CN112194721A

CN112194721A - 一种双溶液混合萃取体系及其在鸵鸟肝脏中的应用

Info

Publication number: CN112194721A
Application number: CN201911038302.7A
Authority: CN
Inventors: 任战军; 李倩; 罗刚; 宋胜杰; 艾尧天; 刘晨苗; 吴婕; 穆今展; 陈佳翎
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2019-10-29
Filing date: 2019-10-29
Publication date: 2021-01-08
Anticipated expiration: 2039-10-29
Also published as: CN112194721B

Abstract

本发明提供一种双溶液混合萃取体系及其在鸵鸟肝脏中的应用，该混合萃取体系由质量比为（1.5~1.7）：1的聚合物溶液与盐溶液组成。制备方法包括：分别配制聚合物溶液和盐溶液；然后按照上述质量百分比将配制好的聚合物溶液和盐溶液混合均匀；静置10~12h。采用本发明的双溶液混合萃取体系及其制备方法提取鸵鸟肝脏中金属硫蛋白，每克鸵鸟肝脏可制得8.2‑8.9mg金属硫蛋白，并且所获得的鸵鸟肝脏金属硫蛋白的纯度高达72%‑78.5%。

Description

一种双溶液混合萃取体系及其在鸵鸟肝脏中的应用

技术领域

本发明涉及一种萃取体系，具体涉及一种双溶液混合萃取体系及其在鸵鸟肝脏中的应用。

背景技术

金属硫蛋白（MT）是一种低分子量（6-7 KDa）、含有大量半胱氨酸的蛋白质。主要的功能有维持必需金属元素的代谢平衡、清除机体自由基和重金属解毒等。目前市场销售的MT产品（如保健品、护肤品等），大多是从兔和猪的肝脏中提取，产品价格较高。

鸵鸟是我国新型的产业，该产业所获得的鸵鸟产品主要有鸵鸟肉、皮、毛和蛋。鸵鸟的浑身都是宝。其综合利用率高达90%。鸵鸟肉的营养价值很高。其含有丰富的蛋白质、Ga、Fe、Zn等微量元素，热量低，适于人类食用。鸵鸟体内富含Zn等金属元素，每百克鸵鸟肉中的Zn含量高达8.2mg，是猪肉（2.18mg-2.97mg）、牛肉（2.07mg-3.71mg）的4倍，鸡肉（1.1mg-1.46mg）、鸭肉（1.31mg-1.38mg）的8倍。医学界公认，鸵鸟内脏、骨骼等组织具有一定的利用价值，可为某些医学研究提供药物成分，比如鸵鸟内脏中的MT，肝脏中为23.069mg/g、肾脏中为19.288 mg/g、脾脏中为9.390 mg/g、心脏中为9.068 mg/g、血液中为7.459mg/g、胃壁中为6.815 mg/g、肺中为6.131mg/g、空肠中为5.045 mg/g、盲肠中为0.850 mg/g。

目前与MT相关的发明主要涉及兔、猪、牛、羊等哺乳动物（参考专利201110025496.4，200410061265.9，200810031274.1，01110021.4）。也有在水生生物中的相关发明（参考专利200610043745.1，200910061460.4，201310213972. 4，201410178077. 8，201510273034.2）。另有研究者对家蝇、酵母菌、虫草中金属硫蛋白的提取做出相关发明（参考专利200910308720.3，96100897.0，201110076199.2）。但截至到目前，还没有关于鸵鸟体内MT提取的相关报道，但鸵鸟内脏所占比重大，且营养丰富，所以研究鸵鸟内脏MT的提取就显得颇有意义。

目前MT的提取通常采用的除杂方式有加热除杂和试剂除杂两种。加热除杂过程操作比较复杂，且过程耗时长，还会涉及到二次除杂过程；而试剂除杂过程中常使用氯仿等有害试剂（参考专利200810031274.1，200910061460.4）。氯仿的使用对人体危害极大，因此，在MT的工业生产中需将生产产品的危害减小到最小，保证生产者和使用者的安全。

MT纯化方法主要有多步层析法和色谱法两种。有发明使用多步层析法分离纯化金属硫蛋白（201210237153. 9），有发明使用色谱法分离纯化金属硫蛋白，（参考专利200910308720.3）。这些方法虽然能获得较高纯度的金属硫蛋白，但其操作步骤较为复杂，且试验成本高，不适用于工业生产中。

发明内容

本发明旨在提供一种双溶液混合萃取体系及其在鸵鸟肝脏中的应用，以解决家鸵鸟肝脏中的金属硫蛋白提取和纯化问题。本发明的技术方案为：

第一个方面，本发明提供一种双溶液混合萃取体系，由质量比为（1.5~1.7）：1的聚合物溶液与盐溶液组成。

进一步的，所述聚合物溶液中聚合物选自聚丙烯醇或聚乙二醇。

优选的，所述聚合物的分子量为4000~6000。

优选的，所述聚合物为聚乙二醇。

优选的，所述聚合物溶液的质量浓度为30~60%。

进一步的，所述盐溶液中盐选自硫酸铵、硫酸钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、乙酸钠、乙酸钾中的至少一种。

优选的，所述盐为硫酸铵。

优选的，所述盐的质量浓度为20~35%。

第二个方面，本发明提供上述双溶液混合萃取体系的制备方法，包括：分别配制聚合物溶液和盐溶液；然后按照上述质量百分比将配制好的聚合物溶液和盐溶液混合均匀；静置10~12h。

第三个方面，本发明提供上述双溶液混合萃取体系及其制备方法在提取鸵鸟肝脏中金属硫蛋白中的应用。

进一步的，所述应用方法包括以下步骤：

（1）将鸵鸟肝脏与Tris-HCl缓冲液进行混合匀浆，然后离心得到匀浆上清液；

（2）将匀浆上清液于75~85℃加热8~10min，然后离心保留上清得到MT粗品；

（3）将MT粗品与双溶液混合萃取体系混合均匀，然后静置一夜，分层后保留上层液体，即获得MT纯液。

进一步的，所述步骤（1）中混合匀浆的控制参数为：Tris-HCl缓冲液的浓度为0.01~0.03mol/L，pH为8~9；鸵鸟肝脏与Tris-HCl缓冲液的质量体积比为1：（4~6）。

优选的，所述步骤（1）中离心条件为：温度为4~6℃，转速为8000~12000rpm，离心时间为10~30min。

优选的，所述步骤（1）中离心条件为：转速为4000~6000rpm，离心时间为10~20min。

优选的，所述步骤（3）中MT粗品和双溶液混合萃取体系的体积比为1.5：2。

本发明的有益效果在于：本发明操作简便、设备投资少，且作用条件温和、无毒、污染小以及提取效率高，此外，鸵鸟本身具有营养好、污染小和易获取等优点。采用本发明方法，每克鸵鸟肝脏可制得8.2~8.9mg金属硫蛋白，提取率达到35.5~38.6%，并且所获得的鸵鸟肝脏金属硫蛋白的纯度高达72%~78.5%，可使鸵鸟肝脏资源得到合理利用。此外，本发明将提取和纯化步骤合并为一步进行，较比现有提取MT并纯化的工艺方法操作更加简单，成本要节省很多，并且具有工业化前景。

具体实施方式

本发明实施例中采用的鸵鸟购自宝鸡凤翔鸵鸟养殖与屠宰场。

在本发明的描述中，需要说明的是，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

下面结合具体的实施例对本发明做进一步详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

实施例1

本实施例提供一种双溶液混合萃取体系，组成为：PEG溶液和硫酸铵溶液质量比为1.7：1，其中PEG溶液质量浓度为60%，PEG分子量为6000，硫酸铵溶液质量浓度为35%。该萃取体系的制备方法包括：分别配制聚合物溶液和盐溶液；然后按照上述质量百分比将配制好的聚合物溶液和盐溶液混合均匀；静置12h。

实施例2

本实施例提供一种双溶液混合萃取体系，组成为：PEG溶液和硫酸铵溶液质量比为1.5：1，其中PEG溶液质量浓度为30%，PEG分子量为4000，硫酸铵溶液质量浓度为20%。制备方法同实施例1。

实施例3

本实施例提供一种双溶液混合萃取体系，组成为：聚丙烯醇溶液和磷酸二氢钠溶液质量比为1.5：1，其中聚丙烯醇溶液质量浓度为30%，聚丙烯醇分子量为4000，磷酸二氢钠溶液质量浓度为20%。制备方法同实施例1。

实施例4

本实施例提供一种双溶液混合萃取体系，组成为：聚乙二醇溶液和乙酸钾溶液质量比为1.5：1，其中聚乙二醇溶液质量浓度为30%，聚乙二醇分子量为4000，乙酸钾溶液质量浓度为20%。制备方法同实施例1。

实施例5

将实施例1制备的双溶液混合萃取体系用于鸵鸟肝脏中MT提取，具体方法如下：

①匀浆：

称取1g鸵鸟肝脏，将其与0.02 mol/L pH8.3的Tris-HCl缓冲液以质量体积比1：5混合匀浆，4℃10000rpm离心30 min。得匀浆上清液。

②除杂：

取上清液于80℃水浴加热8 min，然后于6000rpm离心，取上清即为MT粗品。

③纯化：

纯化工艺使用双溶液混合萃取技术，采用实施例1的双溶液混合萃取体系。将MT粗品与双溶液混合萃取体系按照质量比为1.5：2混合均匀，然后静置一夜，分层后取上层液体，测得吸光度，以半胱氨酸作为标准品，做标准曲线，根据标准曲线得到半胱氨酸的浓度，计算出单位体积的巯基数量，按照每分子MT含有20个巯基计算MT浓度，MT的分子量以6500来计算MT含量。本实施例的金属硫蛋白的提取量为8.9mg/g 肝脏，提取率为38.6%（按照鸵鸟肝脏中MT含量为23.069mg/g计），纯度高达78.5%。

实施例6

将实施例2制备的双溶液混合萃取体系用于鸵鸟肝脏中MT提取，具体方法中与实施例6的区别在于：Tris-HCl缓冲液的pH为8.4，步骤（1）的离心时间为10min。本实施例的金属硫蛋白的提取量为8.8mg/g，提取率为38.1%，纯度高达78%。

实施例7

将实施例3制备的双溶液混合萃取体系用于鸵鸟肝脏中MT提取，具体方法中与实施例6的区别在于： Tris-HCl缓冲液的pH为8.5，步骤（1）的离心时间为10min。本实施例的金属硫蛋白的提取量为8.2mg/g，提取率为35.5%，纯度高达75%。

实施例8

将实施例4制备的双溶液混合萃取体系用于鸵鸟肝脏中MT提取，具体方法中与实施例6的区别在于：Tris-HCl缓冲液的pH为8.9，步骤（1）的离心时间为10min。本实施例的金属硫蛋白的提取量为8.3mg/g，提取率为36.0%，纯度高达72%。

综上，采用本发明，每克鸵鸟肝脏可制得8.1-8.9mg金属硫蛋白，提取率达到35.5~38.6%，并且所获得的鸵鸟肝脏金属硫蛋白的纯度高达72%-78.5%。最重要的是，本发明通过一步法就可以同时进行MT的提取和纯化，并且纯化效果特别好，最高可以达到78.5%，较比现有提取以后再纯化的工艺方式既要简单很多，并且成本低下，这是在其它研究中从未出现的效果。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种双溶液混合萃取体系，其特征在于：由质量比为（1.5~1.7）：1的聚合物溶液与盐溶液组成。

2.根据权利要求1所述一种双溶液混合萃取体系，其特征在于：所述聚合物溶液中聚合物选自聚丙烯醇或聚乙二醇。

3.根据权利要求2所述一种双溶液混合萃取体系，其特征在于：所述聚合物的分子量为4000~6000。

4.根据权利要求2或3所述一种双溶液混合萃取体系，其特征在于：所述聚合物溶液的质量浓度为30~60%。

5.根据权利要求1所述一种双溶液混合萃取体系，其特征在于：所述盐溶液中盐选自硫酸铵、硫酸钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、乙酸钠、乙酸钾中的至少一种。

6.根据权利要求5所述一种双溶液混合萃取体系，其特征在于：所述盐的质量浓度为20~35%。

7.权利要求1~6任意一项所述的一种双溶液混合萃取体系的制备方法，其特征在于：包括：分别配制聚合物溶液和盐溶液；然后按照上述质量百分比将配制好的聚合物溶液和盐溶液混合均匀；静置10~12h。

8.权利要求1~6任意一项所述的一种双溶液混合萃取体系或者权利要求7所述的一种双溶液混合萃取体系的制备方法在提取鸵鸟肝脏中金属硫蛋白中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用方法，其特征在于：所述应用方法包括以下步骤：

将鸵鸟肝脏与Tris-HCl缓冲液进行混合匀浆，然后离心得到匀浆上清液；

将匀浆上清液于75~85℃加热8~10min，然后离心保留上清得到MT粗品；

10.根据权利要求9所述的应用方法，其特征在于：所述步骤（1）中混合匀浆的控制参数为：Tris-HCl缓冲液的浓度为0.01~0.03mol/L，pH为8~9；鸵鸟肝脏与Tris-HCl缓冲液的质量体积比为1：（4~6）。