CN113631560A - 氮杂环丁烷并苯并二氮杂䓬二聚体和用于治疗癌症的包含它们的缀合物 - Google Patents

Abstract

一种式IV的化合物：以及药物接头和包含此化合物的缀合物，以及所述缀合物治疗癌症的用途。

Description

氮杂环丁烷并苯并二氮杂䓬二聚体和用于治疗癌症的包含它 们的缀合物

技术领域

本发明涉及氮杂环丁烷并苯并二氮杂

(ABD)二聚体，包含所述二聚体的缀合物，以及用于制备所述缀合物的前体药物接头。

背景技术

吡咯并苯并二氮杂

(PBD)二聚体已被证明是细胞毒性化合物。

例如，SG2000(SJG-136)：

(Gregson,S.J.等,Chem.Commun.,1999,797-798.doi:10.1039/A809791G；Gregson,S.等,J.Med.Chem.,44,737-748(2001)；Alley,M.C.等，Cancer Research,64,6700-6706(2004)；以及Hartley,J.A.等，Cancer Research,64,6693-6699(2004))已经作为独立药剂参与临床试验，例如，NCT02034227研究了其在治疗急性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞性白血病中的用途(参见：https://www.clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02034227)。

携带C2芳基取代基以及内型不饱和基团(endo-unsaturation)的二聚PBD化合物，如SG2202(ZC-207)，公开于WO 2005/085251中：

以及WO2006/111759中，所述PBD化合物的亚硫酸氢盐，例如SG2285(ZC-423)：

这些化合物已经显示为高度可用的细胞毒性剂(Howard,P.W.等，Bioorg.Med.Chem.(2009),doi:10.1016/j.bmcl.2009.09.012)。

具有用于连接至细胞结合剂(如抗体)的接头基团的二聚体PBD化合物描述于WO2011/130598中。这些化合物中的接头连接于可用的N10位置中的一个，并且通常因酶对接头基团的作用而被切割。WO 2014/057074和WO 2015/052322描述了经由N10位置结合在一个单体上的特定PBD二聚体缀合物。

在PBD作为感兴趣的分子开发的相对早期阶段，在1997年报道了(Bose,D.S.等,Tetrahedron Letters,38(33),5839-5842,1997；doi:10.1016/S0040-4039(97)01297-5)以下化合物：

其已经合成并将作为潜在的DNA结合配体和细胞毒性剂进行评估。没有关于此化合物的进一步公布，因此似乎它们在测试中不稳定或没有活性。

发明内容

本发明的第一方面提供了一种式IV的化合物：

以及其盐和溶剂化物，其中：

R²和R^2’为H；

R⁶和R⁹独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH₂、NHR、NRR’、硝基、Me₃Sn以及卤素；

其中R和R’独立地选自任选取代的C_1-12烷基、C_3-20杂环基以及C_5-20芳基；

并且

(a)R⁷选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH₂、NHR、NRR’、硝基、Me₃Sn以及卤素；

R^7’选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH₂、NHR、NRR’、硝基、Me₃Sn以及卤素；或

(b)R⁷和R⁷'一起形成一个基团，其为：(i)-O-(CH₂)_n-O-，其中n为7至16；或(ii)-O-(CH₂CH₂O)_m-，其中m为2至5；

R″为C_3-12亚烷基，所述链可被一个或多个杂原子，例如O、S、NR^N2(其中R^N2为H或C_1-4烷基)，和/或芳环，例如苯或吡啶中断；

Y和Y'选自O、S或NH；

R^6’和R^9’分别选自与R⁶和R⁹相同的基团；

并且

(i-a)R¹⁰和R¹¹一起在它们所结合的N原子与C原子之间形成双键；或

(i-b)R¹⁰为H并且R¹¹选自OH和OR^A，其中R^A为C_1-4烷基；或(i-c)R¹⁰和R¹¹均为H；

并且

(ii-a)R²⁰和R²¹一起在它们所结合的N原子与C原子之间形成双键；或

(ii-b)R²⁰为H并且R²¹选自OH和OR^B，其中R^B为C_1-4烷基；或(ii-c)R²⁰和R²¹均为H。

本发明的第二方面包括一种具有式I的化合物：

以及其盐和溶剂化物，其中：

Y、Y’、R”、R²、R^2’、R⁶、R^6’、R⁷、R^7’、R⁹和R^9’如本发明的第一方面中所定义；

R^11b选自OH、OR^A，其中R^A为C_1-4烷基；并且

R^L为用于连接至细胞结合剂的接头，其选自：

(iiia)：

其中

Q为：

其中Q^X是使得Q为氨基酸残基、二肽残基或三肽残基；

X为：

其中a＝0至5，b＝0至16，c＝0或1，d＝0至5；

G^L为用于连接至配体单元的接头；以及

(iiib)：

其中R^L1和R^L2独立地选自H和甲基，或与它们所结合的碳原子一起形成亚环丙基或亚环丁基；并且e为0或1；

并且：

(a)R³⁰和R³¹一起在它们所结合的N原子与C原子之间形成双键；或

(b)R³⁰为H并且R³¹选自OH和OR^B，其中R^B为C_1-4烷基；

(c)R³⁰和R³¹均为H；或

(d)R³¹为OH或OR^B，其中R^B为C_1-4烷基并且R³⁰选自：

(i)

(ii)

(iii)

其中R^Z选自：

(z-i)

(z-ii)OC(＝O)CH₃；

(z-iii)NO₂；

(z-iv)OMe；

(z-v)葡萄糖醛酸苷；

(z-vi)NH-C(＝O)-X₁-NHC(＝O)X₂-NH-C(＝O)-R^ZC，其中-C(＝O)-X₁-NH-和-C(＝O)-X₂-NH-代表天然氨基酸残基并且R^ZC选自Me、OMe、CH₂CH₂OMe和(CH₂CH₂O)₂Me。

本发明的第三方面提供了式II的缀合物：

L-(D^L)_p(II)

其中L为配体单元(即，靶向剂)，D^L为式I’的药物接头单元：

其中R²、R^2’、R⁶、R⁷、R⁹、R^11b、Y、R”、Y’、R^6’、R^7’、R^9’、R³⁰和R³¹如本发明的第二方面中所定义；

R^LL为用于连接至细胞结合剂的接头，其选自：

(iiia)：

其中Q和X如第一方面中所定义并且G^LL为连接至配体单元的接头；以及

(iiib)：

其中R^L1和R^L2如第一方面中所定义；

其中p为1至20的整数。

下文更全面地描述的配体单元为结合至靶标部分的靶向剂。配体单元可以，例如，特异性地结合细胞组分(细胞结合剂)或其他目标靶分子。配体单元可以是，例如，蛋白质、多肽或肽，如抗体、抗体的抗原结合片段，或其他结合剂，如Fc融合蛋白。

本发明的第四方面提供了本发明的第三方面的缀合物在制造用于治疗增殖性疾病的药物中的用途。第四方面还提供了用于治疗增殖性疾病的本发明的第三方面的缀合物。第四方面还提供了一种治疗增殖性疾病的方法，其包括向有需要的患者施用治疗有效量的本发明的第二方面的缀合物。

本领域的普通技术人员能够容易地确定候选缀合物是否治疗任何特定细胞类型的增殖性病状。例如，可以方便地用来评估由特定化合物提供的活性的测定描述于以下实施例中。

本发明的第五方面提供了本发明的第三方面的缀合物的合成，其包括将本发明的第二方面的化合物(药物接头)与配体单元缀合。

式IV的化合物是由第三方面的缀合物释放的弹头。

定义

取代基

如本文所用的短语“任选取代的”涉及可为未取代的或可为取代的亲本基团。

除非另外指明，否则如本文所用的术语“取代的”涉及携带一个或多个取代基的亲本基团。术语“取代基”在本文中以常规意义使用并且是指共价连接至亲本基团或在适当时与亲本基团融合的化学部分。多种取代基是众所周知的，并且它们的形成和引入到各种亲本基团中的方法也是众所周知的。

取代基的实例在下面更详细地描述。

C_1-12烷基：如本文所用的术语“C_1-12烷基”涉及通过从具有1至12个碳原子的烃化合物的碳原子处移除氢原子获得的一价部分，其可以是脂族或脂环族的，并且可以是饱和或不饱和的(例如部分不饱和的、完全不饱和的)。如本文所用的术语“C_1-4烷基”涉及通过从具有1至4个碳原子的烃化合物的碳原子处移除氢原子获得的一价部分，其可以是脂族或脂环族的，并且可以是饱和或不饱和的(例如部分不饱和的、完全不饱和的)。因此，术语“烷基”包括以下论述的亚类烯基、炔基、环烷基等。

饱和烷基的实例包括但不限于甲基(C₁)、乙基(C₂)、丙基(C₃)、丁基(C₄)、戊基(C₅)、己基(C₆)以及庚基(C₇)。

饱和直链烷基的实例包括但不限于甲基(C₁)、乙基(C₂)、正丙基(C₃)、正丁基(C₄)、正戊基(戊基)(C₅)、正己基(C₆)以及正庚基(C₇)。

饱和支链烷基的实例包括异丙基(C₃)、异丁基(C₄)、仲丁基(C₄)、叔丁基(C₄)、异戊基(C₅)以及新戊基(C₅)。

C_2-12烯基：如本文所用的术语“-C_2-12烯基”涉及具有一个或多个碳-碳双键的烷基。

不饱和烯基的实例包括但不限于乙烯基(乙烯基，-CH＝CH₂)、1-丙烯基(-CH＝CH-CH₃)、2-丙烯基(烯丙基，-CH-CH＝CH₂)、异丙烯基(1-甲基乙烯基，-C(CH₃)＝CH₂)、丁烯基(C₄)、戊烯基(C₅)以及己烯基(C₆)。

C_2-12炔基：如本文所用的术语“C_2-12炔基”涉及具有一个或多个碳-碳三键的烷基。

不饱和炔基的实例包括但不限于乙炔基(-C≡CH)和2-丙炔基(炔丙基，-CH₂-C≡CH)。

C_3-12环烷基：如本文所用的术语“C_3-12环烷基”涉及也是环基的烷基；即，通过从环状烃(碳环)化合物的脂环环原子处移除氢原子获得的一价部分，所述部分具有3至7个碳原子，包括3至7个环原子。

环烷基的实例包括但不限于衍生自以下的那些：

饱和的单环烃化合物：

环丙烷(C₃)、环丁烷(C₄)、环戊烷(C₅)、环己烷(C₆)、环庚烷(C₇)、甲基环丙烷(C₄)、二甲基环丙烷(C₅)、甲基环丁烷(C₅)、二甲基环丁烷(C₆)、甲基环戊烷(C₆)、二甲基环戊烷(C₇)以及甲基环己烷(C₇)；

不饱和的单环烃化合物：

环丙烯(C₃)、环丁烯(C₄)、环戊烯(C₅)、环己烯(C₆)、甲基环丙烯(C₄)、二甲基环丙烯(C₅)、甲基环丁烯(C₅)、二甲基环丁烯(C₆)、甲基环戊烯(C₆)、二甲基环戊烯(C₇)以及甲基环己烯(C₇)；以及

饱和多环烃化合物：

降蒈烷(norcarane)(C₇)、降蒎烷(norpinane)(C₇)、降莰烷(norbornane)(C₇)。

C_3-20杂环基：如本文所用的术语“C_3-20杂环基”涉及通过从杂环化合物的环原子处移除氢原子获得的一价部分，所述部分具有3至20个环原子，其中1至10个为环杂原子。优选地，各环均具有3至7个环原子，其中1至4个环原子为环杂原子。

在上下文中，前缀(例如C_3-20、C_3-7、C_5-6等)表示环原子的数目或环原子的数目的范围，无论为碳原子还是杂原子。例如，如本文所用的术语“C_5-6杂环基”涉及具有5或6个环原子的杂环基。

单环杂环基的实例包括但不限于衍生自以下的杂环基：

N₁：氮丙啶(C₃)、氮杂环丁烷(C₄)、吡咯烷(四氢吡咯)(C₅)、吡咯啉(例如，3-吡咯啉、2,5-二氢吡咯)(C₅)、2H-吡咯或3H-吡咯(异吡咯、异唑)(C₅)、哌啶(C₆)、二氢吡啶(C₆)、四氢吡啶(C₆)、吖庚因(C₇)；

O₁：环氧乙烷(C₃)、氧杂环丁烷(C₄)、氧杂环戊烷(四氢呋喃)(C₅)、氧杂环戊二烯(oxole)(二氢呋喃)(C₅)、噁烷(四氢吡喃)(C₆)、二氢吡喃(C₆)、吡喃(C₆)、氧杂环庚三烯(C₇)；

S₁：硫杂丙环(thiirane)(C₃)、硫杂环丁烷(thietane)(C₄)、硫杂环戊烷(thiolane)(四氢噻吩)(C₅)、噻烷(四氢噻喃)(C₆)、硫杂环庚烷(thiepane)(C₇)；

O₂：二氧戊烷(C₅)、二噁烷(C₆)和二氧杂环庚烷(C₇)；

O₃：三噁烷(C₆)；

N₂：咪唑烷(C₅)、吡唑烷(二氮杂环戊烷(diazolidine))(C₅)、咪唑啉(C₅)、吡唑啉(二氢吡唑)(C₅)、哌嗪(C₆)；

N₁O₁：四氢噁唑(C₅)、二氢噁唑(C₅)、四氢异噁唑(C₅)、二氢异噁唑(C₅)、吗啉(C₆)、四氢噁嗪(C₆)、二氢噁嗪(C₆)、噁嗪(C₆)；

N₁S₁：噻唑啉(C₅)、噻唑烷(C₅)、硫代吗啉(C₆)；

N₂O₁：噁二嗪(C₆)；

O₁S₁：噁噻唑(oxathiole)(C₅)和氧硫杂环己烷(oxathiane)(噻噁烷(thioxane))(C₆)；以及

N₁O₁S₁：噁噻嗪(C₆)。

取代的单环杂环基的实例包括衍生自呈环状形式的糖类的杂环基，所述糖类例如呋喃糖(C₅)，如阿拉伯呋喃糖、来苏呋喃糖、核呋喃糖和木呋喃糖；以及吡喃糖(C₆)，如阿洛吡喃糖(allopyranose)、阿卓吡喃糖(altropyranose)、葡萄吡喃糖、甘露吡喃糖、古洛吡喃糖(gulopyranose)、艾杜吡喃糖(idopyranose)、半乳吡喃糖以及太洛吡喃糖(talopyranose)。

C_5-20芳基：如本文所用的术语“C_5-20芳基”涉及通过从芳族化合物的芳族环原子处移除氢原子获得的一价部分，所述部分具有3至20个环原子。如本文所用的术语“C_5-7芳基”涉及通过从芳族化合物的芳族环原子处移除氢原子获得的一价部分，所述部分具有5至7个环原子并且如本文所用的术语“C_5-10芳基”涉及通过从芳族化合物的芳族环原子处移除氢原子获得的一价部分，所述部分具有5至10个环原子。优选地，每个环具有5至7个环原子。

在上下文中，前缀(例如C_3-20、C_5-7、C_5-6、C_5-10等)表示环原子的数目或环原子的数目的范围，无论为碳原子还是杂原子。例如，如本文所用的术语“C_5-6芳基”涉及具有5或6个环原子的芳基。

环原子可以全部是碳原子，如在“碳芳基”中。

碳芳基的实例包括但不限于衍生自苯(即苯基)(C₆)、萘(C₁₀)、薁(azulene)(C₁₀)、蒽(C₁₄)、菲(C₁₄)、萘并萘(C₁₈)以及嵌二萘(C₁₆)的那些。

包括其中至少一个为芳环的稠环的芳基的实例包括但不限于衍生自茚满(例如2,3-二氢-1H-茚)(C₉)、茚(C₉)、异茚(C₉)、四氢化萘(1,2,3,4-四氢萘(C₁₀)、二氢苊(C₁₂)、芴(C₁₃)、非那烯(phenalene)(C₁₃)、醋菲(acephenanthrene)(C₁₅)以及醋蒽(aceanthrene)(C₁₆)的基团。

另选地，环原子可包括一个或多个杂原子，如在“杂芳基”中。单环杂芳基的实例包括但不限于衍生自以下的那些：

N₁：吡咯(唑)(C₅)、吡啶(吖嗪)(C₆)；

O₁：呋喃(氧杂环戊二烯)(C₅)；

S₁：噻吩(硫杂环戊二烯)(C₅)；

N₁O₁：噁唑(C₅)、异噁唑(C₅)、异噁嗪(C₆)；

N₂O₁：噁二唑(呋咱)(C₅)；

N₃O₁：噁三唑(C₅)；

N₁S₁：噻唑(C₅)、异噻唑(C₅)；

N₂：咪唑(1,3-二唑)(C₅)、吡唑(1,2-二唑)(C₅)、哒嗪(1,2-二嗪)(C₆)、嘧啶(1,3-二嗪)(C₆)(例如，胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)、吡嗪(1,4-二嗪)(C₆)；

N₃：三唑(C₅)、三嗪(C₆)；以及，

N₄：四唑(C₅)。

包含稠环的杂芳基的实例包括但不限于：

C₉(具有2个稠环)，其衍生自苯并呋喃(O₁)、异苯并呋喃(O₁)、吲哚(N₁)、异吲哚(N₁)、中氮茚(N₁)、吲哚啉(N₁)、异吲哚啉(N₁)、嘌呤(N₄)(例如，腺嘌呤、鸟嘌呤)、苯并咪唑(N₂)、吲唑(N₂)、苯并噁唑(N₁O₁)、苯并异噁唑(N₁O₁)、苯并二噁茂(O₂)、苯并呋咱(N₂O₁)、苯并三唑(N₃)、苯并硫代呋喃(S₁)、苯并噻唑(N₁S₁)、苯并噻二唑(N₂S)；

C₁₀(具有2个稠环)，其衍生自苯并吡喃(O₁)、异苯并吡喃(O₁)、苯并二氢吡喃(O₁)、异苯并二氢吡喃(O₁)、苯并噁烷(O₂)、喹啉(N₁)、异喹啉(N₁)、喹嗪(N₁)、苯并噁嗪(N₁O₁)、苯并二嗪(N₂)、吡啶并吡啶(N₂)、喹喔啉(N₂)、喹唑啉(N₂)、噌啉(N₂)、酞嗪(N₂)、二氮杂萘(N₂)、蝶啶(N₄)；

C₁₁(具有2个稠环)，其衍生自苯并二氮杂

(N₂)；

C₁₃(具有3个稠环)，其衍生自咔唑(N₁)、二苯并呋喃(O₁)、二苯并噻吩(S₁)、咔啉(N₂)、萘嵌间二氮杂苯(N₂)、吡啶并吲哚(N₂)；以及，

C₁₄(具有3个稠环)，其衍生自吖啶(N₁)、呫吨(O₁)、噻吨(S₁)、二苯并对二噁英(oxanthrene)(O₂)、氧硫杂蒽(O₁S₁)、吩嗪(N₂)、吩噁嗪(N₁O₁)、吩噻嗪(N₁S₁)、噻蒽(S₂)、菲啶(N₁)、菲咯啉(N₂)、吩嗪(N₂)。

无论单独还是作为另一取代基的一部分的以上基团均可自身任选地被一个或多个选自自身以及以下列出的另外取代基的基团取代。

卤素：-F、-Cl、-Br和-I。

羟基：-OH。

醚：-OR，其中R是醚取代基，例如，C_1-7烷基(也称为C_1-7烷氧基，以下进行讨论)、C_3-20杂环基(也称为C_3-20杂环氧基)或C_5-20芳基(也称为C_5-20芳基氧基)，优选C_1-7烷基。

烷氧基：-OR，其中R为烷基，例如，C_1-7烷基。C_1-7烷氧基的实例包括但不限于-OMe(甲氧基)、-OEt(乙氧基)、-O(nPr)(正丙氧基)、-O(iPr)(异丙氧基)、-O(nBu)(正丁氧基)、-O(sBu)(仲丁氧基)、-O(iBu)(异丁氧基)以及-O(tBu)(叔丁氧基)。

缩醛：-CH(OR¹)(OR²)，其中R¹和R²独立地为缩醛取代基，例如，C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选C_1-7烷基，或在“环状”缩醛基团的情况下，R¹和R²，与它们所连接的两个氧原子，和它们所连接的碳原子一起，形成具有4至8个环原子的杂环。缩醛基团的实例包括但不限于-CH(OMe)₂、-CH(OEt)₂和-CH(OMe)(OEt)。

半缩醛：-CH(OH)(OR¹)，其中R¹为半缩醛取代基，例如，C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选C_1-7烷基。半缩醛基团的实例包括但不限于-CH(OH)(OMe)和-CH(OH)(OEt)。

缩酮：-CR(OR¹)(OR²)，其中R¹和R²如对于缩醛所定义，并且R是除氢之外的缩酮取代基，例如，C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选C_1-7烷基。缩酮基团的实例包括但不限于-C(Me)(OMe)₂、-C(Me)(OEt)₂、-C(Me)(OMe)(OEt)、-C(Et)(OMe)₂、-C(Et)(OEt)₂以及-C(Et)(OMe)(OEt)。

半缩酮：-CR(OH)(OR¹)，其中R¹如对于半缩醛所定义，并且R是除氢之外的半缩酮取代基，例如，C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选C_1-7烷基。半缩醛基团的实例包括但不限于-C(Me)(OH)(OMe)、-C(Et)(OH)(OMe)、-C(Me)(OH)(OEt)以及-C(Et)(OH)(OEt)。

氧代基(酮、-酮)：＝O。

硫酮(thione)(硫酮(thioketone))：＝S。

亚氨基(亚胺)：＝NR，其中R为亚氨基取代基，例如，氢、C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选氢或C_1-7烷基。酯基的实例包括但不限于＝NH、＝NMe、＝NEt及＝NPh。

甲酰基(醛、甲醛)：-C(＝O)H。

酰基(酮基)：-C(＝O)R，其中R是酰基取代基，例如，C_1-7烷基(也称为C_1-7烷基酰基或C_1-7烷酰基)、C_3-20杂环基(也称为C_3-20杂环酰基)或C_5-20芳基(也称为C_5-20芳基酰基)，优选C_1-7烷基。酰基的实例包括但不限于-C(＝O)CH₃(乙酰基)、-C(＝O)CH₂CH₃(丙酰基)、-C(＝O)C(CH₃)₃(叔丁酰基)和-C(＝O)Ph(苯甲酰基、酰苯基(phenone))。

羧基(羧酸)：-C(＝O)OH。

硫代羧基(硫代羧酸)：-C(＝S)SH。

硫醇羧基(硫醇羧酸)：-C(＝O)SH。

硫酮羧基(硫酮羧酸)：-C(＝S)OH。

亚胺酸：-C(＝NH)OH。

异羟肟酸：-C(＝NOH)OH。

酯(羧酸酯、羧酸的酯、氧羰基)：-C(＝O)OR，其中R是酯取代基，例如，C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选C_1-7烷基。酯基的实例包括但不限于-C(＝O)OCH₃、-C(＝O)OCH₂CH₃、-C(＝O)OC(CH₃)₃和-C(＝O)OPh。

酰氧基(反酯)：-OC(＝O)R，其中R是酰氧基取代基，例如，C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选C_1-7烷基。酰氧基的实例包括但不限于-OC(＝O)CH₃(乙酰氧基)、-OC(＝O)CH₂CH₃、-OC(＝O)C(CH₃)₃、-OC(＝O)Ph和-OC(＝O)CH₂Ph。

氧基羰基氧基：-OC(＝O)OR，其中R是酯取代基，例如，C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选C_1-7烷基。酯基的实例包括但不限于-OC(＝O)OCH₃、-OC(＝O)OCH₂CH₃、-OC(＝O)OC(CH₃)₃和-OC(＝O)OPh。

氨基：-NR¹R²，其中R¹和R²独立地为氨基取代基，例如，氢、C_1-7烷基(也称为C_1-7烷基氨基或二-C_1-7烷基氨基)、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选H或C_1-7烷基，或，在“环状”氨基的情况下，R¹和R²与它们所连接的氮原子一起形成具有4至8个环原子的杂环。氨基可以是伯(-NH₂)、仲(-NHR¹)或叔(-NHR¹R²)，并且在阳离子形式中，可以是季(-⁺NR¹R²R³)。氨基的实例包括但不限于-NH₂、-NHCH₃、-NHC(CH₃)₂、-N(CH₃)₂、-N(CH₂CH₃)₂和-NHPh。环状氨基的实例包括但不限于氮杂环丙烷基、氮杂环丁烷基、吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉代以及硫吗啉代。

酰氨基(氨基甲酰基、氨甲酰基、氨基羰基、羧基酰胺)：-C(＝O)NR¹R²，其中R¹和R²独立地为氨基取代基，如对于氨基所定义。酰氨基的实例包括但不限于-C(＝O)NH₂、-C(＝O)NHCH₃、-C(＝O)N(CH₃)₂、-C(＝O)NHCH₂CH₃和-C(＝O)N(CH₂CH₃)₂，以及其中R¹和R²与它们所连接的氮原子一起形成杂环结构的酰氨基，例如哌啶基羰基、吗啉代羰基、硫吗啉代羰基和哌嗪基羰基。

硫代酰氨基(硫代氨甲酰基)：-C(＝S)NR¹R²，其中R¹和R²独立地为氨基取代基，如对于氨基所定义。酰氨基的实例包括但不限于-C(＝S)NH₂、-C(＝S)NHCH₃、-C(＝S)N(CH₃)₂和-C(＝S)NHCH₂CH₃。

酰氨基(Acylamido)(酰基氨基(acylamino))：-NR¹C(＝O)R²，其中R¹是酰胺取代基，例如，氢、C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选氢或C_1-7烷基，并且R²是酰基取代基，例如，C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选氢或C_1-7烷基。酰基酰胺基团的实例包括但不限于-NHC(＝O)CH₃、-NHC(＝O)CH₂CH₃和-NHC(＝O)Ph。R¹和R²可一起形成环状结构，如例如在琥珀酰亚胺基、马来酰亚胺基和邻苯二甲酰亚胺基中：

氨基羰基氧基：-OC(＝O)NR¹R²，其中R¹和R²独立地为氨基取代基，如对于氨基所定义。氨基羰基氧基的实例包括但不限于-OC(＝O)NH₂、-OC(＝O)NHMe、-OC(＝O)NMe₂和-OC(＝O)NEt₂。

脲基：-N(R¹)CONR²R³，其中R²和R³独立地为氨基取代基，如对于氨基所定义，并且R¹是脲基取代基，例如，氢、C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选氢或C_1-7烷基。脲基的实例包括但不限于-NHCONH₂、-NHCONHMe、-NHCONHEt、-NHCONMe₂、-NHCONEt₂、-NMeCONH₂、-NMeCONHMe、-NMeCONHEt、-NMeCONMe₂和-NMeCONEt₂。

胍基：-NH-C(＝NH)NH₂。

四唑基：具有四个氮原子和一个碳原子的五元芳环，

亚氨基：＝NR，其中R为亚氨基取代基，例如，氢、C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选H或C_1-7烷基。亚氨基的实例包括但不限于＝NH、＝NMe和＝NEt。

脒(脒基)：-C(＝NR)NR₂，其中每个R为脒取代基，例如，氢、C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选H或C_1-7烷基。脒基团的实例包括但不限于-C(＝NH)NH₂、-C(＝NH)NMe₂和-C(＝NMe)NMe₂。

硝基：-NO₂。

亚硝基：-NO。

叠氮基：-N₃。

氰基(腈、甲腈)：-CN。

异氰基：-NC。

氰酰基：-OCN。

异氰酰基：-NCO。

氰硫基(硫氰酰基)：-SCN。

异氰硫基(异硫氰酰基)：-NCS。

硫氢基(Sulfhydryl)(硫醇(thiol)、巯基(mercapto))：-SH。

硫醚(thioether)(硫醚(sulfide))：-SR，其中R为硫醚取代基，例如，C_1-7烷基(也称为C_1-7烷硫基)、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选C_1-7烷基。C_1-7烷硫基的实例包括但不限于-SCH₃和-SCH₂CH₃。

二硫醚：-SS-R，其中R为二硫醚取代基，例如，C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选C_1-7烷基(本文也称为C_1-7烷基二硫醚)。C_1-7烷基二硫醚基团的实例包括但不限于-SSCH₃和-SSCH₂CH₃。

锍化物(亚磺酰基、亚砜)：-S(＝O)R，其中R为锍化物取代基，例如，C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选C_1-7烷基。锍化物基团的实例包括但不限于-S(＝O)CH₃和-S(＝O)CH₂CH₃。

砜(磺酰基)：-S(＝O)₂R，其中R为砜取代基，例如，C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选C_1-7烷基，包括例如氟化或全氟化的C_1-7烷基。砜基团的实例包括但不限于-S(＝O)₂CH₃(甲基磺酰基、甲磺酰基)、-S(＝O)₂CF₃(三氟甲磺酰基)、-S(＝O)₂CH₂CH₃(乙磺酰基)、-S(＝O)₂C₄F₉(九氟丁磺酰基)、-S(＝O)₂CH₂CF₃(三氟乙磺酰基)、-S(＝O)₂CH₂CH₂NH₂(牛磺酰基)、-S(＝O)₂Ph(苯基磺酰基、苯磺酰基)、4-甲基苯基磺酰基(甲苯磺酰基)、4-氯苯基磺酰基(氯苯磺酰基)、4-溴苯基磺酰基(溴苯磺酰基)、4-硝基苯基磺酰基(硝苯磺酰基)、2-萘磺酸酯(萘磺酰基)以及5-二甲基氨基-萘-1-基磺酸酯(丹磺酰基)。

亚磺酸(亚磺基)：-S(＝O)OH、-SO₂H。

磺酸(磺基)：-S(＝O)₂OH、-SO₃H。

亚磺酸酯(亚磺酸的酯)：-S(＝O)OR，其中R为亚磺酸酯取代基，例如，C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选C_1-7烷基。亚磺酸酯基团的实例包括但不限于-S(＝O)OCH₃(甲氧基亚磺酰基；甲基亚磺酸酯)和-S(＝O)OCH₂CH₃(乙氧基亚磺酰基；乙基亚磺酸酯)。

磺酸酯(磺酸的酯)：-S(＝O)₂OR，其中R为磺酸酯取代基，例如，C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选C_1-7烷基。磺酸酯基团的实例包括但不限于-S(＝O)₂OCH₃(甲氧基磺酰基；甲基磺酸酯)和-S(＝O)₂OCH₂CH₃(乙氧基磺酰基；乙基磺酸酯)。

亚磺酰氧基：-OS(＝O)R，其中R为亚磺酰氧基取代基，例如，C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选C_1-7烷基。亚磺酰氧基的实例包括但不限于-OS(＝O)CH₃和-OS(＝O)CH₂CH₃。

磺酰氧基：-OS(＝O)₂R，其中R为磺酰氧基取代基，例如，C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选C_1-7烷基。磺酰氧基的实例包括但不限于-OS(＝O)₂CH₃(甲磺酸酯)和-OS(＝O)₂CH₂CH₃(乙磺酸酯)。

硫酸酯：-OS(＝O)₂OR；其中R为硫酸酯取代基，例如，C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选C_1-7烷基。硫酸酯基团的实例包括但不限于-OS(＝O)₂OCH₃和-SO(＝O)₂OCH₂CH₃。

氨磺酰基(氨磺酰；亚磺酸酰胺；亚磺酰胺)：-S(＝O)NR¹R²，其中R¹和R²独立地为氨基取代基，如对于氨基所定义。氨磺酰基的实例包括但不限于-S(＝O)NH₂、-S(＝O)NH(CH₃)、-S(＝O)N(CH₃)₂、-S(＝O)NH(CH₂CH₃)、-S(＝O)N(CH₂CH₃)₂和-S(＝O)NHPh。

磺酰氨基(sulfonamido)(氨亚磺酰基；磺酸酰胺；磺酰胺)：-S(＝O)₂NR¹R²，其中R¹和R²独立地为氨基取代基，如对于氨基所定义。磺酰氨基的实例包括但不限于-S(＝O)₂NH₂、-S(＝O)₂NH(CH₃)、-S(＝O)₂N(CH₃)₂、-S(＝O)₂NH(CH₂CH₃)、-S(＝O)₂N(CH₂CH₃)₂和-S(＝O)₂NHPh。

磺氨基：-NR¹S(＝O)₂OH，其中R¹为氨基取代基，如对于氨基所定义。磺氨基的实例包括但不限于-NHS(＝O)₂OH和-N(CH₃)S(＝O)₂OH。

磺氨基：-NR¹S(＝O)₂R，其中R¹为氨基取代基，如对于氨基所定义，并且R为磺氨基取代基，例如，C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选C_1-7烷基。磺氨基的实例包括但不限于-NHS(＝O)₂CH₃和-N(CH₃)S(＝O)₂C₆H₅。

亚磺氨基：-NR¹S(＝O)R，其中R¹为氨基取代基，如对于氨基所定义，并且R为亚磺氨基取代基，例如，C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选C_1-7烷基。亚磺氨基的实例包括但不限于-NHS(＝O)CH₃和-N(CH₃)S(＝O)C₆H₅。

膦基(膦)：-PR₂，其中R为膦基取代基，例如，-H、C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选-H、C_1-7烷基或C_5-20芳基。膦基的实例包括但不限于-PH₂、-P(CH₃)₂、-P(CH₂CH₃)₂、-P(t-Bu)₂和-P(Ph)₂。

磷基：-P(＝O)₂。

氧膦基(氧化膦)：-P(＝O)R₂，其中R为氧膦基取代基，例如，C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选C_1-7烷基或C_5-20芳基。氧膦基的实例包括但不限于-P(＝O)(CH₃)₂、-P(＝O)(CH₂CH₃)₂、-P(＝O)(t-Bu)₂和-P(＝O)(Ph)₂。

膦酸(膦酰基)：-P(＝O)(OH)₂。

膦酸酯(膦酰基酯)：-P(＝O)(OR)₂，其中R为膦酸酯取代基，例如，-H、C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选-H、C_1-7烷基或C_5-20芳基。膦酸酯基团的实例包括但不限于-P(＝O)(OCH₃)₂、-P(＝O)(OCH₂CH₃)₂、-P(＝O)(O-t-Bu)₂和-P(＝O)(OPh)₂。

磷酸(膦酰基氧基)：-OP(＝O)(OH)₂。

磷酸酯(膦酰基氧基酯)：-OP(＝O)(OR)₂，其中R为磷酸酯取代基，例如，-H、C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选-H、C_1-7烷基或C_5-20芳基。磷酸酯基团的实例包括但不限于-OP(＝O)(OCH₃)₂、-OP(＝O)(OCH₂CH₃)₂、-OP(＝O)(O-t-Bu)₂和-OP(＝O)(OPh)₂。

亚磷酸：-OP(OH)₂。

亚磷酸酯：-OP(OR)₂，其中R为亚磷酸酯取代基，例如，-H、C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选-H、C_1-7烷基或C_5-20芳基。亚磷酸酯基团的实例包括但不限于-OP(OCH₃)₂、-OP(OCH₂CH₃)₂、-OP(O-t-Bu)₂和-OP(OPh)₂。

亚磷酰胺：-OP(OR¹)-NR² ₂，其中R¹和R²为亚磷酰胺取代基，例如，-H、(任选取代的)C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选-H、C_1-7烷基或C_5-20芳基。亚磷酰胺基团的实例包括但不限于-OP(OCH₂CH₃)-N(CH₃)₂、-OP(OCH₂CH₃)-N(i-Pr)₂和-OP(OCH₂CH₂CN)-N(i-Pr)₂。

磷酰胺：-OP(＝O)(OR¹)-NR² ₂，其中R¹和R²为磷酰胺取代基，例如，-H、(任选取代的)C_1-7烷基、C_3-20杂环基或C_5-20芳基，优选-H、C_1-7烷基或C_5-20芳基。磷酰胺基团的实例包括但不限于-OP(＝O)(OCH₂CH₃)-N(CH₃)₂、-OP(＝O)(OCH₂CH₃)-N(i-Pr)₂和-OP(＝O)(OCH₂CH₂CN)-N(i-Pr)₂。

亚烷基

C_3-12亚烷基：如本文所用的术语“C_3-12亚烷基”涉及通过从具有3至12个碳原子(除非另外指出)的烃化合物上移除2个氢原子(从同一个碳原子处移除两个氢原子或从两个不同碳原子处各移除一个氢原子)而获得的双齿物部分，其可以是脂族的或脂环族的，并且可以是饱和的、部分不饱和的或完全不饱和的。因此，术语“亚烷基”包括以下论述的亚类亚烯基、亚炔基、亚环烷基等。

直链饱和C_3-12亚烷基的实例包括但不限于-(CH₂)_n-，其中n为3至12的整数，例如，-CH₂CH₂CH₂-(亚丙基)、-CH₂CH₂CH₂CH₂-(亚丁基)、-CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂-(亚戊基)和-CH₂CH₂CH₂CH-₂CH₂CH₂CH₂-(亚庚基)。

支链饱和C_3-12亚烷基的实例包括但不限于-CH(CH₃)CH₂-、-CH(CH₃)CH₂CH₂-、-CH(CH₃)CH₂CH₂CH₂-、-CH₂CH(CH₃)CH₂-、-CH₂CH(CH₃)CH₂CH₂-、-CH(CH₂CH₃)-、-CH(CH₂CH₃)CH₂-和-CH₂CH(CH₂CH₃)CH₂-。

直链部分不饱和的C_3-12亚烷基(C_3-12亚烯基和亚炔基)的实例包括但不限于-CH＝CH-CH₂-、-CH₂-CH＝CH₂-、-CH＝CH-CH₂-CH₂-、-CH＝CH-CH₂-CH₂-CH₂-、-CH＝CH-CH＝CH-、-CH＝CH-CH＝CH-CH₂-、-CH＝CH-CH＝CH-CH₂-CH₂-、-CH＝CH-CH₂-CH＝CH-、-CH＝CH-CH₂-CH₂-CH＝CH-和-CH₂-C≡C-CH₂-。

支链部分不饱和的C_3-12亚烷基(C_3-12亚烯基和亚炔基)的实例包括但不限于-C(CH₃)＝CH-、-C(CH₃)＝CH-CH₂-、-CH＝CH-CH(CH₃)-和-C≡C-CH(CH₃)-。

脂环族饱和的C_3-12亚烷基(C_3-12亚环烷基)的实例包括但不限于亚环戊基(例如亚环戊-1,3-基)和亚环己基(例如，亚环己-1,4-基)。

脂环族部分不饱和的C_3-12亚烷基(C_3-12亚环烷基)的实例包括但不限于亚环戊烯基(例如4-亚环戊烯-1,3-基)、亚环己烯基(例如2-亚环己烯-1,4-基；3-亚环己烯-1,2-基；2,5-亚环己二烯-1,4-基)。

其中C_3-12亚烷基被杂原子中断，下标是指包括杂原子的链中的原子数量。例如，链-C₂H₄-O-C₂H₄-将为C₅基团。

其中C_3-12亚烷基被芳环中断，下标是指直接处于包括芳环的链中的原子数量。例如，链

将为C₅基团。

连接标记：在式

中，上标标记C(＝O)和NH指示原子所结合的基团。例如，NH基团被示出为与羰基(其不是所示部分的一部分)结合，并且羰基被示出为与NH基团(其不是所示部分的一部分)结合。

配体单元

配体单元可以是任何种类，并且包括特异性结合至靶分子的蛋白质、多肽、肽以及非肽药剂。在一些实施方案中，配体单元可以是蛋白质、多肽或肽。在一些实施方案中，配体单元可以是环状多肽。这些配体单元可包括抗体或含有至少一个靶分子结合位点的抗体片段、淋巴因子、激素、生长因子或可与靶标特异性结合的任何其他细胞结合分子或物质。

术语“特异性结合(specifically binds和specific binding)”是指抗体或其他蛋白质、多肽或肽与预定分子(例如，抗原)的结合。通常，抗体或其他分子以至少约1x10⁷M^-1的亲和力结合，并且以比与除预定分子或密切相关分子之外的非特异性分子(例如，BSA、酪蛋白)的结合亲和力大至少两倍的亲和力与预定分子结合。

配体单元的实例包括所描述的用于并入本文的WO 2007/085930的那些药剂。

在一些实施方案中，配体单元为与细胞上的细胞外靶标相结合的细胞结合剂。所述细胞结合剂可以是蛋白质、多肽、肽或非肽药剂。在一些实施方案中，细胞结合剂可以是蛋白质、多肽或肽。在一些实施方案中，细胞结合剂可以是环状多肽。细胞结合剂还可以是抗体或抗体的抗原结合片段。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种抗体-药物缀合物(ADC)。

细胞结合剂

细胞结合剂可以是任何种类并且包括肽和非肽。这些细胞结合剂可包括抗体或含有至少一个结合位点的抗体片段、淋巴因子、激素、激素模拟物、维生素、生长因子、营养物转运分子或任何其他细胞结合分子或物质。

肽

在一个实施方案中，细胞结合剂是直链或环状肽，其包含4-30个，优选地6-20个连续的氨基酸残基。在此实施方案中，优选的是一种细胞结合剂连接至一种单体或二聚体氮杂环丁烷并苯并二氮杂

化合物。

在一个实施方案中，细胞结合剂包含结合整联蛋白α_νβ₆的肽。该肽对α_νβ₆的选择性超过XYS。

在一个实施方案中，细胞结合剂包括A20FMDV-Cys多肽。A20FMDV-Cys具有序列：NAVPNLRGDLQVLAQKVARTC。可替代地，可使用A20FMDV-Cys序列的变体，其中一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸残基被另一氨基酸残基取代。此外，所述多肽可具有序列NAVXXXXXXXXXXXXXXXRTC。

抗体

术语“抗体”在本文中是在最广泛的意义上加以使用并且具体地涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、多价抗体以及抗体片段，只要它们显示所期望的生物活性(Miller等(2003)Jour.of Immunology 170:4854-4861)。抗体可以是鼠、人、人源化的、嵌合的，或来源于其他物种。抗体是由免疫系统生成的蛋白质，其能够识别并结合特定抗原。(Janeway,C.、Travers,P.、Walport,M.、Shlomchik(2001)Immuno Biology,第5版,Garland Publishing,New York)。靶抗原通常具有通过多个抗体上的CDR识别的许多结合位点，也称为表位。特异性结合不同表位的各个抗体具有不同的结构。因此，一种抗原可具有多于一种的对应抗体。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性地结合目标靶标的抗原或其部分的抗原结合位点的分子，此类靶标包括但不限于产生与自身免疫疾病相关的自身免疫抗体的一种或多种癌细胞。免疫球蛋白可以属于免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。免疫球蛋白可以源自任何物种，包括人、鼠或兔来源。

“抗体片段”包含全长抗体的一部分，通常为其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')₂和scFv片段；双体分子；线性抗体；由Fab表达文库产生的片段，抗独特型(抗-Id)抗体，CDR(互补决定区)，和任何上述项的表位结合片段，其免疫特异性地结合于癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原，单链抗体分子；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群获得的抗体，即除了可能存在少量可能天然存在的突变之外，构成群的单个抗体是相同的。单克隆抗体针对单一抗原位点具有高度特异性。此外，与包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除了它们的特异性之外，单克隆抗体的优点还在于它们可以在不被其他抗体污染的情况下合成。修饰语“单克隆”表明抗体的特征是从基本上均一的抗体群体获得，并且不应解释为要求通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过Kohler等(1975)Nature 256:495最初描述的杂交瘤方法制备，或可以通过重组DNA方法制备(参见US4816567)。单克隆抗体还可以分离自噬菌体抗体文库，利用例如在Clackson等(1991)Nature,352:624-628；Marks等(1991)J.Mol.Biol.,222:581-597中描述的技术，或者可以分离自携带完全人免疫球蛋白系统的转基因小鼠(Lonberg(2008)Curr.Opinion 20(4):450-459)。

本文的单克隆抗体具体地包括嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。

细胞结合剂的实例包括所描述的用于WO 2007/085930(其并入本文)中的那些细胞结合剂。

用于本发明的实施方案的肿瘤相关抗原和同源抗体在下文列出，并且更详细地描述于被并入本文的WO 2017/186894的第14页至第86页。

(1)BMPR1B(骨形态发生蛋白受体-IB型)

(2)E16(LAT1、SLC7A5)

(3)STEAP1(前列腺的六跨膜上皮抗原)

(4)0772P(CA125、MUC16)

(5)MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核细胞增强因子、间皮素)

(6)Napi3b(NAPI-3B，NPTIIb，SLC34A2，溶质载体家族34(磷酸钠)，成员2，II型钠依赖性磷酸转运蛋白3b)

(7)Sema 5b(FLJ10372，KIAA1445，Mm.42015，SEMA5B，SEMAG，Semaphorin 5bHlog，25sema结构域，7血小板反应蛋白重复(1型和1型样)，跨膜结构域(TM)和短胞质结构域(semaphorin 5B)

(8)PSCA hlg(2700050C12Rik,C530008O16Rik,RIKEN cDNA 2700050C12,RIKENcDNA

2700050C12基因)

(9)ETBR(内皮素B型受体)

(10)MSG783(RNF124，假定蛋白FLJ20315)

(11)STEAP2(HGNC_8639，IPCA-1，PCANAP1，STAMP1，STEAP2，STMP，前列腺癌

相关基因1，前列腺癌相关蛋白1，前列腺的六跨膜上皮

抗原2，六跨膜前列腺蛋白)

(12)TrpM4(BR22450，FLJ20041，TRPM4，TRPM4B，瞬时受体电位阳离子5通道，亚家族M，成员4)

(13)CRIPTO(CR，CR1，CRGF，CRIPTO，TDGF1，畸胎癌源性生长因子)

(14)CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/埃-巴二氏病毒受体(Epstein Barrvirus receptor))或Hs.73792)

(15)CD79b(CD79B，CD79β，IGb(免疫球蛋白相关β)，B29)

(16)FcRH2(IFGP4，IRTA4，SPAP1A(SH2域，包含磷酸酶锚定蛋白1a)，SPAP1B，SPAP1C)

(17)HER2(ErbB2)

(18)NCA(CEACAM6)

(19)MDP(DPEP1)

(20)IL20R-α(IL20Ra,ZCYTOR7)

(21)短蛋白聚糖(Brevican)(BCAN，BEHAB)

(22)EphB2R(DRT,ERK,Hek5,EPHT3,Tyro5)

(23)ASLG659(B7h)

(24)PSCA(前列腺干细胞抗原前体)

(25)GEDA

(26)BAFF-R(B细胞活化因子受体，BLyS受体3，BR3)

(27)CD22(B细胞受体CD22-B同种型，BL-CAM，Lyb-8，Lyb8，SIGLEC-2，FLJ22814)

(27a)CD22(CD22分子)

(28)CD79a(CD79A，CD79α)，免疫球蛋白相关的α、B细胞特异性蛋白，其共价相互作用于Igβ(CD79B)并在表面上形成与Ig M分子的复合物，转导涉及B细胞分化的信号，pI:4.84,MW:25028TM:2[P]基因染色体：19q13.2)。

(29)CXCR5(伯基特淋巴瘤受体1，G蛋白偶联受体，其被CXCL13趋化因子活化，在淋巴细胞迁移和体液性防御中起作用，

10在HIV-2感染中以及也许在AIDS、淋巴瘤、骨髓瘤和白血病的发展中起作用)；372aa,pI:8.54MW:41959TM:7[P]基因染色体：11q23.3，

(30)HLA-DOB(MHC II类分子的β亚基(Ia抗原)，其结合肽并

20将它们呈递到CD4+T淋巴细胞)；273aa,pI:6.56,MW:30820.TM:1[P]基因染色体：6p21.3)

(31)P2X5(嘌呤能受体P2X配体门控离子通道5，由细胞外ATP门控的离子通道，可能涉及突触传递和神经发生，缺乏可能有助于特发性逼尿肌不稳定的病理生理学)；422aa),pI:7.63,

MW:47206TM:1[P]基因染色体：17p13.3)。

(32)CD72(B细胞分化抗原CD72，Lyb-2)；359aa,pI:8.66,MW:40225,TM:15[P]基因染色体：9p13.3)。

(33)LY64(淋巴细胞抗原64(RP105)，富含亮氨酸重复(LRR)家族的I型膜蛋白，调节B细胞活化和细胞凋亡，在患有系统性红斑狼疮的患者中功能的丧失相关于增加的疾病活性)；661aa,pI:6.20,MW:74147TM:1[P]基因染色体：5q12)。

(34)FcRH1(Fc受体样蛋白1，假定受体，用于免疫球蛋白Fc结构域，其包含C2型Ig样和ITAM结构域，在B淋巴细胞20分化中可以具有作用)；429aa,pI:5.28,MW:46925TM:1[P]基因染色体：1q21-1q22)

(35)IRTA2(免疫球蛋白超家族受体易位相关的2，假定的免疫受体，其在B细胞的发育和淋巴瘤发生中具有可能的作用；在一些B细胞恶性疾病中发生基因的去调节(通过易位))；977aa,pI:6.88,MW:106468,TM:1[P]基因染色体：1q21)

(36)TENB2(TMEFF2，tomoregulin，TPEF，HPP1，TR，推定的跨膜35蛋白多糖，涉及到生长因子和卵泡抑素的EGF/调蛋白(heregulin)家族)；374aa)

(37)PSMA–FOLH1(叶酸水解酶(前列腺特异性膜抗原)1)

(38)SST(生长抑素受体；注意：存在5种亚型)

(38.1)SSTR2(生长抑素受体2)

(38.2)SSTR5(生长抑素受体5)

(38.3)SSTR1

(38.4)SSTR3

(38.5)SSTR4

AvB6–两种亚基(39+40)

(39)ITGAV(整联蛋白，αV)

(40)ITGB6(整联蛋白,β6)

(41)CEACAM5(癌胚抗原相关细胞粘附分子5)

(42)MET(met原癌基因；肝细胞生长因子受体)

(43)MUC1(粘蛋白1(Mucin 1)，细胞表面相关的)

(44)CA9(碳酸酐酶IX)

(45)EGFRvIII(表皮生长因子受体(EGFR)，转录变体3，

(46)CD33(CD33分子)

(47)CD19(CD19分子)

(48)IL2RA(白细胞介素2受体，α)；NCBI参考序列：NM_000417.2)；

(49)AXL(AXL受体酪氨酸激酶)

(50)CD30-TNFRSF8(肿瘤坏死因子受体超家族，成员8)

(51)BCMA(B细胞成熟抗原)-TNFRSF17(肿瘤坏死因子受体超家族，成员17)

(52)CT Ags–CTA(睾丸癌抗原(Cancer Testis Antigen))

(53)CD174(Lewis Y)-FUT3(岩藻糖基转移酶3(半乳糖苷3(4)-L-岩藻糖基转移酶，路易斯血型)

(54)CLEC14A(C型凝集素域家族14，成员A；Genbank登录号NM175060)

(55)GRP78–HSPA5(热休克70kDa蛋白5(葡萄糖调节蛋白，78kDa)

(56)CD70(CD70分子)L08096

(57)干细胞特异性抗原。例如：

·5T4(见以下条目(63))

·CD25(见以上条目(48))

·CD32

·LGR5/GPR49

·Prominin/CD133

(58)ASG-5

(59)ENPP3(外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶3)

(60)PRR4(富含脯氨酸4(泪腺的))

(61)GCC–GUCY2C(鸟苷酸环化酶2C(热稳定肠毒素受体)

(62)Liv-1–SLC39A6(溶质载体家族39(锌转运蛋白)，成员6)

(63)5T4，滋养层糖蛋白，TPBG–TPBG(滋养层糖蛋白)

(64)CD56–NCMA1(神经细胞粘附分子1)

(65)CanAg(肿瘤相关抗原CA242)

(66)FOLR1(叶酸盐受体1)

(67)GPNMB(糖蛋白(跨膜)nmb)

(68)TIM-1–HAVCR1(甲型肝炎病毒细胞受体1)

(69)RG-1/前列腺肿瘤靶Mindin–Mindin/RG-1

(70)B7-H4–VTCN1(包含T细胞活化抑制剂的V-set结构域1

(71)PTK7(PTK7蛋白酪氨酸激酶7)

(72)CD37(CD37分子)

(73)CD138-SDC1(多配体聚糖1(syndecan 1))

(74)CD74(CD74分子，主要组织相容性复合物，II类不变链)

(75)Claudins(整合膜连接蛋白)–CLs(Claudins)

(76)EGFR(表皮生长因子受体)

(77)Her3(ErbB3)–ERBB3(v-erb-b2成红细胞白血病病毒癌基因同系物3(禽))

(78)RON-MST1R(巨噬细胞刺激1受体(c-met相关酪氨酸激酶))

(79)EPHA2(EPH受体A2)

(80)CD20–MS4A1(跨膜4结构域，亚家族A，成员1)

(81)腱生蛋白C(肌腱蛋白C，Tenascin C)–TNC(腱生蛋白C)

(82)FAP(成纤维细胞活化蛋白，α)

(83)DKK-1(Dickkopf 1同系物(光滑爪蟾，Xenopus laevis))

(84)CD52(CD52分子)

(85)CS1-SLAMF7(SLAM家族成员7)

(86)Endoglin-ENG(内皮糖蛋白)

(87)膜联蛋白A1-ANXA1(膜联蛋白A1)

(88)V-CAM(CD106)-VCAM1(血管细胞粘附分子1)

另外的肿瘤相关抗原和感兴趣的同源抗体为：

(89)ASCT2(ASC转运蛋白2，也称为SLC1A5)。

ASCT2抗体描述于WO 2018/089393中，其通过引用并入本文。

可在作为缀合物或作为缀合物的一部分掺入之前，对细胞结合剂进行标记，例如以帮助检测或纯化所述药剂。标记可以是生物素标记。在另一个实施方案中，可用放射性同位素标记细胞结合剂。

治疗方法

本发明的化合物可以用于治疗方法。还提供了一种治疗方法，其包括将治疗有效量的式II的缀合物施用给需要治疗的受试者。术语“治疗有效量”是足以对患者显示益处的量。这样的益处可以是至少改善至少一种症状。施用的实际量以及施用的速率和时程将取决于待治疗对象的性质和严重性。治疗处方，例如对剂量的决定，是在全科医生和其他医生的责任范围内。

可以单独地或与其他治疗组合施用缀合物(同时或相继地，其取决于待治疗的病状)。治疗和疗法的实例包括但不限于化疗(施用活性剂，包括，例如药物；手术；以及放射疗法)。

根据本发明和根据本发明使用的药物组合物，除活性成分(即，式II的缀合物)之外，还可以包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员众所周知的其他材料。此类材料应为无毒的并且应不干扰活性成分的功效。载体或其他材料的确切性质将取决于施用途径，所述施用途径可以是口服或通过注射，例如皮肤、皮下或静脉内注射。

用于口服施用的药物组合物可以是片剂、胶囊剂、粉剂或液体形式。片剂可以包含固体载体或佐剂。液体药物组合物通常包含液体载体，如水、石油、动物油或植物油、矿物油或合成油。可包含生理盐水溶液、葡萄糖或其他糖溶液或二醇类如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。胶囊剂可包含固体载体如明胶。

对于静脉内、皮肤或皮下注射或在痛苦部位处的注射，活性成分将具有肠胃外可接受的水性溶液的形式，所述水性溶液是无热原的并具有适宜的pH、等渗性和稳定性。本领域的相关技术人员使用例如等渗媒介物如氯化钠注射液、林格氏注射液、乳酸林格氏注射液完全能够制备合适的溶液。根据需要，可以包含防腐剂、稳定剂、缓冲剂、抗氧化剂和/或其他添加剂。

缀合物可用于治疗增殖性疾病和自身免疫疾病。术语“增殖性疾病”涉及过度或异常细胞的不需要的或不受控制的细胞增殖，这是不期望的，如赘生物或增生性生长(无论是在体外或体内)。

增殖性病状的实例包括但不限于良性、恶化前、和恶性细胞增殖，包括但不限于赘生物和肿瘤(例如组织细胞瘤、神经胶质瘤、星形细胞瘤、骨瘤)、癌症(例如肺癌、小细胞肺癌、胃肠癌、肠癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、睾丸癌、肝癌、肾癌、膀胱癌、胰腺癌、脑癌、肉瘤、骨肉瘤、卡波西肉瘤、黑素瘤)、白血病、银屑癣、骨疾病、纤维增殖性病症(例如结缔组织的纤维增殖性病症)以及动脉粥样硬化。其他所关注的癌症包括但不限于血液学；恶性肿瘤，如白血病和淋巴瘤，如非霍奇金淋巴瘤，以及亚型如DLBCL、边缘区、外套层和滤泡、霍奇金淋巴瘤、AML以及B或T细胞来源的其他癌症。

自身免疫疾病的实例包括以下：类风湿性关节炎、自身免疫性脱髓鞘疾病(例如，多发性硬化症、变态反应性脑脊髓炎)、银屑病性关节炎、内分泌眼病、葡萄膜视网膜炎、全身性红斑狼疮、重症肌无力、格雷夫斯病、肾小球肾炎、自身免疫性肝病、炎症性肠病(例如，克罗恩病)、过敏性反应、变态反应、舍格伦综合症、I型糖尿病、原发性胆汁性肝硬化、韦氏肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)、纤维肌痛症、多肌炎、皮肌炎、多发性内分泌衰竭、施密特氏综合征(Schmidt’ssyndrome)、自身免疫性葡萄膜炎、爱迪生氏病(Addison’sdisease)、肾上腺炎、甲状腺炎、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis)、自身免疫性甲状腺疾病、恶性贫血、胃萎缩、慢性肝炎、狼疮样肝炎、动脉粥样硬化、亚急性皮肤型红斑狼疮、甲状旁腺功能减退症、德雷斯勒综合征(Dressler’s syndrome)、自身免疫性血小板减少症、特发性血小板减少性紫癜、溶血性贫血、寻常型天疱疮、天疱疮、疱疹样皮炎、斑秃、类天疱疮、硬皮病、进行性全身性硬化症、CREST综合征(钙质沉着、雷诺氏现象、食道运动功能障碍、指端硬化以及毛细管扩张)、男性和女性自身免疫性不孕、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎、混合性结蒂组织病、结节性多动脉炎、系统性坏死性血管炎、过敏性皮肤炎、特应性鼻炎、肺出血-肾炎综合征(Goodpasture’s syndrome)、查加斯病(Chagas’disease)、结节病、风湿热、哮喘、复发性流产、抗磷脂综合征、农民肺、多形性红斑、心脏切开后综合征、库欣综合征(Cushing’ssyndrome)、自身免疫性慢性活动性肝炎、养鸟人肺(bird-fancier’slung)、中毒性表皮坏死松解症、Alport综合征、肺泡炎、过敏性肺泡炎、纤维性肺泡炎、间质性肺病、结节性红斑、坏疽性脓皮病、输血反应、大动脉炎、风湿性多肌痛、颞动脉炎、血吸虫病、巨细胞动脉炎、蛔虫病、曲霉病、阿司匹林三联症(Sampter’s syndrome)、湿疹、淋巴瘤样肉芽肿病、贝切特氏病(Behcet’s disease)、卡普兰综合征(Caplan’s syndrome)、川崎氏病(Kawasaki’s disease)、登革热、脑脊髓炎、心内膜炎、心内膜心肌纤维化、眼内炎、持久性隆起性红斑(erythema elevatum et diutinum)、银屑病、胎儿成红细胞增多症、嗜酸细胞性筋膜炎、舒尔曼综合征(Shulman’s syndrome)、费尔蒂氏综合征(Felty’ssyndrome)、丝虫病、睫状体炎、慢性睫状体炎、异时睫状体炎、富克斯氏睫状体炎、IgA肾病、亨-舍二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、移植物抗宿主病、移植排斥反应、心肌症、伊顿-兰伯特综合征(Eaton-Lambert syndrome)、复发性多软骨炎、冷沉球蛋白血症、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’s macroglobulemia)、埃文氏综合征(Evan’s syndrome)以及自身免疫性腺衰竭。

在一些实施方案中，自身免疫性疾病是B淋巴细胞的失调(例如，系统性红斑狼疮、肺出血-肾炎综合征、类风湿性关节炎以及I型糖尿病)、Th1淋巴细胞的失调(例如，类风湿性关节炎、多发性硬化症、银屑病、干燥综合征、桥本氏甲状腺炎、格雷夫斯病、原发性胆汁性肝硬化、韦氏肉芽肿病、肺结核或移植物抗宿主病)或Th2淋巴细胞的失调(例如，特应性皮炎、系统性红斑狼疮、特应性哮喘、结膜炎、过敏性鼻炎、欧门氏综合征(Omenn’ssyndrome)、系统性硬化症或慢性移植物抗宿主病)。一般而言，涉及树突状细胞的病症涉及Th1淋巴细胞或Th2淋巴细胞的失调。在一些实施方案中，自身免疫性病症是T细胞介导的免疫学病症。

在一些实施方案中，所施用的缀合物的量在约0.01mg/kg/剂量至约10mg/kg/剂量的范围内。在一些实施方案中，所施用的缀合物的量在约0.01mg/kg/剂量至约5mg/kg/剂量的范围内。在一些实施方案中，所施用的缀合物的量在约0.05mg/kg/剂量至约5mg/kg/剂量的范围内。在一些实施方案中，所施用的缀合物的量在约0.1mg/kg/剂量至约5mg/kg/剂量的范围内。在一些实施方案中，所施用的缀合物的量在约0.1mg/kg/剂量至约4mg/kg/剂量的范围内。在一些实施方案中，所施用的缀合物的量在约0.05mg/kg/剂量至约3mg/kg/剂量的范围内。在一些实施方案中，所施用的缀合物的量在约0.1mg/kg/剂量至约3mg/kg/剂量的范围内。在一些实施方案中，所施用的缀合物的量在约0.1mg/kg/剂量至约2mg/kg/剂量的范围内。

药物负载量

药物负载量(p)是每个细胞结合剂(例如抗体)的ABD药物的平均数量。在本发明的化合物与半胱氨酸结合的情况下，药物负载量可在每个细胞结合剂1至8个药物(D)的范围内，其中1、2、3、4、5、6、7和8个药物部分与所述细胞结合剂共价连接。缀合物的组合物包括与一定范围的药物(1至8)缀合的细胞结合剂(例如，抗体)的集合。在本发明的化合物与赖氨酸结合的情况下，药物负载量可在每个细胞结合剂1至80个药物(D)的范围内，但是40、20、10或8的上限可为优选的。缀合物的组合物包括与一定范围的药物(1至80、1至40、1至20、1至10或1至8)缀合的细胞结合剂(例如，抗体)的集合。

可以通过常规方法如UV、反相HPLC、HIC、质谱法、ELISA测定和电泳来表征来自缀合反应的ADC的制剂中每个抗体的药物的平均数量。还可以确定就p而言ADC的数量分布。通过ELISA，可确定ADC的特定制剂中p的平均值(Hamblett等(2004)Clin.Cancer Res.10:7063-7070；Sanderson等(2005)Clin.Cancer Res.11:843-852)。然而，通过ELISA的抗体-抗原结合和检测限，无法辨别p(药物)值的分布。此外，用于检测抗体-药物缀合物的ELISA测定不确定在何处药物部分连接至抗体，如重链或轻链片段，或特定氨基酸残基。在一些情况下，可以通过如反相HPLC或电泳的手段来实现其中p是一定值的均质ADC与具有其他药物负载量的ADC的分离、纯化和表征。这样的技术也适用于其他类型的缀合物。

对于一些抗体-药物缀合物，p可受到抗体上的连接位点的数量的限制。举例来说，抗体可仅具有一个或若干个半胱氨酸硫醇基团，或可仅具有可供连接接头的一个或若干个具有足够反应性的硫醇基团。较高的药物负载量，例如p>5，可导致某些抗体-药物缀合物的聚集、不溶性、毒性或细胞渗透性损失。

通常，在缀合反应期间，将小于理论最大值的药物部分缀合于抗体。抗体可以包含，例如，不与药物接头反应的许多赖氨酸残基。只有最具反应性的赖氨酸基团可与胺反应性接头试剂反应。另外，只有最具反应性的半胱氨酸硫醇基团可与硫醇反应性接头试剂反应。通常，抗体不含有许多(如果含有的话)游离且具反应性的半胱氨酸硫醇基团，其可与药物部分连接。化合物的抗体中的大多数半胱氨酸硫醇残基作为二硫桥存在，并且必须用还原剂如二硫苏糖醇(DTT)或TCEP，在部分或完全还原条件下进行还原。可以以几种不同的方式控制ADC的负载量(药物/抗体比率)，包括：(i)限制药物接头相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制缀合反应时间或温度，以及(iii)用于半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制性还原性条件。

某些抗体具有可还原的链间二硫化物，即半胱氨酸桥。可通过用还原剂如DTT(二硫苏糖醇)处理抗体而使其对于与接头试剂的缀合具有反应性。各半胱氨酸桥因此在理论上将形成两个反应性硫醇亲核体。可通过赖氨酸与2-亚氨基硫杂环戊烷(Traut’s试剂)的反应向抗体中引入另外的亲核基团，其导致胺转化为硫醇。可通过对一个、两个、三个、四个或更多个半胱氨酸残基进行工程改造来向抗体(或其片段)中引入反应性硫醇基团(例如，制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突变抗体)。US 7521541教导了通过引入反应性半胱氨酸氨基酸对抗体进行工程改造。

可在抗体中的反应性位点处对半胱氨酸氨基酸进行工程改造并且这不形成链内或分子间二硫键(Junutula等,2008b Nature Biotech.,26(8):925-932；Dornan等(2009)Blood 114(13):2721-2729；US 7521541；US 7723485；WO2009/052249)。工程改造的半胱氨酸硫醇可与接头试剂或本发明的具有硫醇反应性的亲电子基团(如马来酰亚胺或α-卤代酰胺)的药物-接头试剂反应，以形成具有半胱氨酸工程改造的抗体和ABD药物部分的ADC。药物部分的位置因此可以设计、控制并已知。可以控制药物负载量，因为工程改造的半胱氨酸硫醇基团通常以高收率与硫醇反应性接头试剂或药物接头试剂反应。通过在重链或轻链的单个位点上取代引入半胱氨酸氨基酸来工程改造IgG在对称抗体上得到两个新的半胱氨酸。近似2的药物负载量可以通过缀合产物ADC的近似同质性实现。

在抗体的多于一个亲核或亲电子基团与药物-接头中间体或接头试剂、接着是药物部分试剂反应的情况下，那么得到的产物是ADC化合物与连接于抗体的药物部分的分布的混合物，例如1、2、3等。液相色谱法如聚合物反相(PLRP)和疏水性相互作用(HIC)可按照药物负载值来分离混合物中的化合物。可以分离具有单药物负载值(p)的ADC的制剂，然而，这些单负载值ADC可仍然是非均匀混合物，因为可通过接头在抗体上的不同位点处连接药物部分。

因此，本发明的抗体-药物缀合物组合物包括抗体-药物缀合化合物的混合物，其中抗体具有一个或多个ABD药物部分以及其中药物部分可以在不同的氨基酸残基处连接于抗体。

在一个实施方案中，每个细胞结合剂的二聚体氮杂环丁烷并苯并二氮杂

基团的平均数量在1至20的范围内。在一些实施方案中，所述范围选自1至8、2至8、2至6、2至4以及4至8。

在一些实施方案中，每个细胞结合剂存在一个二聚体氮杂环丁烷并苯并二氮杂

基团。

一般合成路线

大量合适的N-Prot^N、O-Prot^O和Y-Prot^Y保护基描述于Greene,T.W.和Wuts,G.M.,Protective Groups in Organic Synthesis,第3版,John Wiley&Sons,Inc.,1999中，其以引用方式并入本文。

式IV的化合物的合成

合成本发明的第一方面的化合物(具体地，式IV的化合物)的一个可能步骤在方案1中示出。这从N10保护的ABD二聚体(d1A)开始。

通过标准方法在N10位置处对二聚体d1A去保护，以得到式IV的化合物。在Prot^N为Alloc的情况下，使用钯进行去保护。取决于所用的溶剂，所产生的化合物可处于其甲醇胺或甲醇胺醚形式，与亚胺平衡。

在ABD的情况下，四元氮杂环丁烷环的环应变是指甲醇胺形式在平衡中是主要的。

合成式IV的化合物的替代步骤在方案2中示出。这从N10氮保护的ABD单体(m2A)开始。

在C11位醇处对N10和Y8位置受保护的ABD单体m2A进行保护，以得到m2B。优选地，Prot^O为TBS并且通过添加过量TBS-Cl实现保护。Prot^Y-Y保护基的后续去保护提供可二聚化的物类(m2C)。当Prot^Y为TIPS时，可使用在DMF和水中的LiOAc实现去保护。

使m2C与二聚体接头R”(X)₂反应以得到二聚体d2D。通常，Y为O并且X为卤素(优选Br)。在此情况下，使用TBAI添加剂，双Williamson醚合成形成二聚体。

从二聚体产物中移除N10保护基以得到d2E。例如，如果Prot^N为Alloc并且Prot^O为用于合成的氧保护基，那么使用钯进行去保护以移除N10保护基，然后消除用于合成的氧保护基。如果Prot^N为Troc并且Prot^O为用于合成的氧保护基，那么使用Cd/Pb对进行去保护。如果Prot^N为SEM或类似基团，并且Prot^O为氧代基，那么可以通过还原移除氧代基，这产生受保护的甲醇胺中间体，然后可以对其进行处理以移除SEM保护基，接着消除水。C11位醇保护基的移除提供式IV的化合物。如果Prot^O为TBS，使用钯和在DCM中的吡咯烷，醇去保护可与前述Alloc N去保护同时发生。

方案1和2分别所需的二聚体d1A和单体m2A可通过若干路线合成。经由氧化闭环的一种可能路线在方案3中示出。

化合物3A、3B、3C、3D和3E可以是二聚体(其中基团R^Y代表与类似的ABD前体连接的R”)或单体(其中基团R^Y代表合适的保护基)。

单体3A是硝基苯甲酸衍生物。许多此类衍生物是可商购获得的并且其他衍生物可以通过常规方法合成(例如Althuis,T.H.和Hess,H.J.,J Medicinal Chem.,20(1),146-266(1977))。通常，硝基苯甲酸衍生自酯，通过在温和条件(如使用LiOH)下酯水解获得。二聚体3A可通过现有技术中公开的各种策略制备(例如，WO 00/12508的方案3)。例如，适当的苯甲酸酯可关于合适的二醇通过Mitsunobo醚化，接着硝化和水解而二聚化。另选地，苯甲酸酯可关于合适的二卤化物通过Williamson醚合成而二聚化。获得单体和二聚体3A所需的另外的转化可在文献中获得。

可通过现有技术中公开的相当的脯氨酸合成的修改来合成氮杂环丁烷起始材料(例如，WO 00/12508的方案4)。与氮杂环丁烷特别相关的策略也是文献中已知的(例如Bose,D.S.等,Tetrahedron Letters,38(33),5839-5842,1997；doi:10.1016/S0040-4039(97)01297-5)。例如，可在氮杂环丁烷的氮处通过合适的保护基如Cbz对可商购获得的氮杂环丁烷-2-羧酸进行保护，然后进行酸性酯化以得到甲基酯。可用在THF中的LiBH₄还原酯以得到Cbz保护的2-(羟甲基)氮杂环丁烷。在一些方法中，可通过与TBS-Cl的反应将适当的保护基(Prot^O)，如TBS，添加到醇中。在其他方法中，醇不受保护。在方案3中，Prot^O可代表合适的保护基或H-合适的Prot^O基团应能够承受NO₂还原条件。接下来，通常通过在H₂气体下还原来移除氮保护基，以产生方案3中所需的氮杂环丁烷起始材料。

化合物3A与氮杂环丁烷起始材料缩合得到3B。通常通过DCC偶联或通过酰氯(由羧酸与草酰氯或SOCl₂形成)或在低温下利用在DCM中的HOBt实现缩合。

使用标准程序，如在MeOH中的SnCl₂，或在MeOH/H₂O/甲酸(90:5:5)中的锌，或连二亚硫酸钠，或雷尼镍和肼，或在钯/炭上催化加氢将3B的硝基还原为胺(3C)。所选择的方法取决于羟基保护基的需要。

所得的胺被合适的保护基单重保护以得到3D。N-Prot^N基团优选地为氨基甲酸酯，如N-Alloc。胺的亲核性在用Alloc保护后降低，因此单重保护是有利的。通常，这通过与吡啶和一当量的氯甲酸烯丙基酯反应来实现。当Prot^O为H时，则3D等同于3E。当Prot^O为保护基时，在标准条件下将其移除以得到醇3E。如果Prot^O为乙酸酯保护基，则可在弱碱性条件下(例如K₂CO₃)将其移除，或者如果Prot^O为甲硅烷基醚保护基，如TBS，则可通过使用TBAF或弱酸将其移除。

通过醛或功能等效物实现的氧化闭环由二聚体3E得到d1A(用于根据方案1的进一步反应)并且由单体3E得到m2A(用于根据方案2的进一步反应)。选择性醇-醛氧化可通过在分子筛上暴露于在N-甲基吗啉N-氧化物(NMO)中的四丙基过钌酸铵(TPAP)或通过Swern氧化(使用DMSO和草酰氯)或通过Dess-Martin氧化(使用DMP)或优选地通过Cu(I)/TEMPO自由基氧化(使用三氟甲磺酸四乙腈铜(I)、1-羟基-2,2,6,6-四甲基-哌啶(TEMPO)、1-甲基咪唑和2-(2-吡啶基)吡啶)来实现。后者是有利的，因为不需要严格的无水条件，并且没有证据表明ABD双内酰胺物类的过度氧化。醛物类经历自发的B环闭合，包括受到单重保护的N10位置的攻击。

获得二聚体d1A和单体m2A的替代路线在方案4中示出。此路线使用醛解掩蔽(unmasking)来介导闭环。

化合物3A、4B、4C和4D可以是二聚体(其中基团R^Y代表与类似的ABD前体连接的R”)或单体(其中基团R^Y代表合适的保护基)。

3A单体和二聚体变体可通过上文关于方案3所讨论的策略生成。氮杂环丁烷起始材料在2位具有硫缩醛(但是可使用其他掩蔽醛等效物)。二乙基硫缩醛氮杂环丁烷可通过类似的脯氨酸合成策略的修改制备(例如Langley,D.R.&Thurston,D.E.,J OrganicChemistry,52,91-97(1987))。与氮杂环丁烷特别相关的路线在文献中也是已知的(例如Bose,D.S.等,Tetrahedron Letters,38(33),5839-5842,1997；doi:10.1016/S0040-4039(97)01297-5)。例如，Cbz保护的2-(羟甲基)氮杂环丁烷可如上文所述(针对方案3)进行制备。然后通常通过Dess-Martin氧化(使用DMP)或在DMSO中的IBX将醇再氧化为醛。优选地利用弱酸催化剂如在质子溶剂中的TMSCl使所得的醛与硫醇如EtSH缩合，以得到硫缩醛。硫缩醛与H₂气体还原不相容，因此通常利用在DCM中的TMS-I移除N保护基(例如Cbz)。这产生二乙基硫缩醛氮杂环丁烷起始材料。

3A与硫缩醛氮杂环丁烷起始材料的直接缩合得到4B。4B的硝基可通过上文关于方案3所讨论的方法，优选地通过氯化锡(II)方法(在MeOH中的SnCl₂)或在MeOH/H₂O/甲酸(90:5:5)中的锌还原为胺(4C)。由于硫缩醛基团的不相容性，优选地不通过直接氢化进行还原。通过与相应的氯甲酸酯或酰氯反应，胺被合适的胺保护基如Alloc单重保护。4D的N-Prot^N基团优选地为氨基甲酸酯，如N-Alloc，因为这些物类有利于单重保护。

硫缩醛对醛的选择性解掩蔽导致B环因受到单重保护的N10位置的攻击而自发环化。通常，解掩蔽是由汞(II)介导的，例如在乙腈:水中的HgCl₂和CaCO₃。对于二聚体4D，这提供了d1A(用于根据方案1的进一步反应)，并且对于单体4D，这提供了m2A(用于根据方案2的进一步反应)。

二聚体或单体硫缩醛4B(根据方案4)可通过替代路线合成，在方案5中示出。此路线原位生成硫缩醛。

实现单体和二聚体3A的合成策略在上文关于方案3进行了讨论。3A与可商购获得的氮杂环丁烷-2-羧酸缩合得到5B。从5B到4B的路线遵循与由氮杂环丁烷-2-羧酸合成硫缩醛氮杂环丁烷起始材料(如关于方案4所讨论的)类似的方法。

通过氢化物还原剂，通常通过LiBH₄将5C还原为仲醇5D。然后将5D再氧化为醛(5E)，通常通过高价碘物类(例如IBX或DMP)。原位生成硫缩醛，优选地在酸性条件下使用EtSH，以提供化合物4B。这可以根据方案4进一步反应，以得到期望的ABD物类。

式I的化合物的合成

合成本发明的第二方面的化合物(具体地，式I的化合物)的一个可能步骤在方案6中示出。这从两个环化的ABD单体开始：具有Prot^N保护的N10位置的m2A和具有R^L附加的N10氮的m6A。

取决于所使用的溶剂，式I的化合物可在亚胺与甲醇胺或甲醇胺醚形式之间平衡存在(类似于针对式IV在方案1中所示的平衡)。

在一些实施方案中，Prot^N可等同于式I的R³⁰取代基(由本发明第二方面的选项(d)i、ii和iii描述)。

m2A起始材料可根据方案3、4和5制备。对于其中Prot^N等同于R³⁰氨基甲酸酯连接基团的化合物，则通过异氰酸酯制备m2A(即与m6A相同的路线-下文讨论)。

使用与关于方案2所描述的类似的策略，可使用二聚体接头R”使m2A和m6A关于Y8位置二聚化。C11位醇由Prot^O保护，其中Prot^O优选为TBS并通过与TBS-Cl的反应引入。Prot^Y基团的后续移除，其中Prot^Y为TIPS，可使用在DMF和水中的LiOAc发生，以分别得到m2C和m6B。

使m2C和m6B与R”(X)₂进一步反应，以得到二聚体d6C。通常，Y为O并且X为卤素(优选地Br)。在此情况下，TBAI添加剂可驱动双Williamson醚合成以形成二聚体。二聚化的替代策略也是本领域已知的，例如通过Mitsonobu醚化。

在一些实施方案中，从非接头ABD中移除N10保护基以得到不对称二聚体d6D。讨论了与方案1和2有关的各种去保护策略。在Prot^N为Alloc的情况下，则可使用钯进行去保护。

在其他实施方案中，不移除N10保护基。通过移除Prot^O将d6C直接转化为式I的化合物。

移除C11位醇保护基提供式I的不对称化合物。如果Prot^O为TBS，则醇去保护可与利用钯和在DCM中的吡咯烷的Alloc N10位去保护同时发生。

单体m6A(方案6所需)的可能合成和式I的化合物的替代路线在方案7中示出。

化合物7A、7B、7C和7D可以是二聚体(其中基团R^YY代表与在N10位单重保护的ABD前体连接的R”)或单体(其中基团R^YY代表合适的保护基)。单体7A等同于单体3C，并且可以通过类似的路线合成(如方案3所示)。

7A的胺转化为异氰酸酯7B。在现有技术(例如，WO 2005/023814)中详细描述了异氰酸酯形成的策略。通常，使用光气，优选地在碱性条件下使用三光气；固体三光气晶体比有毒的光气气体更安全且更容易处理。该反应应在无水和非羟基有机溶剂中进行，所述溶剂优选是非极性的。合适的溶剂包括无水DCM和无水甲苯。该反应可在室温下进行，并且通过红外光谱在约2265cm^-1下方便地监测。

氨基甲酸酯7C是通过R^L-OH的攻击由异氰酸酯形成的。氨基甲酸酯的形成通常通过一锅法实现，其中异氰酸酯通过三光气与在DCM中的TEA形成，并将R^L-OH直接添加到反应混合物中。这种方法减少了异氰酸酯在氨基甲酸酯形成之前的停留时间，从而减少副反应的机会。

通过合适的方法移除Prot^O保护基以提供仲醇7D，通常在酸性条件下(例如，在THF:水溶剂中的乙酸)。

通过醛或功能等效物实现的7D的氧化闭环可通过在分子筛上暴露于在N-甲基吗啉N-氧化物(NMO)中的四丙基过钌酸铵(TPAP)或通过Swern氧化(DMSO和草酰氯)或优选地通过Cu(I)/TEMPO自由基氧化(三氟甲磺酸四乙腈铜(I)、1-羟基-2,2,6,6-四甲基-哌啶(TEMPO)、1-甲基咪唑和2-(2-吡啶基)吡啶)来实现。这对于单体7D变体(即其中R^YY＝Prot^Y)得到m6A(用于在方案6中进一步反应)，或对于二聚体7D变体(即其中R^YY＝与N10保护的ABD连接的R”)得到d7E。

氮保护基(Prot^N)(通常用钯移除的Alloc)的移除提供式I的不对称化合物。

单体m6A(方案6)和二聚体d7E(方案7)的替代路线在方案8中示出。

化合物8A、8B和8C可以是二聚体(其中基团R^YY代表与在N10位置单重保护的ABD前体连接的R”)或单体(其中基团R^YY代表合适的保护基Prot^Y)。8A转化为异氰酸酯8B，其继而与R^L-OH反应以通过氨基甲酸酯附加R^L。优选策略类似于关于方案7所讨论的策略。

硫缩醛8C对醛的选择性解掩蔽导致B环因受到单重保护的N10位置的攻击而自发环化。通常，解掩蔽是由汞(II)介导的，例如在乙腈:水中的HgCl₂和CaCO₃。环化提供单体m6A(由单体8C)和二聚体d7E(由二聚体8C)。m6A可根据方案6反应，并且d7E可根据方案7反应，以产生式I的化合物。

对于单体7A(即其中R^YY为Prot^Y)，方案7的起始材料可通过与方案3(单体3A至3C)类似的路线实现。类似地，对于单体8A(即其中R^YY为Prot^Y)，方案8的起始材料可通过与方案4(单体3A至4C)类似的路线实现。

获得二聚体7A和8A的路线(即其中R^YY为连接至在N10位置处单重保护的ABD前体的R”)在方案9中示出。

3C和4C的二聚体变体是通过方案3、4和5中讨论的策略生成的。3C和4C仅在一个N10位置处被保护以分别产生不对称ABD二聚体7A和8A。这是通过添加一当量的保护试剂(当Prot^N为Alloc时，其通常为氯甲酸烯丙基酯)，并且随后进行纯化以移除未保护或双重保护的产物来实现的。

式II的缀合物的合成

合成本发明第三方面的缀合物(具体地，式II的成分药物接头单元(D^L))的一个可能步骤涉及将接头与配体单元连接，从而将基团R^L(根据式I的化合物)转化为基团R^LL(根据式I’的化合物)。

可如先前所述制备缀合物。可如Doronina等,Nature Biotechnology,2003,21,778-784)中所述将抗体缀合至药物接头化合物。简单地说，在37℃下用三(羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)还原在pH 7.4的含有50mM硼酸钠的PBS中的抗体(4-5mg/mL)。还原链间二硫化物的反应的进展通过与5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的反应进行监测并且使其进行直到实现期望水平的巯基/mAb。然后将还原的抗体冷却至0℃并且每抗体巯基用1.5当量的马来酰亚胺药物-接头进行烷基化。1小时后，通过添加5当量N-乙酰半胱氨酸将反应淬灭。通过在PD-10柱上进行凝胶过滤来移除淬灭的药物-接头。然后通过0.22μm注射过滤器将ADC无菌过滤。可分别在280nm和329nm处进行光谱分析来确定蛋白质浓度，其中针对在280nm处的药物吸光度的贡献进行校正。可使用尺寸排阻色谱确定抗体聚集的程度，并且可使用RP-HPLC确定剩余的NAC淬灭的药物-接头的水平。

大环实施方案的合成

在本发明的第一、第二和第三方面的一些实施方案中，R⁷和R⁷'取代基可一起形成一个基团，所述基团为：(i)-O-(CH₂)_n-O-，其中n为7至16，或(ii)-O-(CH₂CH₂O)_m-，其中m为2至5，以得到大环ABD二聚体。

可采用各种策略引入R⁷-R⁷'接头，如以下方案10中所示。从d2D开始，其中R⁷和R⁷'均代表-OR，可通过添加在DCM中的BBr₃移除R基团以显露醇。二溴烷烃在碱中的取代反应(如1,7-二溴庚烷与K₂CO₃)通过两个C7位醇的攻击而得到大环产物。

从d2D开始的替代路线包括用n-溴烷-1-烯取代C7位醇。这提供了两个末端不饱和的烯基链，其可以容易地进行闭环复分解(RCM)。例如，可使用Grubs-II催化剂利用5-溴戊-1-烯和RCM实现取代。通过RCM实现的大环化通常是高收率的。

获得大环的优选路线从二聚体3A或酯前体开始，其中R⁷和R^7'均代表-OR。移除R基团并用二溴烷烃取代(使用与上文类似的条件)提供大环化合物。然后可根据方案3或4得到ABD。

所得产物可通过方案2或方案6反应以分别获得式IV和I的化合物。

获得此类大环产物所需的另外的转化细节可在文献中获得(Donnell,A.F.、Zhang,Y.、Stang,E.M.、Wei,D.D.、Tebben,A.J.、Perez,H.L.、Schroeder,G.M.、Pan,C.、Rao,C.、Borzilleri,R.M.、Vite,G.D.、Gangwar,S.,Macrocyclic pyrrolobenzodiazepinedimers as antibody-drug conjugate payloads,Bioorganic&Medicinal ChemistryLetters(2017),doi:https://doi.org/10.1016/j.bmcl.2017.10.028和WO 2016/209951)。

仲胺实施方案的合成

其中N10-C11基团为-NH-CH₂-的化合物(即仲胺)可通过以上程序的修改来合成。具体地，化合物3B*的还原胺化可以产生m2A或d1A的修饰型式，以用于另外的步骤：

化合物3B*可以由前体醇通过氧化合成，前体醇可通过与用于合成3B的那些类似的步骤获得。

药物缀合物的合成

可如先前所述制备缀合物。可如Doronina等,Nature Biotechnology,2003,21,778-784)中所述将抗体缀合至药物接头化合物。简单地说，在37℃下用三(羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)还原在pH 7.4的含有50mM硼酸钠的PBS中的抗体(4-5mg/mL)。还原链间二硫化物的反应的进展通过与5,5’-二硫代双(2-硝基苯甲酸)的反应进行监测并且使其进行直到实现期望水平的巯基/mAb。然后将还原的抗体冷却至0℃并且每抗体巯基用1.5当量的马来酰亚胺药物-接头进行烷基化。1小时后，通过添加5当量N-乙酰半胱氨酸将反应淬灭。通过在PD-10柱上进行凝胶过滤来移除淬灭的药物-接头。然后通过0.22μm注射过滤器将ADC无菌过滤。可分别在280nm和329nm处进行光谱分析来确定蛋白质浓度，其中针对在280nm处的药物吸光度的贡献进行校正。可使用尺寸排阻色谱确定抗体聚集的程度，并且可使用RP-HPLC确定剩余的NAC淬灭的药物-接头的水平。

附图说明

图1示出当通过对照或通过本发明的缀合物进行治疗时对肿瘤细胞系的生长的影响。

具体实施方式

另外优选项

以下优选项可应用于如上所述的本发明的所有方面，或者可涉及单个方面。优选项可以任何组合被组合在一起。

R^6’和R^9’分别选自与R⁶和R⁹相同的基团。在一些实施方案中，R^6’、R^7’、R^9’和Y’分别与R⁶、R⁷、R⁹和Y相同。

二聚体连接

在一些实施方案中，Y和Y’均为O。

在一些实施方案中，R”是不具有取代基的C_3-7亚烷基。在这些实施方案的一些中，R”是C₃、C₅或C₇亚烷基。具体地讲，R”可以是C₃或C₅亚烷基。

在其他实施方案中，R”是下式的基团：

其中r为1或2。

亚苯基可被亚吡啶基替代。

R⁶至R⁹

在一些实施方案中，R⁹是H。

在一些实施方案中，R⁶选自H、OH、OR、SH、NH₂、硝基和卤素，并且可选自H或卤素。在这些实施方案的一些中，R⁶是H。

在一些实施方案中，R⁷选自H、OH、OR、SH、SR、NH₂、NHR、NRR’以及卤素。在这些实施方案的一些中，R⁷选自H、OH和OR，其中R选自任选取代的C_1-7烷基、C_3-10杂环基以及C_5-10芳基。R可更优选地为C_1-4烷基，它可以是或可以不是被取代的。感兴趣的取代基为C_5-6芳基(例如苯基)。7位上特别优选的取代基为OMe和OCH₂Ph。其他特别感兴趣的取代基为二甲氨基(即–NMe₂)；-(OC₂H₄)_qOMe，其中q为0至2；含氮C₆杂环基，包括吗啉代、哌啶基和N-甲基-哌嗪基。

这些实施方案和优选项分别适用于R^9’、R^6’和R^7’。

在其他实施方案中，R⁷和R^7’一起形成为-O-(CH₂)_n-O-的基团，其中n为7至16。n可以是至少7、8、9、10或11。N可以是至多16、15、14或13。

在其他实施方案中，R⁷和R^7’一起形成为-O-(CH₂CH₂O)_m-的基团，其中m为2至5。m可以是至少2、3或4。m可以是至多5、4或3。

R¹⁰、R¹¹、R²⁰、R²¹(式IV)

在一些实施方案中，R¹⁰和R¹¹一起在它们所结合的N原子与C原子之间形成双键。在这些实施方案的一些中，R²⁰和R²¹一起在它们所结合的N原子与C原子之间形成双键。在这些实施方案的其他者中，R²⁰和R²¹均为H。

在一些实施方案中，R¹⁰为H并且R¹¹选自OH和OR^A，其中R^A为C_1-4烷基。在这些实施方案的一些中，R²⁰为H并且R²¹选自OH和OR^B，其中R^B为C_1-4烷基。在这些实施方案的其他者中，R²⁰和R²¹均为H。

在一些实施方案中，R¹⁰和R¹¹均为H。在这些实施方案的一些中，R²⁰和R²¹一起在它们所结合的N原子与C原子之间形成双键。在这些实施方案的其他者中，R²⁰为H并且R²¹选自OH和OR^B，其中R^B为C_1-4烷基。

在一些实施方案中，R^A为甲基。在一些实施方案中，R^B为甲基。

在一些实施方案中，R¹⁰和R¹¹对以及R²⁰和R²¹对中只有一对均为H。在其他实施方案中，R¹⁰和R¹¹对以及R²⁰和R²¹对中没有一对均为H。

在一些实施方案中，R¹⁰、R¹¹、R²⁰和R²¹全部为H。

N10’-C11’(式I和I*)

在一些实施方案中，R³⁰和R³¹一起在它们所结合的N原子与C原子之间形成双键。

在一些实施方案中，R³⁰为H并且R³¹选自OH和OR^B，其中R^B为C_1-4烷基。在这些实施方案的一些中，R^B为甲基。

在一些实施方案中，R³⁰为H并且R³¹为H。

在一些实施方案中，R³¹为OH或OR^B，其中R^B为C_1-4烷基并且R³⁰选自：

-C(＝O)-X₁-NHC(＝O)X₂-NH-代表二肽。二肽中的氨基酸可以是天然氨基酸的任何组合。二肽可以是组织蛋白酶介导的切割的作用位点。

在一个实施方案中，二肽-C(＝O)-X₁-NHC(＝O)X₂-NH-选自：

-Phe-Lys-、

-Val-Ala-、

-Val-Lys-、

-Ala-Lys-、

-Val-Cit-、

-Phe-Cit-、

-Leu-Cit-、

-Ile-Cit-、

-Phe-Arg-、

-Trp-Cit-，

其中Cit是瓜氨酸。

优选地，二肽-C(＝O)-X₁-NHC(＝O)X₂-NH-选自：

-Phe-Lys-、

-Val-Ala-、

-Val-Lys-、

-Ala-Lys-、

-Val-Cit-。

更优选地，二肽-C(＝O)-X₁-NHC(＝O)X₂-NH-是-Phe-Lys-或-Val-Ala-。

可使用其他二肽组合，包括Dubowchik等,Bioconjugate Chemistry,2002,13,855-869(其通过引用并入本文)所述的那些。

在一个实施方案中，在适当时，氨基酸侧链是衍生化的。例如，氨基酸侧链的氨基或羧基可以是衍生化的。

在一个实施方案中，侧链氨基酸如赖氨酸的氨基NH₂是选自由NHR和NRR’组成的组的衍生化形式。

在一个实施方案中，侧链氨基酸如天冬氨酸的羧基COOH是选自由COOR、CONH₂、CONHR和CONRR’组成的组的衍生化形式。

在一个实施方案中，在适当时，氨基酸侧链被化学保护。侧链保护基可以是如上文所论述的基团。本发明人已证实，受保护的氨基酸序列可被酶切割。例如，已证实包含Boc侧链保护的Lys残基的二肽序列可被组织蛋白酶切割。

氨基酸侧链的保护基是本领域熟知的，并且描述于Novabiochem目录中。另外的保护基策略阐述于Protective Groups in Organic Synthesis,Greene和Wuts中。

下文示出用于具有反应性侧链官能团的那些氨基酸的可能的侧链保护基：

Arg：Z、Mtr、Tos；

Asn：Trt、Xan；

Asp：Bzl、t-Bu；

Cys：Acm、Bzl、Bzl-OMe、Bzl-Me、Trt；

Glu：Bzl、t-Bu；

Gln：Trt、Xan；

His：Boc、Dnp、Tos、Trt；

Lys：Boc、Z-Cl、Fmoc、Z、Alloc；

Ser：Bzl、TBDMS、TBDPS；

Thr：Bz；

Trp：Boc；

Tyr：Bzl、Z、Z-Br。

在一个实施方案中，对侧链保护进行选择，使得正交于作为封端基团(在存在时)或其一部分提供的基团。因此，侧链保护基的移除不移除封端基团，或作为封端基团的一部分的任何保护基官能团。

在本发明的其他实施方案中，所选氨基酸是不具有反应性侧链官能团的那些。例如，氨基酸可选自：Ala、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Pro和Val。

在本发明中尤其优选的是，如果Q包括二肽，那么-C(＝O)-X₁-NHC(＝O)X₂-NH-是相同的二肽。优选基团的实例为：

其他优选的R³⁰基团包括：

R^11b(式I和I*)

在一些实施方案中，R^11b是OH。

在一些实施方案中，R^11b是OR^A，其中R^A是C_1-4烷基。在这些实施方案的一些中，R^A是甲基。

另外的式

在本发明的第一方面的一些实施方案中，其具有式IVa、IVb或IVc：

其中R^1a选自甲基和苄基；

R¹⁰、R¹¹、R²⁰和R²¹如上文所定义。

在本发明的第二方面的一些实施方案中，其具有式Ia、Ib或Ic：

其中R^1a选自甲基和苄基；

R³⁰、R³¹、R^L和R^11b如上文所定义。

这些实施方案和优选项也适用于本发明的第三方面。

接头(R^L)

在一些实施方案中，R^L具有式IIIa。

在一些实施方案中，R^LL具有式IIIa’。

G^L

G^L可选自

其中Ar代表C_5-6亚芳基，例如亚苯基。

在一些实施方案中，G^L选自G^L1-1和G^L1-2。在这些实施方案的一些中，G^L是G^L1-1。

G^LL

G^LL可选自：

其中Ar代表C_5-6亚芳基，例如亚苯基。

在一些实施方案中，G^LL选自G^LL1-1和G^LL1-2。在这些实施方案的一些中，G^LL是G^LL1-1。

X

X为：

其中a＝0至5，b＝0至16，c＝0或1，d＝0至5。

a可以是0、1、2、3、4或5。在一些实施方案中，a为0至3。在这些实施方案的一些中，a为0或1。在另外的实施方案中，a为0。

b可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16。在一些实施方案中，b为0至12。在这些实施方案的一些中，b为0至8，并且可以是0、2、4或8。

c可以是0或1。

d可以是0、1、2、3、4或5。在一些实施方案中，d为0至3。在这些实施方案的一些中，d为1或2。在另外的实施方案中，d为2。

在X的一些实施方案中，a为0，c为1且d为2，并且b可以是0至8。在这些实施方案的一些中，b为0、4或8。

Q

在一个实施方案中，Q为氨基酸残基。氨基酸可以是天然氨基酸或非天然氨基酸。

在一个实施方案中，Q选自：Phe、Lys、Val、Ala、Cit、Leu、Ile、Arg和Trp，其中Cit是瓜氨酸。

在一个实施方案中，Q包括二肽残基。二肽中的氨基酸可以是天然氨基酸和非天然氨基酸的任何组合。在一些实施方案中，二肽包含天然氨基酸。在接头是组织蛋白酶不稳定接头的情况下，二肽是组织蛋白酶介导的切割的作用位点。则二肽是组织蛋白酶的识别位点。

在一个实施方案中，Q选自：

^CO-Phe-Lys-^NH、

^CO-Val-Ala-^NH、

^CO-Val-Lys-^NH、

^CO-Ala-Lys-^NH、

^CO-Val-Cit-^NH、

^CO-Phe-Cit-^NH、

^CO-Leu-Cit-^NH、

^CO-Ile-Cit-^NH、

^CO-Phe-Arg-^NH，以及

^CO-Trp-Cit-^NH；

其中Cit是瓜氨酸。

优选地，Q选自：

^CO-Phe-Lys-^NH、

^CO-Val-Ala-^NH、

^CO-Val-Lys-^NH、

^CO-Ala-Lys-^NH、

^CO-Val-Cit-^NH。

最优选地，Q选自^CO-Phe-Lys-^NH、^CO-Val-Cit-^NH和^CO-Val-Ala-^NH。

感兴趣的其他二肽组合包括：

^CO-Gly-Gly-^NH、

^CO-Pro-Pro-^NH，以及

^CO-Val-Glu-^NH。

可使用其他二肽组合，包括Dubowchik等,Bioconjugate Chemistry,2002,13,855-869(其通过引用并入本文)所述的那些。

在一些实施方案中，Q^X是三肽残基。三肽中的氨基酸可以是天然氨基酸和非天然氨基酸的任何组合。在一些实施方案中，三肽包含天然氨基酸。当接头是组织蛋白酶不稳定接头时，三肽是组织蛋白酶介导的切割的作用位点。则三肽是组织蛋白酶的识别位点。特别感兴趣的三肽接头为：

^CO-Glu-Val-Ala-^NH

^CO-Glu-Val-Cit-^NH

^CO-αGlu-Val-Ala-^NH

^CO-αGlu-Val-Cit-^NH

在一个实施方案中，在适当时，氨基酸侧链被化学保护。侧链保护基可以是如下文所论述的基团。受保护的氨基酸序列可被酶切割。例如，包含Boc侧链保护的Lys残基的二肽序列可被组织蛋白酶切割。

氨基酸侧链的保护基团是本领域熟知的，并且描述于Novabiochem目录中并且如上所述。

在一些实施方案中，R^L具有式IIIb。

在一些实施方案中，R^LL具有式IIIb’。

R^L1和R^L2独立地选自H和甲基，或与它们所结合的碳原子一起形成亚环丙基或亚环丁基。

在一些实施方案中，R^L1和R^L2均为H。

在一些实施方案中，R^L1是H并且R^L2是甲基。

在一些实施方案中，R^L1和R^L2均为甲基。

在一些实施方案中，R^L1和R^L2与它们所结合的碳原子一起形成亚环丙基。

在一些实施方案中，R^L1和R^L2与它们所结合的碳原子一起形成亚环丁基。

在基团IIIb中，在一些实施方案中，e是0。在其他实施方案中，e是1且硝基可处于环的任何可用位置。在这些实施方案的一些中，它处于邻位。在这些实施方案的其他者中，它处于对位。

在一个特定实施方案中，本发明的第二方面包括式Id的化合物：

其中Q选自：

(a)-CH₂-；

(b)-C₃H₆-；以及

(c)

在一个特定实施方案中，本发明的第三方面，药物接头(D^L)具有式(Id’)：

其中Q选自：

(a)-CH₂-；

(b)-C₃H₆-；以及

(c)

在本发明的一些实施方案中，C11取代基可相对于相邻基团处于以下立体化学布置：

在其他实施方案中，C11取代基可相对于相邻基团处于以下立体化学布置：

实施例

一般信息

利用Merck Kieselgel 60F254硅胶进行手动快速色谱。从Fisher Scientific,U.K.购买萃取和色谱溶剂且不经进一步纯化即使用。所有化学品购自Aldrich,Lancaster或BDH。

使用Biotage Isolera 1^TM进行自动快速色谱，使用从88％己烷/EtOAc或99.9％DCM/MeOH开始的梯度洗脱，直到从柱上洗脱所有UV活性组分(在214nm和254nm下检测)。每当观察到UV活性材料的大量洗脱时，手动保持梯度。在铝板上利用荧光指示剂，使用MerckKieselgel 60F254硅胶，用薄层色谱(TLC)检查级分的纯度。除非另有说明，否则借助于UV光或碘蒸气来实现TLC的可视化。从VWR U.K.购买萃取和色谱溶剂且不经进一步纯化即使用。所有精细化学品购自Sigma-Aldrich或TCI Europe，除非另行指出。聚乙二醇化试剂通过Stratech UK从Quanta biodesign US获得。

LC/MS条件如下：

使用Waters Aquity H-class进行阳性模式电喷雾质谱。使用的流动相是溶剂A(具有0.1％甲酸的水)和溶剂B(具有0.1％甲酸的乙腈)。

LCMS 3min：初始组成为5％B，保持0.25min，然后经2min时间段从5％B增加至100％B。将组成在100％B下保持0.50min，然后在0.05分钟内回到5％B，并且保持0.05min。总梯度运行时间等于3min。流速0.8mL/min。在254nm下检测。柱：Waters Acquity

BEH Shield RP18 1.7μm 2.1x50mm，50℃，配备有Waters Acquity

BEH ShieldRP18VanGuard前置柱，130A，1.7μm，2.1mm x 5mm。

LCMS 15min：初始组成为5％B，保持1min，然后经9min时间段从5％B增加至100％B。将组成在100％B下保持2min，然后在0.10分钟内回到5％B，并且保持3min。总梯度运行时间等于15min。流速0.6mL/min。波长检测范围：190至800nm。烘箱温度：50℃。柱：ACE Excel2 C18-AR，2μ，3.0x100mm。

制备型HPLC：

反相超快速高效液相色谱(UFLC)在Shimazdzu

机器上使用

Gemini NX 5μC18柱(在50℃下)进行，所述柱尺寸：150x21.2mm。使用的洗脱液是溶剂A(具有0.1％甲酸的H₂O)和溶剂B(具有0.1％甲酸的CH₃CN)。所有UFLC实验均使用梯度条件进行：初始组成13％B经15分钟时段增加至60％B，然后经2分钟增加至100％B。组成在100％B处保持1分钟，然后在0.1分钟内回到13％B且在此处保持1.9分钟。梯度运行的总持续时间为20.0分钟。流速为20.0毫升/分钟并且在254nm和280nm下进行检测。

实施例1

a)1-((苄氧基)羰基)氮杂环丁烷-2-羧酸(2)

将(2S)-氮杂环丁烷-2-羧酸1(3g，29.674mmol)和碳酸氢钠(6.3g，75mmol)溶解于H₂O(25mL，1387.75mmol)中并且逐滴添加在THF(25mL，307mmol，100质量％)中的N-(苄氧基羰基)琥珀酰亚胺(8.5g，34mmol)。在室温下搅拌12h后，使两相分离。将水相用二乙醚(50mL)洗涤，在冰浴中冷却，并且接着用浓HCl酸化至pH＝2。用乙酸乙酯(2x50mL)萃取水层并且将合并的有机萃取物干燥(MgSO₄)，将过量溶剂真空蒸发以得到为澄清油状物的粗产物。粗材料不经纯化即用于下一步骤。LCMS 3min:ES⁺＝1.34min,m/z 258.2[M+Na]⁺。

b)(S)-氮杂环丁烷-1,2-二羧酸1-苄酯2-甲酯(3)

在干燥的圆底烧瓶中，将(2S)-1-苄氧基羰基氮杂环丁烷-2-羧酸2(6.98g，29.7mmol)溶解于MeOH(65mL)中并添加硫酸(3mL)。将混合物加热至回流并将其搅拌过夜。使混合物冷却至室温并且用Net₃淬灭(至pH＝7)，然后搅拌1h。真空除去甲醇。将残余物溶解于EtOAc中，用H₂O和盐水洗涤，然后用MgSO₄干燥并过滤。真空除去有机物，以得到为澄清油状物的粗产物3(8.004g，32.11mmol)。LCMS 3min:ES⁺＝1.53min,m/z无离子化

c)(S)-2-(羟甲基)氮杂环丁烷-1-羧酸苄酯(4)

将(2S)-氮杂环丁烷-1,2-二羧酸O1-苄酯O2-甲酯3(7.6g，30mMol)溶解于THF(75mL，922mmol)中，冷却至0℃并添加LiBH₄(1g，45mMol)。使混合物升温至室温，并且再搅拌1小时，此时反应完全。将反应混合物冷却至0℃，然后用H₂O和1M HCl淬灭。真空除去挥发物。将残余物溶解于EtOAc中并且用盐水(2x50mL)洗涤，用MgSO₄干燥，过滤，并且在减压下通过旋转蒸发除去溶剂。通过硅胶柱色谱(Hex/EtOAc，100％至1:2)纯化，得到为澄清油状物的产物4(4.076g，60％收率，经3步)。LCMS 3min:ES⁺＝1.36min,m/z 222.3[M+H]⁺。

d)(S)-2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-羧酸苄酯(5)

将(2S)-2-(羟甲基)氮杂环丁烷-1-羧酸苄酯4(4.0766g，18.425mmol)溶解于无水CH₂Cl₂(20mL，312.0mmol)中并且将混合物冷却至0℃，然后添加咪唑(2.508g，36.84mmol)和TBS-Cl(4.16g，27.6mmol)。使混合物升温至室温并且进行搅拌。LCMS显示在5min内反应完全。将有机物用饱和NH₄Cl、水、盐水洗涤，用MgSO₄干燥，过滤并真空除去挥发物。通过硅胶柱色谱(Hex/EtOAc，100％至9:1)纯化，得到产物5(6.90g，未完全干燥，定量)。LCMS 3min:ES⁺＝2.15min,m/z 336.9[M+H]⁺。

e)(S)-2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)氮杂环丁烷(6)

用EtOAc(5mL)逐滴处理碳载钯(10％)(100mg，0.93mMol)并且在帕尔加氢瓶中在室温下将所得浆液添加到5(6.9027g，20.57mmol)在EtOH(100mL)中的悬浮液中。使反应混合物经受20psi下的H₂气体，接着将瓶在真空下抽空(重复3次)。然后将瓶充气至38psi H₂，并振荡1小时。在此期间将压力降低至～30psi并且将瓶再次充气至40psi并且再振荡1小时。未观察到压力的进一步降低并且认为反应完全。这通过LC-MS证实。通过硅藻土过滤混合物并且将滤液真空蒸发以提供为棕色油状物的粗产物6(3.761g，90％收率)。LCMS 3min:ES⁺＝1.70min,m/z无离子化。

f)((S)-2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-基)(4-(6-(4-((2R)-2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)环丁烷-1-羰基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)己基)-5-甲氧基-2-硝基苯基)甲酮(8)

在0℃下将DCC(3.8g，18mmol)添加到7(3.9g，7.9mMol)和HOBt(2.3g，17mMol)在CH₂Cl₂(200mL)中的溶液中。移除冷浴并且使反应在室温下进行30min，此时在氩气、-10℃下快速添加6(3.65g，18mMol)和三乙胺(3.2mL，23mmol)在CH₂Cl₂(200mL)中的溶液。在室温下搅拌反应混合物并通过LC/MS监测。2min后，反应完全。通过在硅藻土上过滤移除固体并且将有机相用冷的0.1M HCl水溶液洗涤，直到测得pH为2。然后将有机相用水洗涤，接着用饱和碳酸氢钠水溶液、盐水洗涤，用MgSO₄干燥，过滤并减压浓缩(vacced down)。通过硅胶柱色谱(Hex/EtOAc/CH₂Cl₂，100％至1:2:1)纯化，得到产物8(5.9g，87％收率)。产物被一些单偶联产物污染(杂质在色谱时未分离)。LCMS 3min:ES⁺＝2.35min,m/z 862.2[M+H]⁺。

g)((戊烷-1,5-二基双(氧基))双(2-氨基-5-甲氧基-4,1-亚苯基))双(((S)-2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-基)甲酮)(9)

将锌(4.65g，71.1mmol)缓慢添加到8(2.45g，2.85mmol)在MeOH/H₂O/甲酸90:5:5混合物(66mL)中的溶液中。使用冰浴控制所造成的放热以将反应混合物的温度维持在40℃以下。在完成时，通过在硅藻土上过滤除去固体并且用水和盐水洗涤有机相，然后用MgSO₄干燥，过滤并且在减压下除去挥发物。粗材料9(2.28g，定量)原样用于下一步骤。LCMS3min:ES⁺＝2.32min,m/z 802.3[M+H]⁺。

h)((戊烷-1,5-二基双(氧基))双(6-((S)-2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-羰基)-4-甲氧基-3,1-亚苯基))二氨基甲酸二烯丙基酯(10)

在氩气气氛下，将化合物9(2.23g，2.78mmol)溶解于CH₂Cl₂(50mL)中。将混合物冷却至-78℃，然后添加吡啶(0.99mL，12.3mMol)和氯甲酸烯丙基酯(0.738mL，2.49mmol)。将反应物在-78℃下搅拌10min，然后使其升温至室温。15min后反应完全。将有机物用饱和CuSO₄、H₂O、盐水洗涤，然后用MgSO₄干燥，过滤并且在减压下除去挥发物。粗产物10(1.47g，1.52mMol，定量)原样用于下一步骤。LCMS 3min:ES⁺＝2.53min,m/z 970.3[M+H]⁺。

i)((戊烷-1,5-二基双(氧基))双(6-((S)-2-(羟甲基)氮杂环丁烷-1-羰基)-4-甲氧基-3,1-亚苯基))二氨基甲酸二烯丙基酯(11)

将化合物10(1.47g，1.52mMol)溶解于H₂O/THF/乙酸的3:1:1混合物(16mL)中并且将反应物搅拌过周末。将混合物用CH₂Cl₂萃取并用饱和NaHCO₃、H₂O和盐水洗涤，然后用MgSO₄干燥，过滤并且在减压下除去挥发物。通过硅胶柱色谱(Hex/EtOAc，100％至1:1)纯化，得到为澄清油状物的产物11(859mg，76.5％收率)。LCMS 3min:ES⁺＝1.75min,m/z 742.0[M+H]⁺。

j)二烯丙基7,7'-(戊烷-1,5-二基双(氧基))(10aS,10a'S)-双(10-羟基-6-甲氧基-4-氧代-1,2,10,10a-四氢氮杂环丁烯并[1,2-a]苯并[e][1,4]二氮杂

-9(4H)-羧酸酯)(12)

将化合物11(850mg，1.14mMol)溶解于CH₂Cl₂(60mL)中。随后添加1-羟基-2,2,6,6-四甲基-哌啶；1-甲基咪唑；2-(2-吡啶基)吡啶(0.7mL，1140mmol，0.2mMl/L)和三氟甲磺酸四乙腈铜(I)(55mg，0.145mMol)并且将混合物在35℃下在压进2个气球空气的情况下搅拌。将反应物搅拌过夜，然后在旋转蒸发器中抽真空至干燥。通过硅胶柱色谱(CHCl₃/MeOH，100％至95:5)纯化，得到产物12(346g，0.47mMol，41％收率)。LCMS 3min:ES⁺＝1.48min,m/z 737.9[M+H]⁺。

k)(10aS,10a'S)-7,7'-(戊烷-1,5-二基双(氧基))双(6-甲氧基-1,10a-二氢氮杂环丁烯并[1,2-a]苯并[e][1,4]二氮杂

-4(2H)-酮)(Ex1)

在氩气下，在烧瓶中将化合物12(335mg，0.45mmol)溶解于CH₂Cl₂(20mL)中。随后添加吡咯烷(650μL，7.8mMol)和Pd(PPh₃)₄(50mg，0.004mMol)，并且将混合物在室温下搅拌，直到反应完全。将有机物用饱和NH₄Cl、H₂O和盐水洗涤，然后用MgSO₄干燥，过滤并且在减压下除去挥发物。通过isolera色谱(CH₂Cl₂/(CH₂Cl₂+10％MeOH)92:7至10:90进行纯化。含有产物的两个级分被分离但纯度不足。将级分合并，并通过手动色谱再纯化，并且分离纯产物Ex1(146mg，0.27mMol，24％收率)。LCMS 3min:ES⁺＝1.32min,m/z 533.8[M+H]⁺。LCMS15min:ES⁺＝4.83min,m/z 533.9[M+H]⁺。

实施例2

a)((S)-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-基)(5-甲氧基-2-硝基-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基)甲酮(13)

在0℃下，将DCC(4.021g，19.49mmol)添加到5-甲氧基-2-硝基-4-三异丙基甲硅烷基氧基-苯甲酸13(6g，16.24mmol)和HOPO(1.984g，17.86mMol)在CH₂Cl₂(100mL)中的溶液中。移除冷浴并且使反应在室温下进行30min，此时在氩气、-10℃下，快速添加[(2S)-氮杂环丁烷-2-基]甲氧基-叔丁基-二甲基-硅烷6(3.761g，18.68mmol)和三乙胺(3.39mL，33.5mmol)在CH₂Cl₂(100mL)中的溶液。在室温下搅拌反应混合物并通过LC/MS监测。2min后，反应完全。通过在硅藻土上过滤移除固体并且将有机相用冷的0.1M HCl水溶液洗涤，直到测得pH为2。然后将有机相用水洗涤，接着用饱和碳酸氢钠水溶液、盐水洗涤，用MgSO₄干燥，过滤并减压浓缩。通过硅胶柱色谱(Hex/EtOAc，100％至1:1)纯化，得到产物14(8.6737g，96.63％收率)。LCMS 3min:ES⁺＝2.44min,m/z 554.2[M+H]⁺。

b)(S)-(2-氨基-5-甲氧基-4-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基)(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-基)甲酮(15)

将锌(10g，152.9mMol)缓慢添加到14(8.6737g，15.69mMol)在MeOH/H₂O/甲酸90:5:5混合物(200mL)中的溶液中。使用冰浴控制所造成的放热以将反应混合物的温度维持在40℃以下。在完成时，通过在硅藻土上过滤除去固体并且用水和盐水洗涤有机相，然后用MgSO₄干燥，过滤并且在减压下除去挥发物。粗材料15(7.6343g，14.6mMol，93.05％收率)原样用于下一步骤。LCMS 3min:ES⁺＝2.42min,m/z 524.4[M+H]⁺。

c)(S)-(2-(2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-羰基)-4-甲氧基-5-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基)氨基甲酸烯丙基酯(16)

在氩气气氛下，将化合物15(7.6343g，14.60mMol)溶解于CH₂Cl₂(100mL)中。将混合物冷却至-78℃，然后添加吡啶(2.6mL，32mMol)和氯甲酸烯丙基酯(1.7mL，16mMol)。将反应物在-78℃下搅拌10min，然后使其升温至室温。15min后反应完全。将有机物用饱和CuSO₄、H₂O、盐水洗涤，然后用MgSO₄干燥，过滤并且在减压下除去挥发物。粗产物16(8.9129g，14.69mMol，定量)原样用于下一步骤。LCMS 3min:ES⁺＝2.53min,m/z 608.2[M+H]⁺。

d)(S)-(2-(2-(羟甲基)氮杂环丁烷-1-羰基)-4-甲氧基-5-((三异丙基甲硅烷基)氧基)苯基)氨基甲酸烯丙基酯(17)

将化合物16(8.9129g，14.69mMol)溶解于H₂O/THF/乙酸的3:1:1混合物(80mL)中并且将反应物搅拌过周末。将混合物用CH₂Cl₂萃取并用饱和NaHCO₃、H₂O和盐水洗涤，然后用MgSO₄干燥，过滤并且在减压下除去挥发物。通过硅胶柱色谱(Hex/EtOAc，100％至1:1)纯化，得到为澄清油状物的产物17(5.5572g，76.80％收率)。LCMS3min:ES⁺＝1.97min,m/z494.0[M+H]⁺。

e)(10aS)-10-羟基-6-甲氧基-4-氧代-7-((三异丙基甲硅烷基)氧基)-1,2,10,10a-四氢氮杂环丁烯并[1,2-a]苯并[e][1,4]二氮杂

-9(4H)-羧酸烯丙基酯(18)。

将化合物17(5.5572g，11.28mMol)溶解于CH₂Cl₂(40mL)中。随后添加1-羟基-2,2,6,6-四甲基-哌啶；1-甲基咪唑；2-(2-吡啶基)吡啶(6mL，1mMol)和三氟甲磺酸四乙腈铜(I)(425mg，1.1279mMol)并且将混合物在35℃下在压进2个气球空气的情况下搅拌。将反应物搅拌过夜，然后在旋转蒸发器中抽真空至干燥。通过硅胶柱色谱(CHCl₃/MeOH，100％至97:3)纯化，得到为浅橙色泡沫的产物18(5.3835g，10.97mMol，97.27％收率)。LCMS 3min:ES⁺＝2.00min,m/z 491.8[M+H]⁺。

f)(10aS)-10-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-6-甲氧基-4-氧代-7-((三异丙基甲硅烷基)氧基)-1,2,10,10a-四氢氮杂环丁烯并[1,2-a]苯并[e][1,4]二氮杂

-9(4H)-羧酸烯丙基酯(19)

将化合物18(5.3835g，10.97mMol)溶解于CH₂Cl₂(50mL)中并且将混合物冷却至-78℃。随后添加2,6-二甲基吡啶(2.55mL，21.9mMol)和TBS-OTf(3.78mL，16.4mMol)。将混合物放置10min，然后移除冷却浴并使其升温至室温。将有机物用H₂O和盐水洗涤，然后用MgSO₄干燥，过滤并且在减压下除去挥发物。通过硅胶柱色谱(CHCl₃/MeOH，100％至95:5)纯化，得到产物19(6.8532g，定量)。LCMS 3min:ES⁺＝2.47min,m/z 606.0[M+H]⁺。

g)(10aS)-10-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-7-羟基-6-甲氧基-4-氧代-1,2,10,10a-四氢氮杂环丁烯并[1,2-a]苯并[e][1,4]二氮杂

-9(4H)-羧酸烯丙基酯(20)

将化合物19(6.8g，14mMol)溶解于DMF(10mL)中。添加LiOAc.2H₂O(1.4g，14mmMl)和H₂O(3mL或尽可能多)。当溶液再次变得澄清时，添加几滴水。保持重复该过程，直到反应完全。将有机物用CHCl₃稀释并用柠檬酸溶液(pH＝3)、H₂O和盐水洗涤，然后用MgSO₄干燥，过滤并在减压下除去挥发物。通过硅胶柱色谱(CHCl₃/MeOH，100％至95:5)纯化，得到为黄色油状物的产物20(5.2885g，11.79mMol，85％收率)。LCMS 3min:ES⁺＝1.86min,m/z449.8[M+H]⁺。

h)二烯丙基7,7'-(丙烷-1,3-二基双(氧基))(10aS,10a'S)-双(10-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-6-甲氧基-4-氧代-1,2,10,10a-四氢氮杂环丁烯并[1,2-a]苯并[e][1,4]二氮杂

-9(4H)-羧酸酯)(21)

在氩气气氛下，将1,3-二溴丙烷(204.9mg，1.015mMol)和化合物20(1g，2.030mMol)溶解于CH₂Cl₂(50mL)中。随后添加K₂CO₃(280mg，2.026mMol)和TBAI(149mg，0.2mMol)并且在40℃下搅拌混合物，直到反应完全。将混合物搅拌过夜，但是反应不向完全进行而是形成杂质。将有机物用H₂O和盐水洗涤，然后用MgSO₄干燥，过滤并且在减压下除去挥发物。通过硅胶柱色谱(CHCl₃/MeOH，100％至97:3)纯化，得到产物21(482mg，0.471mMol，46.50％收率)，其被不可分离的杂质污染(室温＝9.95min，在LCMS上，15min)。LCMS 15min:ES⁺＝9.86min,m/z 938.3[M+H]⁺。

i)(10aS,10a'S)-7,7'-(丙烷-1,3-二基双(氧基))双(6-甲氧基-1,10a-二氢氮杂环丁烯并[1,2-a]苯并[e][1,4]二氮杂

-4(2H)-酮)(Ex2A)

在氩气下，在烧瓶中将化合物21(482mg，0.5143mMol)溶解于CH₂Cl₂(20mL)中。随后添加吡咯烷(786μL，9.44mMol)和Pd(PPh₃)₄(54mg，0.046mMol)并且在室温下搅拌混合物，直到反应完全。将有机物用饱和NH₄Cl、H₂O和盐水洗涤，然后用MgSO₄干燥，过滤并且在减压下除去挥发物。通过isolera色谱(CH₂Cl₂/(CH₂Cl₂+10％MeOH)98:2至30:70进行纯化。含有产物的两个级分被分离但纯度不足。将级分合并，并通过isolera色谱再纯化(相同溶剂体系)，并且分离纯产物Ex2A(35.1mg，0.135mMol，13.5％收率)。LCMS 3min:ES⁺＝1.23min,m/z 505.8[M+H]⁺。

j)二烯丙基7,7'-((1,3-亚苯基双(亚甲基))双(氧基))(10aS,10a'S)-双(10-((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)-6-甲氧基-4-氧代-1,2,10,10a-四氢氮杂环丁烯并[1,2-a]苯并[e][1,4]二氮杂

-9(4H)-羧酸酯)(22)

在氩气气氛下，将1,3-双(溴甲基)苯(267.9mg，1.011mMol)和化合物20(1g，2.030mMol)溶解于DMF(5mL)中。随后添加K₂CO₃(280mg，2.026mMol)和TBAI(749mg，2.027mMol)并且在40℃下搅拌混合物，直到反应完全。将混合物搅拌过夜，但是反应未达到完全并形成杂质。将混合物用CH₂Cl₂稀释并用H₂O和盐水洗涤，然后用MgSO₄干燥，过滤并在减压下除去挥发物。通过硅胶柱色谱(CHCl₃/MeOH，100％至97:3)纯化，得到产物22(467mg，0.43mMol，42.47％收率)+398mg混合级分。LCMS 3min:ES⁺＝2.30min,m/z1000.5[M+H]⁺。

k)(10aS,10a'S)-7,7'-((1,3-亚苯基双(亚甲基))双(氧基))双(6-甲氧基-1,10a-二氢氮杂环丁烯并[1,2-a]苯并[e][1,4]二氮杂

-4(2H)-酮)(Ex2B)

在氩气下，在烧瓶中将化合物22(455mg，0.419mMol)溶解于CH₂Cl₂(20mL)中。随后添加吡咯烷(600μL，7.2mMol)和Pd(PPh₃)₄(48mg，0.041mMol)并且在室温下搅拌混合物，直到反应完全。将有机物用饱和NH₄Cl、H₂O和盐水洗涤，然后用MgSO₄干燥，过滤并且在减压下除去挥发物。通过isolera色谱(CH₂Cl₂/(CH₂Cl₂+10％MeOH)98:2至30:70进行纯化。含有产物的两个级分被分离但纯度不足。将级分合并，并通过isolera色谱再纯化(相同溶剂体系)，并且分离为白色固体的纯产物Ex2B(214.5mg，0.378mMol，90.5％收率)。LCMS 3min:ES⁺＝1.38min,m/z 567.8[M+H]⁺。

实施例3

a)(5-((5-(5-氨基-4-((S)-2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-羰基)-2-甲氧基苯氧基)戊基)氧基)-2-((S)-2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-羰基)-4-甲氧基苯基)氨基甲酸烯丙基酯(23)

在氩气气氛下，将化合物9(1.192g，1.488mMol)溶解于CH₂Cl₂(250mL)中。将混合物冷却至-78℃，然后添加吡啶(0.241mL，2.98mMol)和氯甲酸烯丙基酯(0.158mL，1.484mMol)。将反应物在-78℃下搅拌10min，然后使其升温至室温。15min后反应完全。将有机物用饱和CuSO₄、H₂O、盐水洗涤，然后用MgSO₄干燥，过滤并且在减压下除去挥发物。通过硅胶柱色谱(CHCl₃/MeOH)纯化，得到单和双-alloc的混合物，将其用第二柱(Hex/EtOAc)进一步纯化以得到纯产物23(499.2g，可能的50％中的37.9％收率(37.9％yield out of 50％possible))。LCMS 3min:ES⁺＝2.41min,m/z 886.6[M+H]⁺。

b)(5-((5-(5-((((4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基)氧基)羰基)氨基)-4-((S)-2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-羰基)-2-甲氧基苯氧基)戊基)氧基)-2-((S)-2-(((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)甲基)氮杂环丁烷-1-羰基)-4-甲氧基苯基)氨基甲酸烯丙基酯(24)

在0℃下，将三光气(68.8mg，0.232mMol)一次性添加到23(620mg，0.7mMol)和TEA(203μL，1.46mMol)在CH₂Cl₂(50mL)中的混合物中。移除冰浴，并且在15min后，一次性添加为细粉末的Alloc-Val-Ala-PAB-OH(275mg，0.728mMol)，然后添加更多的TEA(73μL，0.524mMol,)和二月桂酸二丁基锡(39.6μL，0.07mMol)。将反应混合物在37℃下搅拌4h，然后在室温下搅拌过夜。将有机物用H₂O、饱和NH₄Cl和盐水洗涤，然后用MgSO₄干燥，过滤并且在减压下除去挥发物。通过硅胶柱色谱(CHCl₃/MeOH)纯化，以得到纯产物24(414g，45.9％收率)。LCMS 3min:ES⁺＝2.43min,m/z 1289.5[M+H]⁺。

c)(5-((5-(5-((((4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基)氧基)羰基)氨基)-4-((S)-2-(羟甲基)氮杂环丁烷-1-羰基)-2-甲氧基苯氧基)戊基)氧基)-2-((S)-2-(羟甲基)氮杂环丁烷-1-羰基)-4-甲氧基苯基)氨基甲酸烯丙基酯(25)

将化合物24(414mg，0.32mMol)溶解于H₂O/THF/乙酸的3:1:1混合物(10mL)中并且将反应物搅拌过周末。将混合物用CH₂Cl₂萃取并用饱和NaHCO₃、H₂O和盐水洗涤，然后用MgSO₄干燥，过滤并且在减压下除去挥发物。通过硅胶柱色谱(CHCl₃/MeOH，100％至94:6)纯化，得到产物25(326mg，95.7％收率)。LCMS 3min:ES⁺＝1.80min,m/z 1060.1[M+H]⁺。

d)(10aS)-7-((5-(((10S,10aS)-9-(((4-((S)-2-((S)-2-(((烯丙氧基)羰基)氨基)-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基)氧基)羰基)-10-羟基-6-甲氧基-4-氧代-1,2,4,9,10,10a-六氢氮杂环丁烯并[1,2-a]苯并[e][1,4]二氮杂

-7-基)氧基)戊基)氧基)-10-羟基-6-甲氧基-4-氧代-1,2,10,10a-四氢氮杂环丁烯并[1,2-a]苯并[e][1,4]二氮杂

-9(4H)-羧酸烯丙基酯(26)

将化合物25(202.4mg，0.3mMol)溶解于CH₂Cl₂(20mL)中。随后添加1-羟基-2,2,6,6-四甲基-哌啶；1-甲基咪唑；2-(2-吡啶基)吡啶(0.4mL，0.03mMol)和三氟甲磺酸四乙腈铜(I)(11mg，0.03mMol)并且将混合物在35℃下在压进2个气球空气的情况下搅拌。将反应物搅拌过夜，然后在旋转蒸发器中抽真空至干燥。通过硅胶柱色谱(CHCl₃/MeOH，100％至97:3)纯化，得到产物26(313mg，0.19mMol，64.5％收率)。LCMS 3min:ES⁺＝1.59min,m/z1057.1[M+H]⁺。

e)4-((S)-2-((S)-2-氨基-3-甲基丁酰氨基)丙酰氨基)苄基(10S,10aS)-10-羟基-6-甲氧基-7-((5-(((S)-6-甲氧基-4-氧代-1,2,4,10a-四氢氮杂环丁烯并[1,2-a]苯并[e][1,4]二氮杂

-7-基)氧基)戊基)氧基)-4-氧代-1,2,10,10a-四氢氮杂环丁烯并[1,2-a]苯并[e][1,4]二氮杂

-9(4H)-羧酸酯)(27)

在氩气下，在烧瓶中将化合物26(195mg，0.184mMol)溶解于CH₂Cl₂(10mL)中。随后添加吡咯烷(262μL，3.15mMol)和Pd(PPh₃)₄(21mg，0.018mMol)并且在室温下搅拌混合物，直到反应完全。将有机物用饱和NH₄Cl、H₂O和盐水洗涤，然后用MgSO₄干燥，过滤并且在减压下除去挥发物。通过isolera色谱(CH₂Cl₂/(CH₂Cl₂+10％MeOH)98:2至30:70进行纯化，得到产物27(141mg，0.16mMol，87.7％收率)。LCMS 3min:ES⁺＝1.23min,m/z 870.9[M+H]⁺。

f)(10S,10aS)-10-羟基-6-甲氧基-7-((5-(((S)-6-甲氧基-4-氧代-1,2,4,10a-四氢氮杂环丁烯并[1,2-a]苯并[e][1,4]二氮杂

-7-基)氧基)戊基)氧基)-4-氧代-1,2,10,10a-四氢氮杂环丁烯并[1,2-a]苯并[e][1,4]二氮杂

-9(4H)-羧酸4-((2S,5S)-37-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)-5-异丙基-2-甲基-4,7,35-三氧代-10,13,16,19,22,25,28,31-八氧杂-3,6,34-三氮杂三十七烷酰氨基)苄基酯(Ex3)

反应在手套箱中进行。在氩气、室温下，在烧瓶中将化合物27(70mg，0.080mMol)溶解于CH₂Cl₂(10mL)中。添加Mal-dPEG₈-OH(50mg，0.084mMol)和EDCI.HCl(15.4mg，0.080mMol)，并搅拌混合物直到反应完全。将有机物用H₂O和盐水洗涤，然后用MgSO₄干燥，过滤并且在减压下除去挥发物。通过isolera色谱(CH₂Cl₂/(CH₂Cl₂+10％MeOH)98:2至30:70进行纯化，得到不纯的产物。通过反相isolera进一步纯化，得到纯Ex3(4mg，0.027mMol，3.4％收率)外加一些不干净的级分(22mg)。LCMS 3min:ES⁺＝1.51min,m/z 1445.6[M+H]⁺。

实施例4

ConjA(Her2-Ex3)

将三(2-羧乙基)膦(TCEP)在磷酸盐缓冲盐水pH 7.4(PBS)中的10mM溶液添加(50摩尔当量/抗体，7.6微摩尔，762.7μL)到曲妥珠单抗(22.9mg，153纳摩尔)在含有30mM组氨酸/组氨酸HCl、30mM精氨酸pH 6.8和1mM乙二胺四乙酸(EDTA)的还原缓冲液中的最终抗体浓度为1.1mg/mL的20.8mL溶液中。在温和(60rpm)振荡下，在轨道振荡器中，使还原混合物在37℃下反应2小时(或直到通过UHPLC观察到完全还原)。通过自旋过滤器离心将还原的抗体溶液缓冲液交换(以移除所有过量还原剂)到含有30mM组氨酸/组氨酸HCl、30mM精氨酸和1mM EDTA的缀合缓冲液中，实现1.1mg/mL的最终抗体浓度。将Ex3以DMSO溶液(12.5摩尔当量/抗体，1.9微摩尔，在2.1mL DMSO中)的形式添加到18.6mL的这一还原的抗体溶液(20.5mg，136纳摩尔)中，实现10％(v/v)最终DMSO浓度。将溶液在室温下混合17小时，然后通过添加N-乙酰基半胱氨酸(8.5微摩尔，68μL，100mM)淬灭缀合，然后使用15mL AmiconUltracell 30KDa MWCO自旋过滤器通过自旋过滤器离心进行纯化、无菌过滤并分析。

通过Shimadzu Prominence系统，使用Thermo Scientific MAbPac 50mm x 2.1mm柱(用水和乙腈的梯度进行洗脱)对ConjA的还原样品在214nm和330nm处(SG3931特异性)进行的UHPLC分析表明，未缀合轻链、连接至单分子SG3931的轻链、未缀合重链以及连接至最多三分子SG3931的重链的混合物与7.32分子SG3931/抗体的药物/抗体比率(DAR)一致。

在Shimadzu Prominence系统上，使用Tosoh Bioscience TSKgel SuperSW mAbHTP 4μm 4.6x150mm柱(具有4μm 3.0x20mm保护柱)，用含有200mM磷酸钾pH 6.95、250mM氯化钾和10％异丙醇(v/v)的0.3mL/分钟无菌过滤的SEC缓冲液洗脱，在280nm处对ConjA样品的UHPLC分析显示出94.2％的单体纯度。UHPLC SEC分析给出最终ConjA浓度为在5.8mL中的1.29mg/mL，获得的ConjA质量为7.5mg(37％收率)。

实施例5-细胞毒性测定

所述分子的效力通过体外细胞毒性测定在癌细胞系NCI-N87中测量。

将固体材料在DMSO中溶解成2mM储备液，在DMSO中以1:10比率由所述储备液制备八份连续稀释液，并储存于-20℃直到使用。

用D-PBS洗涤贴壁的NCI-N87细胞并用胰蛋白酶-EDTA使其剥离，然后使用自动细胞计数器(LUNA-II^TM)通过台盼蓝拒染测定一式两份确定细胞密度和活力。将细胞悬浮液在生长培养基(具有Glutamax+10％(v/v)HyClone^TM胎牛血清的RPMI 1640)中稀释至1x10⁵细胞/ml并涡旋，然后2mL每孔分配到无菌的3mL聚丙烯板中。然后将弹头稀释液以10μl/孔分配到适当的孔中并且通过重复吸移进行混合。对于对照孔，将10μl的DMSO分配到2mL细胞悬浮液中并彻底混合。接着将100μl的各样品等分到无菌平坦96孔微板的2个重复孔中并且在37℃CO₂充气(5％)的培养箱中温育。在温育时间段(7天)结束时，通过CellTiter96Aqueous One(MTS)测定测量细胞活力，其以20μl/孔分配并在37℃、5％CO₂下温育4小时。然后在EnVision Multi-label读板器(Perkin Elmer)上，使用490nm处的吸光度读板。

细胞存活百分比(％)由每个样品的2个重复孔的平均吸光度计算，与仅用DMSO处理的两个对照孔中的平均吸光度(100％)相比较。通过在GraphPad Prism软件(San Diego,CA)上，使用非线性曲线拟合算法，将每个数据集拟合至具有可变斜率的剂量-反应曲线来确定IC₅₀。

进行此报道中的所有实验并且在三个独立实验中进行测试。数据报道为三个独立重复的平均值。

	IC<sub>50</sub>(nM)
		Ex2A	70.11
Ex1	2.202
		Ex2B	4.035

实施例6-ADC细胞毒性测定

来自亚汇合(80-90％汇合)T75烧瓶的细胞的浓度和活力通过台盼蓝染色进行测量并且使用LUNA-II^TM自动细胞计算器进行计数。将细胞稀释至2x10⁵/ml，分配(50μl/孔)到96孔平底板中。

通过将过滤灭菌的ADC稀释到细胞培养基中来制备测试抗体药物缀合物(ADC)(20μg/ml)的储备溶液(1ml)。通过连续转移100μl到900μl的细胞培养基中，在24孔板中进行储备ADC的一组8x10倍稀释。将ADC稀释液分配(50μl/孔)到96孔板的4个重复孔中，其含有先前接种的50μl细胞悬浮液。对照孔接收50μl细胞培养基。将含有细胞和ADC的96孔板在37C下在CO₂充气的培养箱中温育，持续暴露时间。

在温育期结束时，通过MTS测定来测量细胞活力。将MTS(Promega)分配(20μl每孔)到每个孔中并且在CO₂充气的培养箱中在37℃下温育4小时。测量在490nm处的孔吸光度。由与4个对照未处理孔中的平均吸光度(100％)相比的4个ADC处理孔中的平均吸光度计算细胞存活百分比。使用GraphPad Prism，使用非线性曲线拟合算法由剂量-反应数据确定IC₅₀：具有可变斜率的西格摩德剂量-反应曲线。

ADC温育时间为MDA-MB-468的4天和NCI-N87的7天。在具有Glutamax+10％(v/v)HyClone^TM胎牛血清的RPMI 1640中培养MDA-MB-468和NCI-N87。

通过使用GraphPad Prism软件v6.05(GraphPad,San Diego,CA)将数据拟合至具有可变斜率的S型剂量-反应曲线来确定EC₅₀值。

实施例7-异种移植测试

NCI-N87异种移植小鼠

在研究的第1天，雌性严重联合免疫缺陷小鼠(Fox Chase

C.B-17/Icr-Prkdcscid，Charles River)为八周龄，具有16.5克至21.6克的体重(BW)范围。给动物不限量喂饲水(反渗透，1ppm Cl)，以及由18.0％粗蛋白、5.0％粗脂肪以及5.0％粗纤维组成的NIH 31Modified and Irradiated Lab

采用12小时光照循环，在20-22℃(68–72°F)和40–60％湿度下，将小鼠饲养在静态微型隔离器中的经照射的Enricho’cobs^TMLaboratory Animal Bedding上。CR Discovery Services特别按照实验室动物护理和使用指南(Guide for Care and Use of Laboratory Animals)中有关约束、饲养、手术步骤、饲料和流体规章以及兽医护理的建议进行。CR Discovery Services上的动物护理和使用程序为国际实验动物护理评估和认可管理委员会(Association for Assessment andAccreditation of Laboratory Animal Care International)(AAALAC)所认可，这确保符合实验动物的护理和使用的公认标准。

肿瘤细胞培养

在补充有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、100单位/mL青霉素G钠、100μg/mL硫酸链霉素以及25μg/mL庆大霉素的RPMI-1640培养基中培养人NCI-N87胃癌淋巴瘤细胞。使细胞在37℃下，在5％CO₂和95％空气的气氛中在湿润培养箱中的组织培养烧瓶中生长。

体内移植和肿瘤生长

将用于移植的NCI-N87细胞在对数生长期期间收获并且重悬于含有50％Matrigel^TM(BD Biosciences)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。在肿瘤移植的当天，将每只测试小鼠在右侧腹部皮下注射1x10⁷个细胞(0.1mL细胞悬浮液)并且当平均尺寸接近100至150mm³的目标范围时监测肿瘤生长。十四天后，指定为研究的第1天，根据所计算的肿瘤尺寸将小鼠分选到组中，每组由具有在108至144mm³的范围内的单独肿瘤体积的十只动物组成并且组平均肿瘤体积为115mm³。

使用卡尺在两个维度上测量肿瘤，并且使用下式计算体积：

其中w＝肿瘤的宽度并且l＝肿瘤的长度，单位为mm。假设1mg等于1mm3的肿瘤体积，可估计肿瘤重量。

治疗

第1天，在具有建立的皮下NCI-N87肿瘤(108–144mm³)的10只小鼠的组(n＝10)中开始治疗。ConjA(4mg/kg)在第1天静脉内施用一次(qd x 1)。媒介物治疗组用作功效分析的对照组。每周两次测量肿瘤，直到在第79天研究结束。每只小鼠在其肿瘤达到800mm³的终点体积时或在最后一天(以先到者为准)被实施安乐死。计算每只小鼠的终点时间(time toendpoint，TTE)。

结果在图1中示出，其示出归一化的肿瘤生长的变化(■–对照；◆-ConjA)。

终点和肿瘤生长延迟(TGD)分析

使用卡尺每周两次测量肿瘤，并且当其肿瘤达到800mm³的终点体积时或在研究结束时(第79天)(以先到者为准)对每只动物实施安乐死。将由于达到肿瘤体积终点而退出研究的动物记录为由于肿瘤进展(TP)而被实施安乐死，并记录安乐死的日期。通过以下公式计算每只小鼠用于分析的终点时间(TTE)：

其中TTE以天表示，终点体积以mm³表示，b为截距，并且m为通过对数转化的肿瘤生长数据集的线性回归获得的直线斜率。数据集由超出分析中所用的终点体积的第一观察值和即将达到此终点体积之前的三个连续观察值组成。计算出的TTE通常不到TP日期，即动物因肿瘤尺寸而被实施安乐死的这天。为肿瘤未达到终点体积的动物分配等于研究最后一天(第79天)的TTE值。在对数转化的计算出的TTE不到达到终点之前的这天或超出达到肿瘤体积终点的这天的情况下，进行线性内插以估算TTE。由于意外(NTRa)或由于未知原因(NTRu)被分类为死于NTR(非治疗相关)原因的任何动物从TTE计算(和所有进一步分析)中排除。对分类为TR(治疗相关)死亡或NTRm(由转移造成的非治疗相关死亡)的动物分配等于死亡这天的TTE值。由肿瘤生长延迟(TGD)评估治疗结果，将TGD定义为治疗组相比于对照组的中值终点时间(TTE)的增加：

TGD＝T–C，

以天表示，或表示为对照组的中值TTE的百分比：

其中：

T＝治疗组的中值TTE，并且

C＝指定对照组的中值TTE。

肿瘤生长抑制

肿瘤生长抑制(TGI)分析评价治疗小鼠和对照小鼠的中值肿瘤体积(MTV)的差异。对于此研究，用于确定TGI的终点为第19天，其为所有可评价的对照小鼠保留在研究中的最后一天。确定每组的MTV(n)，即TGI分析当天n只动物的中值肿瘤体积。肿瘤生长抑制百分比(％TGI)定义为指定对照组的MTV与药物治疗组的MTV之间的差，表示为对照组的MTV的百分比。

用于TGI分析的数据集包括组中的所有动物，在TGI分析这天之前死于治疗相关(TR)或非治疗相关(NTR)原因的那些动物除外。

MTV和消退反应的标准

可由在最后一天保留在研究中的动物的肿瘤体积确定治疗功效。MTV(n)定义为肿瘤尚未达到终点体积的剩余数量的动物(n)在研究最后一天的中值肿瘤体积。也可由在研究过程中观察到的消退反应的发生率和幅度确定治疗功效。治疗可导致动物肿瘤的部分消退(PR)或完全消退(CR)。在PR反应中，对于研究过程期间的连续三次测量，肿瘤体积为其第1天体积的50％或更小，并且这三次测量中的一个或多个等于或大于13.5mm³。在CR反应中，对于研究过程期间的连续三次测量，肿瘤体积小于13.5mm³。在研究期间仅可针对PR或CR事件对动物评分一次，并且在满足PR和CR两种标准的情况下，仅评分为CR。在研究终止时具有CR反应的动物另外被分类为无肿瘤存活者(TFS)。针对消退反应对动物进行监测。

毒性

在第1-5天每天对动物称重，接着每周两次称重，直到研究完成。频繁观察小鼠的任何不良的治疗相关(TR)副作用的明显征象，并且在观察到时记录临床征象。根据方案监测各个体重，并且对一次测量体重减轻超过30％或三次连续测量超过25％的任何动物实施安乐死，作为TR死亡。还根据CR Discovery Services方案监测组平均体重减轻。可接受毒性定义为在研究期间组平均体重(BW)减轻小于20％并且不超过10％TR死亡。在任何组的平均体重减轻超过可接受极限时，暂停给药。如果组平均体重恢复至可接受水平，则将给药修改为较低水平和/或降低的频率，接着重新开始。如果临床征象和/或尸体剖检证明死亡归因于治疗副作用，则将其分类为TR。在给药期间或在最后一次剂量的14天内因未知原因造成的死亡也被指定为TR分类。如果没有证据表明死亡与治疗副作用相关，则将所述死亡分类为非治疗相关(NTR)。NTR死亡还归类如下：NTRa描述由意外或人为失误造成的死亡；据认为由肿瘤播散(通过侵犯)和/或转移(基于尸体剖检结果)造成的死亡被指定为NTRm；NTRu描述未知原因的死亡，其缺乏死亡与转移、肿瘤进展、意外或人为失误相关的可获得证据。应当指出的是，被分类为NTRu的死亡中不可排除治疗副作用。

统计和图形分析

使用用于Windows的GraphPad Prism 8.0进行所有统计分析和图形演示。统计分析中不包括所经历的毒性超过可接受极限(>20％组平均体重减轻或大于10％治疗相关死亡)或具有少于五个可评价观察值的研究组。采用对数秩检验评估两组的总体生存情况(survival experience)之间差异的显著性。对数秩检验分析组中所有动物的各个TTE，由于NTR死亡退出研究的那些除外。使用Mann-Whitney U检验完成对照组与治疗组的第19天中值肿瘤体积(MTV)之间差异的统计分析。对于统计分析，以显著性水平P＝0.05进行双尾检验。Prism将检验结果总结为不显著(ns)，P>0.05；显著(符号为“*”)，0.01<P≤0.05；非常显著(“**”)，0.001<P≤0.01；以及极显著(“***”)，P≤0.001。由于统计显著性的检验不提供组间差异幅度的估计，因此在此报道的上下文中将所有显著性水平描述为显著或不显著。

		n	中值TTE	T-C	％TGD	MTV(n)，第79天
							媒介物	-	10	24.8	--	-	466(10)
ConjA	4mg/kg	10	79.0	54.2	219	32(9)

	PR	CR	TFS	BW Nadir	TR	NTRm	NTR
								媒介物	0	0	0	-2.0(2)	0	0	0
ConjA	6	4	0	-1.9(2)	0	0	0

用ConjA治疗的动物的第19天MTV(10)为32mm³，或显著的93％TGI(P<0.001，Mann-Whitney)。九只动物在研究中存活并且分配的中值TTE为79.0天；这表示最大可能的显著219％TGD(P<0.001，对数秩)。第79天MTV(9)为320mm³并且存在六个PR和四个CR。

上文提及的所有文档和其他参考文献均以引用方式并入本文。

发明陈述

1.一种式IV的化合物：

以及其盐和溶剂化物，其中：

R²和R^2’为H；

R⁶和R⁹独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH₂、NHR、NRR’、硝基、Me₃Sn以及卤素；

其中R和R’独立地选自任选取代的C_1-12烷基、C_3-20杂环基以及C_5-20芳基；

并且

(a)R⁷选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH₂、NHR、NRR’、硝基、Me₃Sn以及卤素；

R^7’选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH₂、NHR、NRR’、硝基、Me₃Sn以及卤素；或

(b)R⁷和R⁷'一起形成一个基团，其为：(i)-O-(CH₂)_n-O-，其中n为7至16；或(ii)-O-(CH₂CH₂O)_m-，其中m为2至5；

R″为C_3-12亚烷基，所述链可被一个或多个杂原子，例如O、S、NR^N2(其中R^N2为H或C_1-4烷基)，和/或芳环，例如苯或吡啶中断；

Y和Y'选自O、S或NH；

R^6’和R^9’分别选自与R⁶和R⁹相同的基团；

并且

(i-a)R¹⁰和R¹¹一起在它们所结合的N原子与C原子之间形成双键；或

(i-b)R¹⁰为H并且R¹¹选自OH和OR^A，其中R^A为C_1-4烷基；或(i-c)R¹⁰和R¹¹均为H；

并且

(ii-a)R²⁰和R²¹一起在它们所结合的N原子与C原子之间形成双键；或

(ii-b)R²⁰为H并且R²¹选自OH和OR^B，其中R^B为C_1-4烷基；或(ii-c)R²⁰和R²¹均为H。

2.根据陈述1所述的化合物，其中Y和Y’均为O。

3.根据陈述1或陈述2所述的化合物，其中R”为C_3-7亚烷基。

4.根据陈述1或陈述2所述的化合物，其中R”为下式的基团：

其中r为1或2。

5.根据陈述1至4中任一项所述的化合物，其中R⁹为H。

6.根据陈述1至5中任一项所述的化合物，其中R⁶为H。

7.根据陈述1至6中任一项所述的化合物，其中R⁷选自H、OH或OR并且R^7’选自H、OH和OR。

8.根据陈述7所述的化合物，其中R⁷为C_1-4烷氧基并且R^7’为C_1-4烷氧基。

9.根据陈述1至8中任一项所述的化合物，其中R^2’是与R²相同的基团，R⁶'是与R⁶相同的基团，R⁷'是与R⁷相同的基团，R^9’是与R⁹相同的基团并且Y'是与Y相同的基团。

10.根据陈述1至9中任一项所述的化合物，其中R¹⁰和R¹¹一起在它们所结合的N原子与C原子之间形成双键。

11.根据陈述1至9中任一项所述的化合物，其中R¹⁰为H并且R¹¹选自OH和OR^A。

12.根据陈述11所述的化合物，其中R^A为甲基。

13.根据陈述1至9中任一项所述的化合物，其中R¹⁰和R¹¹均为H。

14.根据陈述1至13中任一项所述的化合物，其中R²⁰和R²¹一起在它们所结合的N原子与C原子之间形成双键。

15.根据陈述1至13中任一项所述的化合物，其中R²⁰为H并且R²¹选自OH和OR^B。

16.根据陈述14所述的化合物，其中R^B为甲基。

17.根据陈述1至13中任一项所述的化合物，其中R²⁰和R²¹均为H。

18.根据陈述1所述的化合物，其具有式IVa、IVb或IVc：

其中R^1a选自甲基和苄基。

19.一种式I的化合物：

以及其盐和溶剂化物，其中：

Y、Y’、R”、R²、R^2’、R⁶、R^6’、R⁷、R^7’、R⁹和R^9’如陈述1至18中任一项所定义；

R^11b选自OH、OR^A，其中R^A为C_1-4烷基；并且

R^L为用于连接至细胞结合剂的接头，其选自：

(iiia)：

其中

Q为：

其中Q^X是使得Q为氨基酸残基、二肽残基或三肽残基；

X为：

其中a＝0至5，b＝0至16，c＝0或1，d＝0至5；

G^L为用于连接至配体单元的接头；以及

(iiib)：

其中R^L1和R^L2独立地选自H和甲基，或与它们所结合的碳原子一起形成亚环丙基或亚环丁基；并且e为0或1；

并且：

(a)R³⁰和R³¹一起在它们所结合的N原子与C原子之间形成双键；或

(b)R³⁰为H并且R³¹选自OH和OR^B，其中R^B为C_1-4烷基；或

(c)R³⁰和R³¹均为H；或

(d)R³¹为OH或OR^B，其中R^B为C_1-4烷基并且R³⁰选自：

(i)

(ii)

(iii)

其中R^Z选自：

(z-i)

(z-ii)OC(＝O)CH₃；

(z-iii)NO₂；

(z-iv)OMe；

(z-v)葡萄糖醛酸苷；

(z-vi)NH-C(＝O)-X₁-NHC(＝O)X₂-NH-C(＝O)-R^ZC，其中-C(＝O)-X₁-NH-和-C(＝O)-X₂-NH-代表天然氨基酸残基并且R^ZC选自Me、OMe、CH₂CH₂OMe和(CH₂CH₂O)₂Me。

20.根据陈述19所述的化合物，其中R³⁰和R³¹一起在它们所结合的N原子与C原子之间形成双键。

21.根据陈述19所述的化合物，其中R³⁰为H并且R³¹选自OH和OR^B，其中R^B为C_1-4烷基。

22.根据陈述19所述的化合物，其中R³⁰和R³¹均为H。

23.根据陈述19所述的化合物，其中R³¹为OH或OR^A并且R³⁰选自：

24.根据陈述23所述的化合物，其中-C(＝O)-X₁-NHC(＝O)X₂-NH-选自：-Phe-Lys-、-Val-Ala-、-Val-Lys-、-Ala-Lys-和-Val-Cit-。

25.根据陈述23所述的化合物，其中-C(＝O)-X₁-NHC(＝O)X₂-NH-选自：-Phe-Lys-和-Val-Ala-。

26.根据陈述23至25中任一项所述的化合物，其中R^ZC选自CH₂CH₂OMe和(CH₂CH₂O)₂Me。

27.根据陈述26所述的化合物，其中R^ZC为(CH₂CH₂O)₂Me。

28.根据陈述19所述的化合物，其具有式Ia、Ib或Ic：

其中R^1a选自甲基和苄基。

29.根据陈述19至28中任一项所述的化合物，其中R^11b为OH。

30.根据陈述19至29中任一项所述的化合物，其中R^11b为OR^A，其中R^A为C_1-4烷基。

31.根据陈述30所述的化合物，其中R^A为甲基。

32.根据陈述19至31中任一项所述的化合物，其中R^L具有式IIIa，并且Q为选自Phe、Lys、Val、Ala、Cit、Leu、Ile、Arg和Trp的氨基酸残基。

33.根据陈述19至31中任一项所述的化合物，其中R^L具有式IIIa，并且Q为选自以下的二肽残基：

^CO-Phe-Lys-^NH、

^CO-Val-Ala-^NH、

^CO-Val-Lys-^NH、

^CO-Ala-Lys-^NH、

^CO-Val-Cit-^NH、

^CO-Phe-Cit-^NH、

^CO-Leu-Cit-^NH、

^CO-Ile-Cit-^NH、

^CO-Phe-Arg-^NH，以及

^CO-Trp-Cit-^NH。

34.根据陈述33所述的化合物，其中Q选自^CO-Phe-Lys-^NH、^CO-Val-Cit-^NH和^CO-Val-Ala-^NH。

35.根据陈述19至31中任一项所述的化合物，其中R^L具有式IIIa，并且Q为选自以下的三肽残基：

^CO-Glu-Val-Ala-^NH、

^CO-Glu-Val-Cit-^NH、

^CO-αGlu-Val-Ala-^NH，以及

^CO-αGlu-Val-Cit-^NH。

36.根据陈述19至35中任一项所述的化合物，其中R^L具有式IIIa并且a为0至3。

37.根据陈述36所述的化合物，其中a为0。

38.根据陈述19至37中任一项所述的化合物，其中R^L具有式IIIa并且b为0至12。

39.根据陈述38所述的化合物，其中b为0至8。

40.根据陈述19至39中任一项所述的化合物，其中R^L具有式IIIa并且d为0至3。

41.根据陈述38所述的化合物，其中d为2。

42.根据陈述19至35中任一项所述的化合物，其中R^L具有式IIIa，并且a为0，c为1且d为2，并且b为0至8。

43.根据陈述42所述的化合物，其中b为0、4或8。

44.根据陈述19至43中任一项所述的化合物，其中R^L具有式IIIa并且G^L选自：

其中Ar代表C_5-6亚芳基。

45.根据陈述44所述的化合物，其中Ar是亚苯基。

46.根据陈述44或陈述45所述的化合物，其中G^L选自G^L1-1和G^L1-2。

47.根据陈述46所述的化合物，其中G^L为G^L1-1。

48.根据陈述19至31中任一项所述的化合物，其中R^L具有式IIIb，并且R^L1和R^L2均为H。

49.根据陈述19至31中任一项所述的化合物，其中R^L具有式IIIb，R^L1为H并且R^L2为甲基。

50.根据陈述19至31中任一项所述的化合物，其中R^L具有式IIIb，并且R^L1和R^L2均为甲基。

51.根据陈述19至31中任一项所述的化合物，其中R^L具有式IIIb，并且R^L1和R^L2与它们所结合的碳原子一起形成亚环丙基。

52.根据陈述19至31中任一项所述的化合物，其中R^L具有式IIIb，并且R^L1和R^L2与它们所结合的碳原子一起形成亚环丁基。

53.根据陈述19至31和48至52中任一项所述的化合物，其中R^L具有式IIIb，并且e为0。

54.根据陈述19至31和48至52中任一项所述的化合物，其中R^L具有式IIIb，并且e为1。

55.根据陈述54所述的化合物，其中所述硝基处于对位。

56.根据陈述19所述的化合物，其中所述化合物具有式Id：

其中Q选自：

(a)-CH₂-；

(b)-C₃H₆-；以及

(c)

57.一种式II的缀合物：

L-(D^L)_p(II)

其中L为配体单元(即，靶向剂)，D^L为式I’的药物接头单元：

其中：

Y、Y’、R”、R²、R^2’、R⁶、R^6’、R⁷、R^7’、R⁹和R^9’如陈述1至18中任一项所定义；

R^11b、R³⁰和R³¹如陈述19至27和29至31中任一项所定义；

R^LL为用于连接至细胞结合剂的接头，其选自：

(iiia)：

其中Q和X如陈述19和32至43中任一项所定义，并且G^LL是连接至配体单元的接头；以及

(iiib)：

其中R^L1和R^L2如陈述19和48至52中任一项所定义；

其中p为1至20的整数。

58.根据陈述57所述的缀合物，其中G^LL选自：

其中Ar代表C_5-6亚芳基。

59.根据陈述58所述的缀合物，其中Ar为亚苯基。

60.根据陈述58或陈述59所述的缀合物，其中G^LL选自G^LL1-1和G^LL1-2。

61.根据陈述60所述的缀合物，其中G^LL为G^LL1-1。

62.根据陈述57所述的缀合物，其中D^L具有式(Id’)：

其中Q选自：

(a)-CH₂-；

(b)-C₃H₆-；以及

(c)

63.根据陈述57至62中任一项所述的缀合物，其中所述配体单元为抗体或其活性片段。

64.根据陈述63所述的缀合物，其中所述抗体或抗体片段是肿瘤相关抗原的抗体或抗体片段。

65.根据陈述64所述的缀合物，其中所述抗体或抗体片段是与一种或多种肿瘤相关抗原或细胞表面受体结合的抗体，所述肿瘤相关抗原或细胞表面受体选自(1)-(88)：

(1)BMPR1B；

(2)E16；

(3)STEAP1；

(4)0772P；

(5)MPF；

(6)Napi3b；

(7)Sema 5b；

(8)PSCA hlg；

(9)ETBR；

(10)MSG783；

(11)STEAP2；

(12)TrpM4；

(13)CRIPTO；

(14)CD21；

(15)CD79b；

(16)FcRH2；

(17)HER2；

(18)NCA；

(19)MDP；

(20)IL20R-α；

(21)短蛋白聚糖；

(22)EphB2R；

(23)ASLG659；

(24)PSCA；

(25)GEDA；

(26)BAFF-R；

(27)CD22；

(28)CD79a；

(29)CXCR5；

(30)HLA-DOB；

(31)P2X5；

(32)CD72；

(33)LY64；

(34)FcRH1；

(35)IRTA2；

(36)TENB2；

(37)PSMA–FOLH1；

(38)SST；

(38.1)SSTR2；

(38.2)SSTR5；

(38.3)SSTR1；

(38.4)SSTR3；

(38.5)SSTR4；

(39)ITGAV；

(40)ITGB6；

(41)CEACAM5；

(42)MET；

(43)MUC1；

(44)CA9；

(45)EGFRvIII；

(46)CD33；

(47)CD19；

(48)IL2RA；

(49)AXL；

(50)CD30-TNFRSF8；

(51)BCMA-TNFRSF17；

(52)CT Ags–CTA；

(53)CD174(Lewis Y)-FUT3；

(54)CLEC14A；

(55)GRP78–HSPA5；

(56)CD70；

(57)干细胞特异性抗原；

(58)ASG-5；

(59)ENPP3；

(60)PRR4；

(61)GCC–GUCY2C；

(62)Liv-1–SLC39A6；

(63)5T4；

(64)CD56–NCMA1；

(65)CanAg；

(66)FOLR1；

(67)GPNMB；

(68)TIM-1–HAVCR1；

(69)RG-1/前列腺肿瘤靶Mindin–Mindin/RG-1；

(70)B7-H4–VTCN1；

(71)PTK7；

(72)CD37；

(73)CD138–SDC1；

(74)CD74；

(75)紧密连接蛋白–CL；

(76)EGFR；

(77)Her3；

(78)RON-MST1R；

(79)EPHA2；

(80)CD20–MS4A1；

(81)腱生蛋白C–TNC；

(82)FAP；

(83)DKK-1；

(84)CD52；

(85)CS1-SLAMF7；

(86)内皮糖蛋白–ENG；

(87)膜联蛋白A1–ANXA1；

(88)V-CAM(CD106)-VCAM1；

(89)ASCT2(SLC1A5)。

66.根据陈述63至65中任一项所述的缀合物，其中所述抗体或抗体片段是半胱氨酸工程改造的抗体。

67.根据陈述57至66中任一项所述的缀合物，其中p为1至8的整数。

68.根据陈述67所述的缀合物，其中p为1、2、3或4。

69.一种组合物，其包含根据陈述57至68中任一项所述的缀合物的混合物，其中在所述缀合化合物的混合物中，平均p为约1至约8。

70.根据陈述57至68中任一项所述的缀合物，其在治疗中使用。

71.一种药物组合物，其包含如陈述57至68中任一项所述的缀合物，以及药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。

72.根据陈述57至68中任一项所述的缀合物或根据陈述71所述的药物组合物，其在治疗受试者的增殖性疾病中使用。

73.根据陈述72所述所使用的缀合物，其中所治疗的所述疾病为癌症。

74.根据陈述57至68中任一项所述的缀合物或根据陈述71所述的药物组合物在医学治疗方法中的用途。

75.一种医学治疗的方法，其包括向患者施用如陈述71所述的药物组合物。

76.根据陈述75所述的方法，其中所述医学治疗方法是用于治疗癌症。

77.根据陈述76所述的方法，其中与所述缀合物组合地向所述患者施用化学治疗剂。

78.根据陈述57至68中任一项所述的缀合物在制造用于治疗增殖性疾病的药物的方法中的用途。

79.一种治疗具有增殖性疾病的哺乳动物的方法，其包括施用有效量的根据陈述57至68中任一项所述的缀合物或根据陈述71所述的药物组合物。

Claims (23)

1.一种式IV的化合物：

以及其盐和溶剂化物，其中：

R²和R^2’为H；

R⁶和R⁹独立地选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH₂、NHR、NRR’、硝基、Me₃Sn以及卤素；

其中R和R’独立地选自任选取代的C_1-12烷基、C_3-20杂环基以及C_5-20芳基；

并且

(a)R⁷选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH₂、NHR、NRR’、硝基、Me₃Sn以及卤素；

R^7’选自H、R、OH、OR、SH、SR、NH₂、NHR、NRR’、硝基、Me₃Sn以及卤素；或

(b)R⁷和R⁷'一起形成一个基团，其为：(i)-O-(CH₂)_n-O-，其中n为7至16；或(ii)-O-(CH₂CH₂O)_m-，其中m为2至5；

R″为C_3-12亚烷基，其链可被一个或多个杂原子，例如O、S、NR^N2(其中R^N2为H或C_1-4烷基)，和/或芳环，例如苯或吡啶中断；

Y和Y'选自O、S或NH；

R^6’和R^9’分别选自与R⁶和R⁹相同的基团；

并且

(i-a)R¹⁰和R¹¹一起在它们所结合的N原子与C原子之间形成双键；或

(i-b)R¹⁰为H并且R¹¹选自OH和OR^A，其中R^A为C_1-4烷基；或

(i-c)R¹⁰和R¹¹均为H；

并且

(ii-a)R²⁰和R²¹一起在它们所结合的N原子与C原子之间形成双键；或

(ii-b)R²⁰为H并且R²¹选自OH和OR^B，其中R^B为C_1-4烷基；或

(ii-c)R²⁰和R²¹均为H。

2.根据权利要求1所述的化合物，其中Y和Y’均为O。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的化合物，其中R”为C_3-7亚烷基。

4.根据权利要求1或权利要求2所述的化合物，其中R”为下式的基团：

其中r为1或2。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中R⁹为H，R⁶为H，R⁷和R^7’独立地为C_1-4烷氧基。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中R^6’是与R⁶相同的基团，R⁷'是与R⁷相同的基团，R⁹'是与R⁹相同的基团并且Y'是与Y相同的基团。

7.根据权利要求1所述的化合物，其具有式IVa、IVb或IVc：

其中R^1a选自甲基和苄基。

8.一种式I的化合物：

以及其盐和溶剂化物，其中：

Y、Y’、R”、R²、R^2’、R⁶、R^6’、R⁷、R^7’、R⁹和R^9’如权利要求1至9中任一项所定义；

R^11b选自OH、OR^A，其中R^A为C_1-4烷基；并且

R^L为用于连接至细胞结合剂的接头，其选自：

(iiia)：

其中

Q为：

其中Q^X是使得Q为氨基酸残基、二肽残基或三肽残基；

X为：

其中a＝0至5，b＝0至16，c＝0或1，d＝0至5；

G^L为用于连接至配体单元的接头；以及

(iiib)：

其中R^L1和R^L2独立地选自H和甲基，或与它们所结合的碳原子一起形成亚环丙基或亚环丁基；并且e为0或1；

并且：

(a)R³⁰和R³¹一起在它们所结合的N原子与C原子之间形成双键；或

(b)R³⁰为H并且R³¹选自OH和OR^B，其中R^B为C_1-4烷基；

(c)R³⁰和R³¹均为H；或

(d)R³¹为OH或OR^B，其中R^B为C_1-4烷基并且R³⁰选自：

(i)

(ii)

(iii)

其中R^Z选自：

(z-i)

(z-ii)OC(＝O)CH₃；

(z-iii)NO₂；

(z-iv)OMe；

(z-v)葡萄糖醛酸苷；

(z-vi)NH-C(＝O)-X₁-NHC(＝O)X₂-NH-C(＝O)-R^ZC，其中-C(＝O)-X₁-NH-和-C(＝O)-X₂-NH-代表天然氨基酸残基并且R^ZC选自Me、OMe、CH₂CH₂OMe和(CH₂CH₂O)₂Me。

9.根据权利要求8所述的化合物，其中R³⁰和R³¹一起在它们所结合的N原子与C原子之间形成双键。

10.根据权利要求8所述的化合物，其具有式Ia、Ib或Ic：

其中R^1a选自甲基和苄基。

11.根据权利要求8至10中任一项所述的化合物，其中R^L具有式IIIa，并且Q为选自以下的二肽残基：

^CO-Phe-Lys-^NH、

^CO-Val-Ala-^NH、

^CO-Val-Lys-^NH、

^CO-Ala-Lys-^NH、

^CO-Val-Cit-^NH、

^CO-Phe-Cit-^NH、

^CO-Leu-Cit-^NH、

^CO-Ile-Cit-^NH、

^CO-Phe-Arg-^NH，以及

^CO-Trp-Cit-^NH。

12.根据权利要求8至10中任一项所述的化合物，其中R^L具有式IIIa，并且a为0，c为1且d为2，并且b为0至8。

13.根据权利要求14所述的化合物，其中b为0、4或8。

14.根据权利要求8至13中任一项所述的化合物，其中R^L具有式IIIa并且G^L选自：

其中Ar代表C_5-6亚芳基。

15.根据权利要求14所述的化合物，其中G^L为G^L1-1，

16.根据权利要求8所述的化合物，其中所述化合物具有式Id：

其中Q选自：

(a)-CH₂-；

(b)-C₃H₆-；以及

(c)

17.一种式II的缀合物：

L-(D^L)_p(II)

其中L为配体单元(即，靶向剂)，D^L为式I’的药物接头单元：

其中：

Y、Y’、R”、R²、R^2’、R⁶、R^6’、R⁷、R^7’、R⁹和R^9’如权利要求1至6中任一项所定义；

R^11b、R³⁰和R³¹如权利要求8和9中任一项所定义；

R^LL为用于连接至细胞结合剂的接头，其选自：

(iiia)：

其中Q和X如权利要求8和11至13中任一项所定义，并且G^LL是连接至配体单元的接头；以及

(iiib)：

其中R^L1和R^L2如权利要求8中所定义；

其中p为1至20的整数。

18.根据权利要求17所述的缀合物，其中G^LL选自：

其中Ar代表C_5-6亚芳基。

19.根据权利要求17所述的缀合物，其中D^L具有式(Id’)：

其中Q选自：

(a)-CH₂-；

(b)-C₃H₆-；以及

(c)

20.一种组合物，其包含根据权利要求17至19中任一项所述的缀合物的混合物，其中在缀合化合物的所述混合物中，平均p为约1至约8。

21.根据权利要求17至19中任一项所述的缀合物，其在治疗中使用。

22.一种药物组合物，其包含如权利要求17至19中任一项所述的缀合物，以及药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。

23.根据权利要求17至19中任一项所述的缀合物或根据权利要求22所述的药物组合物，其在治疗受试者的增殖性疾病中使用。

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