CN112175985A

CN112175985A - 提高豆科植物除草剂抗性的方法及其应用

Info

Publication number: CN112175985A
Application number: CN202010956094.5A
Authority: CN
Inventors: 席真; 王宁宁; 韦韬
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2020-09-11
Filing date: 2020-09-11
Publication date: 2021-01-05
Anticipated expiration: 2040-09-11
Also published as: CN112175985B

Abstract

本发明涉及基因工程领域，公开了突变除草剂靶标蛋白中的至少一个氨基酸位点以提高豆科植物除草剂抗性的方法在制备具有除草剂抗性的豆科植物中的用途。该方法能够有效解决现有技术中对豆科植物难以采用CRISPR/Cas9介导的单碱基编辑技术进行抗除草剂育种的问题。通过该方法制备获得的豆科植物植株具有明显抗除草剂的特性，将其应用于豆科植物尤其是大豆的育种和种植中可以很好地解决杂草防治中除草剂对作物生长具有负面影响的问题，有效避免了除草剂使用不当对作物生产的不利影响。

Description

提高豆科植物除草剂抗性的方法及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及豆科植物除草剂抗性的方法及其应用。

背景技术

杂草在农作物生长过程中，不仅与作物争夺光照、生长空间与营养物质等，还会传播病虫害，释放有毒物质造成粮食减产。因此，为了避免杂草对粮食生产的危害，在农作物种植过程中往往会进行杂草防治。目前最常用的防治方法是喷施除草剂，该方法不仅省时省力，而且效果明显。但是，除草剂喷施过程中不可避免的会与农作物进行接触，在防治杂草的同时对农作物也造成了一定伤害，对于某些除草剂敏感的农作物而言，除草剂使用不当极容易导致作物死亡，对粮食产量提升和农民增收造成阻碍。因此，为了确保粮食产量和农民收入，亟需开发新型抗除草剂大豆品种。

植物基因组编辑技术为植物基础科学和育种领域的革命提供了巨大的希望，为定向开发植物品种提供了可能。其中，CRISPR/Cas9介导的单碱基编辑技术可以在不产生双链断裂的情况下实现靶向核苷酸替换(C到T或G到A)，这可以大大提高基因的碱基特异性替换效率。近来，利用CRISPR/Cas9介导的单碱基编辑技术研究人员成功地在西瓜、小麦和油菜的AHAS基因上引入了单碱基突变，获得了相应的抗除草剂品种。

豆科植物中有大量极具经济价值的作物，其中，大豆是人类食物中植物蛋白的主要来源，也是植物油脂的主要来源之一。然而，豆科植物基因组复杂，例如大豆是古四倍体，其基因有约75％是以同源基因的形式表现的。由于大豆基因组结构复杂，同源基因较多，难以设计突变位点，而且对大豆进行基因编辑容易脱靶，造成筛选困难等问题，并且大豆的遗传转化还存在着流程复杂、周期长、效率低和成功率低的缺陷，极大限制了大豆基因组研究的发展，也使得基因编辑技术在大豆育种中应用受到了极大阻碍。到目前为止，尚未有利用CRISPR/Cas9介导的单碱基编辑技术对豆科植物基因进行定点编辑，获得抗除草剂的豆科植物的报道。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题，提供突变除草剂靶标蛋白中的至少一个氨基酸位点以提高豆科植物除草剂抗性的方法在制备具有除草剂抗性的豆科植物中的用途，通过该方法制备获得的豆科植物能够具有抗除草剂的特性，将其应用于豆科植物育种和种植中可以很好地解决种植过程中的杂草防治问题，有效避免了除草剂使用不当对豆科植物生产的不利影响。

为了实现上述目的，本发明一方面提供突变除草剂靶标蛋白中的至少一个氨基酸位点以提高豆科植物除草剂抗性的方法在制备具有除草剂抗性的豆科植物中的用途。

本发明第二方面提供一种提高豆科植物除草剂抗性的方法，所述方法包括突变除草剂靶标蛋白中的至少一个氨基酸位点以提高豆科植物除草剂抗性。

本发明第三方面一种提高豆科植物除草剂抗性的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)通过生物大分子定量构效关系建立对应的生物大分子定量构效关系模型，对豆科植物中除草剂靶标蛋白抗性突变体进行抗性突变预测，初步筛选对除草剂具有较高抗性的除草剂靶标蛋白单点突变体和/或多点突变体；

(2)通过定点突变技术，构建步骤(1)中初步筛选的突变体，并对其进行体外筛选，获得具有除草剂抗性的突变体；

(3)根据步骤(2)的结果，利用单碱基编辑技术对豆科植物除草剂靶标蛋白进行定点修饰，将步骤(2)中体外筛选获得的具有除草剂抗性的突变体引入豆科植物植株，并对其进行培育和传代，获得纯合子代。

本发明第四方面提供上述方法在豆科植物育种中的应用。

通过上述技术方案，本发明采用生物大分子定量构效关系(MB-QSAR)对大豆中除草剂靶标蛋白抗性突变进行预测，建立对应的MB-QSAR模型，利用计算机技术进行靶标蛋白抗性突变体筛选，节约了大量实验的时间和材料，再对初步筛选的突变体进行体外筛选，最后利用CRISPR/Cas9介导的单碱基编辑技术将体外筛选获得的抗性突变引入豆科植物植株。实现了短时间、高通量、高效率的靶标蛋白抗性突变体筛选和转化。并通过该方法首次获得了不含转基因成分的抗除草剂大豆植株(例如GmAHAS4基因发生P180S纯合突变的抗除草剂大豆植株)，该方法的推广和应用可以很好的解决豆科植物，尤其是大豆种植过程中的杂草防治问题，为培育抗除草剂大豆新品种提供理论和实验基础，在既能够采用喷施除草剂的简单经济的防治方法的同时，将除草剂对大豆生产的影响降到最低。

附图说明

图1是T0代基因编辑材料的测序结果图；

图2是野生型和纯合突变材料的测序结果对比图；

图3是野生型和纯合突变材料的除草剂抗性对比图。

具体实施方式

以下将对本申请的具体实施方式进行详细阐述，应当能够理解的是，以下具体实施方式仅用于解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

术语解释：

生物大分子定量构效关系(MB-QSAR)：小分子3D-QSAR是上世纪八十年代末期出现的小分子性质预测和结构优化方法。该方法利用小分子周围三维空间中的分子场数值与小分子性质进行定量相关，从而实现对小分子性质的预测和提供化学直观的三维构效关系。按照该方法的基本原理，如果认为一系列具有类似结构作用域的蛋白大分子结合空腔中的分子场与蛋白大分子性质也存在定量关系，那么3D-QSAR同样可以用来实现对一系列蛋白大分子的定量构效关系研究。基于此，本发明的发明人发展了蛋白大分子MB-QSAR(Mutation-dependent Biomacromolecular Quantitative Structure ActivityRelationship，即本发明中所述生物大分子定量构效关系)方法用于蛋白大分子分析研究。

生物大分子定量构效关系模型：在小分子的3D-QSAR研究中，当小分子具有不同的取代基时，会造成小分子周围空间分子场的变化从而影响小分子活性。而对于蛋白大分子，氨基酸残基的突变会影响蛋白局部结构的变化，同样造成局部三维空间中分子场的改变，而影响蛋白大分子与小分子相互作用的敏感程度。因此对小分子3D-QSAR方法进行改造，发展适用于生物大分子的3D-QSAR方法，利用生物大分子的3D-QSAR方法研究一系列蛋白大分子类似结构周围三维空间中的分子场分布，并将分子场与蛋白大分子与小分子相互作用的性质进行统计相关，得到能定量描述蛋白大分子的QSAR模型，此即为MB-QSAR(Mutation-dependent Biomacromolecular Quantitative Structure Activity Relationship)的基本思路。

乙酰羟酸合成酶：乙酰羟酸合成酶是微生物体和植物体中支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)合成途径中的关键性酶，其催化两分子的丙酮酸缩合生成2-乙酰乳酸，或催化一分子的丙酮酸与另一分子的2-酮丁酸形成2-乙酰-2-羟基丁酸。乙酰羟酸合成酶是迄今为止最重要的绿色除草剂作用靶标之一。

定点突变技术：是指通过聚合酶链式反应(PCR)或基因编辑等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除、(单/多)点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。

本发明的发明人在研究的过程中巧妙地发现，当将豆科植物的除草剂靶标蛋白中的一个或多个氨基酸位点进行突变时，能够获得具有较强的除草剂抗性的豆科植物植株。

本发明第一方面提供突变除草剂靶标蛋白中的至少一个氨基酸位点以提高豆科植物除草剂抗性的方法在制备具有除草剂抗性的豆科植物中的用途。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述用途可以包括任意本领域内现有制备具有除草剂抗性的豆科植物的用途。例如，可以是通过该方法制备具有除草剂抗性的豆科植物，从而为开发新的豆科植物品种提供参考；还可以是通过该方法制备具有除草剂抗性的豆科植物，作为抗除草剂模式生物进行相应的研究工作等。

所述豆科植物可以是本领域内任意现有的豆科植物。根据本发明的优选实施方式，所述豆科植物可以是选自大豆、花生、蚕豆、豌豆、赤豆、绿豆、豇豆、四季豆和扁豆中的至少一种。例如，可以是任意野生型的上述豆科植物，也可以是经过培养、驯化、改造的上述豆科植物品种。

任意本领域内现有的豆科植物除草剂靶标蛋白均可适用于本发明提供的方法。根据本发明的优选实施方式，其中，所述除草剂靶标蛋白选自乙酰羟酸合成酶、乙酰辅酶A羧化酶、原卟啉原氧化酶、八氢番茄红素脱氢酶、对羟苯基丙酮酸双氧化酶、5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、谷氨酰胺合成酶和二氢蝶酸合成酶中的至少一种。

本领域技术人员根据本领域一般技术常识和本发明的上述内容能够很容易获知，本发明提供的提高豆科植物除草剂抗性的方法中所述豆科植物与上述用途中的豆科植物相同，在此不再赘述。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述除草剂靶标蛋白中的氨基酸位点选自乙酰羟酸合成酶1的103位丙氨酸、178位脯氨酸、186位丙氨酸、357位天冬氨酸、358位精氨酸、555位色氨酸、634位丝氨酸，乙酰羟酸合成酶2的107位丙氨酸、182位脯氨酸、190位丙氨酸、361位天冬氨酸、362位精氨酸、560位色氨酸、639位丝氨酸，乙酰羟酸合成酶3的97位丙氨酸、172位脯氨酸、180位丙氨酸、351位天冬氨酸、352位精氨酸、549位色氨酸、628位丝氨酸，乙酰羟酸合成酶4的105位丙氨酸、180位脯氨酸、188位丙氨酸、359位天冬氨酸、360位精氨酸、557位色氨酸、636位丝氨酸中的至少一种。

上述任意氨基酸位点发生的任意突变均可适用于本发明提供的方法。根据本发明的优选实施方式，其中，所述除草剂靶标蛋白氨基酸位点发生的突变选自将脯氨酸突变为丝氨酸/亮氨酸/苏氨酸/丙氨酸/组氨酸/谷氨酰胺/精氨酸/谷氨酸/异亮氨酸/酪氨酸、将丙氨酸突变为苏氨酸/缬氨酸/酪氨酸/苯丙氨酸、将天冬氨酸突变为谷氨酸、将色氨酸突变为亮氨酸/甘氨酸/蛋氨酸、将丝氨酸突变为天冬氨酰/苏氨酸/异亮氨酸中的至少一种。

本发明的发明人在研究的过程中发现，通过生物大分子定量构效关系(MB-QSAR)模型对目标基因/蛋白的突变体进行模拟和计算，可以对其功能改变可行性和改变程度进行预测。从而可以利用计算机技术，对预期突变效果进行预测，完成突变体的初步筛选。再通过定点突变技术对初步筛选获得的突变体进行构建，进行体外筛选，最后通过农杆菌介导等转化手段，利用单碱基编辑技术将体外筛选获得的效果最理想的突变引入植株进行培育并进行效果验证。通过这样的方式，能够减少研究的盲目性和随机性(不确定性)，从而节约大量实验材料和时间，提高植物培育实验效率，节约实验成本。尤其是豆科植物基因组复杂，转化效率低，采用常规的转基因或杂交等方式进行育种时往往耗时长，而且经常会遭遇经过长时间实验后，最终获得的突变体植株测试结果仍不尽人意等问题。而利用MB-QSAR初筛，再利用定点突变技术进行体外筛选，最后利用单碱基编辑技术将筛选后的突变引入植株的实验方式能够有效解决上述豆科植物育种难的问题，为豆科植物育种提供新的思路和方式。

本发明第三方面提供一种提高豆科植物除草剂抗性的方法，所述方法包括以下步骤：

根据本发明的优选是实施方式，其中，所述豆科植物选自大豆、花生、蚕豆、豌豆、赤豆、绿豆、豇豆、四季豆和扁豆中的至少一种。

本发明的发明人在研究的过程中巧妙地发现，上述方法对于提高大豆植株的除草剂抗性尤其适用，采用该方法能够在较短时间内获得除草剂抗性得到提升的目标大豆植株。尤其是相比于现有技术中的筛选方法，本发明提供的方法在制备具有除草剂抗性的大豆时，其优质、高效、针对性强的特点尤为突出。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述豆科植物为大豆。

根据本发明的优选实施方式，其中，步骤(1)中所述除草剂选自磺酰脲类、磺酰胺羰基三唑啉酮类、咪唑啉酮类、嘧啶基硫代苯甲酸酯类和三唑并嘧啶类中的至少一种。

任意本领域现有活性组分为上述类别的除草剂均可适用于本发明，例如，氯磺隆、双草醚、阔草清、氟酮磺隆钠、灭草烟、咪草酸、甲氧咪草烟、甲咪唑烟酸、环酯草醚、嘧草醚、嘧草硫醚、丙苯磺隆钠盐、氟唑磺隆钠、噻酮磺隆、苯磺隆、氯嘧磺隆、氟嘧磺隆和甲磺隆等。

根据本发明的优选实施方式，其中，步骤(1)中所述靶标蛋白包括乙酰羟酸合成酶、乙酰辅酶A羧化酶、原卟啉原氧化酶、八氢番茄红素脱氢酶、对羟苯基丙酮酸双氧化酶、5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、谷氨酰胺合成酶和二氢蝶酸合成酶中的至少一种。

根据本发明的优选实施方式，其中，步骤(1)中，初步筛选对除草剂具有较高抗性的除草剂靶标蛋白单点突变体和/或多点突变体的方法为：根据MB-QSAR预测数据对突变体的抗性倍数(resistance fold，RF)进行计算，并对其进行抗性等级划分。其中，RF≤5为除草剂敏感(s)，5＜RF≤10为除草剂中等抗性(r)，RF＞10为除草剂高抗性(R)。将筛选出的评级为R的突变体作为具有较高抗性的突变体，进行定点突变构建和体外筛选。

根据本发明的优选实施方式，其中，步骤(2)中获得的具有除草剂抗性的突变体为选自乙酰羟酸合成酶4第180位脯氨酸发生单点突变的突变体。

优选地，所述突变体选自第180位脯氨酸突变为丝氨酸、亮氨酸、苏氨酸、丙氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、谷氨酸、异亮氨酸和酪氨酸的乙酰羟酸合成酶4突变体中的至少一种。

根据本发明的优选实施方式，其中，步骤(2)中获得的具有除草剂抗性的突变体为第180位脯氨酸突变为丝氨酸的乙酰羟酸合成酶4突变体。所述乙酰羟酸合成酶4突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选地，大豆中表达所述乙酰羟酸合成酶4突变体的DNA分子如SEQ ID NO:2所示。

根据本发明的优选实施方式，其中，步骤(2)中所述定点突变技术为CRISPR/Cas9介导的单碱基编辑技术。

优选地，所述单碱基编辑技术中采用的Cas9蛋白的氨基酸序列和sgRNA的种子序列的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

根据本发明的优选实施方式，其中，步骤(2)中体外筛选的方式为酶水平(蛋白质水平)上的筛选。

根据本发明的优选实施方式，其中，步骤(3)中根据步骤(2)中体外筛选的结果，将其中筛选获得的对除草剂抗性较高的突变体，利用单碱基编辑技术，对豆科植物除草剂靶标蛋白进行定点修饰，从而将步骤(2)中筛选获得的具有除草剂抗性的突变体引入豆科植物植株。

根据本发明的优选实施方式，其中，步骤(3)包括将如上所述的DNA分子(即SEQ IDNO:2所示的DNA分子)引入至大豆植株中，通过杂交、转育或回交的方式对该大豆植株进行培育和传代，获得具有180位脯氨酸突变为丝氨酸的乙酰羟酸合成酶4的大豆纯合子代。

根据本发明的优选实施方式，其中，步骤(3)中所述将具有除草剂抗性的突变体引入大豆植株的方式包括农杆菌介导转化法、基因枪法和原生质体转化法中的至少一种。

本发明第四方面提供如上所述的方法在豆科植物育种中的应用。

任意本领域内现有的豆科植物均可适用于本发明。根据本发明的优选实施方式，其中，所述豆科植物可以为选自大豆、花生、蚕豆、豌豆、赤豆、绿豆、豇豆、四季豆和扁豆等中的至少一种。例如，可以是任意野生型的上述豆科植物，也可以是经过培养、驯化、改造的上述豆科植物品种。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。应当能够理解的是，以下实施例仅用于进一步解释和说明本发明，而不用于限制本发明。

实施例1

本实施例用于说明通过MB-QSAR模型对大豆中除草剂靶标蛋白突变体性能的预测和筛选。

利用商品化除草剂(氯磺隆、双草醚、阔草清和氟酮磺隆钠)中的活性物质与大肠杆菌ⅡAHAS及其突变体的MB-QSAR模型，跨种属定量预测了这些除草剂与拟南芥AHAS及其突变体的相互作用，发现了对除草剂具有较高抗性的单点及多点突变体。

利用MB-QSAR模型对大豆4个AHAS酶活性空腔进行点突变后的除草剂抗性预测，发现GmAHAS4的P180S突变为除草剂抗性突变。

实验前期解析了大肠杆菌乙酰羟基酸合成酶同功酶II的晶体结构，获得该酶的大部分骨架结构。为了得到该酶的完整结构，采用同源模建的方式来获得，以拟南芥乙酰羟基酸合成酶的晶体结构(1YBH)为模板，在InsightII软件中同源模建得到大肠杆菌乙酰羟基酸合成酶的完整结构。为了得到氟酮磺隆钠以及氯磺隆分子与大肠杆菌乙酰羟基酸合成酶的复合物晶体结构，在同源模建的优化过程中，将氟酮磺隆钠或者氯磺隆小分子按照其在拟南芥乙酰羟基酸合成酶里的结合模式放入到了大肠杆菌乙酰羟基酸合成酶的结构中，采用一起优化的方式来得到复合物的三维结构。并且认为此复合物的构象为大肠杆菌乙酰羟基酸合成酶与氟酮磺隆钠或氯磺隆分子相互作用的活性构象，用此构象作为后续的突变体结构模建的模板，并且用此构象来构建后续的MB-QSAR模型。对于阔草清和双草醚分子，由于并无这两个分子与乙酰羟基酸合成酶的晶体结构报道，采用分子对接的方式获得这两个分子与大肠杆菌AHAS II催化亚基的作用模式。对接过程如下：野生型乙酰羟基酸合成酶的蛋白大分子受体采用上述同源模建方式得到的结构，阔草清或双草醚分子的结构在SYBYL软件中优化得到。分子对接采用AutoDock4.0软件进行，分子对接所采用的格子大小为

格子的步长为

格子的中心与结合空腔的中心近似重合。对接轮数为500轮。对接得到的拥有最低结合能的构象被确定为最终的复合物构象。至此得到了四个除草剂分子与野生型大肠杆菌AHAS II催化亚基的复合物结构。

对于大肠杆菌AHAS II突变体与不同除草剂分子的复合物结构，在SYBYL软件中利用模建的野生型复合物结构基础上得到。采用的具体步骤为：

1.首先通过SYBYL软件中的BIOPOLYMER模块进行酶的突变，将对应位置的氨基酸残基换为突变的残基。

2.对突变完的蛋白进行加氢原子操作，其中精氨酸和赖氨酸为质子化状态，谷氨酸和天冬氨酸为解离状态。组氨酸为中性状态，并且氢原子在delta氮原子上。

3.对加完氢原子的蛋白赋予电荷，采用AMBER电荷计算方式。

4.抑制剂小分子按照其在野生型的结合模式并入蛋白结构中，小分子赋予Gasteiger-Marsili形式电荷。将得到的复合物结构存为mol2格式，以进行后续工作。

至此得到了四种除草剂小分子与大肠杆菌乙酰羟酸合成酶蛋白突变体复合物的初始结构。

本发明利用前期工作中建立的四个除草剂(氯磺隆、双草醚、阔草清和氟酮磺隆钠)与大肠杆菌AHAS II的MB-QSAR/CoMFA模型预测了四个除草剂对野生型拟南芥或大豆AHAS催化亚基及突变体的表观抑制活性。

获得拟南芥AHAS中的除草剂抗性突变包括P197S、P197F、P197L、W574L、P197S-G654D、P197F-S653N、P197F-G654N、P197L-G654D、P197L-S653N、P197S-G654D-G655S、P197S-S653N-G654N、P197L-G654D-G655S、P197L-S653N-G654D、P197L-S653N-G655N、P197F-G654N-G655N、P197F-S653N-G655N等。

获得大豆AHAS4中的除草剂抗性突变包括A105V、P180S、P180F、P180L等。

实施例2

材料与方法

菌株：大肠杆菌DH5α，BL21(DE3)pLys S。获得方法详见He Y,Niu C,Li H,Wen X,Xi Z:Experimental and computational correlation and prediction on herbicideresistance for acetohydroxyacid synthase mutants to Bispyribac.Science China(Chemistry)2013,56:286–295.。

DNA测序委托天津擎科生物技术有限公司完成。

单点突变体的构建

采用“Dpn I消化”的突变方法，构建拟南芥AHAS和大豆AHAS4的单点突变体。根据实验设计选择突变位点设计正反向引物，以野生型拟南芥AHAS或大豆AHAS4质粒DNA为模板，进行PCR扩增，对PCR产物进行电泳检测。然后在PCR产物中加入适量的Dpn I酶，37度孵育2小时，消化掉野生型模板DNA。把消化后的PCR产物转化到大肠杆菌DH5α，过夜培养。从平板上挑起单菌落至2×YT培养基中，37℃过夜培养，然后制成甘油管，测序确认突变成功与否。

多点突变体的构建

基于无缝克隆技术的基因定点突变方法构建拟南芥AHAS的双点及三点突变体。根据实验设计，选择突变位点设计正反向引物，以野生型拟南芥AHAS质粒DNA为模板进行目的片段的PCR扩增，对PCR产物进行电泳检测，并用胶回收试剂盒纯化目的片段。按照无缝克隆和组装试剂盒说明书，进行载体和插入片段的组装反应。把组装后的产物转化到大肠杆菌DH5α，过夜培养。从平板上挑起单菌落至2×YT培养基中，37℃过夜培养，然后制成甘油管，送公司测序确认突变成功与否。

野生型和突变型AHAS的表达与纯化

把经测序验证的AHAS突变体转化到大肠杆菌BL21(DE3)pLys S中。从平板上挑取单菌落到20mL 2×YT(kana，50μg/mL)培养基中，37℃、200rpm过夜培养。第二天早上，把20mL的过夜培养物按照1：25的比例转到500mL 2×YT(Kana，50μg/mL)培养基中，37℃、200rpm培养到OD600nm＝0.7-0.8。然后加入适量的1M IPTG至终浓度为0.5mM。18℃、200rpm继续过液培养12h-16h。收获菌体。

把收获的沉淀按重悬在裂解缓冲液中(10mM imidazole，20μM FAD，0.5M NaCl，50mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM DTT)，加入溶菌酶lysome(1mg/mL))，冰浴0.5h。然后在0℃按(60×1s with 9s间歇)进行超声处理，超声时间至2min。然后在27000g，4℃，离心2h。上清用0.45μm微孔滤膜过滤后，加到预先装好Ni-NTA agarose的分离柱中，使蛋白与树脂充分结合后，用洗涤缓冲液(20mM imidazole，20μM FAD，0.5M NaCl，50mM Tris-HCl，pH 8.0，1mM DTT)把杂蛋白洗掉。用洗脱缓冲液(400mM imidazole，20μM FAD，0.5M NaCl，50mMTris-HCl，pH 8.0，1mM DTT)把目的蛋白洗脱出来。收集洗脱组份，然后在透析液中(50mM磷酸钾，pH 7.5，20μM FAD,1mM DTT)进行透析，除去咪唑。把纯化的蛋白分装成小份，在-80度保存。

蛋白质的浓度测定参照Bradford[1]的方法进行。

[1]Bradford M M.Rapid and sensitive method for quantitation ofmicrogram quantities of protein utilizing principle of protein dyebinding.Anal Biochem,1976,72:248-254.

AHAS的酶动力学和抑制动力学性质测定

拟南芥AHAS野生型及突变体的酶活性以及除草剂对野生型和突变体的抑制常数测定在westerfeld[2]和Singh等[3]方法的基础上稍有改进。

底物米氏常数(Km)的测定

反应液中含有50mmol/L磷酸钾缓冲液(pH7.5)，10mmol/L MgCl2,1mmol/L硫胺素焦磷酸(ThDP)，10μmol/L黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，以及各种浓度的丙酮酸，加入AHAS开始反应。先在37℃下孵育1h后，加入10μL 3mol/L的硫酸溶液终止反应；再在60℃下孵育15min，使乙酰乳酸转化为3-羟基丁酮；最后加入质量分数为0.5％的肌酸和质量分数为5％的α-萘酚，60℃下孵育15min进行显色，将96孔板放在酶标仪上，于λ＝525nm处测定吸光度。1单位(U)的酶活性定义为每分钟生成1μmol的乙酰乳酸。

丙酮酸的Km值测定参照文献[3]，采用方程(1)非线性回归方法拟合数据进行。

v＝Vmax/(1+Km/[S]) (1)

在方程中，v表示反应速率，Vmax表示最大反应速率，S是底物的浓度。

除草剂抑制常数的测定

除草剂用DMSO溶解。反应液中含有50mmol/L磷酸钾缓冲液(pH7.5)，10mmol/LMgCl2,1mmol/L硫胺素焦磷酸(ThDP)，10μmol/L黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)，50mmol/L丙酮酸，以及各种浓度的除草剂。每个除草剂的抑制常数重复测定3次。

[2]Westerfeld W W.A colorimetric determination of blood acetoin.JBiol Chem,1945,161:495-502.

[3]Singh B K,Stidham M A,Shaner D L.A ssay ofacetohydroxyacidsynthase.Anal Biochem,1988,171:173-179.

化合物的抑制常数Kiapp值通过方程(1)拟合得到。

νi＝ν∞+(ν0-ν∞)/(1+[I]/Kiapp) (2)

νi和ν0分别表示在抑制剂存在和不存在情况下的酶的速率(这里可以用相对活性表示)；[I]表示抑制剂的浓度；Kiapp为表观抑制常数，也就是在抑制剂抑制了AHAS酶50％的活性时所对应的浓度。如果测定结果表明，在饱和的抑制剂浓度下，酶几乎没有活性，可以令ν∞＝0，再拟合方程求出Kiapp值。

本实施例用于说明采用定点突变技术对实施例1中筛选获得的突变体进行构建，并在酶水平进行体外筛选。

本实施例中，对大豆GmAHAS4基因定点编辑通过农杆菌介导的遗传转化法实现，单碱基编辑载体pBSE901由中国农业大学姜临建老师惠赠(构建方法详见Chen Y，Wang Z，NiH，et al.CRISPR/Cas9-mediated base-editing system efficiently generates gain-of-function mutations in Arabidopsis[J].Science China Life Sciences，2017，60(5):520-523.)，sgRNA委托天津擎科生物技术有限公司合成。

选取GmAHAS4基因P180位点为定点编辑位点，将设计好的sgRNA种子序列(核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)连接到单碱基编辑载体pBSE901(其中含有氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示的Cas9蛋白)的BsaI酶切位点之间。

选取GmAHAS4基因A105位点为定点编辑位点，将设计好的sgRNA种子序列(核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)连接到单碱基编辑载体pBSE901(其中含有氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示的Cas9蛋白)的BsaI酶切位点之间。

实施例3

本实施例用于说明将实施例2中筛选获得的突变体引入大豆植株，并培养获得纯合突变子代。以及对该纯合突变子代植株的抗除草剂性能进行验证。

本实施例中，天隆一号(TL-1)大豆购自中国农业科学院油料作物研究所。氯磺隆购自天根生化科技(北京)有限公司。采用的其他除草剂均为市售产品。采用的农杆菌为本实验室保存(具体参见Liu S,Wang D,Mei Y,Xia T,Xu W,Zhang Y,You X,Zhang X,Li L,Wang NN:Overexpression of GmAAP6a enhances tolerance to lownitrogen andimproves seed nitrogen status by optimizingamino acid partitioning insoybean.Plant Biotechnology Journal 2020,18:1749–1762.)。转基因材料PCR测序委托天津擎科生物技术有限公司完成。

通过农杆菌介导的子叶节转化法，利用单碱基编辑技术对大豆乙酰羟酸合成酶4进行定点修饰，将实施例2中筛选获得的突变引入大豆栽培品种天隆1号(TL-1)。对获得的转基因材料进行PCR测序，成功获得P180位点发生定点突变的材料(即T0代植株，其测序结果如图1所示)。

将T0代植株进行自交，获得不含转基因成分的T1子代，对其进行PCR测序，结果(如图2所示)显示，这些T1子代即为180位点脯氨酸(Pro)突变为丝氨酸(Ser)的纯合材料。

采用5mg/L氯磺隆对T1子代和TL-1进行处理，其结果(如图3所示)显示，T1子代植株对氯磺隆具有明显抗性，植株生长不受其影响。

采用不同浓度的氯磺隆对T1子代和TL-1进行处理，发现当氯磺隆浓度达到200mg/L时，T1子代植株仍能正常生长(其结果与图3类似)。

采用不同浓度的其他除草剂对T1子代进行处理，T1子代植株能够正常生长的除草剂最高浓度详见表1。

表1 T1子代植株各除草剂处理最高浓度

除草剂	除草剂浓度(mg/L)
		苯磺隆	200
氯嘧磺隆	200
		氟嘧磺隆	200
甲磺隆	200
		阔草清	50
双氯磺草胺	50
		甲氧磺草胺	50
氟酮磺隆钠	100
		丙苯磺隆钠盐	100
氟唑磺隆钠	100
		噻酮磺隆	100

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 南开大学

<120> 提高豆科植物除草剂抗性的方法及其应用

<130> I64644NKU

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 653

<212> PRT

<213> P180S乙酰羟酸合成酶4突变体

<400> 1

Met Ala Ala Thr Thr Ala Pro Lys Pro Ala Phe Thr Ala Leu Pro Ser

1 5 10 15

Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gln Lys Pro Phe Leu Arg Leu Ala Leu Gln

20 25 30

Phe Pro Ser Leu Pro Asn Ser Ser Tyr His Ser Gln Arg Pro Ser Leu

35 40 45

Lys Ile Ser Ser Ala Leu Ser Asp Ala Thr Ala Lys Thr Thr Thr Ala

50 55 60

Ala Ala Ala Glu Asp Phe Val Ser Arg Phe Gly Leu Glu Glu Pro Arg

65 70 75 80

Lys Gly Ala Asp Ile Leu Val Glu Ala Leu Glu Arg Gln Gly Val Thr

85 90 95

Asp Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly Ala Ser Met Glu Ile His Gln Ala

100 105 110

Leu Thr Arg Ser Ala Ser Ile Arg Asn Val Leu Pro Arg His Glu Gln

115 120 125

Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly Tyr Ala Arg Ser Ser Gly Ile Pro

130 135 140

Gly Val Cys Ile Ala Thr Ser Gly Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser

145 150 155 160

Gly Leu Ala Asp Ala Met Leu Asp Ser Val Pro Leu Val Ala Ile Thr

165 170 175

Gly Gln Val Ser Arg Arg Met Ile Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr

180 185 190

Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser Val Thr Lys His Asn Tyr Leu Val

195 200 205

Leu Asp Val Asp Asp Ile Pro Arg Ile Val Asn Glu Ala Phe Phe Leu

210 215 220

Ala Thr Ser Gly Arg Pro Gly Pro Val Leu Ile Asp Ile Pro Lys Asp

225 230 235 240

Ile Gln Gln Gln Phe Ala Ile Pro Asn Trp Asp Gln Pro Ile Arg Leu

245 250 255

Pro Gly Tyr Met Ser Arg Leu Pro Lys Ser Pro Asn Glu Asn His Leu

260 265 270

Glu Leu Ile Val Arg Leu Val Met Glu Ser Lys Lys Pro Val Leu Tyr

275 280 285

Val Gly Gly Gly Cys Leu Asn Ser Ser Glu Glu Leu Arg Arg Phe Val

290 295 300

Glu Leu Thr Gly Val Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly Ala

305 310 315 320

Tyr Pro Ile Ala Asp Glu Asn Ser Leu Gln Met Leu Gly Met His Gly

325 330 335

Thr Val Tyr Ala Asn Tyr Ala Val Asp Lys Ala Asp Ile Leu Leu Ala

340 345 350

Phe Gly Val Arg Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala Phe

355 360 365

Ala Ser Arg Ala Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala Glu Ile

370 375 380

Gly Lys Asn Lys Gln Pro His Val Ser Val Cys Ala Asp Leu Lys Leu

385 390 395 400

Ala Leu Lys Gly Ile Asn His Met Leu Glu Ser Arg Gly Val Gly Gly

405 410 415

Lys Leu Asp Phe Arg Gly Trp Arg Glu Glu Leu Asn Glu Gln Lys Arg

420 425 430

Arg Phe Pro Leu Ser Tyr Lys Thr Phe Glu Asp Glu Ile Ser Pro Gln

435 440 445

Tyr Ala Ile Gln Val Leu Asp Glu Leu Thr Asn Gly Asp Ala Ile Val

450 455 460

Ser Thr Gly Val Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln Phe Tyr Lys

465 470 475 480

Tyr Lys Arg Pro Arg Gln Trp Leu Thr Ser Gly Gly Leu Gly Ala Met

485 490 495

Gly Phe Gly Leu Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ala Val Ala Asn Pro Gly

500 505 510

Ala Val Val Val Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met Asn Val

515 520 525

Gln Glu Leu Ala Thr Ile Lys Val Glu Lys Leu Pro Val Lys Ile Leu

530 535 540

Leu Leu Asn Asn Gln His Leu Gly Met Val Val Gln Trp Glu Asp Arg

545 550 555 560

Phe Tyr Lys Ser Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asp Pro Ser Asn

565 570 575

Glu Asn Ala Ile Phe Pro Asp Met Leu Lys Phe Ala Asp Ala Cys Gly

580 585 590

Ile Pro Ala Ala Arg Val Thr Lys Lys Glu Asp Leu Arg Ala Ala Ile

595 600 605

Gln Lys Met Leu Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val Ile Val

610 615 620

Pro His Gln Glu His Val Leu Pro Met Ile Pro Ser Asn Gly Thr Phe

625 630 635 640

Gln Asp Val Ile Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Ser Tyr

645 650

<210> 2

<211> 1962

<212> DNA

<213> 表达P180S乙酰羟酸合成酶4突变体的DNA分子

<400> 2

atggcggcaa ccactgcccc aaaacctgcg ttcaccgccc tcccttcttc atcatcatca 60

tcttcccaga agccctttct gcgtctcgcc ctccaatttc cctccctccc aaacagttcc 120

tatcactccc aacgcccttc tctcaaaatc tccagcgccc tctccgatgc aaccgcgaaa 180

accaccaccg ccgccgccgc cgaagatttt gtctcccgat tcggcctgga ggagccccgc 240

aagggcgccg acatcctcgt ggaggcgctg gagcggcagg gcgtgacgga cgtgttcgcc 300

taccccggtg gtgcttccat ggagatccac caggcactca cccgctccgc ctccatccgc 360

aacgtcctcc cccgccacga gcagggtggc gtcttcgccg ccgagggcta cgcccgttcc 420

tccggcatcc ccggcgtctg catcgccacc tccggccccg gcgccaccaa cctcgtcagc 480

ggcctcgccg acgccatgct cgacagcgtc cccctcgtcg ccatcaccgg ccaggtttcc 540

cgccgcatga tcggcaccga cgccttccaa gaaaccccca tcgtcgaggt aacgcgttcc 600

gtcacaaagc ataactatct cgttctagat gttgatgata ttcctagaat cgttaatgaa 660

gcgtttttct tagccacttc gggtagacct ggccctgtgt taattgatat acccaaagat 720

attcagcaac agtttgcgat tcctaattgg gatcaaccaa ttaggttacc tggttacatg 780

tctaggttgc ctaagtctcc caatgagaat catttggagc ttattgtgag gttggttatg 840

gaatctaaga aacctgtttt gtatgttggt ggtggttgtt tgaattctag tgaagaattg 900

cggcgttttg tcgagctcac tggtgttcct gttgctagta ctttgatggg tcttggtgct 960

tatcccattg ctgatgagaa ttctcttcag atgcttggga tgcacgggac tgtttatgct 1020

aattatgctg tggacaaggc tgatattttg cttgcgtttg gggtgaggtt tgatgaccgt 1080

gtcacgggga agctcgaggc ttttgcgagc cgggctaaga tagttcacat tgatattgat 1140

tcggcagaga ttggaaagaa caagcagccg catgtttcgg tttgcgctga tttgaagctg 1200

gcgttgaagg ggattaatca catgttggag agcagagggg ttggggggaa gcttgatttt 1260

agaggttgga gggaagagct gaatgagcag aagcgaaggt ttcctttgag ctataagact 1320

tttgaggatg agatttctcc tcagtatgct atacaggttc ttgatgagtt gactaatggg 1380

gatgctattg tgagtactgg agttggacag caccagatgt gggctgctca gttttacaag 1440

tacaagaggc ctaggcagtg gttaacatcc ggtggtcttg gtgctatggg gtttggattg 1500

ccggctgcca tcggtgcggc tgtggctaat ccgggtgcgg ttgtggttga cattgatggt 1560

gatgggagtt ttataatgaa tgttcaggag ctggccacta tcaaggtaga gaagctcccg 1620

gttaagatat tgttgttgaa taatcaacac ttgggtatgg ttgttcagtg ggaggatcgg 1680

ttctataagt ctaacagggc tcacacgtat ctgggagacc cctctaatga gaatgccata 1740

tttcctgata tgttgaagtt tgctgatgct tgcgggatac cggcagctcg tgtgaccaag 1800

aaagaagacc ttagagcggc aattcagaaa atgttggaca cccctggccc ctatcttctt 1860

gatgtcattg taccccatca agagcatgtc ttgcccatga ttcctagcaa tggaaccttc 1920

caggacgtga taactgaggg tgatggcagg acaagttact ga 1962

<210> 3

<211> 1367

<212> PRT

<213> Cas9蛋白

<400> 3

Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly

1 5 10 15

Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys

20 25 30

Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly

35 40 45

Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys

50 55 60

Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe

85 90 95

Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His

100 105 110

Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His

115 120 125

Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser

130 135 140

Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met

145 150 155 160

Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp

165 170 175

Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn

180 185 190

Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys

195 200 205

Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu

210 215 220

Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu

225 230 235 240

Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp

245 250 255

Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp

260 265 270

Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu

275 280 285

Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile

290 295 300

Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met

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Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala

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Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp

340 345 350

Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln

355 360 365

Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly

370 375 380

Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys

385 390 395 400

Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly

405 410 415

Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu

420 425 430

Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro

435 440 445

Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met

450 455 460

Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val

465 470 475 480

Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn

485 490 495

Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu

500 505 510

Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr

515 520 525

Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys

530 535 540

Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val

545 550 555 560

Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser

565 570 575

Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr

580 585 590

Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn

595 600 605

Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu

610 615 620

Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His

625 630 635 640

Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr

645 650 655

Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys

660 665 670

Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala

675 680 685

Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys

690 695 700

Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His

705 710 715 720

Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile

725 730 735

Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg

740 745 750

His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr

755 760 765

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770 775 780

Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val

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Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln

805 810 815

Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu

820 825 830

Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp

835 840 845

Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly

850 855 860

Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn

865 870 875 880

Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe

885 890 895

Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys

900 905 910

Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys

915 920 925

His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu

930 935 940

Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys

945 950 955 960

Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu

965 970 975

Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val

980 985 990

Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val

995 1000 1005

Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys

1010 1015 1020

Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr

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Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn

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1055 1060 1065

Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg

1070 1075 1080

Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu

1085 1090 1095

Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg

1100 1105 1110

Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys

1115 1120 1125

Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu

1130 1135 1140

Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser

1145 1150 1155

Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe

1160 1165 1170

Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu

1175 1180 1185

Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe

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Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu

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Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn

1220 1225 1230

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Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His

1250 1255 1260

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1265 1270 1275

Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr

1280 1285 1290

Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile

1295 1300 1305

Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe

1310 1315 1320

Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr

1325 1330 1335

Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly

1340 1345 1350

Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

1355 1360 1365

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> P180S定点编辑sgRNA种子序列

<400> 4

aggtcccccg ccgcatgat 19

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> A150V定点编辑sgRNA种子序列

<400> 5

gtggtgtttc catggagat 19

Claims

1.突变除草剂靶标蛋白中的至少一个氨基酸位点以提高豆科植物除草剂抗性的方法在制备具有除草剂抗性的豆科植物中的用途。

2.一种提高豆科植物除草剂抗性的方法，其特征在于，所述方法包括突变除草剂靶标蛋白中的至少一个氨基酸位点以提高豆科植物除草剂抗性。

3.根据权利要求1所述的用途或权利要求2所述的方法，其中，所述除草剂靶标蛋白选自乙酰羟酸合成酶、乙酰辅酶A羧化酶、原卟啉原氧化酶、八氢番茄红素脱氢酶、对羟苯基丙酮酸双氧化酶、5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、谷氨酰胺合成酶和二氢蝶酸合成酶中的至少一种；

和/或，所述豆科植物选自大豆、花生、蚕豆、豌豆、赤豆、绿豆、豇豆、四季豆和扁豆中的至少一种；

优选地，所述豆科植物为大豆；

更优选地，所述除草剂靶标蛋白中的氨基酸位点选自乙酰羟酸合成酶1的103位丙氨酸、178位脯氨酸、186位丙氨酸、357位天冬氨酸、358位精氨酸、555位色氨酸、634位丝氨酸，乙酰羟酸合成酶2的107位丙氨酸、182位脯氨酸、190位丙氨酸、361位天冬氨酸、362位精氨酸、560位色氨酸、639位丝氨酸，乙酰羟酸合成酶3的97位丙氨酸、172位脯氨酸、180位丙氨酸、351位天冬氨酸、352位精氨酸、549位色氨酸、628位丝氨酸，乙酰羟酸合成酶4的105位丙氨酸、180位脯氨酸、188位丙氨酸、359位天冬氨酸、360位精氨酸、557位色氨酸、636位丝氨酸中的至少一种；

更优选地，所述突变选自将脯氨酸突变为丝氨酸/亮氨酸/苏氨酸/丙氨酸/组氨酸/谷氨酰胺/精氨酸/谷氨酸/异亮氨酸/酪氨酸、将丙氨酸突变为苏氨酸/缬氨酸/酪氨酸/苯丙氨酸、将天冬氨酸突变为谷氨酸、将色氨酸突变为亮氨酸/甘氨酸/蛋氨酸、将丝氨酸突变为天冬氨酰/苏氨酸/异亮氨酸中的至少一种。

4.一种提高豆科植物除草剂抗性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述豆科植物选自大豆、花生、蚕豆、豌豆、赤豆、绿豆、豇豆、四季豆和扁豆中的至少一种；

优选地，所述豆科植物为大豆。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，步骤(1)中所述除草剂选自磺酰脲类、磺酰胺羰基三唑啉酮类、咪唑啉酮类、嘧啶基硫代苯甲酸酯类和三唑并嘧啶类中的至少一种；

和/或，所述靶标蛋白包括乙酰羟酸合成酶、乙酰辅酶A羧化酶、原卟啉原氧化酶、八氢番茄红素脱氢酶、对羟苯基丙酮酸双氧化酶、5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶、谷氨酰胺合成酶和二氢蝶酸合成酶中的至少一种。

7.根据权利要求4或5所述的方法，其中，步骤(2)中获得的具有除草剂抗性的突变体为选自乙酰羟酸合成酶4第180位脯氨酸发生单点突变的突变体；

优选地，步骤(2)中获得的具有除草剂抗性的突变体为选自第180位脯氨酸突变为丝氨酸、亮氨酸、苏氨酸、丙氨酸、组氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、谷氨酸、异亮氨酸和酪氨酸的乙酰羟酸合成酶4突变体中的至少一种；

更优选地，步骤(2)中获得的具有除草剂抗性的突变体为第180位脯氨酸突变为丝氨酸的乙酰羟酸合成酶4突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

更优选地，所述大豆中表达所述乙酰羟酸合成酶4突变体的DNA分子如SEQ ID NO:2所示。

8.根据权利要求4、5和7中任意一项所述的方法，其中，步骤(2)中所述定点突变技术为CRISPR/Cas9介导的单碱基编辑技术；

9.根据权利要求4或5所述的方法，其中，步骤(3)包括将权利要求6中所述的DNA分子引入至大豆植株中，通过杂交、转育或回交的方式对该大豆植株进行培育和传代，获得具有180位脯氨酸突变为丝氨酸的乙酰羟酸合成酶4的大豆纯合子代；

优选地，步骤(3)中所述将具有除草剂抗性的突变体引入大豆植株的方式包括农杆菌介导转化法、基因枪法和原生质体转化法中的至少一种。

10.权利要求4-9中任意一项所述的方法在豆科植物育种中的应用。