CN112190496A - 富含异鼠李素的产品、制备方法以及异鼠李素的提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药领域，一种富含异鼠李素的护肤品，包括质量百分比为0.01％～10％的异鼠李素，所述异鼠李素可通过添加异鼠李素直接获得或通过添加含有异鼠李素的提取物间接获得，富含异鼠李素的护肤品的剂型为溶液、乳液、悬浮液、霜、凝胶、泡沫或喷雾。异鼠李素对痤疮丙酸杆菌引起的炎症具有较好的减轻作用，其能抑制相关炎症因子的释放，可用于制备具有祛痘消炎效果的化妆品，为祛痘改善皮肤状况提供一种新的添加剂。

Description

富含异鼠李素的产品、制备方法以及异鼠李素的提取方法
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及祛痘护肤品。
背景技术
痤疮是皮肤科常见的疾病，俗称青春痘、粉刺、暗疮等，是一种发生于毛囊皮脂腺的慢性疾病，多发于头面部，颈部、前胸后背等皮脂腺丰富的部位。在正常代谢过程中，毛囊可以寄生大量的皮肤正常菌群，例如痤疮丙酸杆菌。不正常的因素导致的性激素紊乱和皮脂腺痤疮丙酸杆菌的大量繁殖、皮脂腺导管的异常角化、皮脂大量分泌、炎症反应导致了痤疮的产生。长痘常常困扰着人们，特别是青春痘困扰着许多青少年，对祛痘化妆品的研究近年来也越来越重视，植物来源祛痘产品由于其具有天然、无害、安全、高效等特点从而成为研究的热点，拥有广泛的市场开发价值。其植物功能性原料主要通过提取、分离等手段提取有效成分，添加到化妆品基质中，经皮肤吸收从而发挥作用。
在医学上定义的痤疮性质是：痤疮是一种慢性炎症皮肤病，影响者人们毛囊皮脂腺。其发展主要分一下三个步骤，第一，皮脂腺受刺激，激活多种受体，包括：雄性激素受体、神经肽受体及类胰导素生长因子受体，过氧化酶体增生物激活受体；第二，激素结合受体后刺激皮肤脂分泌，皮脂腺通道产生角质化，毛孔堵塞；第三，毛孔堵塞后形成的毛囊内的活氧化，促使皮肤毛囊中的厌氧菌痤疮杆菌滋生，引起了后续炎症反应的进行。痤疮性肌肤的护理，比油性肌肤更复杂，清洁肌肤及控油补水的同时，需要抑制痤疮杆菌生长，很多情况下痘痘都处于炎症发作的状态，因此需要同时有镇静舒缓的成份在里。
发明内容
本发明的目的在于提供一种富含异鼠李素的护肤品。
本发明的目的还在于提供一种异鼠李素的提取方法，用于提取异鼠李素。
本发明的目的还在于提供一种富含异鼠李素的面霜。
本发明的目的还在于提供富含异鼠李素的面霜的制备方法。
本发明的目的还在于提供一种富含异鼠李素的精华。
本发明的目的还在于提供富含异鼠李素的精华的制备方法。
本发明的目的还在于提供一种富含异鼠李素的面膜。
本发明的目的还在于提供富含异鼠李素的面膜的制备方法。
本发明所解决的技术问题可以采用以下技术方案来实现：
一种富含异鼠李素的护肤品，其特征在于，包括质量百分比为0.01％～10％的异鼠李素，所述异鼠李素可通过添加异鼠李素直接获得或通过添加含有异鼠李素的提取物间接获得，富含异鼠李素的护肤品的剂型为溶液、乳液、悬浮液、霜、凝胶、泡沫或喷雾。
异鼠李素对痤疮丙酸杆菌引起的炎症具有较好的减轻作用，其能抑制相关炎症因子的释放，可用于制备具有祛痘消炎效果的化妆品，为祛痘改善皮肤状况提供一种新的添加剂。
优选，所述异鼠李素的质量百分比为0.1％～5％。进一步优选，所述异鼠李素的质量百分比为0.5％～3％。
所述异鼠李素可从银杏、沙棘等药用植物中提取分离所得。
一种异鼠李素的提取方法，其特征在于，以新鲜的银杏叶片，经60℃烘干24h，粉碎，过筛；
然后，装入超声萃取釜中，加入45％乙醇，料液比1Kg∶17L-19L，混合；
然后，过滤，弃去滤渣，得富含异鼠李素的银杏提取物。
优选，超声萃取釜为中国宁波振国制药设备制造有限公司生产的型号为TCLX200的超声波中药提取仪。
超声发生方式为：
它激式超声发声装置，径向振动柱状换能器；超声波功率：100W；超声频率：28kHz；提取方式：间隔3min，超声作用一次，超声作用时间3min，总提取时间36min；提取温度：45℃；搅拌方式：气升式搅拌。
优选，过筛后颗粒的不大于0.45μm。
一种富含异鼠李素的面霜，其特征在于，包括如下质量百分比的组分：水88.8％；甘油5％；异鼠李素5％；β-谷甾醇0.5％；山梨坦倍半油酸酯0.1％；对羟基苯乙酮0.5％；EDTA二钠0.1％。
富含异鼠李素的面霜的制备方法，将如下质量百分比的组分：水88.8％；甘油5％；异鼠李素5％；β-谷甾醇0.5％；山梨坦倍半油酸酯0.1％；对羟基苯乙酮0.5％；EDTA二钠0.1％的各相混合加热到80到85摄氏度使其完全溶解，搅拌均匀，冷却至室温即。
一种富含异鼠李素的精华，其特征在于，包括如下质量百分比的组分：水84.55％；甘油5％；丁二醇5％；1,2-戊二醇2％；聚天冬氨酸钠0.5％；异鼠李素2％；β-谷甾醇0.5％；乳糖0.1％；扁桃酸0.1％；凝血酸0.05％；1,2-己二醇0.1％；EDTA二钠0.05％；黄原胶0.05％。
富含异鼠李素的精华的制备方法，将如下质量百分比的组分：水84.55％；甘油5％；丁二醇5％；1,2-戊二醇2％；聚天冬氨酸钠0.5％；异鼠李素2％；β-谷甾醇0.5％；乳糖0.1％；扁桃酸0.1％；凝血酸0.05％；1,2-己二醇0.1％；EDTA二钠0.05％；黄原胶0.05％的各相混合加热到60到80摄氏度使其完全溶解，搅拌均匀，冷却至室温即。
一种富含异鼠李素的面膜，包括面膜液、浸有面膜液的面膜基质，其特征在于，所述面膜液包括如下质量百分比的组分：甘油5～10份、1,3-丁二醇1～5份、1,2-丙二醇4～8份、无患子酵素20～40份、海藻酸钠1～3份、乙二胺四乙酸二钠0.1～0.3份、丙酸0.1～0.3份、龙脑精油0.00001-0.01份、去离子水30～40份、异鼠李素0.01～10份，所述异鼠李素可通过添加异鼠李素直接获得或通过添加含有异鼠李素的提取物间接获得。
富含异鼠李素的面膜的制备方法，步骤如下：
(1)制备面膜液的配料：按质量份数计，甘油5～10份、1,3-丁二醇1～5份、1,2-丙二醇4～8份、无患子酵素20～40份、海藻酸钠1～3份、乙二胺四乙酸二钠0.1～0.3份、丙酸0.1～0.3份、龙脑精油0.00001～0.01份、去离子水30～40份、异鼠李素0.01～10份；
(2)按照步骤(2)中的配料关系制备面膜液：
(3.1)将甘油、1,3-丁二醇、1,2-丙二醇以及部分去离子水混合，加热至60～70℃，搅拌混匀；
(3.2)加入无患子酵素20～40份、异鼠李素0.01～10份，保持50～65℃，搅拌均匀；
(3.3)用部分去离子水完全溶解海藻酸钠和乙二胺四乙酸二钠，并加入步骤
(3.2)的混合溶液中；
(3.4)搅拌降温至30～40℃，依次加入龙脑精油、丙酸和剩余去离子水；
(3)将面膜液进行辐照灭菌；
(4)将面膜液浸入面膜基质后，真空包装。
所述异鼠李素可通过添加异鼠李素直接获得或通过添加富含异鼠李素的银杏提取物获得，
采用富含异鼠李素的银杏提取物时，富含异鼠李素的银杏提取物的质量份数为20～40份，富含异鼠李素的银杏提取物中异鼠李素的浓度为12.5μg/m。
优选，步骤(4)中，辐照灭菌的条件为：采用吸收剂量为3～5KGy的60 Co-γ射线电离辐照15～30min。
有益效果：本发明通过研究发现异鼠李素对痤疮丙酸杆菌引起给炎症具有较好的消炎作用，可作为祛痘产品的活性成分添加于祛痘化妆品中。
附图说明
图1为异鼠李素结构图；
图2为IL-1β含量随菌量及时间的变化；
图3为异鼠李素对NF-κB p65核质转移的影响。
具体实施方式
为了本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合附图，进一步阐述本发明。
富含异鼠李素的护肤品
富含异鼠李素的护肤品，包括质量百分比为0.01％～10％的异鼠李素，异鼠李素可通过添加异鼠李素直接获得或通过添加含有异鼠李素的提取物间接获得，富含异鼠李素的护肤品的剂型为溶液、乳液、悬浮液、霜、凝胶、泡沫或喷雾。异鼠李素对痤疮丙酸杆菌引起的炎症具有较好的减轻作用，其能抑制相关炎症因子的释放，可用于制备具有祛痘消炎效果的化妆品，为祛痘改善皮肤状况提供一种新的添加剂。
优选，异鼠李素的质量百分比为0.1％～5％。进一步优选，异鼠李素的质量百分比为0.5％～3％。异鼠李素可从银杏、沙棘等药用植物中提取分离所得。
异鼠李素的提取方法
以新鲜的银杏叶片，经60℃烘干24h，粉碎，过筛；然后，装入超声萃取釜中，加入45％乙醇，料液比1Kg∶17L-19L，混合；然后，过滤，弃去滤渣，得富含异鼠李素的银杏提取物。
优选，超声萃取釜为中国宁波振国制药设备制造有限公司生产的型号为TCLX200的超声波中药提取仪。超声发生方式为：它激式超声发声装置，径向振动柱状换能器；超声波功率：100W；超声频率：28kHz；提取方式：间隔3min，超声作用一次，超声作用时间3min，总提取时间36min；提取温度：45℃；搅拌方式：气升式搅拌。优选，过筛后颗粒的不大于0.45μm。
富含异鼠李素的面霜、精华及其制备方法
富含异鼠李素的面霜，包括如下质量百分比的组分：水88.8％；甘油5％；异鼠李素5％；β-谷甾醇0.5％；山梨坦倍半油酸酯0.1％；对羟基苯乙酮0.5％；EDTA二钠0.1％。
富含异鼠李素的面霜的制备方法，将如下质量百分比的组分：水88.8％；甘油5％；异鼠李素5％；β-谷甾醇0.5％；山梨坦倍半油酸酯0.1％；对羟基苯乙酮0.5％；EDTA二钠0.1％的各相混合加热到80到85摄氏度使其完全溶解，搅拌均匀，冷却至室温即。
富含异鼠李素的精华，包括如下质量百分比的组分：水84.55％；甘油5％；丁二醇5％；1,2-戊二醇2％；聚天冬氨酸钠0.5％；异鼠李素2％；β-谷甾醇0.5％；乳糖0.1％；扁桃酸0.1％；凝血酸0.05％；1,2-己二醇0.1％；EDTA二钠0.05％；黄原胶0.05％。
富含异鼠李素的精华的制备方法，将如下质量百分比的组分：水84.55％；甘油5％；丁二醇5％；1,2-戊二醇2％；聚天冬氨酸钠0.5％；异鼠李素2％；β-谷甾醇0.5％；乳糖0.1％；扁桃酸0.1％；凝血酸0.05％；1,2-己二醇0.1％；EDTA二钠0.05％；黄原胶0.05％的各相混合加热到60到80摄氏度使其完全溶解，搅拌均匀，冷却至室温即。
富含异鼠李素的面膜及其制备方法
富含异鼠李素的面膜，包括面膜液、浸有面膜液的面膜基质，面膜液包括如下质量百分比的组分：甘油5～10份、1,3-丁二醇1～5份、1,2-丙二醇4～8份、无患子酵素20～40份、海藻酸钠1～3份、乙二胺四乙酸二钠0.1～0.3份、丙酸0.1～0.3份、龙脑精油0.00001-0.01份、去离子水30～40份、异鼠李素0.01～10份，异鼠李素可通过添加异鼠李素直接获得或通过添加含有异鼠李素的提取物间接获得。
富含异鼠李素的面膜的制备方法，步骤如下：
(1)制备面膜液的配料：按质量份数计，甘油5～10份、1,3-丁二醇1～5份、1,2-丙二醇4～8份、无患子酵素20～40份、海藻酸钠1～3份、乙二胺四乙酸二钠0.1～0.3份、丙酸0.1～0.3份、龙脑精油0.00001～0.01份、去离子水30～40份、异鼠李素0.01～10份；
(2)按照步骤(2)中的配料关系制备面膜液：
(3.1)将甘油、1,3-丁二醇、1,2-丙二醇以及部分去离子水混合，加热至60～70℃，搅拌混匀；
(3.2)加入无患子酵素20～40份、异鼠李素0.01～10份，保持50～65℃，搅拌均匀；
(3.3)用部分去离子水完全溶解海藻酸钠和乙二胺四乙酸二钠，并加入步骤
(3.2)的混合溶液中；
(3.4)搅拌降温至30～40℃，依次加入龙脑精油、丙酸和剩余去离子水；
(3)将面膜液进行辐照灭菌；
(4)将面膜液浸入面膜基质后，真空包装。
异鼠李素可通过添加异鼠李素直接获得或通过添加富含异鼠李素的银杏提取物获得。采用富含异鼠李素的银杏提取物时，富含异鼠李素的银杏提取物的质量份数为20～40份，富含异鼠李素的银杏提取物中异鼠李素的浓度为12.5μg/m。富含异鼠李素的银杏提取物可按照本文异鼠李素的提取方法进行提取获得。步骤(4)中，辐照灭菌的条件为：采用吸收剂量为3～5KGy的60 Co-γ射线电离辐照15～30min。
具体实施例1
富含异鼠李素的银杏提取物祛痘面膜，按质量份数计，包含的成分如下：甘油5份、1,3-丁二醇1份、1,2-丙二醇4份、无患子酵素20份、富含异鼠李素的银杏提取物20份、海藻酸钠1份、乙二胺四乙酸二钠0.1份、食品级丙酸0.1份、龙脑精油0.00005份、去离子水40份。
制备方法为：
(1)将甘油、1,3-丁二醇、1,2-丙二醇置于烧杯中，加入适量的去离子水，加热至60℃，采用玻璃棒搅拌使其充分混匀，搅拌速率为70r/min；
(2)将无患子酵素、富含异鼠李素的银杏提取物加入步骤(1)中，保持65℃，搅拌均匀，搅拌速率为65r/min；
(3)将海藻酸钠、乙二胺四乙酸二钠采用适量去离子水溶解完全后，加入步骤(2)中；
(4)搅拌降温至40℃(搅拌速率为70r/min)，将龙脑精油、丙酸依次加至步骤(3)中，并将去离子水补足，得到面膜液；
(5)采用吸收剂量为3KGy的60 Co-γ射线电离辐照15min，再将面膜基质浸润于面膜液中，然后真空包装，制备出具有祛痘的面膜产品。
具体实施例2
富含异鼠李素的银杏提取物祛痘面膜，按质量份数计，包含的成分如下：甘油5份、1,3-丁二醇2份、1,2-丙二醇5份、无患子酵素25份、异鼠李素5份、海藻酸钠1份、乙二胺四乙酸二钠0.1份、食品级丙酸0.15份、龙脑精油0.0001份、去离子水35份。
制备方法，包括以下步骤：
(1)将甘油、1,3-丁二醇、1,2-丙二醇置于烧杯中，加入适量的去离子水，加热至60℃，采用玻璃棒搅拌使其充分混匀，搅拌速率为70r/min；
(2)将无患子酵素、异鼠李素加入步骤(1)中，保持65℃，搅拌均匀，搅拌速率为70r/min；
(3)将海藻酸钠、乙二胺四乙酸二钠采用适量去离子水溶解完全后，加入步骤(2)中：
(4)搅拌降温至40℃(搅拌速率为75r/min)，将龙脑精油、丙酸依次加至步骤(3)中，并将去离子水补足，得到面膜液；
(5)采用吸收剂量为3.5KGy的60 Co-γ射线电离辐照20min，再将面膜基质浸润于面膜液中，然后真空包装，制备出具有抑菌祛痘的面膜产品。
具体实施例3
富含异鼠李素的银杏提取物祛痘面膜，按质量份数计，包含的成分如下：甘油7份、1,3-丁二醇3份、1,2-丙二醇6份、无患子酵素30份、异鼠李素9份、海藻酸钠1份、乙二胺四乙酸二钠0.15份、食品级丙酸0.1份、龙脑精油0.0004份、去离子水35份。
制备方法，包括以下步骤：
(1)将甘油、1,3-丁二醇、1,2-丙二醇置于烧杯中，加入适量的去离子水，加热至60℃，采用玻璃棒搅拌使其充分混匀，搅拌速率为75r/min；
(2)将无患子酵素、异鼠李素加入步骤(1)中，保持65℃，搅拌均匀，搅拌速率为80r/min；
(3)将海藻酸钠、乙二胺四乙酸二钠采用适量去离子水溶解完全后，加入步骤(2)中：
(4)搅拌降温至40℃(搅拌速率为75r/min)，将龙脑精油、丙酸加至步骤(3)中，并将去离子水补足，得到面膜液；
(5)采用吸收剂量为4KGy的60 Co-γ射线电离辐照25min，再将面膜基质浸润于面膜液中，然后真空包装，制备出具有抑菌祛痘的面膜产品。
具体实施例4
富含异鼠李素的银杏提取物祛痘面膜，按质量份数计，包含的成分如下：甘油7份、1,3-丁二醇5份、1,2-丙二醇8份、无患子酵素30份、异鼠李素2份、海藻酸钠1.5份、乙二胺四乙酸二钠0.2份、食品级丙酸0.15份、龙脑精油0.0007份、去离子水35份。
制备方法为：
(1)将甘油、1,3-丁二醇、1,2-丙二醇置于烧杯中，加入适量的去离子水，加热至60℃，采用玻璃棒搅拌使其充分混匀，搅拌速率为80r/min；
(2)将无患子酵素、富含异鼠李素的银杏提取物加入步骤(1)中，保持65℃，搅拌均匀，搅拌速率为80r/min；
(3)将海藻酸钠、乙二胺四乙酸二钠采用适量去离子水溶解完全后，加入步骤(2)中：
(4)搅拌降温至40℃(搅拌速率为85r/min)，将龙脑精油、丙酸加至步骤(3)中，并将去离子水补足，得到面膜液；
(5)采用吸收剂量为4.5KGy的60 Co-γ射线电离辐照25min，再将面膜基质浸润于面膜液中，然后真空包装，制备出具有祛痘的面膜产品。
具体实施例5
富含异鼠李素的银杏提取物祛痘面膜，按质量份数计，包含的成分如下：甘油9份、1,3-丁二醇4份、1,2-丙二醇6份、无患子酵素7份、富含异鼠李素的银杏提取物35份、海藻酸钠1.5份、乙二胺四乙酸二钠0.15份、食品级丙酸0.15份、龙脑精油0.001份、去离子水30份。
制备方法为：
(1)将甘油、1,3-丁二醇、1,2-丙二醇置于烧杯中，加入适量的去离子水，加热至60℃，采用玻璃棒搅拌使其充分混匀，搅拌速率为85r/min；
(2)将无患子酵素、富含异鼠李素的银杏提取物加入步骤(1)中，保持65℃，搅拌均匀，搅拌速率为80r/min；
(3)将海藻酸钠、乙二胺四乙酸二钠采用适量去离子水溶解完全后，加入步骤(2)中：
(4)搅拌降温至40℃(搅拌速率为85r/min)，将龙脑精油丙酸、加至步骤(3)中，并将去离子水补足，得到面膜液；
(5)采用吸收剂量为5KGy的60 Co-γ射线电离辐照20min，再将面膜基质浸润于面膜液中，然后真空包装，制备出具有抑菌祛痘的面膜产品。
对照例1，对照例1的具体实施方式同实施例1，不同之处在于，所述的富含异鼠李素的银杏提取物更换为等质量份数的去离子水。
对照例2，对照例2的具体实施方式同实施例2，不同之处在于，所述的富含异鼠李素的银杏提取物更换为等质量份数的去离子水。
对照例3，照例3的具体实施方式同实施例3，不同之处在于，所述的富含异鼠李素的银杏提取物更换为等质量份数的去离子水。
对照例4，对照例4的具体实施方式同实施例4，不同之处在于，所述的富含异鼠李素的银杏提取物更换为等质量份数的去离子水。
对照例5，对照例5的具体实施方式同实施例5，不同之处在于，所述的富含异鼠李素的银杏提取物更换为等质量份数的去离子水。
性能评价
1.稳定性测试
耐寒性实验：取实施例1～5与对照例1～5中的面膜液各5mL，于-20℃下的冰箱中储存24h后取出，置于25℃的室温下放置20min，观察产品是否有分层或浮油现象发生，其色泽和状态是否发生变化。若面膜液保持透明、无沉淀、无浮油、无颜色气味发生改变记录为温度，否则记录为不稳定。
耐热性实验：称取实施例1～5与对照例1～5中的面膜液各5mL，于40℃下的恒温电热水浴锅中水浴8h左右，观察是否有油水分离现象，色泽是否发生变化。若面膜液保持透明、无分层、无颜色气味发生改变记录为温度，否则记录为不稳定。
离心稳定性实验：称取实施例1～5与对照例1～5中的面膜液各5mL，于25℃室温下，采用4000r/min转速，离心30min，观察是否出现结块或颗粒状成分析出的乳析现象。若面膜液保持透明、无结块、无颜色气味发生改变记录为稳定，否则记录为不稳定。测试结果如表1所示。
表1性能表征测试
Figure BDA0002627615440000111
异鼠李素祛痘效果实验，参照图1、2、3
消炎祛痘模型的建立
实验材料：单核细胞THP-1细胞购于中国科学院细胞所，IL-1βELISA试剂盒购自上海威奥生物，碎肉培养基基础、庖牛肉丁购自青岛日水生物，RPMI-1640培养基购自GIBCO公司。
实验方法：痤疮丙酸杆菌(P.acnes)培养于含1/3(体积)庖肉的碎肉培养基中，恒温37℃厌氧培养，4-5天传代一次。
THP-1细胞培养于含10％胎牛血清、100units/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，置于37℃恒温，5％CO2及饱和湿度的培养箱培养，每2-3天传代一次。
取指数生长期的细胞，用培养液调节细胞密度约为1×106/mL，接种于96孔培养板中，取厌氧培养72h的痤疮丙酸杆菌离心，用PBS溶液清洗3-4次，制成活菌悬液或热灭火菌悬液(80℃水浴加热30min)，按细菌：细胞(1:1，10:1，100:1)的比例加入96孔板中，以不加药物孵育为阴性对照，以只加PBS溶液为空白对照。置于37℃恒温，5％CO2及饱和湿度的培养箱培养24h。采用ELISA法测细胞上清中IL-1β的含量变化。
ELISA法：(1)确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目，并增加1孔作为TMB空白显色孔。(2)将300pg/mL，150pg/mL，750pg/mL,37.5pg/mL，18.75pg/mL，9.375pg/mL，4.6875pg/mL，1.56pg/mL的标准品各0.1mL依次加入一排7孔中，1孔只加供试物稀释液的作为零孔。将已用供试物稀释液稀释的供试物100μL加入孔中。37℃反应40min。(3)除去酶标板内液体，将准备好的抗人IL-1β抗体工作液按每孔0.1mL依次加入。(TMB空白显色孔除外)。37℃反应20min。(4)除去酶标板内液体，PBS洗涤3次，每次浸泡1min左右。(5)将准备好的ABC工作液按每孔0.1mL依次加入(TMB空白显色孔除外)。37℃反应10min。(6)除去酶标板内液体，PBS洗涤5次，每次浸泡1-2min左右。(7)按每孔0.1mL依次加入已在37℃平衡30min的TMB显色液，37℃避光反应15min。(8)按每孔0.1mL依次加入TMB终止液。(9)用酶标仪在450nm测定OD值。(10)根据供试物的吸光值在标准曲线上找出对应的浓度。
用不同P.acnes(热灭火菌和活菌)菌浓度及时间刺激THP-1细胞，当细菌浓度较低，或是热灭活时，IL-1β的分泌量较少；当选择活菌，菌浓度较高时，细胞上清液中IL-1β含量较多，变化显著。同时，活细菌：细胞＝100:1、孵育24h后，用台盼蓝对细胞染色，发现活痤疮丙酸杆菌对细胞的存活无显著影响。因此，后续实验中选用活细菌：细胞＝100:1，孵育24h。
供试物对THP-1细胞存活率的影响：
采用噻唑兰(MTT)法检测供试物对THP-1细胞增殖的影响。
取指数生长期的细胞，用培养液调节细胞密度约为2×104cells/mL，接种于96孔培养板中，加不同浓度供试物(终浓度为6.25μM，12.5μM，25μM，50μM，100μM)，孵育48h。测定细胞增殖率时，每孔加入20μL的MTT(5mg/mL)，保证每孔内加入终浓度为0.5mg/mL，置CO2培养箱中继续培养4h后，1700rpm离心，小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150μL DMSO，振荡1min，使结晶物完全溶解，放置于酶标仪，选取570nm为测量波长，630nm为参照波长测光吸收值。
细胞存活率＝检测组的OD平均值/对照组的OD平均值×100％。
采用MTT法测试供试物对THP-1细胞的毒性作用，其目的在于找出一个合适的安全剂量范围。通过MTT法，研究了不同浓度的供试物对细胞的增殖作用影响。异鼠李素在小于等于12.5μM时，THP-1细胞存活率大于80％，且细胞形态没有明显改变。
供试物对THP-1细胞中IL-1β分泌的影响：
THP-1细胞发生炎症反应时，特异性产生IL-1β，故通常作为筛选的指标。
THP-1细胞培养于含10％胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中，置于37℃恒温，5％CO2及饱和湿度的培养箱培养，每2-3天传代一次。
取指数生长期的细胞，用培养液调节细胞密度约为1×106/mL，接种于96孔培养板中，加不同浓度的供试物(每种供试物允许的最高浓度)，孵育4h。取厌氧培养72h的痤疮丙酸杆菌，离心，用PBS溶液清洗3-4次，制成活菌悬液，按细菌：细胞(100:1)的比例加入96孔板中，以不加药物孵育为阴性对照，以只加PBS溶液为空白对照。置于37℃恒温，5％CO2及饱和湿度的培养箱培养24h。采用ELISA法测细胞上清中IL-1β的含量变化。
抑制率＝(阴性对照组IL-1β量-加药组IL-1β量)/阴性对照组IL-1β量×100％。
以痤疮丙酸杆菌诱导的THP-1细胞作为阴性对照，浓度12.5μg/mL的异鼠李素能明显抑制细胞模型中炎症细胞因子IL-1β的分泌，抑制率为41.26％。
供试物对THP-1细胞NF-κB核质转移的影响：
取指数生长期的THP-1细胞，用培养液调节细胞密度约为1×106/mL，接种于6孔培养板中，加不同浓度的供试物孵育4h。取厌氧培养72h的痤疮丙酸杆菌，离心，用PBS溶液清洗3-4次，制成活菌悬液，按细菌：细胞(100:1)的比例加入6孔板中，以只加PBS溶液为空白对照，以不加药物孵育为阴性对照。置于37℃恒温，5％CO2及饱和湿度的培养箱培养1h。采用细胞免疫荧光法测细胞中NF-κB核质转移情况，方法如下：
(1)细胞固定：用细胞固定液(4％的多聚甲醛)在室温下固定20min,固定完毕后，用PBS洗细胞2次，每次5min，并用800rpm离心5min，收集细胞。
(2)细胞穿膜：用穿膜剂(0.3％的Triton X-100)在室温中穿膜10min，穿膜完毕后，用PBS洗细胞2次，每次5min，并用800rpm离心5min，收集细胞。
(3)封闭：用封闭液(3％BSA-PBS)在室温封闭1h，用800rpm离心5min，收集细胞。
(4)一抗孵育：用100μL稀释好的兔抗人TLR2抗体(1:50稀释)重悬细胞，并于4℃孵育过夜，孵育完成后用PBS洗细胞两次，每次,5min，并用800rpm离心5min，收集细胞。
(5)二抗孵育：用稀释好的FITC标记的羊抗兔抗体(1:100稀释)重悬细胞，避光条件下室温孵育1h，之后PBS洗细胞两次，每次5min，并用800rpm离心5min，收集细胞。
(6)核染料孵育：用稀释好的DAPI染料染色2min，之后用PBS洗细胞两次，每次5min，并用800rpm离心5min，收集细胞。
(7)封片：将细胞涂到玻片上，室温避光晾干，之后用抗荧光猝灭封片液封片，待观测。
未加P.acnes处理的细胞中，NF-κB p65存在与细胞质中，而加P.acnes处理1h后的细胞中，NF-κB p65明显移至细胞核区域，同时荧光强度增加，说明NF-κB p65含量也上升。用异鼠李素预处理4h的细胞中，NF-κB p65相对于只加P.acnes的组别，含量降低，同时移向细胞核的减少。
异鼠李素抗氧化效果实验
DPPH(二苯代苦味酰基自由基)是一种稳定的长寿命自由基，其乙醇溶液呈深紫色，在517nm附近有强吸收。当有自由基清除剂存在时，由于与其单电子配对而使DPPH光吸收减弱。DPPH乙醇溶液退色程度与其接受的电子数呈定量关系，借此可评价抗氧化剂清除自由基的能力或抗氧化活性的大小。
试剂与仪器
试剂：DPPH为SIGMA试剂；无水乙醇、维生素C/维生素均购自弗霓
仪器：酶标仪
实验步骤
DPPH测试液的配制
取DPPH 12mg溶于100ml溶剂无水乙醇中，超声5min使溶液均匀。检测时DPPH溶液的OD值需在1.0-1.5之间在最佳。DPPH溶液需避光保存，现用现配。
样品液的配制
异鼠李素用无水乙醇溶解，配制成1mg/ml的异鼠李素溶液。
预试
取DPPH溶液0.5ml，往其中先少后多逐加样品液，边加边振荡，并观察溶液的褪色情况，当溶液颜色基本退去时，记下样品的加样量，此即为样品的最大用量，在此最大用量的基础上，往前设置浓度梯度。
实验步骤：实验分为样品组，记为T；样品对照组，记为T0；阴性对照组，记为C；空白对照组，记为C0，实验设置3个复孔，取均值。
室温避光反应10min后，在517nm处测定其光密度值(OD)。
DPPH自由基清除率(抑制率)用下式计算：
Figure BDA0002627615440000151
其中：T为样品管OD；T0为样品对照管OD；C为阴性对照管OD；C0为空白对照管OD。
清除率越大表明抗氧化能力越强，当溶液中不存在DPPH自由基时，空白组的DPPH清除率为0，本发明异鼠李素对DPPH自由基的去除率为76.2 3％。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种富含异鼠李素的护肤品，其特征在于，包括质量百分比为0.01％～10％的异鼠李素，异鼠李素可通过添加异鼠李素直接获得或通过添加含有异鼠李素的提取物间接获得，富含异鼠李素的护肤品的剂型为溶液、乳液、悬浮液、霜、凝胶、泡沫或喷雾。
2.根据权利要求1的一种富含异鼠李素的护肤品，其特征在于，异鼠李素的质量百分比为0.1％～5％。
3.一种异鼠李素的提取方法，其特征在于，以新鲜的银杏叶片，经60℃烘干24h，粉碎，过筛；
然后，装入超声萃取釜中，加入45％乙醇，料液比1Kg∶17L-19L，混合；
然后，过滤，弃去滤渣，得富含异鼠李素的银杏提取物。
4.一种富含异鼠李素的面霜，其特征在于，包括如下质量百分比的组分：水88.8％；甘油5％；异鼠李素5％；β-谷甾醇0.5％；山梨坦倍半油酸酯0.1％；对羟基苯乙酮0.5％；EDTA二钠0.1％。
5.富含异鼠李素的面霜的制备方法，其特征在于，将如下质量百分比的组分：水88.8％；甘油5％；异鼠李素5％；β-谷甾醇0.5％；山梨坦倍半油酸酯0.1％；对羟基苯乙酮0.5％；EDTA二钠0.1％的各相混合加热到80到85摄氏度使其完全溶解，搅拌均匀，冷却至室温即。
6.一种富含异鼠李素的精华，其特征在于，包括如下质量百分比的组分：水84.55％；甘油5％；丁二醇5％；1,2-戊二醇2％；聚天冬氨酸钠0.5％；异鼠李素2％；β-谷甾醇0.5％；乳糖0.1％；扁桃酸0.1％；凝血酸0.05％；1,2-己二醇0.1％；EDTA二钠0.05％；黄原胶0.05％。
7.富含异鼠李素的精华的制备方法，其特征在于，将如下质量百分比的组分：水84.55％；甘油5％；丁二醇5％；1,2-戊二醇2％；聚天冬氨酸钠0.5％；异鼠李素2％；β-谷甾醇0.5％；乳糖0.1％；扁桃酸0.1％；凝血酸0.05％；1,2-己二醇0.1％；EDTA二钠0.05％；黄原胶0.05％的各相混合加热到60到80摄氏度使其完全溶解，搅拌均匀，冷却至室温即。
8.一种富含异鼠李素的面膜，包括面膜液、浸有面膜液的面膜基质，其特征在于，面膜液包括如下质量百分比的组分：甘油5～10份、1,3-丁二醇1～5份、1,2-丙二醇4～8份、无患子酵素20～40份、海藻酸钠1～3份、乙二胺四乙酸二钠0.1～0.3份、丙酸0.1～0.3份、龙脑精油0.00001-0.01份、去离子水30～40份、异鼠李素0.01～10份，异鼠李素可通过添加异鼠李素直接获得或通过添加含有异鼠李素的提取物间接获得。
9.富含异鼠李素的面膜的制备方法，其特征在于，步骤如下：
(1)制备面膜液的配料：按质量份数计，甘油5～10份、1,3-丁二醇1～5份、1,2-丙二醇4～8份、无患子酵素20～40份、海藻酸钠1～3份、乙二胺四乙酸二钠0.1～0.3份、丙酸0.1～0.3份、龙脑精油0.00001～0.01份、去离子水30～40份、异鼠李素0.01～10份；
(2)按照步骤(2)中的配料关系制备面膜液：
(3.1)将甘油、1,3-丁二醇、1,2-丙二醇以及部分去离子水混合，加热至60～70℃，搅拌混匀；
(3.2)加入无患子酵素20～40份、异鼠李素0.01～10份，保持50～65℃，搅拌均匀；
(3.3)用部分去离子水完全溶解海藻酸钠和乙二胺四乙酸二钠，并加入步骤(3.2)的混合溶液中；
(3.4)搅拌降温至30～40℃，依次加入龙脑精油、丙酸和剩余去离子水；
(3)将面膜液进行辐照灭菌；
(4)将面膜液浸入面膜基质后，真空包装。
10.根据权利要求9的富含异鼠李素的面膜的制备方法，其特征在于，异鼠李素可通过添加异鼠李素直接获得或通过添加富含异鼠李素的银杏提取物获得，
采用富含异鼠李素的银杏提取物时，富含异鼠李素的银杏提取物的质量份数为20～40份，富含异鼠李素的银杏提取物中异鼠李素的浓度为12.5μg/m。
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