CN112195183A

CN112195183A - 一种水稻质子泵转运蛋白OsA1的应用

Info

Publication number: CN112195183A
Application number: CN202010744885.1A
Authority: CN
Inventors: 朱毅勇; 张茂星; 陈熙; 丁明; 肖靓; 许飞云; 曾后清
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2020-07-29
Filing date: 2020-07-29
Publication date: 2021-01-08

Abstract

本发明公开了一种水稻质子泵转运蛋白OsA1的应用。水稻质子泵转运蛋白基因OsA1在促进气孔开放、增加水稻光合速率、提高产量中的应用。本发明所述的水稻质子泵蛋白基因OsA1，通过35S超表达后，对促进水稻加速生长、提高水稻籽粒产量具有重要意义。

Description

一种水稻质子泵转运蛋白OsA1的应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，涉及一种水稻质子泵转运蛋白OsA1的应用。

背景技术

大气中二氧化碳浓度不断升高是一个全球性的问题，我国目前二氧化碳排放仍然处于高峰期，这是导致气候变暖的主要原因。而植物的光合作用一直以来就是地球上固定二氧化碳的重要方式。如果作物能主动增强吸收二氧化碳，那就能降低周围环境中的二氧化碳浓度，并且还能促进光合作用，提高作物产量。

植物叶片上的气孔开度决定了二氧化碳的吸收，而气孔开度是由两个保卫细胞的膨胀度控制的。保卫细胞的膨胀与收缩具有昼夜节律。在光诱导下通过一系列信号途径激活细胞膜上质子泵活性，向胞外泵出大量质子，使膜电位超极化，促使内流钾离子通道打开，大量钾离子进入细胞后水势下降，保卫细胞吸水膨胀，使气孔张开。夜晚光线减弱后上述过程逆转。

发明内容

本发明的目的是提供水稻质子泵转运蛋白基因OsA1促进气孔开放、增加水稻光合速率、提高产量中的应用。

水稻质子泵转运蛋白基因OsA1在促进水稻生长与产量中的应用，水稻质子泵转运蛋白基因组序列在RAP-DB数据库中的登录号为Os03g0689300，编码的蛋白序列在RAP-DB数据库中的登录号为Os03g0689300。

水稻质子泵转运蛋白基因OsA1在增加水稻气孔开度、促进光合速率中的应用。

有益效果：

本发明所述的水稻质子泵转运蛋白基因OsA1，经35S启动子超表达后，提高叶片光合速率，促进了水稻发育加快了水稻生长，对提高水稻籽粒产量具有重要意义。

附图说明

图1：OsA1超表达株系的鉴定。

A:DNA鉴定；B:拷贝数鉴定。

图2：OsA1超表达水稻生物量增加，气孔开度率及气孔导度和净光合速率。A：水稻生物量；B,C，D：水稻气孔开度率及气孔导度和净光合速率。

图3：OsA1基因在超表达水稻叶片中的表达上调(A)，质子泵水解活性增加(B)，叶片细胞膜蛋白总量增加(C,D)。

图4：叶片光合相关基因GO分析显示OsA1超表达水稻光合作用相关的基因表达水平上调。

图5：OsA1超表达水稻产量构成因子图。A：OsA1超表达水稻水稻在不同区域产量；B、 C：OsA1超表达水稻水稻在不同区域的穗重，穗粒数和穗数。

图6：生长期时间，分蘖时间，开花时间长，灌浆时间，蜡熟期时间

图7：产量构成因子结果

具体实施方式

实施例1 OsA1超表达植株的创制及鉴定

一OsA1超表达植株的创制

利用CAM 35S启动子转基因技术构建OsA1超表达材料。首先根据根据OsA1基因的全长cDNA序列(NCBI网站查得)，用软件Primer 5.0设计扩增全长ORF引物，在引物的5’端分别设计XbaⅠ和KpnⅠ两个不同的酶切位点，以用于表达载体pBWA(V)HS，正义链为 overOsA1-F：5’-CAGTCGTCTCNTTTGATGGCGGAGGACAAGGGAGG-3’(SEQ ID NO.1)，反义链overOsA1-R：5’-CAGTCGTCTCNTTGGAA ATGGCCAACTTGAT-3’(SEQ ID NO.2)，以购自National Institute ofAgrobiological Sciences(NIAS)的OsA1基因cDNA全长克隆质粒为模板扩增得到开放阅读框(ORF)序列。含目的基因的PCR产物经回收纯化后连入pMD19-T cloning Vector，酶切验证并测序。测序正确的质粒分别用XbaⅠ和KpnⅠ单酶切得到含特定酶切位点的基因片段。将目的基因片段分别连入pBWA(V)HS载体，得到35S::OsA1表达载体 (图1A)，经酶切测序正确的表达载体通过电转法转入根癌农杆菌EHA105中，通过水稻转基因技术获得35S：：OsA1超表达水稻材料。

二OsA1超表达植株的鉴定

采集转基因T0代苗的叶片，提取水稻基因组DNA。以基因组和35S启动子部分片段DNA为模板，PCR扩增35S：：OsA1载体片段，产物测序后与野生型序列比对，挑选出阳性植株(图1B)。此外将提取的转基因株系做Southern blot，提取WT和转基因株系水稻总DNA，分别用XbaⅠ和KpnⅠ双酶切，采用水稻Southern blot的步骤杂交，纯化后制作探针检测WT和转基因株系水稻拷贝数，从而获得3个单拷贝的株系，命名为OSA1#1,OSA1#2,OSA1#3(图1B)。

实施例2

野生型和OsA1超表达材料幼苗在含有2mM NH₄ ⁺的IRRI营养液中培养6周。使用 Li-Cor6400型光合作用测定仪测定水稻新完全展开叶的净光合速率和气孔导度。首先光合作用测定仪机器校正,校正结束后回到测定界面，CO₂浓度为大气CO₂浓度(400μmol mol^-1)，叶片温度和叶室内空气湿度分别控制在23℃和60％-70％。等叶室温度和CO₂浓度稳定后，匹配一次再打开Ai-Autolog程序，每30s记录一个数据，先暗处理半小时，之后打开光源叶室内的光照强度为1000μmol m^-2s^-1，光照2小时后关闭光源暗处理半小时，每个植株处理3小时并测量该植株的叶宽。每个材料测定前一天放置在暗室下过夜并且重复测定三株(图2C,D)。同时观察表型并拍照后放入0.1mM的CaSO₄溶液中漂洗1分钟，收获植物样品，105℃杀青30分钟，然后放在70℃烘箱里烘干称重(图2A)。将OsA1超表达及野生型植株的种子剥壳消毒处理接种在1/2MS培养基，先暗室培养三天后转移至光照培养室培养10天。处理前一天将植株放置暗室过夜，之后将培养盒打开取完全新展开的叶片，用破碎机打碎匀浆10秒过滤58μm滤膜，用镊子取少许未过滤的叶片组织，随后放置在不同气孔观测液中进行不同处理(光照、黑暗、 ABA)3h。处理完后制作盖玻片用40x体式显微镜观测记录，每个样品选取50个气孔后进行统计气孔开放情况，每个材料选取3株进行重复统计(图2B)。

实施例3

1)野生型和OsA1超表达材料幼苗在含有2mM NH₄ ⁺的IRRI营养液中培养3周。TRIzol法提取叶片总RNA，反转录获得cDNA，扩增基因后，定量检测叶片中OsA1基因的表达。OsA1基因特异性引物序列为：PF1:5’-ATGGTGTAAACGATGCTCCA；PR1:5’-ATCAGATGCACTCCTTGCTG。结果发现OsA1基因在正常营养条件下表达上调(图3A)。

2)水稻细胞膜蛋白的提取参照Zhu et al,(2009)方法，略有修改。提取的细胞膜蛋白质含量测定用BCA试剂盒测定。质膜H⁺-ATPase水解活性的测定原理是膜蛋白与底物(ATP)反应后会释放出无机磷，因此我们可以通过测定释放的无机磷的量与空白对照的差值经过计算得出其水解活性。反应时间为30min，反应体系体积为0.50ml(图3B)。

3)将培养三周的水稻叶片利用kinoshit et al,(2011)细胞膜蛋白提取方法提取叶片蛋白。剪取水稻叶片样品1-2cm²,加入液氮研磨充分成粉末状。加入研磨液{含100mmol/L Tris-Hcl PH 8.0、250KCl、3mmol/L DTT、0.5％(w/v)PVP(K-30)、10％(v/v)甘油、5mmol/L EDTA、 1mmol/L PMSF、0.1mmol/L NaF}200ul冰浴研磨至透明状。研磨充分后转移至1.5ml离心管中，4℃12000g离心1分钟。离心后吸取上清得到膜蛋白。测定蛋白浓度，将分离好的膜蛋白20ug加上一定体积比(2:1)的5*SDS-PAGE混匀后准备上样电泳并做Western blot(图3C,D)。

实施例4

1)野生型和OsA1超表达材料幼苗在含有2mM NH₄ ⁺的IRRI营养液中培养4周。TRIzol法提取叶片总RNA。采用TruSeq RNA步骤方法和NextSeq 500(Illumina)进行测序，样本准备通过试剂盒v.2(Illumina)构建互补DNA文库。序列读取后筛选，仅使用高质量序列reads(质量值>25的50个连续核苷酸)进行测序。经过Bowtie软件将Reads转录序列根据Oryzasativa (IRGSP v1.0 2019.8.29)数据库进行匹配处理。基因表达值以RPM为单位进行报道。使用EdgeR包装对读计数进行归一化和统计分析。EdgeR由web工具Degust Ver.3.1.0(http://degust.erc.monash.edu)进行。得到的RPM值用Excel进行进一步分析。只有log2fold change≥1或≤-1，FDR<0.05的基因被认为差异显著基因(DEGs)，将差异基因进行GO分析 (图4)。

实施例5

将野生型和OsA1超表达材料幼苗温室大棚里土培育秧培养4周。随后将足够壮大的苗分别种植在不同区域(2016年南京，2017年南京，2017年凤阳)。每个区域种植野生型和3个超表达株系，每个株系分20行，每行3株共种60穴水稻秧苗，边界设置保护行。收获时每个小区每个株系挑选具有代表性植株8株，统计产量并测定植株各个产量指标，田间种植过程中统计各个生育期时间(分蘖期，开花期，灌浆期，蜡熟期，成熟期)。理论亩产量＝亩有效穗数 *平均穗粒数*千粒重*结实率/1000000。当植株生长至收获期时，统计株高(自地面至穗部顶端的高度)、有效穗数、穗长(从穗基部到顶端的长度)及穗粒数、结实率等(图5A、B、C)。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种水稻质子泵转运蛋白OsA1的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagtcgtctc ntttgatggc ggaggacaag ggagg 35

<210> 2

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagtcgtctc nttggaaatg gccaacttga t 31

Claims

1.水稻质子泵转运蛋白基因OsA1在促进水稻生长与产量中的应用，水稻质子泵转运蛋白基因组序列在RAP-DB数据库中的登录号为Os03g0689300，编码的蛋白序列在RAP-DB数据库中的登录号为Os03g0689300。

2.水稻质子泵转运蛋白基因OsA1在增加水稻气孔开度、促进光合速率中的应用。