Figure 02_image031
，R 16a及R 16b中之一者為H，且另一者係選自C 1-4飽和烷基、C 2-3烯基，該烷基及該烯基視情況經取代。 33. 根據敘述1至32中任一項之共軛物，其中D’為D’1，C2’與C3’之間存在雙鍵，且R 22為C 5-7芳基。 34. 根據敘述33之共軛物，其中R 22為苯基。 35. 根據敘述1至32中任一項之共軛物，其中D’為D’1，C2’與C3’之間存在雙鍵，且R 22為C 8-10芳基。 36. 根據敘述33至35中任一項之共軛物，其中R 22攜帶一個至三個取代基。 37. 根據敘述33至36中任一項之共軛物，其中該等取代基係選自甲氧基、乙氧基、氟、氯、氰基、雙-氧-亞甲基、甲基-哌嗪基、嗎啉基及甲基-苯硫基。 38. 根據敘述1至32中任一項之共軛物，其中D’為D’1，C2’與C3’之間存在雙鍵，且R 22為C 1-5飽和脂族烷基。 39. 根據敘述38之共軛物，其中R 22為甲基、乙基或丙基。 40. 根據敘述1至32中任一項之共軛物，其中D’為D’1，C2’與C3’之間存在雙鍵，且R 22為C 3-6飽和環烷基。 41. 根據敘述40之共軛物，其中R 22為環丙基。 42. 根據敘述1至32中任一項之共軛物，其中D’為D’1，C2’與C3’之間存在雙鍵，且R 22為具有下式之基團：
Figure 02_image034
。 43. 根據敘述42之共軛物，其中R 22基團中之碳原子總數不大於4。 44. 根據敘述43之共軛物，其中R 22基團中之碳原子總數不大於3。 45. 根據敘述42至44中任一項之共軛物，其中R 31、R 32及R 33中之一者為H，而另外兩個基團係選自H、C 1-3飽和烷基、C 2-3烯基、C 2-3炔基及環丙基。 46. 根據敘述42至44中任一項之共軛物，其中R 31、R 32及R 33中之兩者為H，而另一基團係選自H、C 1-3飽和烷基、C 2-3烯基、C 2-3炔基及環丙基。 47. 根據敘述1至32中任一項之共軛物，其中D’為D’1，C2’與C3’之間存在雙鍵，且R 22為具有下式之基團：
Figure 02_image036
。 48. 根據敘述47之共軛物，其中R 22為基團：
Figure 02_image292
。 49. 根據敘述1至32中任一項之共軛物，其中D’為D’1，C2’與C3’之間存在雙鍵，且R 22為具有下式之基團：
Figure 02_image038
。 50. 根據敘述49之共軛物，其中R 24係選自H、甲基、乙基、乙烯基及乙炔基。 51. 根據敘述50之共軛物，其中R 24係選自H及甲基。 52. 根據敘述1至32中任一項之共軛物，其中D’為D’1，C2’與C3’之間存在單鍵，且R 22為H。 53. 根據敘述1至32中任一項之共軛物，其中D’為D’1，C2’與C3’之間存在單鍵，R 22為
Figure 02_image040
，且R 26a及R 26b均為H。 54. 根據敘述1至32中任一項之共軛物，其中D’為D’1，C2’與C3’之間存在單鍵，R 22為
Figure 02_image040
，且R 26a及R 26b均為甲基。 55. 根據敘述1至32中任一項之共軛物，其中D’為D’1，C2’與C3’之間存在單鍵，R 22為
Figure 02_image040
，R 26a及R 26b中之一者為H，且另一者係選自C 1-4飽和烷基、C 2-3烯基，該烷基及該烯基視情況經取代。 56. 根據敘述1至55中任一項之共軛物，其中R 11a為H。 57. 根據敘述1至55中任一項之共軛物，其中R 11a為OH。 58. 根據敘述1至55中任一項之共軛物，其中R 11a為OR A，其中R A為C 1-4烷基。 59. 根據敘述58之共軛物，其中R A為甲基。 60. 根據敘述1至59中任一項之共軛物，其中R 6’係選自與R 6相同之基團，R 7’係選自與R 7相同之基團，R 9’係選自與R 9相同之基團，且Y ’係選自與Y相同之基團。 61. 根據敘述60之共軛物，其中R 6’為與R 6相同之基團，R 7’為與R 7相同之基團，R 9’為與R 9相同之基團，且Y ’為與Y相同之基團。 62. 根據敘述1至61中任一項之共軛物，其中R 22為與R 2相同之基團。 63. 根據敘述1之共軛物，該共軛物具有式Ia-1、Ia-2或Ia-3：
Figure 02_image301
Figure 02_image303
Figure 02_image305
其中虛線表示C2與C3之間及C2’與C3’之間可能存在雙鍵； 在C2與C3之間及C2’與C3’之間不存在雙鍵之情況下，R 2a及R 22a係相同的且選自： (a) H；及 (b)
Figure 02_image114
； 在C2與C3之間及C2’與C3’之間存在雙鍵之情況下，R 2a及R 22a係相同的且選自： (a)
Figure 02_image116
； (b)
Figure 02_image118
； (c)
Figure 02_image120
； (d)
Figure 02_image122
； (e)
Figure 02_image124
； (f)
Figure 02_image126
； (g)
Figure 02_image128
；及 (h)
Figure 02_image130
； R 1a係選自甲基及苄基；且 R LL1、R LL2及R 11a如敘述1中所定義。 64. 根據敘述1至63中任一項之共軛物，其中Q為選自Phe、Lys、Val、Ala、Cit、Leu、Ile、Arg及Trp之胺基酸殘基。 65. 根據敘述1至63中任一項之共軛物，其中Q為選自以下各者之二肽殘基： CO-Phe-Lys- NH、 CO-Val-Ala- NH、 CO-Val-Lys- NH、 CO-Ala-Lys- NH、 CO-Val-Cit- NH、 CO-Phe-Cit- NH、 CO-Leu-Cit- NH、 CO-Ile-Cit- NH、 CO-Phe-Arg- NH及 CO-Trp-Cit- NH。 66. 根據敘述65之共軛物，其中Q係選自 CO-Phe-Lys- NH、 CO-Val-Cit- NH及 CO-Val-Ala- NH。 67. 根據敘述1至63中任一項之共軛物，其中Q為選自以下各者之三肽殘基： NH-Glu-Val-Ala- C=O NH-Glu-Val-Cit- C=O NH-αGlu-Val-Ala- C=O NH-αGlu-Val-Cit- C=O。 68. 根據敘述1至63中任一項之共軛物，其中Q為選自以下各者之四肽鏈接子： NH-Gly-Gly-Phe-Gly C=O；及 NH-Gly-Phe-Gly-Gly C=O。 69. 根據敘述1至68中任一項之共軛物，a為0至3。 70. 根據敘述69之共軛物，其中a為0。 71. 根據敘述1至70中任一項之共軛物，其中b為0至12。 72. 根據敘述71之共軛物，其中b為0至8。 73. 根據敘述1至72中任一項之共軛物，其中c為0。 74. 根據敘述1至72中任一項之共軛物，其中c為1。 75. 根據敘述1至74中任一項之共軛物，其中d為0至3。 76. 根據敘述75之共軛物，其中d為2。 77. 根據敘述1至68中任一項之共軛物，其中a為0，c為1且d為2，且b為0至8。 78. 根據敘述77之共軛物，其中b為0、4或8。 79. 根據敘述1至78中任一項之共軛物，其中G LL係選自：
(G LL1-1)
Figure 02_image182
 (G LL7)
Figure 02_image184
(G LL1-1A)
Figure 02_image186
 (G LL8-1)
Figure 02_image188
(G LL1-2)
Figure 02_image190
 (G LL8-2)
Figure 02_image192
(G LL2)
Figure 02_image194
 (G LL9-1)
Figure 02_image196
(G LL3-1)
Figure 02_image198
 (G LL9-2)
Figure 02_image200
(G LL3-2)
Figure 02_image202
 (G LL10)
Figure 02_image204
(G LL-4)
Figure 02_image206
 (G L11)
Figure 02_image208
(G LL5)
Figure 02_image210
 (G LL12)
Figure 02_image212
(G LL6)
Figure 02_image214
 (G LL13)
Figure 02_image216
其中CBA表示至該經修飾抗體之連接點，Ar表示C 5-6伸芳基，例如伸苯基，且X 1表示C 1-4烷基。 80. 根據敘述79之共軛物，其中Ar為伸苯基。 81. 根據敘述79或敘述80中任一項之共軛物，其中G LL係選自G LL1-1及G LL1-2。 82. 根據敘述81之共軛物，其中G LL為G LL1-1。 83. 根據敘述81之共軛物，其中G LL為G LL1-1 A。 84. 根據敘述1之共軛物，該共軛物具有式Id：
Figure 02_image225
其中m為2至8之整數，且X係選自： (a)
Figure 02_image227
； (b)
Figure 02_image229
；及 (c)
Figure 02_image231
。 85. 根據敘述1之共軛物，該共軛物具有式Ie：
Figure 02_image233
其中m為2至8之整數，且X係選自： (a)
Figure 02_image227
； (b)
Figure 02_image229
；及 (c)
Figure 02_image231
。 86. 根據前述敘述中任一項之共軛物，其中在每一重鏈上具有至少一個自由共軛位置之該經修飾抗體為IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗體。 87. 根據敘述86之共軛物，其中在每一重鏈上具有至少一個自由共軛位置之該經修飾抗體為人類抗體。 88. 根據敘述87之共軛物，其中在每一重鏈上具有至少一個自由共軛位置之該經修飾抗體為人源化抗體。 89. 根據敘述88之共軛物，其中該抗體或抗體片段為用於腫瘤相關抗原之抗體或抗體片段。 90. 根據敘述89之共軛物，其中該抗體或抗體片段為結合至選自(1)至(89)之一或多個腫瘤相關抗原或細胞-表面受體的抗體： (1)BMPR1B； (2)E16； (3)STEAP1； (4)0772P； (5)MPF； (6)Napi3b； (7)Sema 5b； (8)PSCA hlg； (9)ETBR； (10)MSG783； (11)STEAP2； (12)TrpM4； (13)CRIPTO； (14)CD21； (15)CD79b； (16)FcRH2； (17)HER2； (18)NCA； (19)MDP； (20)IL20R-α； (21)Brevican； (22)EphB2R； (23)ASLG659； (24)PSCA； (25)GEDA； (26)BAFF-R； (27)CD22； (28)CD79a； (29)CXCR5； (30)HLA-DOB； (31)P2X5； (32)CD72； (33)LY64； (34)FcRH1； (35)IRTA2； (36)TENB2； (37)PSMA – FOLH1； (38)SST； (38.1) SSTR2； (38.2) SSTR5； (38.3) SSTR1； (38.4) SSTR3； (38.5) SSTR4； (39)ITGAV； (40)ITGB6； (41)CEACAM5； (42)MET； (43)MUC1； (44)CA9； (45)EGFRvIII； (46)CD33； (47)CD19； (48)IL2RA； (49)AXL； (50)CD30 - TNFRSF8； (51)BCMA - TNFRSF17； (52)CT Ags – CTA； (53)CD174 (Lewis Y) - FUT3； (54)CLEC14A； (55)GRP78 – HSPA5； (56)CD70； (57)幹細胞特異性抗原； (58)ASG-5； (59)ENPP3； (60)PRR4； (61)GCC – GUCY2C； (62)Liv-1 – SLC39A6； (63)5T4； (64)CD56 – NCMA1； (65)CanAg； (66)FOLR1； (67)GPNMB； (68)TIM-1 – HAVCR1； (69)RG-1/前列腺腫瘤靶Mindin – Mindin/RG-1； (70)B7-H4 – VTCN1； (71)PTK7； (72)CD37； (73)CD138 – SDC1； (74)CD74； (75)密連蛋白 – CL； (76)EGFR； (77)Her3； (78)RON - MST1R； (79)EPHA2； (80)CD20 – MS4A1； (81)肌腱蛋白C – TNC； (82)FAP； (83)DKK-1； (84)CD52； (85)CS1 - SLAMF7； (86)內皮蛋白– ENG； (87)膜聯蛋白A1 – ANXA1； (88)V-CAM (CD106) - VCAM1； (89)ASCT2 (SLC1A5)。 91. 根據敘述86至90中任一項之共軛物，其中天然鏈間半胱胺酸殘基已用缺少硫醇基之胺基酸殘基取代。 92. 根據敘述91之共軛物，該共軛物在每一重鏈中包含對包含適合於接合至鏈接子之反應基的胺基酸殘基之至少一個額外取代。 93. 根據敘述92之共軛物，其中該另外經取代之胺基酸為半胱胺酸或非天然胺基酸。 94. 根據敘述92或93之共軛物，其中取代位置係選自以下陳述之彼等位置：
抗體 同型 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4
位置(Kabat EU)及相應胺基酸 239 Ser Ser Ser Ser
282 Val Val Val Val
289 Thr Thr Thr Thr
297 Asn Asn Asn Asn
312 Asp Asp Asp Asp
324 Ser Ser Ser Ser
330 Ala Ala Ala Ser
335 Thr Thr Thr Thr
337 Ser Ser Ser Ser
339 Ala Thr Thr Ala
356 Glu Glu Glu Glu
359 Thr Thr Thr Thr
361 Asn Asn Asn Asn
383 Ser Ser Ser Ser
384 Asn Asn Ser Asn
398 Leu Leu Leu Leu
400 Ser Ser Ser Ser
422 Val Val Ile Val
440 Ser Ser Ser Ser
442 Ser Ser Ser Ser
SEQ ID NO： 1 2 3 4
95. 根據敘述86至90中任一項之共軛物，該共軛物包含在每一重鏈中至少插入一個包含適合於接合至鏈接子之反應基的胺基酸殘基。 96. 根據敘述95之共軛物，其中插入之胺基酸為半胱胺酸或非天然胺基酸。 97. 根據敘述96之共軛物，其中插入之胺基酸為半胱胺酸。 98. 根據敘述97之共軛物，其中插入之胺基酸為CP2-NNAA：
Figure 02_image342
。 99. 一種式II之化合物：
Figure 02_image048
及其鹽及溶劑合物， 其中D、R 2、R 6、R 7、R 9、R 11a、Y、R”、Y’、D’、R 6’、R 7’、R 9’及R 22(包括在C2與C3之間及C2’與C3’之間分別存在或不存在雙鍵)如敘述1至62中任一項中所定義； R L1及R L2為用於連接至細胞結合劑之鏈接子，該等鏈接子獨立地為
Figure 02_image050
， 其中Q及X如敘述1及64至78中任一項中所定義，且G L為用於連接至抗體之鏈接子。 100. 根據敘述99之化合物，其中G L係選自：
(G L1-1)
Figure 02_image148
 (G L6)
Figure 02_image150
(G L1-2)
Figure 02_image152
 (G L7)
Figure 02_image154
(G L2)
Figure 02_image156
 (G L8)
Figure 02_image158
(G L3-1)
Figure 02_image160
其中NO 2基團係可選的 		(G L9)
Figure 02_image162
(G L3-2)
Figure 02_image164
其中NO 2基團係可選的 		(G L10)
Figure 02_image166
(G L3-3)
Figure 02_image168
其中NO 2基團係可選的 		(G L11)
Figure 02_image170
(G L3-4)
Figure 02_image172
其中NO 2基團係可選的 		(G L12)
Figure 02_image174
(G L4)
Figure 02_image176
其中Hal = I, Br, Cl 		(G L13)
Figure 02_image178
(G L5)
Figure 02_image180
      
其中Ar表示C 5-6伸芳基，例如伸苯基，且X 1表示C 1-4烷基。 101. 根據敘述100之化合物，其中Ar為伸苯基。 102. 根號敘述100或敘述101中任一項之化合物，其中G L係選自G L1-1及G L1-2。 103. 根據敘述102之化合物，其中G L為G L1-1。 104. 根據敘述99之化合物，其中該化合物具有式IId：
Figure 02_image238
其中m為2至8之整數，且X係選自： (a)
Figure 02_image227
； (b)
Figure 02_image229
；及 (c)
Figure 02_image231
。 105. 根據敘述1至98中任一項之共軛物，該共軛物被用於治療。 106. 一種醫藥組合物，該醫藥組合物包含如敘述1至98中任一項之共軛物及至少一種醫藥可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。 107. 根據敘述1至98中任一項之共軛物或根據敘述106之醫藥組合物，其用於治療受試者之增生性疾病。 108. 根據敘述107之共軛物用途，其中接受治療之疾病係癌症。 109. 根據敘述1至98中任一項之共軛物或根據敘述106之醫藥組合物在醫療方法中的使用。 110.       一種醫療方法，該醫療方法包含向患者施藥敘述106之醫藥組合物。 111. 如敘述110之方法，其中該醫療方法用於治療癌症。 112.       如敘述111之方法，其中結合該共軛物向該患者施藥化學治療劑。 113.       根據敘述1至98中任一項之共軛物在用於治療增生性疾病之藥物之製造方法中的使用。 114.       一種治療患有增生性疾病之哺乳動物的方法，該方法包含施藥有效量的根據敘述1至98中任一項之共軛物或根據敘述106之醫藥組合物。 115.       一種合成根據敘述1至98中任一項之共軛物的方法，該方法包含將根據敘述99至104中任一項之化合物與經修飾抗體接合。 116.       一種使用藉由光延反應由式V之化合物製造式IV之化合物的方法：
Figure 02_image052
Figure 02_image054
； 其中R 8’係選自： (a) OMe、OCH 2Ph、OH及–Y’-R”-Hal； (b)
Figure 02_image056
(Vb) (c)
Figure 02_image058
(Vc) R 6、R 7、R 9、R 11a、R 6’、R 7’、R 9’、Y、R”、Y’、D及D’如敘述1至62中任一項中所定義； Hal為鹵素； R L2pre為R L2的前驅物； R L1pre為R L1的前驅物；且 Prot O為羥基保護基。 117.       根據敘述114之方法，其中Hal為Br。 118. 如敘述114或敘述115中任一項之方法，其中R L1pre及R L2pre獨立地為：
Figure 02_image082
， 其中Q如敘述1及64至68中任一項中所定義，且Prot N為胺保護基。 119.       根據敘述118之方法，其中Prot N為胺甲酸酯。 120. 根據敘述119之方法，其中Prot N為Alloc。 121. 根據敘述116至120中任一項之方法，其中Prot O為矽烷醚。 122. 根據敘述121之方法，其中Prot O為TIPS。 123. 根據敘述116至122中任一項之方法，其中使用三苯基膦及偶氮二羧酸酯來實行該反應。 124. 如請求項123之方法，其中該偶氮二羧酸酯為偶氮二羧酸二乙酯(DEAD)或偶氮二羧酸二異丙酯(DIAD)。
Figure 111113931-A0101-11-0003-8

Claims (24)

  1. 一種式I之共軛物：
    Figure 03_image001
    其中 Ab為在每一重鏈上具有至少一個自由共軛位置之經修飾抗體 D表示基團D1或D2中之任一者：
    Figure 03_image003
    ； 虛線指示C2與C3之間可選地存在雙鍵； 當C2與C3之間存在雙鍵時，R 2係選自由以下各者組成之群組： (ia) C 5-10芳基，視情況由選自包含以下各者之群組的一或多個取代基取代：鹵素、硝基、氰基、醚、羧基、酯、C 1-7烷基、C 3-7雜環基及雙-氧基-C 1-3伸烷基； (ib) C 1-5飽和脂族烷基； (ic) C 3-6飽和環烷基； (id)
    Figure 03_image025
    ，其中R 11、R 12及R 13中之每一者係獨立地選自H、C 1‑3飽和烷基、C 2-3烯基、C 2-3炔基及環丙基，其中R 2基團中之碳原子總數不大於5； (ie)
    Figure 03_image027
    ，其中R 15a及R 15b中之一者為H且另一者係選自：苯基，該苯基視情況由選自鹵素、甲基、甲氧基之基團取代；吡啶基；及苯硫基；及 (if)
    Figure 03_image029
    ，其中R 14係選自：H；C 1-3飽和烷基；C 2-3烯基；C 2-3炔基；環丙基；苯基，該苯基視情況由選自鹵素、甲基、甲氧基之基團取代；吡啶基；及苯硫基； 當C2與C3之間存在單鍵時， R 2係選自H、OH、F、diF及
    Figure 03_image031
    ，其中R 16a及R 16b係獨立地選自H、F、C 1-4飽和烷基、C 2-3烯基，該烷基及該烯基視情況由選自C 1-4烷基醯胺基及C 1-4烷基酯之基團取代；或，當R 16a及R 16b中之一者為H時，另一者係選自腈及C 1-4烷基酯； D’表示基團D’1或D’2中之任一者：
    Figure 03_image005
    其中虛線指示C2’與C3’之間可選地存在雙鍵； 當C2’與C3’之間存在雙鍵時，R 22係選自由以下各者組成之群組： (iia) C 5-10芳基，視情況由選自包含以下各者之群組的一或多個取代基取代：鹵素、硝基、氰基、醚、羧基、酯、C 1-7烷基、C 3-7雜環基及雙-氧基-C 1-3伸烷基； (iib) C 1-5飽和脂族烷基； (iic) C 3-6飽和環烷基； (iid)
    Figure 03_image034
    ，其中R 31、R 32及R 33中之每一者係獨立地選自H、C 1-3飽和烷基、C 2-3烯基、C 2-3炔基及環丙基，其中R 22基團中之碳原子總數不大於5； (iie)
    Figure 03_image036
    ，其中R 25a及R 25b中之一者為H且另一者係選自：苯基，該苯基視情況由選自鹵素、甲基、甲氧基之基團取代；吡啶基；及苯硫基；及 (iif)
    Figure 03_image038
    ，其中R 24係選自：H；C 1-3飽和烷基；C 2-3烯基；C 2-3炔基；環丙基；苯基，該苯基視情況由選自鹵素、甲基、甲氧基之基團取代；吡啶基；及苯硫基； 當C2’與C3’之間存在單鍵時， R 22係選自H、OH、F、diF及
    Figure 03_image040
    ，其中R 26a及R 26b係獨立地選自H、F、C 1-4飽和烷基、C 2-3烯基，該烷基及該烯基視情況由選自C 1-4烷基醯胺基及C 1-4烷基酯之基團取代；或，當R 26a及R 26b中之一者為H時，另一者係選自腈及C 1-4烷基酯； R 6及R 9係獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH 2、NHR、NRR’、硝基、Me 3Sn及鹵素； 其中R及R’係獨立地選自視情況經取代之C 1-12烷基、C 3-20雜環基及C 5-20芳基； R 7係選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH 2、NHR、NRR’、硝基、Me 3Sn及鹵素； R″為C 3-12伸烷基，其鏈可由以下各者斷開：一或多個雜原子，例如O、S、NR N2(其中R N2為H或C 1-4烷基)，及/或芳環，例如苯或吡啶； Y及Y’係選自O、S及NH； R 11a為： (i) H；或 (ii) OH或OR A，其中R A為C 1-4烷基； R 6’、R 7’及R 9’分別選自與R 6、R 7及R 9相同之基團；且 R LL1及R LL2為在不同位點連接至該抗體之鏈接子，該等鏈接子獨立地為
    Figure 03_image042
    ， 其中 Q為：
    Figure 03_image044
    ，其中Q X使得Q為胺基酸殘基、二肽殘基、三肽殘基或四肽殘基； X為：
    Figure 03_image046
    ， 其中a = 0至5，b = 0至16，c = 0或1，d = 0至5； G LL為連接至該抗體之鏈接子。
  2. 如請求項1之共軛物，其中： (a) Y及Y’均為O；及/或 (b) R’’為 (b-i) C 3-7伸烷基；或 (b-ii)式
    Figure 03_image092
    之基團，其中r為1或2。
  3. 如請求項1或請求項2中任一項之共軛物，R 9及R 6均為H。
  4. 如請求項1至3中任一項之共軛物，其中R 7為C 1-4烷氧基。
  5. 如請求項1至4中任一項之共軛物，其中D為D1，C2與C3之間存在雙鍵，且R 2係選自： (a) 視情況經取代之苯基，其中可選取代基係選自甲氧基、乙氧基、氟、氯、氰基、雙-氧基-亞甲基、甲基-哌嗪基、嗎啉基及甲基-苯硫基； (b) 視情況經取代之C 8-10芳基，其中可選取代基係選自甲氧基、乙氧基、氟、氯、氰基、雙-氧基-亞甲基、甲基-哌嗪基、嗎啉基及甲基-苯硫基； (c) 甲基、乙基或丙基； (d) 環丙基； (e) 式
    Figure 03_image025
    之基團，其中R 2基團中之碳原子總數不大於4； (f)
    Figure 03_image292
    ； (g) 式
    Figure 03_image029
    之基團，其中R 14係選自H及甲基。
  6. 如請求項1至4中任一項之共軛物，其中D為D1，C2與C3之間存在單鍵，R 2為
    Figure 03_image031
    且： (a) R 16a及R 16b均為H；或 (b) R 16a及R 16b均為甲基；或 (c) R 16a及R 16b中之一者為H，且另一者係選自C 1-4飽和烷基、C 2-3烯基，該烷基及該烯基視情況經取代。
  7. 如請求項1至6中任一項之共軛物，其中D’為D’1，C2’與C3’之間存在雙鍵，且R 22係選自： (a) 視情況經取代之苯基，其中可選取代基係選自甲氧基、乙氧基、氟、氯、氰基、雙-氧基-亞甲基、甲基-哌嗪基、嗎啉基及甲基-苯硫基； (b) 視情況經取代之C 8-10芳基，其中可選取代基係選自甲氧基、乙氧基、氟、氯、氰基、雙-氧基-亞甲基、甲基-哌嗪基、嗎啉基及甲基-苯硫基； (c) 甲基、乙基或丙基； (d) 環丙基； (e) 式
    Figure 03_image034
    之基團，其中R 2基團中之碳原子總數不大於4； (f)
    Figure 03_image292
    ； (g) 式
    Figure 03_image038
    之基團，其中R 24係選自H及甲基。
  8. 如請求項1至6中任一項之共軛物，其中D’為D’1，C2’與C3’之間存在單鍵，R 22為
    Figure 03_image040
    且： (a) R 26a及R 26b均為H；或 (b) R 26a及R 26b均為甲基；或 (c) R 26a及R 26b中之一者為H，且另一者係選自C 1-4飽和烷基、C 2-3烯基，該烷基及該烯基視情況經取代。
  9. 如請求項1至8中任一項之共軛物，其中R 11a為H或OH。
  10. 如請求項1至9中任一項之共軛物，其中R 6’為與R 6相同之基團，R 7’為與R 7相同之基團，R 9’為與R 9相同之基團，Y ’為與Y相同之基團，且R 22為與R 2相同之基團。
  11. 如請求項1之共軛物，該共軛物具有式Ia-1、Ia-2或Ia-3：
    Figure 03_image301
    Figure 03_image303
    Figure 03_image305
    其中虛線表示C2與C3之間及C2’與C3’之間可能存在雙鍵； 在C2與C3之間及C2’與C3’之間不存在雙鍵之情況下，R 2a及R 22a係相同的且選自： (a) H；及 (b)
    Figure 03_image114
    ； 在C2與C3之間及C2’與C3’之間存在雙鍵之情況下，R 2a及R 22a係相同的且選自： (a)
    Figure 03_image116
    ； (b)
    Figure 03_image118
    ； (c)
    Figure 03_image120
    ； (d)
    Figure 03_image122
    ； (e)
    Figure 03_image124
    ； (f)
    Figure 03_image126
    ； (g)
    Figure 03_image128
    ；及 (h)
    Figure 03_image130
    ； R 1a係選自甲基及苄基；且 R LL1、R LL2及R 11a如請求項1中所定義。
  12. 如請求項1至11中任一項之共軛物，其中Q為： (a)選自Phe、Lys、Val、Ala、Cit、Leu、Ile、Arg及Trp的胺基酸殘基； (b)選自 CO-Phe-Lys- NH、 CO-Val-Cit- NH及 CO-Val-Ala- NH的二肽殘基； (c)選自 NH-Glu-Val-Ala- C=O、 NH-Glu-Val-Cit- C=O、 NH-αGlu-Val-Ala- C=O及 NH-αGlu-Val-Cit- C=O的三肽殘基； (d)選自 NH-Gly-Gly-Phe-Gly C=O及 NH-Gly-Phe-Gly-Gly C=O的四肽鏈接子。
  13. 如請求項1至12中任一項之共軛物，其中a為0，c為1，且d為2，且b為0至8。
  14. 如請求項1至13中任一項之共軛物，其中G LL係選自： (G LL1-1)
    Figure 03_image182
     (G LL7)
    Figure 03_image184
         (G LL1-1A)
    Figure 03_image186
     (G LL8-1)
    Figure 03_image188
         (G LL1-2)
    Figure 03_image190
     (G LL8-2)
    Figure 03_image192
         (G LL2)
    Figure 03_image194
     (G LL9-1)
    Figure 03_image196
         (G LL3-1)
    Figure 03_image198
     (G LL9-2)
    Figure 03_image200
         (G LL3-2)
    Figure 03_image202
     (G LL10)
    Figure 03_image204
         (G LL-4)
    Figure 03_image206
     (G L11)
    Figure 03_image208
         (G LL5)
    Figure 03_image210
     (G LL12)
    Figure 03_image212
         (G LL6)
    Figure 03_image214
     (G LL13)
    Figure 03_image216
    其中CBA表示至該經修飾抗體之連接點，Ar表示C 5-6伸芳基，例如伸苯基，且X 1表示C 1-4烷基。
  15. 如請求項14之共軛物，其中G LL為G LL1-1或G LL1-1A。
  16. 如請求項1之共軛物，該共軛物具有式Id：
    Figure 03_image225
    其中m為2至8之整數，且X係選自： (a)
    Figure 03_image227
    ； (b)
    Figure 03_image229
    ；及 (c)
    Figure 03_image231
    。
  17. 如請求項1之共軛物，該共軛物具有式Ie：
    Figure 03_image233
    其中m為2至8之整數，且X係選自： (a)
    Figure 03_image227
    ； (b)
    Figure 03_image229
    ；及 (c)
    Figure 03_image231
    。
  18. 一種式II之化合物：
    Figure 03_image048
    及其鹽及溶劑合物， 其中D、R 2、R 6、R 7、R 9、R 11a、Y、R”、Y’、D’、R 6’、R 7’、R 9’及R 22(包括C2與C3之間及C2’與C3’之間分別存在或不存在雙鍵)如請求項1至11中任一項中所定義； R L1及R L2為用於連接至細胞結合劑之鏈接子，獨立地為
    Figure 03_image050
    ， 其中Q及X如請求項1、12及13中任一項中所定義，且G L為用於連接至抗體之鏈接子。
  19. 如請求項18之化合物，其中G L係選自： (G L1-1)
    Figure 03_image148
     (G L6)
    Figure 03_image150
         (G L1-2)
    Figure 03_image152
     (G L7)
    Figure 03_image154
         (G L2)
    Figure 03_image156
     (G L8)
    Figure 03_image158
         (G L3-1)
    Figure 03_image160
    其中NO 2基團係可選的     (G L9)
    Figure 03_image162
         (G L3-2)
    Figure 03_image164
    其中NO 2基團係可選的     (G L10)
    Figure 03_image166
         (G L3-3)
    Figure 03_image168
    其中NO 2基團係可選的     (G L11)
    Figure 03_image170
         (G L3-4)
    Figure 03_image172
    其中NO 2基團係可選的     (G L12)
    Figure 03_image174
         (G L4)
    Figure 03_image176
    其中Hal = I, Br, Cl     (G L13)
    Figure 03_image178
         (G L5)
    Figure 03_image180
          
    其中Ar表示C 5-6伸芳基，例如伸苯基，且X 1表示C 1-4烷基
  20. 如請求項19之化合物，其中G L為G L1-1。
  21. 如請求項18之化合物，其中該化合物具有式IId：
    Figure 03_image238
    其中m為2至8之整數，且X係選自： (a)
    Figure 03_image227
    ； (b)
    Figure 03_image229
    ；及 (c)
    Figure 03_image231
    。
  22. 一種醫藥組合物，該醫藥組合物包含如請求項1至17中任一項之共軛物及至少一種醫藥可接受的稀釋劑、載體或賦形劑。
  23. 一種使用藉由光延反應由式V之化合物製造式IV之化合物的方法：
    Figure 03_image052
    Figure 03_image054
    ； 其中R 8’係選自： (a) OMe、OCH 2Ph、OH及–Y’-R”-Hal； (b)
    Figure 03_image056
    (Vb) (c)
    Figure 03_image058
    (Vc) R 6、R 7、R 9、R 11a、R 6’、R 7’、R 9’、Y、R”、Y’、D及D’如請求項1至11中任一項中所定義； Hal為鹵素； R L2pre為R L2的前驅物； R L1pre為R L1的前驅物；且 Prot O為羥基保護基。
  24. 如請求項23之方法，其中R L1pre及R L2pre獨立地為：
    Figure 03_image082
    ， 其中Q如請求項1或請求項12中任一項中所定義，且Prot N為胺保護基。
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