CN112175940A - 一种基于外切酶的寡核苷酸纯化方法 - Google Patents
一种基于外切酶的寡核苷酸纯化方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112175940A CN112175940A CN201910592848.0A CN201910592848A CN112175940A CN 112175940 A CN112175940 A CN 112175940A CN 201910592848 A CN201910592848 A CN 201910592848A CN 112175940 A CN112175940 A CN 112175940A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- exonuclease
- oligonucleotide
- dna
- sequence
- target
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 150
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 title claims abstract description 69
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 title claims abstract description 69
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 238000000746 purification Methods 0.000 title claims abstract description 19
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 48
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 33
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 20
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 7
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 6
- 108010007577 Exodeoxyribonuclease I Proteins 0.000 claims description 5
- 102100029075 Exonuclease 1 Human genes 0.000 claims description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 5
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000009471 action Effects 0.000 claims description 4
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 3
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 claims description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 claims description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 claims 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 4
- 230000004907 flux Effects 0.000 abstract description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 abstract 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 abstract 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 abstract 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 abstract 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 abstract 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 abstract 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 7
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 3
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 3
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 1
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000001668 nucleic acid synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
Abstract
本发明涉及一种寡核苷酸的纯化方法。该方法是利用目标寡核苷酸的二级结构，以及DNA单链外切酶对不同结构寡核苷酸的特异性降解的原理，实现对不同结构寡核苷酸的分离纯化目的。特别是当目标寡核苷酸的结构是一种发夹结构，而非目标寡核苷酸是线性单链结构时，利用DNA单链外切酶可实现特异性降解非目标寡核苷酸，而保留目标寡化苷酸。该方法纯化后的寡核苷酸可直接用于下游操作，特别是用于基因合成。减少了其它方法中涉及的切胶、浸出或融胶、离心、清洗、洗脱等操作，可实现高通量低成本纯化寡核苷酸的目的。
Description
技术领域
本发明涉及一种寡核苷酸的纯化方法，特别涉及用外切酶水解非目标寡核苷酸的方法获得纯净寡核苷酸的方法。
背景技术
现代生命科学与传统生命科学的最大差别是对遗传物质的认识。在生物学领域，从基因或基因组的角度来解读生命是最基本的操作。在此过程中，寡核苷酸的人工合成发挥了重要的作用。目前所有的寡核苷酸合成都是通过亚磷酰胺化学法合成的，其反应的每一个循环可分解为：1)脱保护，2)单体耦合，3)加帽(capping)，4)氧化。这4个步骤的反应效率都不是100％的，其每一个循环的效率在95-99.5％之间，导致最后得到的寡核苷酸是目标寡核苷酸与非目标寡核苷酸的混合物，其中非目标寡核苷酸大部分是合成中途被中止的短序列寡核苷酸。这些非目标寡核苷酸会降低下游操作的可靠性，比如：1)用低质量的寡核苷酸作基因合成会导致成功率和正确率的极大损害，2)一代和二代DNA测序所用的引物都需要很高的纯度，否则会导致测序质量下降，3)多重PCR的引物如果太差，可能导致基于这个技术的诊断试剂盒可靠性下降等。
目前寡核苷酸的纯化方法大致可以分为两种：1)基于寡核苷酸长度的分离手段，包括聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术和高效液相色谱(HPLC)技术，都是基于不同长度的寡核苷酸在介质中移动的速度差异分离出目标寡核苷酸。这两个方法的通量都不高。2)基于DMT基团的特异性吸附，目标寡核苷酸在合成最后一个碱基后可以选择性地带有DMT基团，而提前中止的寡核苷酸不带这个基团，这种差异可以被特异性结合DMT基团的介质识别，从而只收获目标寡核苷酸。这个方法通量较高，但只适合于较短的寡核苷酸，而且在纯化后还需要加一步去除DMT基团的操作。如果合成的寡核苷酸质量很高，也可以直接脱盐纯化，即只去除非DNA的杂质，不会对下游操作产生太大的影响。
以上的几种方法都是基于物理或化学的方法来分离目标寡核苷酸，在通量和分离效率上都有一定的局限。生物酶通常具有高效、专一的特点，核酸酶是其中专门水解核酸的蛋白质的总称，根据其作用底物的不同，存在不同的分类，RNA酶和DNA酶分别作用于RNA和DNA；双链核酸酶和单链核酸酶分别作用于双链核酸和单链核酸；内切酶和外切酶分别作用于核酸序列的内部和两端。其中外切酶根据其作用方向的不同，又可分为5’-3‘外切酶和3’-5‘外切酶。
文献(Michael et al.(2017).Biochemistry 56,18,2417-2424)报道了一种5'-3'单链外切酶RecJ，其能够作用于合成中途中止的寡核苷酸，但无法作用于带DMT基团的目标寡核苷酸。利用这个特点可以将较短的寡核苷酸去除。这个方法的局限在于纯化后的寡核苷酸还需要脱DMT基团，与上述第二种方法相比并无显著优势。
发明内容
本发明提供了一种基于单链外切酶的纯化特殊结构寡核苷酸的方法，通过在目标寡核苷酸序列的3’端或5‘端添加辅助碱基形成发夹的形式，保护目标寡核苷酸的一端，而没有这种结构的寡核苷酸将被特异性降解。对于一些在目标序列的某一端添加辅助碱基而不影响功能的应用来说，可以实现高通量、高效率的寡核苷酸纯化操作。
本发明的提供一种基于外切酶的寡核苷酸纯化方法，包括以下步骤：
(1)在目标寡核苷酸的5‘端或3’端增加一段与目标寡核苷酸互补的DNA序列，使其能够形成发夹结构；
(2)合成上述设计的寡核苷酸，此寡核苷酸被称为引物；
(3)用单链外切酶处理引物；
(4)高温灭活外切酶，得到的溶液直接用于下游操作；或者外切酶处理后的溶液也可以直接用其它方法纯化后用于下游操作。
在一些实施方案中，所述的目标寡核苷酸是指在下游操作中发挥功能作用的DNA单链。
在一些实施方案中，所述的互补的DNA序列被称为辅助序列，辅助序列可以与目标寡核苷酸部分互补或者完全互补。
在一些实施方案中，所述的辅助序列与目标序列之间的互补是不完美互补或完美互补。
在一些实施方案中，所述的辅助序列，可以被设计在目标寡核苷酸的5‘端，此时辅助序列与目标寡核苷酸在引物的5‘端形成发夹结构，此结构不会被5’-3‘作用的DNA单链外切酶降解，而没有形成该发夹结构的寡核苷酸会被其降解。
在一些实施方案中，所述的辅助序列，可以被设计在目标寡核苷酸的3’端，此时辅助序列与目标寡核苷酸在引物的3‘端形成发夹结构，此结构不会被3’-5‘作用的DNA单链外切酶降解，而没有形成该发夹结构的寡核苷酸会被其降解。
在一些实施方案中，所述的引物是指用DNA合成仪合成的单链寡核苷酸。
在一些实施方案中，所述的外切酶是指作用于DNA的水解酶，其活性是从DNA的5’端或3‘端水解DNA，而不会从DNA序列内部水解DNA。
在一些实施方案中，所述的单链外切酶是指只作用于DNA单链，而不会水解DNA双链的酶。
在一些实施方案中，所述的高温灭活是指在50-100摄氏度之间处理反应体系一段时间，使外切酶失去其原有活性，从而使外切酶不会干扰下游操作。
在一些实施方案中，所述的下游操作是指使用寡核苷酸实现不同应用目的的操作，包括但不限于基因合成、聚合酶链式反应核酸扩增、引物探针、DNA测序等操作。
在一些实施方案中，所述的下游操作是指等温双向延伸法基因合成。
在一些实施方案中，所述的其它方法纯化是指用不同的方法将寡核苷酸从混合物中分离的操作，包括但不限于乙醇沉淀回收、silica吸附回收、PEG沉淀回收等操作。
在一些实施方案中，所述的部分互补是指辅助序列与目标寡核苷酸的一部分序列互补。
在一些实施方案中，所述的完全互补是指辅助序列与目标寡核苷酸的全部序列互补。
在一些实施方案中，所述的不完美互补是指辅助序列与目标寡核苷酸之间的互补不完全符合碱基配对原则。
在一些实施方案中，所述的完美互补是指辅助序列与目标寡核苷酸之间的互补完全符合碱基配对原则。
在一些实施方案中，所述的碱基配对原则是指符合碱基A与碱基T配对，碱基G与碱基C配对。
在一些实施方案中，所述的5’-3‘作用的DNA单链外切酶是指只作用于DNA单链的5’-3‘外切酶，特别是指RecJ和RecJf单链外切酶。
在一些实施方案中，所述的3’-5‘作用的DNA单链外切酶是指只作用于DNA单链的3’-5‘外切酶，特别是指exonuclease I。
在一些实施方案中，所述的用单链外切酶处理引物，是指在一定的反应条件下，外切酶将非目标寡核苷酸水解而只留下目标寡核苷酸的过程。
附图说明
通过以下详细的描述并结合附图将更充分地理解本发明，其中：
图1是典型发夹结构的示意图。
图2显示了5‘端添加辅助序列的两种模式。
图3显示了3’端添加辅助序列的两种模式。
图4显示了用于测试的寡核苷酸。
图5显示了RecJf水解寡核苷酸的琼脂糖电泳图。
具体实施方式
本发明提供了一种基于外切酶水解的寡核苷酸纯化方法。通过在目标寡核苷酸的3’端或5‘端添加与目标序列互补的辅助序列，以形成寡核苷酸的二级结构。这种设计可以使寡核苷酸在溶液中产生局部双链结构，使单链外切酶无法识别，从而保护目标寡核苷酸不被外切酶降解。
亚磷酰胺化学法合成的寡核苷酸都是单链形态的，由于碱基配对的原则，单链内部的一些碱基片段存在互补的可能性，从而使单链在溶液中形成各种不同的结构，一般我们称之为发夹结构。一个典型的发夹结构如图1，图中第5到第9碱基与序列中第22到第26碱基之间存在碱基互补，互补的碱基已被方框突出显示。方框中的碱基属于发夹结构的茎部，方框左上角的单链形态的碱基属于发夹的闭环部，方框右下角的开放的单链属于发夹的开环部，开环部的下方的ATTT这4个碱基所在的位置是整个寡核苷酸的5’端，而其上方的一个碱基A是整个寡核苷酸的3‘端。对于一个5‘-3’核酸单链外切酶来说，其作用方向是从5‘到3’逐渐发生的，即图1中的5‘端碱基A会被第一个水解。而对于3’-5‘核酸单链外切酶来说，3’端的A会被第一个水解。
发夹结构的稳定性与互补序列的长短、互补序列的距离、互补序列的碱基组成等因素有关。在常温下，对于一段随机的单链DNA溶液来说，绝大部分单链分子都会处于完全单链和几种瞬时形成的发夹结构状态下，这种状态不会抑制核酸单链外切酶对其的降解。但在某些极端的条件下，单链内部存在大片段的互补片段，形成的发夹结构在常温下非常稳定。这会导致某些核酸单链外切酶在作用到发夹的茎部附近时停止，从而阻止外切酶的进一步水解。
正是利用发夹结构的这种特性，本发明通过人为添加互补碱基的方式形成稳定的发夹结构，保护发夹结构附近的目标寡核苷酸不被降解。而在合成中途中止的非目标寡核苷酸由于没有这部分辅助序列或没有辅助序列对应的目标序列，无法形成稳定的发夹结构，将被外切酶选择性地降解，只留下具有完整结构的目标寡核苷酸。
寡核苷酸合成的方向是从3’-5‘进行的，因此中途中止的寡核苷酸将缺少5’端的碱基。
辅助序列的长短与其参与形成的发夹结构稳定性有关。目前有多种寡核苷酸结构预测的软件能够提供经验性的发夹稳定性数据，比如Mfold(Michael Zuker.(2003).Nucleic Acids Res.31:3406-15)可以预测序列中发夹结构的热动力学参数，包括其Tm值和吉布斯自由能。Tm值是一个温度值，反映的是在标准溶液状态下，处于该温度的寡核苷酸有一半处于单链状态，还有一半处于发夹结构状态。吉布斯自由能反映的是在标准溶液和标准温度下，寡核苷酸在单链与发夹结构之间转换的方向性。一般来说，一个发夹结构的吉布斯自由能数值越低，这个发夹就越稳定。
本发明提供了两种添加辅助序列的方式，都能实现对目标寡核苷酸的保护。
第一种是在目标寡核苷酸的5‘端添加辅助序列，如图2所示，图2中细箭头代表的是目标寡核苷酸，箭头方向表示寡核苷酸的3’端。蓝色粗线(即b和c中显示于最左端的粗线，以及d和e中位置处于上方的粗线)代表在5‘端添加的辅助序列，红色粗线(即b和c中分别显示于中间和右端的粗线，以及d和e中位置处于下方的粗线)表示在目标寡核苷酸中与辅助序列互补的那部分序列。可以看到辅助序列可以被设计成与目标寡核苷酸的中间部分互补(图2,b)，也可以被设计成与目标寡核苷酸的3’端互补(图2,c)，这两种结构的区别在于其形成的发夹开环部不同。与中间部分互补的辅助序列会形成3‘端依然保持单链状态的发夹结构(图2,d)，这种结构会被3‘-5’作用的外切酶水解，比如exonulcease I可以水解这种结构，但无法被5‘-3’作用的外切酶水解，比如RecJ。因此可以用5‘-3’作用的外切酶来实现对目标寡核苷酸的纯化。与目标寡核苷酸3‘端互补的结构(图2,e)可以实现对所有单链外切酶的免疫。对于采用何种结构，取决于目标寡核苷酸在下游操作中发挥的作用，比如对于需要保持寡核苷酸单链自由杂交的应用来说，结构d更适合。而对于在某种情况下需要隐藏寡核苷酸序列的应用来说，结构e更有效。
第二种是在目标寡核苷酸的3’端添加辅助序列，如图3所示，与在5‘端添加辅助序列类似，在3’端添加辅助序列也有两种模式，分别是辅助序列与目标寡核苷酸中间互补(图3,b)和辅助序列与目标寡核苷酸5‘端互补(图3,c)，其形成的发夹结构分别对应图3d和图3e。图3d的结构可以免疫3’-5‘外切酶的水解，而图3e的结构可以免疫所有单链外切酶的水解。值得注意的是图3d的结构并不是十分适合用来纯化目标寡核苷酸，因为在这种模式下，合成时中途中止于目标寡核苷酸5’端附近的非目标寡核苷酸将无法被有效清除。
适合本发明的单链外切酶有exonuclease I、exonuclease T，RecJ，RecJf以及与这几种酶功能类似的其它酶。其中exonuclease I和exonuclease T是3‘-5’单链外切酶。而RecJ和RecJf是5‘-3’单链外切酶。
本发明着重测试了RecJf这个酶。测试结果显示，RecJf在25-45摄氏度之间都有很好的水解活性。本发明测试了16种寡核苷酸序列(图4)的RecJf酶作用结果。反应在45度进行，各寡核苷酸的量是10pmol，RecJf(NEB)的用量是5U。寡核苷酸序号9-16是未添加辅助碱基的寡核苷酸，而序号1-8是对应9-16的添加了辅助碱基的寡核苷酸。从结果来看，添加了辅助序列之后，所有的寡核苷酸都无法被RecJf所水解，而没有添加辅助序列的寡核苷酸则都被完全水解(图5)。值得注意的是寡核苷酸序号11的序列内部存在很稳定的发夹结构，但由于其吉布斯自由能为-2.4,不能保证绝大部分引物都处于发夹状态，也被完全水解了。说明RecJf对绝大部分随机形成的发夹结构都能有效水解，而人为添加一定长度的辅助序列，可有效避免水解的发生。因此这个技术可以用于绝大部分寡核苷酸的纯化。
在一种基因合成方法(一种基于双向等温延伸的核酸合成方法，公开号CN104212791A))中，用于基因拼接的寡核苷酸被设计成一种发夹结构，每一段目标寡核苷酸都在5’端添加了10-20个辅助序列。这种基因合成方法对寡核苷酸的纯度要求较高，因为其拼接温度在37度以下，比较容易发生非特异性拼接。为了获得很高的拼接成功率，其一般要求对寡核苷酸进行聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化，这种纯化方式不仅成本高，而且通量也无法做到太高。
本发明测试了RecJf处理后的寡核苷酸用于基因合成，结果显示RecJf处理后的寡核苷酸不仅将拼接成功率提高了70％(相对于未处理的寡核苷酸)，其成功率还稍高于聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化的寡核苷酸。此外，用RecJf处理过的寡核苷酸在碱基正确率方面也略有提升。由于这种纯化方式只是在原来基因拼接的基础上增加了一步水解，相对之前的纯化方式而言，操作步骤得到了简化，通量也提高了不少。
下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步详细的说明，但本发明不限于下面的实施例。
实施例1：用基于RecJf纯化的寡核苷酸进行基因合成
1、按照专利公开号CN104212791A的方法设计了6条用于拼接的寡核苷酸，其序列见表1。
表1
2、用核酸合成仪合成表1中的6条寡核苷酸。
3、将合成的6条寡核苷酸等摩尔数混合，得到寡核苷酸混合水溶液，溶液中每条寡核苷酸的浓度是0.1微摩尔/升。
4、配制5微升体系，其组成为：
(1)0.5微升10XCutsmart Buffer(NEB)；
(2)1.7微升寡核苷酸混合水溶液；
(3)0.2微升RecJf外切酶(NEB)；
(4)2.6微升双蒸水。
5、将上述5微升体系置于45摄氏度20分钟进行水解反应，然后再置于58度20分钟将酶灭活。
6、再将以上处理的寡核苷酸直接用于基因合成(按照专利公开号CN104212791A中的方法)。
7、同时将未用RecJf外切酶处理的寡核苷酸和聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化的寡核苷酸也用于基因合成，作为对照。
8、将基因合成结果转化大肠杆菌，统计菌落数，并计算正确克隆的比例。
9、结果RecJf处理对应的培养皿上菌落数是520个，未处理对应的培养皿上菌落数是203个，聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化对应的培养皿菌落数是476个。可见从菌落数来看，RecJf处理比未处理的菌落数提高了2.5倍，也比聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化的多一些。
10、从3个培养皿中各挑取16个克隆进行测序验证，结果RecJf处理对应的16个克隆中有14个克隆符合预期，未处理组对应的16个克隆中有8个符合预期，而聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化组对应的16个克隆也有14个符合预期。
11、可见RecJf处理后的寡核苷酸在用于基因合成时，其效果可以与聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化的寡核苷酸相近，甚至有所超出。
本发明的实施方式并不限于上述实施例所述，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域普通技术人员可以在形式和细节上对本发明做出各种改变和改进，而这些均被认为落入了本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于外切酶的寡核苷酸纯化方法，包括以下步骤：
(1)在目标寡核苷酸的5‘端或3’端增加一段辅助序列，所述辅助序列是与目标寡核苷酸互补的DNA序列，能与目标寡核苷酸形成发夹结构；
(2)合成上述设计的寡核苷酸，此寡核苷酸被称为引物；
(3)用单链外切酶处理引物；
(4)高温灭活外切酶，得到的溶液直接用于下游操作；或者将外切酶处理后的溶液直接用其它方法纯化后用于下游操作；
其中所述单链外切酶是只作用于DNA单链的水解酶，其活性是从DNA的5’端或3‘端水解DNA，而不会从DNA序列内部水解DNA，也不会水解DNA双链；
其中所述用单链外切酶处理引物，是在一定的反应条件下，所述外切酶将非目标寡核苷酸水解而只留下目标寡核苷酸的过程。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述目标寡核苷酸是在下游操作中发挥功能作用的DNA单链。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述辅助序列与目标寡核苷酸部分互补或者完全互补，所述部分互补是辅助序列与目标寡核苷酸的一部分序列互补，所述完全互补是辅助序列与目标寡核苷酸的全部序列互补。
4.根据权利要求1或3所述的方法，其中所述辅助序列与目标序列之间的互补是不完美互补或完美互补，所述不完美互补是辅助序列与目标寡核苷酸之间的互补不完全符合碱基配对原则，所述完美互补是辅助序列与目标寡核苷酸之间的互补完全符合碱基配对原则；优选地，所述碱基配对原则是指符合碱基A与碱基T配对，碱基G与碱基C配对。
5.根据权利要求1或3所述的方法，其中：
所述单链外切酶是5’-3‘作用的DNA单链外切酶，所述辅助序列被增加在目标寡核苷酸的5‘端，辅助序列与目标寡核苷酸在引物的5‘端形成发夹结构，此结构不会被5’-3‘作用的DNA单链外切酶降解，而没有形成该发夹结构的寡核苷酸会被其降解；
或者，所述单链外切酶是3’-5‘作用的DNA单链外切酶，所述辅助序列被增加在目标寡核苷酸的3’端，辅助序列与目标寡核苷酸在引物的3‘端形成发夹结构，此结构不会被3’-5‘作用的DNA单链外切酶降解，而没有形成该发夹结构的寡核苷酸会被其降解。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述引物是用DNA合成仪合成的单链寡核苷酸。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述高温灭活是在50-100摄氏度之间处理反应体系一段时间，使外切酶失去其原有活性，从而使外切酶不会干扰下游操作。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述下游操作是使用寡核苷酸实现不同应用目的的操作；优选地，所述操作是基因合成、聚合酶链式反应核酸扩增、引物探针或DNA测序；更优选地，所述下游操作是等温双向延伸法基因合成。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述其它方法纯化是用不同的方法将寡核苷酸从混合物中分离的操作；所述操作优选是乙醇沉淀回收、silica吸附回收或PEG沉淀回收。
10.根据权利要求5所述的方法，其中：
所述5’-3‘作用的DNA单链外切酶是只作用于DNA单链的5’-3‘外切酶，特别是RecJ和RecJf单链外切酶；
所述3’-5‘作用的DNA单链外切酶是只作用于DNA单链的3’-5‘外切酶，特别是exonuclease I。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910592848.0A CN112175940A (zh) | 2019-07-03 | 2019-07-03 | 一种基于外切酶的寡核苷酸纯化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910592848.0A CN112175940A (zh) | 2019-07-03 | 2019-07-03 | 一种基于外切酶的寡核苷酸纯化方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112175940A true CN112175940A (zh) | 2021-01-05 |
Family
ID=73915458
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910592848.0A Pending CN112175940A (zh) | 2019-07-03 | 2019-07-03 | 一种基于外切酶的寡核苷酸纯化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112175940A (zh) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030152984A1 (en) * | 2002-01-11 | 2003-08-14 | Huseyin Aygun | Method for the manufacture of DNA |
| US20050164207A1 (en) * | 2003-12-19 | 2005-07-28 | Affymetrix, Inc. | Method of oligonucleotide synthesis |
| CN101560538A (zh) * | 2008-04-17 | 2009-10-21 | 上海青兰生物科技有限公司 | 一种等温双向生长的基因合成方法 |
| CN102321612A (zh) * | 2011-08-29 | 2012-01-18 | 苏州金唯智生物科技有限公司 | 工业化的基因合成方法 |
| CN103270174A (zh) * | 2010-10-28 | 2013-08-28 | 生命技术公司 | 化学增强型引物组合物、方法和试剂盒 |
| CN104212791A (zh) * | 2013-06-03 | 2014-12-17 | 无锡青兰生物科技有限公司 | 一种基于双向等温延伸的核酸合成方法 |
| CN106715715A (zh) * | 2014-08-14 | 2017-05-24 | 雅培分子公司 | 多功能寡核苷酸 |
-
2019
- 2019-07-03 CN CN201910592848.0A patent/CN112175940A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20030152984A1 (en) * | 2002-01-11 | 2003-08-14 | Huseyin Aygun | Method for the manufacture of DNA |
| US20050164207A1 (en) * | 2003-12-19 | 2005-07-28 | Affymetrix, Inc. | Method of oligonucleotide synthesis |
| CN101560538A (zh) * | 2008-04-17 | 2009-10-21 | 上海青兰生物科技有限公司 | 一种等温双向生长的基因合成方法 |
| CN103270174A (zh) * | 2010-10-28 | 2013-08-28 | 生命技术公司 | 化学增强型引物组合物、方法和试剂盒 |
| CN102321612A (zh) * | 2011-08-29 | 2012-01-18 | 苏州金唯智生物科技有限公司 | 工业化的基因合成方法 |
| CN104212791A (zh) * | 2013-06-03 | 2014-12-17 | 无锡青兰生物科技有限公司 | 一种基于双向等温延伸的核酸合成方法 |
| CN106715715A (zh) * | 2014-08-14 | 2017-05-24 | 雅培分子公司 | 多功能寡核苷酸 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2898090B1 (en) | Method and kit for preparing a target rna depleted sample | |
| US10150985B2 (en) | Methods of depleting a target molecule from an initial collection of nucleic acids, and compositions and kits for practicing the same | |
| CA2477519C (en) | Method of error reduction in nucleic acid populations | |
| US20140309118A1 (en) | Method of preparing nucleic acid molecules | |
| US20070059700A1 (en) | Methods and compositions for optimizing multiplex pcr primers | |
| CN107119043B (zh) | 一种去除rna样本中非目标rna的方法 | |
| JPH06505872A (ja) | １本鎖直鎖状ｄｎａ鋳型から全長２本鎖ｄｎａを合成する方法 | |
| CA2620081A1 (en) | Cdna library preparation | |
| EP2961866B1 (en) | Methods for the production of libraries for directed evolution | |
| JP2006528482A (ja) | 核酸の逆転写及び／または増幅方法 | |
| JP6917629B2 (ja) | 鎖特異的ｃＤＮＡライブラリーを構築するための組成物および方法 | |
| WO2014092886A2 (en) | Pairing code directed assembly | |
| CA2468754A1 (en) | Annealing control primer and its uses | |
| US6787310B2 (en) | Strand displacement methods employing competitor oligonucleotides for isolating one strand of a double-stranded nucleic acid | |
| WO2022199511A1 (zh) | 一种Lt1Cas13d蛋白及基因编辑系统 | |
| CN112301020B (zh) | Iii类脱氧核酶突变体及其制备方法与应用 | |
| WO2014043133A1 (en) | Methods of depleting a target nucleic acid in a sample and kits for practicing the same | |
| CN115461457A (zh) | 双链核酸分子及利用其去除dna文库中glass接头的方法 | |
| CN111286527B (zh) | 合成dna纳米球互补链的方法和测序方法 | |
| CA2819431A1 (en) | Targeted alteration of dna with oligonucleotides. | |
| CN112175940A (zh) | 一种基于外切酶的寡核苷酸纯化方法 | |
| JP7333171B2 (ja) | Ｒｎａ検出方法、ｒｎａ検出用核酸及びｒｎａ検出用キット | |
| CN109983136B (zh) | 提纯可逆阻断脱氧核糖核苷三磷酸的方法和测序方法 | |
| KR101940900B1 (ko) | 표적 핵산 분자를 생성하는 방법 및 조성물 | |
| CN116732076A (zh) | 一种闭合线性dna制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20210105 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |