CN112119292A - 组织取样 - Google Patents
组织取样 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112119292A CN112119292A CN201980030993.8A CN201980030993A CN112119292A CN 112119292 A CN112119292 A CN 112119292A CN 201980030993 A CN201980030993 A CN 201980030993A CN 112119292 A CN112119292 A CN 112119292A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tissue sample
- cells
- solution
- tissue
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000005070 sampling Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 74
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 40
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 34
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 34
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 34
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 122
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 28
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 claims description 13
- 238000013019 agitation Methods 0.000 claims description 8
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 8
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 8
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 7
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims description 7
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 claims description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 4
- 239000003082 abrasive agent Substances 0.000 claims description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 claims description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000007482 whole exome sequencing Methods 0.000 claims description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 claims 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 16
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 211
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 154
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 122
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 34
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 15
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 14
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 12
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 8
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 5
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 3
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 3
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000013188 needle biopsy Methods 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 239000008156 Ringer's lactate solution Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- -1 e.g. Proteins 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 206010073095 invasive ductal breast carcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 208000019901 Anxiety disease Diseases 0.000 description 1
- 108090000145 Bacillolysin Proteins 0.000 description 1
- 241000854350 Enicospilus group Species 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037396 Intraductal Noninfiltrating Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000035092 Neutral proteases Human genes 0.000 description 1
- 108091005507 Neutral proteases Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000005299 abrasion Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 230000036506 anxiety Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000017455 cell-cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 102000038379 digestive enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108091007734 digestive enzymes Proteins 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 208000028715 ductal breast carcinoma in situ Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001861 endoscopic biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 229940125532 enzyme inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000002532 enzyme inhibitor Substances 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 1
- 238000007387 excisional biopsy Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000232 gallbladder Anatomy 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000000644 isotonic solution Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000011206 morphological examination Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 210000002741 palatine tonsil Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229940021222 peritoneal dialysis isotonic solution Drugs 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000007388 punch biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000008354 tissue degradation Effects 0.000 description 1
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000003708 urethra Anatomy 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/34—Purifying; Cleaning
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/40—Concentrating samples
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/40—Concentrating samples
- G01N1/4055—Concentrating samples by solubility techniques
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
本发明涉及从固体组织样品中取样新鲜全细胞的方法,例如用于诊断方法。该方法包括:将细胞从固体组织样品释放到溶液中,将至少一部分溶液从固体组织样品中分离出来,以及保留从固体组织样品分离的溶液。由于细胞从周围组织样品释放到溶液中的温和性质,核心组织样品结构得以保持并且仍然适合病理医生进行常规组织分析(例如,在显微镜下检查组织)。释放的细胞可用于多种应用,例如核酸测序。
Description
本发明涉及从固体组织样品中取样新鲜全细胞的方法,例如用于诊断方法。
例如,对于多种实验室过程,癌症的诊断需要肿瘤组织或细胞。肿瘤的基因检测正日益成为癌症诊断和治疗的重要组成部分。期望进行肿瘤DNA的测序以鉴定特异性突变,从而能够进行特异性或确定性更佳的诊断。在某些情况下,对特定突变的了解还允许针对患者肿瘤的遗传组成量身定制更具针对性的治疗方法。还可对除肿瘤以外的组织样品进行基因检测,例如DNA测序,例如,以帮助诊断其他遗传疾病。
当前获得用于测序的肿瘤DNA的方法包括从患者的手术切除物中获取活检或组织,然后机械地和酶促地破坏样品组织以提取DNA。这种技术的一个问题是DNA的产量相对较低(在某些情况下大约提取组织中存在的DNA的5%左右)。另一个问题是该过程破坏了所有组织,这意味着这些物质无法通过常规手段(例如组织病理学检查)进行后续分析,这些分析依赖于完整的组织结构。病理学家喜欢尽可能多地查看活检,以确保其诊断正确性且确定性。如果组织被破坏用于DNA提取,则无法实现这一目的。另一方面,使用常规病理技术处理和分析样品会损坏样品中的DNA,这意味着此类样品通常不适合提供用于全基因组测序的DNA。通常,组织被放置于患者床旁的福尔马林中。结果,整个组织最终都带有受损的DNA。应当指出,目前对嵌入蜡块中的福尔马林损伤的样品进行了基因检测。但是,这些是针对这种情况的单基因测试或成组检测,而不是对整个基因组进行测序,对整个基因组的测序在存在福尔马林损伤的情况下是无法完成的。总之,根据现有的实践和方法,如果既要进行常规分析又要进行DNA测序,则每个过程都需要单独的组织样品。
但是,临床医生通常不愿采集多个活检样品,以免使患者面临额外的风险。活检采样还会给患者带来严重的焦虑和不适,这意味着希望将活检采样保持在最低水平。此外,可能难以获得两个活检样品中都具有很高的肿瘤比例。第二个样品可能不足以进行诊断或DNA提取。活检样品的常规分析将优先于DNA测序,因此,在许多情况下,患者无法进行DNA测序。对于极少数癌症,在活检时可能没有疑似诊断。这些患者还错过了对癌症进行基因组测试的机会。
现有方法的另一个问题是用于DNA提取的组织样品必须冷冻,以阻止组织降解并保存DNA直到可以提取。逐渐冷冻是有问题的,因为细胞内的水逐渐膨胀,破坏了其中的结构(Karlsson&Toner,Biomaterials.1996Feb;17(3):243-56)。迅速冷冻是一种快速冷冻组织的技术,可将与缓慢冷冻相关的细胞损伤降至最低。但是,迅速冷冻需要使用液氮,这很危险并且需要大量劳动。在没有大量投资的情况下,在现有系统中将迅速冷冻作为标准诊断活检采样的一部分(与高度怀疑癌症诊断的情况相反)是不可行的。
本发明解决了与现有方法相关的问题。
发明内容
本发明提供了一种从固体组织样品中取样全部新鲜细胞的方法,该方法包括:
(i)将细胞从固体组织样品释放到溶液中,
(ii)将至少一部分溶液从固体组织样品中分离出来,以及
(iii)保留从固体组织样品分离的溶液。
由于细胞从周围组织样品释放到溶液中的温和性质,核心组织样品结构得以保持并且仍然适合病理医生进行常规组织分析(例如,在显微镜下检查组织)。释放的细胞可用于多种应用。例如,可以从组织样品的细胞中提取核酸并测序。因此,该方法允许更有效地使用组织样品,因为单个组织样品现在可以同时提供用于测序(或其他需要新鲜细胞的方法)和常规组织分析的材料。这意味着只采集了最少组织的患者仍然可以使用测序方法。此外,在从患者的肿瘤中获取多个组织样品的情况下,本发明的方法可以应用于每个样品,以确保从具有最高肿瘤比例的样品中获取细胞。
样品
根据本发明的方法从而释放细胞的样品是固体组织样品。这样的样品具有固体组织核心。这与通过细针抽吸获得的样品相反,该技术使用细针(内径约0.5mm或更小)通过反复切开组织以破坏组织并使材料通过毛细作用进入孔中而从患者体内收集细胞。
可以使用多种活检技术从对象获取固体组织样品。这些技术包括使用穿孔活检从皮肤进行组织采样,或使用内窥镜(内窥镜活检),空心针(核心针活检)或通过手术(切除活检)从难以接近的器官和组织采样。请注意,核心针活检不同于细针抽吸,因为获得的样品是组织的核心,而不是具有偶然组织碎片的细胞集合。用于核心针活检的针的直径明显大于用于细针抽吸的针的直径,内径通常约为1毫米或更大,通常2毫米。这种针用于在一次切割中深深地刺入组织中,而组织完好地充满了孔并被整个抽出。本发明适用于包含任何尺寸的组织核心的任何固体组织样品。在一些实施方案中,在活检过程或其他提取技术中提取的所有组织样品都用于本发明的方法。在其他实施方案中,在本发明的方法中使用一定比例的提取样品。剩余的新鲜组织可保持完整以用于其他应用(例如测试或研究)。来自这种样品表面的细胞可以移入溶液中,而核心仍然保持完整。样品的尺寸可为直径约0.5-2mm和/或长度约5-20mm。样品可以是具有约1cm3量级的组织的立方体。样品的大小可以为约0.5微克至约0.5克重量。
本发明的方法可以应用于所有类型的固体组织样品,例如,心脏,肝脏,肺,脑,脾,肾,胰腺,乳房,脐带,皮肤,胎盘,卵巢,输卵管,子宫,前列腺,扁桃体,胸腺,食道,胃,睾丸,骨骼肌,平滑肌,小肠,结肠直肠,淋巴结,甲状腺,肾上腺,膀胱,尿道,眼睛和胆囊。
固体组织样品可以从肿瘤或可以不从肿瘤获得。样品可以包含或不包含/包括癌组织。本发明特别适用于肿瘤样品,但也适用于需要进行基因检测(例如DNA测序)的其他组织样品。
与具有较低的切割表面比例的组织样品相比,具有较高的切割表面比例的组织样品预期将释放更多的细胞或以更高的速率释放细胞。例如,一些活检样品是通过捏住上皮表面而获得的,这意味着大部分组织被完整的上皮所覆盖而没有切割边缘。与通过活检方法获得的组织样品相比,这些组织样品释放的细胞数量较少,因为活检方法更依赖切割组织。
在一些实施方案中,在进行本发明的方法之前,不用任何试剂处理固体组织样品。例如,一旦将组织样品从对象中取出,就可以将其直接放入溶液中以实施本发明的方法。优选地,在执行该方法之前,样品不被保存或存储任何显著的时间。该方法可以在从对象去除组织样品之后尽快进行。在一些实施方案中,该方法在从对象取出样品的约72小时,约48小时,约24小时,约1小时,约45分钟,约30分钟,约20分钟,约10分钟,约5分钟,约2分钟或大约1分钟内进行。在从对象取出组织到执行本发明的方法之间的这段时间,组织样品可以被冷却或可以不被冷却。
从组织样品释放细胞
本发明的方法包括将细胞从固体组织样品释放到溶液中。这意味着可以从释放的细胞中提取核酸,并且可以保存固体组织样品以进行诊断测试,例如组织学分析。释放的细胞还可以用于其他测试或干预措施,包括用于免疫疗法的引发抗原。重要的是,该方法期间组织样品保持完整。释放细胞的动作优选不破坏组织样品的整体结构。在从组织释放细胞的步骤期间,组织样品优选不被均质化、片段化或以其他方式机械破坏,并保持完整。机械破坏可包括使用工具,例如针或其他抽取工具、破坏工具、切割工具等。在一个实施方案中,不使用抽吸技术或工具从组织样品中释放细胞。组织样品优选例如在从组织释放细胞的步骤中不进行超声处理。在一些实施方案中,从组织样品释放细胞的步骤不涉及使用酶,例如蛋白水解酶,例如胰蛋白酶或胶原酶。在一些实施方案中,从组织样品释放细胞的步骤不涉及使用组织解离剂。在一些实施方案中,从组织样品释放细胞的步骤不涉及使用组织降解酶。在一些实施方案中,从组织样品释放细胞的步骤不涉及使用螯合剂。
从样品释放细胞的步骤尽可能温和,以保持组织样品的结构。释放细胞所需的力相对较低,尤其是从包含大量切割边缘的组织样品中释放。在一些实施方案中,组织样品包含肿瘤组织。肿瘤细胞相对松散地附着在其周围细胞上,而支持肿瘤的正常细胞则彼此牢固地结合在一起,因此不能轻易释放到溶液中。这意味着,当从包含肿瘤组织和健康组织的样品中释放的细胞中提取核酸时,样品中来源于肿瘤细胞而不是其健康邻居的核酸(例如DNA)的比例(肿瘤纯度)相对较高。
只要大块组织样品保持完整,可以通过多种技术实现细胞的释放。优选地,细胞通过溶液接触组织样品的作用而释放。例如,可通过在溶液中搅动固体组织样品将细胞释放到溶液中。这样的搅动应该是温和的,以保持组织样品的结构。替代地或另外地,可以在组织样品上洗涤溶液以释放细胞。如果在组织样品上洗涤溶液,则组织样品可能会或可能不会基本上或完全固定在适当的位置。在一些实施方案中,不使用酶从组织样品中释放细胞。在一些实施方案中,细胞仅通过机械作用从组织样品中释放,例如通过在溶液中搅动样品或在样品上洗涤溶液。
固体组织样品可以包含在烧瓶或样品管中的溶液中,例如具有盖子或塞子的烧瓶或样品管,该盖子或塞子形成不透液体的密封。合适的样品管包括PCR管,通用样品管和微量离心管,例如可从Eppendorf英国公司获得的那些。如果要在溶液中搅动样品以释放细胞,则这种样品管可能是优选的。容器的大小将取决于组织样品的大小和要容纳的溶液的体积。在一些实施方案中,容器容纳约1ml至约200ml的体积。例如,可以使用1.5ml的样品管。
可以通过例如摇动,振摇,倒置,旋转,振动或滚动容纳样品和溶液的容器而从组织释放细胞。搅动可以手动或自动进行。用于自动搅动样品的装置是可商购的,包括实验室涡旋振荡器,定轨振荡器,摇摆振荡器,腕动烧瓶振荡器,管辊振荡器,微量滴定板振荡器和数字波动振荡器。
通常在约1-2分钟的轻柔搅动下,从组织中释放出足够量的细胞。已经观察到,一些组织样品在缓慢搅动10分钟后继续将细胞释放到溶液中。可以将样品组织搅动至少约30秒,至少约1分钟,至少约2分钟,至少约5分钟或至少约10分钟。可以将样品搅动不超过约15分钟,不超过约10分钟或不超过约5分钟。可以将样品搅动约1分钟至约15分钟。优选地,将样品搅动约2分钟至约10分钟。在一个实施方案中,通过重复地例如倒转包含样品的样品管,例如大约每秒一次,例如大约1分钟,来搅动样品。在一个实施方案中,通过重复地例如倒转包含样品的样品管,例如大约每秒一次,例如大约2分钟来搅动样品。
优选地,样品的搅动不包括使样品涡旋。如果使用涡旋,则优选以低速和/或短时间涡旋样品。涡旋可在约400rpm或以下,约350rpm或以下,约300rpm或以下,约250rpm或以下,约200rpm或以下,或约150rpm或以下进行。可以进行约20秒或更短,约15秒或更短,约10秒或更短,或约5秒或更短的时间。如果涡旋速度或涡旋持续时间过高,则组织样品可能不会保持完整。在一个实施方案中,通过振动组织样品将细胞释放到溶液中。优选地,这是在短时间段内完成的,例如大约20秒或更短,大约15秒或更短,大约10秒或更短,或大约5秒或更短时间。
通过将样品置于腔室中,溶液可以通过所述腔室,例如通过泵或抽吸装置,从组织样品中释放细胞。可以控制流速,以确保组织样品本身保持完整。例如,流速可以在每秒约5-30ml的范围内。组织样品可以通过任何合适的方式保持在适当位置。例如,腔室可以设置有物理屏障,用于限制组织样品的运动,同时允许溶液洗涤在样品上。可以收集并保留通过腔室的溶液,以便可以从其中包含的细胞中提取核酸。
可以将组织样品的搅动和在样品上洗涤溶液结合起来使用。例如,可以将样品放置在可以使溶液通过的腔室或管道系统中,而不是将组织样品保持在适当的位置,可以通过溶液的流动来携带组织。可以控制流速,以确保组织样品本身保持完整。例如,流速可以在每秒约5-50ml的范围内。
在一些实施方案中,可以通过酶促手段促进细胞的释放。酶可以与从本文所述的从样品组织释放细胞的其他方式组合使用或作为其替代方式使用。可以使用蛋白水解酶和/或降解细胞外基质组分的酶。实例包括:胶原酶,蛋白激酶,胰蛋白酶,弹性蛋白酶,透明质酸酶,木瓜蛋白酶和中性蛋白酶。在这样的实施方案中,可能需要最少或不需要搅动或组织洗涤。选择与组织样品接触的酶的类型、浓度和持续时间,以使组织样品结构本身的保持完整。这些酶可以在组织样品与溶液首次接触时就存在于溶液中,或者可以稍后添加。一旦已经从组织样品中释放出足够量的细胞,可以通过将样品与包含酶的溶液分离来保存组织样品本身。可以添加对溶液中的酶特异的酶抑制剂,以停止组织样品的酶消化。消化酶(蛋白酶)的浓度可以为每毫升约20微克至每毫升约500微克。酶促反应的温度可以为约37℃至65℃,例如约50℃。可以使酶促反应持续约1小时至约12-24小时。
在其他实施方案中,不使用酶从组织样品中释放细胞或促进细胞的释放。在这样的实施方案中,组织样品可以不与任何酶(例如蛋白水解酶,例如胰蛋白酶或胶原酶)接触或处理以促进细胞释放。在一些实施方案中,在进行本发明的方法之前,组织样品没有被均质化或以其他方式机械破坏。在一些实施方案中,在从对象取出之后并且在经受本发明的方法之前,不对组织样品进行进一步的解剖或切割。
从组织释放的细胞的期望数量将取决于释放的细胞将被使用的目的。例如,如果要从细胞中获得DNA,则每1微克DNA可能需要大约250,000个细胞。细胞释放到溶液中通常会使溶液变得混浊。观察到溶液的浊度增加可以用作表明足够的细胞已经释放到溶液中的指示。测量浊度的技术在本领域中是已知的,并且可以包括检测穿过溶液的光的透射。
从组织样品中分离溶液
本发明的方法包括从固体组织样品中分离至少一部分溶液。从组织样品分离的溶液将包含源自组织样品的细胞。在一些实施方案中,将所有或基本上所有溶液与组织样品分离。在其他实施方案中,至少约99%,90%,85%,80%,75%,70%,65%,60%,55%,50%,45%,40%,35%,30%,25%,20%,15%,10%或5%的溶液从组织样品中分离出来。可能需要从组织样品中分离出更高比例的溶液,以使溶液中的细胞数量最大化。
可以使用任何合适的方法将溶液从固体组织样品中分离出来。组织样品可以从溶液中去除。例如,可以例如使用镊子或抽吸装置从容纳溶液的容器中提取组织样品。可以例如通过在有或没有过滤器的情况下倾倒以捕获组织的溶液,或者使用移液管或其他抽吸装置,从包含样品组织的容器中提取溶液。如果组织溶液经溶液携带通过腔室或管道系统,则可以通过将组织样品保持在适当位置并从组织样品所在的腔室或管道系统的部分中排出溶液来实现溶液与组织样品的分离。或者,可以机械地或手动地从溶液流中提取组织样品。一部分溶液可以从携带组织样品的溶液流中转移出来并收集。以上示例不是限制性的。其他变化对于技术人员将是显而易见的。
保留溶液
保留与组织样品分离的溶液,以便释放到溶液中的细胞可用于测试或其他干预措施。例如,可以通过使核酸经受测序方法而从细胞中提取核酸以进行分析。在一些实施方案中,保留溶液是指一直到来自组织样品的核酸经收集用于分析后才丢弃溶液。保留并不一定意味着溶液可以存储任何特定时间长度。一旦溶液与组织分离,就可以进行核酸提取和/或分析(例如测序),或者任何其他细胞处理、干预或分析。但是,如果需要的话,可以存储从组织样品中分离出的溶液,例如,直到对溶液中包含的细胞进行加工方法(如核酸提取方法),或者直到例如使用测序方法对源自组织的核酸进行分析为止。当然,可以从溶液中分离出核酸或其他细胞物质之后分析核酸或其他细胞物质。在这种情况下,一旦已经从溶液中分离出核酸或其他物质和/或对其进行了分析(例如测序),可以将溶液丢弃。
包含从组织释放的细胞的溶液可以在约2℃至约10℃的温度下存储。众所周知,DNA冷藏后可以保存至少72小时。因此,该溶液可以存储最长达约12小时,约24小时,约36小时,约48小时,约60小时,约72小时,约5天或约1周。因此省去了冷冻组织用于随后的核酸提取的复杂性。然而,在一些实施方案中,溶液可被冷冻以将细胞或从细胞释放的物质(例如DNA)保存更长的时间。优选地,使用迅速冷冻来冷冻溶液以最小化或防止对细胞的损害。
在一些实施方案中,将细胞与溶液分离并冷冻保存。在一些实施方案中,可以将溶液离心以形成细胞沉淀物。可以将细胞沉淀物迅速冷冻用于储存。例如,DNA提取可以在以后的时间进行。
释放到溶液中的细胞可用于个性化免疫治疗;在体外测试他们对化学疗法的反应;测试其蛋白质表达或进行其他最好用新鲜组织进行的实验室测试。释放到溶液中的细胞可以经处理以提取除核酸之外的细胞内物质,例如蛋白质、脂质、细胞器。在某些实施方案中,细胞仅用于这些目的之一。
在一些实施方案中,从组织样品释放的细胞用于建立细胞系。在一些实施方案中,从组织样品释放的细胞仅用于建立细胞系的目的。在一些实施方案中,使从组织样品释放的细胞生长、培养或扩增。在一些实施方案中,从组织样品释放的细胞按细胞类型分类或分离。
在一些实施方案中,从组织样品释放的细胞不用于建立细胞系。在一些实施方案中,从组织样品释放的细胞不进行生长、培养或扩增。在一些实施方案中,从组织样品释放的细胞不按组织类型进行分类或分离。在一些实施方案中,从固体组织样品获取的细胞仅用于从其提取核酸的目的。
核酸提取
本发明的方法可以包括从组织样品的细胞中提取核酸。核酸可以包含DNA或RNA或由其组成。可以在从组织样品中分离出含有源自组织样品的细胞的溶液后进行核酸提取。在一些实施方案中,细胞在从组织释放和核酸提取之间不经历任何处理步骤。从组织样品中释放后,细胞可能会或可能不会进行任何分析(例如在显微镜下观察)。可以在从组织样品分离溶液后大约1周,1天,72小时,约48小时,约36小时,约24小时,约12小时,约6小时,约2小时,约1小时,约45分钟,约30分钟,约20分钟,约10分钟,约5分钟,约2分钟或约1分钟内从细胞提取核酸。如果溶液经冷冻,该时间范围可以延长。
核酸提取和分离技术是本领域众所周知的。大量试剂盒是可商购的,例如来自凯杰公司(Qiagen)。
已经发现,与使用常规方法(例如将组织匀浆然后提取)使用整个组织样品进行提取时获得的产量相比,根据本发明的方法从释放到溶液中的细胞中提取核酸可显著提高每个细胞的核酸产量。不限于任何一种特定的理论,据信由于以下原因实现了增加的产量。根据从组织获得DNA的现有方法,将均质/部分均质的固体组织(通过机械或其他方式获得)施加至DNA提取柱。许多细胞(例如肿瘤细胞)仍然包裹在基质中,以致无法获取其DNA。此外,DNA提取柱可能变得饱和,结果残留的DNA被冲洗掉而不被捕获。将包含根据本发明的方法获得的细胞的溶液施加到DNA提取柱上,使得DNA更易于被捕获在提取柱中,并且避免了柱的过饱和。
溶液
在本发明中可以使用任何合适的溶液。优选地,溶液是水溶液。溶液可以缓冲也可以不缓冲。生物组织的缓冲溶液是技术人员已知的。该溶液可以包含以下物质或由其组成:无菌等渗溶液,例如PBS;生理盐水;哈特曼溶液(Hartmann’s solution);汉克均衡盐溶液(Hank’s balanced salt solution);葡萄糖盐水。该溶液可以包含以下物质或由其组成:细胞培养溶液,例如RPMI(Roswell Park Memorial Institute medium)。该溶液可以包含以下物质或由其组成:基于醇的溶液,包括基于醇的固定剂,例如Boonfix;RCl2;KINfix。该溶液可以包含以下物质或由其组成:基于甲醇的溶液,包括基于甲醇的固定剂,例如UMfix。该溶液可以包含DMSO或由DMSO组成。合适的溶液的其他示例包括:PAXgene;SurePath;TruePath;PreservCyt;RNAlater。
在一个特定的实施方案中,溶液包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)或由磷酸盐缓冲盐水(PBS)组成。
在一个实施方案中,溶液不包含任何其他试剂,例如活性剂,例如酶。
在其他实施方案中,溶液可进一步包含其他试剂,例如酶。溶液可包含一种或多种酶,以促进如本文所述的从组织样品中释放细胞。这些酶可以在组织样品与溶液接触时就存在于溶液中,或者可以稍后添加。
在一些实施方案中,溶液包含实验室级砂砾。这提供了研磨作用并促进了细胞从组织样品中的释放。可以使用其他类似的磨料。这些磨料可以在组织样品与溶液接触时就存在于溶液中,或者可以稍后添加。
核酸分析
可以对从组织样品的细胞获得的核酸进行分析。例如,诸如RNA或DNA之类的核酸可以单独地或成组地测序或用于特定基因测试,或者可以使用任何合适的方法进行PCR扩增或者可以不扩增。在一个实施方案中,对获自组织样品的核酸进行无PCR的全基因组测序(WGS)。在一个实施方案中,对获自组织样品的核酸进行全外显子组测序。在一个实施方案中,DNA用于基因成组检测或个体基因检测。在一个实施方案中,将收集的全部细胞用于FISH测试。测序方法可以包括下一代全基因组测序,桥式PCR和任何高通量测序方法。
固体组织的保存
本发明的优点之一是从组织样品中释放细胞的过程不会破坏组织样品的结构。细胞从组织样品的外周释放,使组织样品的核心保持完整。因此,组织样品仍可用于常规分析,包括诊断所需的任何其他组织病理学研究。一旦将溶液与组织样品分离,就可以通过任何常规手段保存和/或处理组织样品以进行进一步分析。例如,可以将组织样品保存在福尔马林中,加工成石蜡块,然后进行切片以进行苏木精和曙红染色、特异性染色或免疫组织化学染色。从溶液中分离后,可将组织迅速冷冻,例如在液氮中。
本发明每个方面的优选特征与其他方面的每一个都可以作必要的修改。提及的现有技术文件在法律允许的最大范围内纳入本文。
现在将参考附图和以下非限制性实施例更详细地描述本发明。
附图说明
图1:来自实施例1的组织和细胞悬液处理的示意图。
图2:来自实施例1的DNA产量。X轴显示单次1分钟摇动(每秒倒转一次,持续1分钟)后,具浸润性乳腺导管癌的单次假活检的DNA产量。方框显示第二和第三四分位数,中位为黑线。加号表示平均值。虚线显示范围。
图3:来自实施例2的DNA产量。X轴显示单次1分钟摇动(每秒倒转一次,持续1分钟)后,具浸润性乳腺导管癌的单次诊断性活检的DNA产量。方框显示第二和第三四分位数,中位为黑线。虚线显示范围。
实施例1
基本原理
设计该实验是为了确定在溶液中摇动组织是否可以将足够的细胞释放到溶液中以进行全基因组测序(WGS)。
结果
·对组织进行形态学评估以确保其适合用于诊断的完整性组织学分析。
·检查悬液中的细胞,以量化所收获细胞中恶性细胞的比例,并评估保存状态。
·从摇动的液体中提取DNA。
方法
总共招募了八名同意进行研究并接受乳腺癌手术切除的患者。对于这些患者中的六位,从肿瘤组织切开了三个诊断假活检,其尺寸约为15x 2x 2mm。第七名患者的肿瘤较小,只能切除一组假活检,与B组相同。第八名患者没有明显的肿瘤组织,并且从良性组织中切出了三个假活检作为对照。
如图1所示,以三种方式切开并处理三个假活检,即A,B和C组。将每个假活检放入装有1ml磷酸盐缓冲盐溶液的1.5ml Eppendorf管中。然后将试管轻轻倒转和放正,以每秒一次的速度持续一分钟。然后从溶液中去除组织。
取出A组的组织并在液氮中迅速冷冻用于WGS。将该溶液细胞接种(cytospun)到载玻片上进行显微镜检查,以检查通过摇动获得的细胞的类型和质量。将B组的组织固定在福尔马林并石蜡包埋,切片以进行苏木精和曙红染色,检查摇动后其余组织的形态。
将来自B组的溶液以10,000rpm离心10分钟以形成细胞沉淀物。对制造商推荐的从动物血液或细胞中提取DNA的方法进行了改进(旋转柱(Spin-Column)),使用QIAGENDNeasy血液和组织试剂盒对DNA进行提取。
也将C组的组织在液氮中迅速冷冻,并将溶液在4℃下在冰箱中保存72小时,然后再进行与B组相同的处理。
结果
组织形态
组织活检是完整的,没有证据表明组织摇动对组织的外观有影响。
细胞悬液形态
细胞学制剂具有高细胞率并且主要含有完整的恶性细胞,其外观和形态质量与常规诊断性细针抽吸样品所见相似。
DNA产量和质量
如图2所示,细胞悬液的平均DNA产量为4.0微克,范围为1.1-11.6微克。这些样品的DNA完整性数值在所有样品中均超过6,平均值为8,这表明这些样品中DNA降解最小。评估了DNA污染情况,所有情况下260/280的比率都在1.74到2.04之间,这是即将在NHS基因组医学服务中纳入全基因组测序的资格的预定范围。
在六例中的五例中,与B组相比,C组悬液的DNA产量降低。B组的平均产量为4.5微克,而C组的平均产量为3.3微克。差异无统计学意义。
从良性组织切下的三个假-活检组织每个产生少于1微克的DNA。
讨论
该原理证明实验证明,可以从少量组织中获取完整细胞,而不会破坏该组织的结构。释放到悬液中的细胞主要是完整的肿瘤细胞,其具有保留的形态,适合于需要全细胞的研究或测试。从B和C组的组织悬液中回收的DNA对于全基因组测序都具有足够的产量和质量,表明这种收集细胞材料的手段的一种具体用途。
实施例2
基本原理
为了证明摇动活检技术可以成功地从“真实”诊断活检组织中获取细胞,与实施例1中使用的假-活检组织相比,这种“真实”诊断活检组织更小且更脆弱,并且所包含的肿瘤比例更小。
评价指标
评估摇动细胞的DNA产量和质量,其与匹配的活检的产量和质量进行比较,并且还与潜在的诊断有关。评估组织的冷冻切片用于诊断、肿瘤含量和形态检查。
方法
在疑似乳腺癌的病变的患者中30名接受放射线引导的乳腺核心活检样品的患者同意使用其组织的研究用途。使用14G核心活检针获取乳腺核心。将第一个核心放入中性缓冲福尔马林中固定。随后的核心放入装有1ml磷酸盐缓冲盐水的1.5ml Eppendorf管中。然后将小瓶倒转和放正,以每秒一次的速率持续1分钟。然后去除组织并迅速冷冻。将细胞悬液以10,000rpm离心10分钟以形成细胞沉淀物。对制造商推荐的从动物血液或细胞中提取DNA的方法进行了改进(旋转柱(Spin-Column)),使用QIAGEN DNeasy血液和组织试剂盒对DNA进行提取。将冷冻的组织在载玻片上制成冷冻切片,并用苏木精和曙红染色以进行形态学评估。
结果
在30例活检中,有23例为浸润性恶性肿瘤(其中1例仅为原位DCIS),7例为良性。来自良性组织的七个细胞液中的三个产生了超过1微克的DNA,而其他四个细胞悬液产生了小于500纳克的DNA。来自恶性组织的23种细胞悬液中的17种(占74%)产生了500纳克,足以在即将到来的NHS基因组医学服务中心进行全基因组测序。
恶性细胞悬液的平均DNA产量为1.9微克,范围为0.8-6.1微克(见图3)。对于具有500纳克以上DNA的所有样品,这些样品的DNA完整性数值均超过6,平均值为8,这表明这些样品中的DNA降解最小。评估了DNA污染情况,其中两个DNA含量超过500纳克的病例的260/280比率在1.74至2.04范围之外。在总共23例恶性肿瘤病例中,有13例具有足够的产量和质量的DNA,可用于基于单次活检的一次摇动(每秒一次,每次1分钟)的全基因组测序。
活检组织的冷冻切片显示完整的结构,没有迹象表明摇动会对形态产生有害影响。
讨论
该实验表明,可以从活检组织中取出完整的细胞,而不会破坏该组织的结构。释放到悬液中的细胞主要是完整的肿瘤细胞,其具有保留的形态,适合于需要全细胞的研究或测试。
尽管这项工作是在乳腺癌样品上进行的,但可以合理地假设结果可以外推到其他类型的肿瘤。恶性细胞的固有特征是它们会失去细胞-细胞粘附分子,这意味着它们会更自由地从周围组织中释放出来。这解释了这项实验工作中良性和恶性乳腺组织细胞产量之间的差异。这是不是肿瘤类型特异性的生物学现象。
如果需要更高的产量,可以合并两次或两次以上活检的细胞悬液。通过摇动两次活检使产量增加一倍,将使23名患者中的19名获得足够的全基因组测序产量。
Claims (20)
1.一种从固体组织样品中取样新鲜全细胞的方法,所述方法包括:
(i)将细胞从固体组织样品释放到溶液中,
(ii)将至少一部分溶液从固体组织样品中分离出来,以及
(iii)保留从固体组织样品分离的溶液。
2.如权利要求1所述的方法,其中,通过在溶液中搅动固体组织样品和/或通过在固体组织样品上洗涤溶液来将细胞释放到溶液中。
3.如权利要求1或2所述的方法,其中,保留溶液包括将所述溶液存储在约2℃至约10℃的温度下。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法,其进一步包括从所述保留溶液中包含的细胞中提取核酸。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法,其进一步包括分析所述细胞的核酸。
6.如权利要求5所述的方法,其中,所述分析包括对所述核酸进行测序方法,例如全基因组测序或全外显子组测序。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中,在步骤(ii)中将所述固体组织样品与一部分的溶液分离之后,保留所述固体组织样品用于诊断测试,任选地,例如通过将所述样品固定在福尔马林中或通过迅速冷冻来保存所述固体组织样品。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述溶液包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)或由磷酸盐缓冲盐水(PBS)组成。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中,通过将所述组织样品搅动至少1分钟或至少2分钟来从所述组织样品释放细胞。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中,通过将所述组织样品搅动不超过10分钟而从所述组织样品中释放细胞。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中,通过重复地倒转包含所述固体组织样品的样品管来从所述组织样品中释放细胞。
12.如权利要求11所述的方法,其中,所述样品大约每秒倒转一次。
13.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中,通过手动搅动所述组织样品来从所述组织样品中释放细胞。
14.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中,通过自动搅动装置从所述组织样品中释放细胞。
15.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述固体组织样品不进行涡旋处理。
16.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述固体组织样品不经受超声处理。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述固体组织样品不经受机械破坏。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述固体组织样品不经过酶处理。
19.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述溶液包括磨料,例如实验室级砂砾。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法,其中,所述固体组织样品是肿瘤组织样品。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB1807493.0 | 2018-05-08 | ||
GBGB1807493.0A GB201807493D0 (en) | 2018-05-08 | 2018-05-08 | Tissue sampling |
PCT/GB2019/051260 WO2019215440A1 (en) | 2018-05-08 | 2019-05-08 | Tissue sampling |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN112119292A true CN112119292A (zh) | 2020-12-22 |
Family
ID=62598170
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201980030993.8A Pending CN112119292A (zh) | 2018-05-08 | 2019-05-08 | 组织取样 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20210247279A1 (zh) |
EP (1) | EP3791153A1 (zh) |
CN (1) | CN112119292A (zh) |
AU (1) | AU2019266386A1 (zh) |
GB (1) | GB201807493D0 (zh) |
WO (1) | WO2019215440A1 (zh) |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050233367A1 (en) * | 2004-04-16 | 2005-10-20 | Wei-Sing Chu | Device for extracting biological molecules from tissue specimens and methods for preparing the same |
US20060008903A1 (en) * | 2004-07-09 | 2006-01-12 | Tofy Mussivand | Method and apparatus for collecting cells for macromolecular analysis |
WO2009078386A1 (ja) * | 2007-12-14 | 2009-06-25 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 組織形態保持および核酸品質保持に優れた新規標本作製法 |
US20130109024A1 (en) * | 2010-05-28 | 2013-05-02 | Sridharan Rajagopalan | Obtaining analytes from a tissue specimen |
US20130115649A1 (en) * | 2010-05-19 | 2013-05-09 | Jeffrey Richard Shuster | Methods and Reagents for Metabolomics and Histology in a Biological Sample and a Kit for the Same |
CN104302301A (zh) * | 2011-12-07 | 2015-01-21 | 西托维拉公司 | 用于样品处理的方法和装置 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2002259017B2 (en) * | 2001-04-26 | 2007-08-16 | Boston Biomedica, Inc. | Multichamber device and uses thereof for processing of biological samples |
EP1578995A2 (en) * | 2002-11-18 | 2005-09-28 | Agency for Science, Technology and Research | Method and system for cell and/or nucleic acid molecules isolation |
ES2948803T3 (es) * | 2014-09-17 | 2023-09-19 | Hologic Inc | Método de lisis parcial y ensayo |
BR112018000294B1 (pt) * | 2015-07-09 | 2024-02-27 | Syngenta Participations Ag | Método para retenção da viabilidade para a seleção de embriões de milho com uma característica desejada |
JPWO2018070222A1 (ja) * | 2016-10-13 | 2019-08-08 | パナソニックIpマネジメント株式会社 | 生体分子の抽出方法、抽出システムおよび抽出容器 |
-
2018
- 2018-05-08 GB GBGB1807493.0A patent/GB201807493D0/en not_active Ceased
-
2019
- 2019-05-08 EP EP19724570.7A patent/EP3791153A1/en not_active Withdrawn
- 2019-05-08 WO PCT/GB2019/051260 patent/WO2019215440A1/en unknown
- 2019-05-08 CN CN201980030993.8A patent/CN112119292A/zh active Pending
- 2019-05-08 US US17/053,624 patent/US20210247279A1/en not_active Abandoned
- 2019-05-08 AU AU2019266386A patent/AU2019266386A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20050233367A1 (en) * | 2004-04-16 | 2005-10-20 | Wei-Sing Chu | Device for extracting biological molecules from tissue specimens and methods for preparing the same |
US20060008903A1 (en) * | 2004-07-09 | 2006-01-12 | Tofy Mussivand | Method and apparatus for collecting cells for macromolecular analysis |
WO2009078386A1 (ja) * | 2007-12-14 | 2009-06-25 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 組織形態保持および核酸品質保持に優れた新規標本作製法 |
US20130115649A1 (en) * | 2010-05-19 | 2013-05-09 | Jeffrey Richard Shuster | Methods and Reagents for Metabolomics and Histology in a Biological Sample and a Kit for the Same |
US20130109024A1 (en) * | 2010-05-28 | 2013-05-02 | Sridharan Rajagopalan | Obtaining analytes from a tissue specimen |
CN104302301A (zh) * | 2011-12-07 | 2015-01-21 | 西托维拉公司 | 用于样品处理的方法和装置 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GB201807493D0 (en) | 2018-06-20 |
WO2019215440A1 (en) | 2019-11-14 |
EP3791153A1 (en) | 2021-03-17 |
US20210247279A1 (en) | 2021-08-12 |
AU2019266386A1 (en) | 2020-12-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP3827241B1 (en) | Dissociation of biological samples | |
JP6712737B2 (ja) | バイオマーカー、疾患関連遺伝子の探索方法、及び腎がんマーカー | |
WO2010064634A1 (ja) | 糞便試料の調製方法、糞便試料調製用溶液、及び採便用キット | |
JP2002536635A (ja) | 体液から腫瘍細胞を濃縮するか又は除去する方法及びかかる目的に適したキット | |
JP2009531033A (ja) | 胎児栄養膜の単離 | |
Qin et al. | Tissue-derived extracellular vesicles: Research progress from isolation to application | |
JP5710969B2 (ja) | 糞便試料からの核酸回収方法 | |
CN109207473B (zh) | 一种宫颈细胞裂解试剂盒及裂解方法 | |
JP2008249543A (ja) | 組織標本からの細胞の調製方法 | |
CN111575236B (zh) | 一种人肝癌组织和肝脏组织活性单细胞悬液的制备方法 | |
CN112119292A (zh) | 组织取样 | |
WO2010134245A1 (ja) | 哺乳細胞由来核酸の回収方法、核酸解析方法、及び採便用キット | |
CN112574943B (zh) | 一种体外模拟皮肤癣菌感染的模型及其建立方法和应用 | |
JP6173577B1 (ja) | 細胞増殖法を用いた循環腫瘍細胞の検出・分離取得方法 | |
CN109988745A (zh) | 一种细胞核的提取方法 | |
CA3136308C (en) | Obtaining cellular and dna material from human female reproductive system for various purposes including ovarian and endometrial cancer detection | |
EP2783011B1 (en) | Methods for detecting of benign conditions | |
US20210348993A1 (en) | Methods and kits for isolating whole cells from frozen tissues for cell fingerprinting | |
KR20130136345A (ko) | 검체 시료의 응집용 조성물 | |
WO2019091034A1 (zh) | 一种提取动物组织线粒体的方法 | |
CN117305243A (zh) | 一种类器官培养方法 | |
Oloyede | DNA extraction from chorionic villi for prenatal diagnosis of foetal haemoglobin genotype | |
JP2015225010A (ja) | アダプタ及び標本作製法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |