CN112110990A

CN112110990A - 一种TNFα结合肽及其用途

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Publication number: CN112110990A
Application number: CN202011016130.6A
Authority: CN
Inventors: 张慧君; 杜勇; 陈太标
Original assignee: Jiangsu Fenghua Biological Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Fenghua Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-09-24
Filing date: 2020-09-24
Publication date: 2020-12-22
Anticipated expiration: 2040-09-24
Also published as: CN112110990B

Abstract

本发明公开了一种TNFα结合肽及其用途，本发明利用噬菌体肽库筛选得到的TNFα结合肽，其是由7个氨基酸组成短肽，分子量只有约0.8KD，其与现有单克隆抗体相比，分子质量小，更易于进入病灶的内部而发挥作用；同时其能够较强的结合TNFα，阻断TNFα的细胞毒活性，显示了良好的特异性，且其特异性以及阻断TNFα的细胞毒活性都成剂量依赖性；此外在生产制备方面，其既可以通过化学合成得到，也可以通过基因重组表达技术得到，大大的降低了工艺难度和成本。

Description

一种TNFα结合肽及其用途

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其是涉及一种TNFα结合肽及其用途。

背景技术

人肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα，TNFα)是一种主要由巨噬细胞和单核细胞产生的促炎细胞因子，并参与正常炎症反应和免疫反应。在诸如类风湿关节炎、克罗恩病(Crohn’s disease)、多发性硬化或慢性丙型肝炎等很多炎症性及自身免疫性疾病的发生发展中，多种类型的细胞，如巨噬细胞、单核细胞、T细胞、平滑肌细胞、脂肪细胞或成纤维细胞都可分泌过量的TNFα，此时TNFα的功能是作为促炎细胞因子，过多的TNFα会导致病情加重。另外，在老年性痴呆、帕金森氏病等中枢神经系统疾病中，小神经胶质细胞、星状胶质细胞、内皮细胞、T1辅助细胞及神经元也会产生过量的TNFα，提示其在这些中枢神经系统疾病的致病过程中也发挥着重要作用。

此外，TNFα作为炎症性细胞因子，其还可以通过与55kDa的肿瘤坏死因子受体I(TNFR-1)或75kDa的肿瘤坏死因子受体2(TNFR-2)结合，在细胞间的信号传导中发挥多种功能，可以引起细胞的死亡(necrosis)或凋亡(apoptosis)，因而，其也在抗感染和抗肿瘤生成中起着重要作用。

在上述众多疾病的致病过程中，TNFα的促炎功能既有有利的一面，也有不利的一面。有利的功能包括诱导肿瘤细胞坏死及介导细菌、病毒和寄生虫入侵的免疫反应。另外，作为早期蛋白，TNFα能够引发细胞因子瀑布和增加血管的浸润，从而趋化巨噬细胞和中性粒细胞到炎症部位。但另一方面，TNFα也有致病的一面，如可能促进一些肿瘤细胞的生长、过强的细胞因子瀑布可以损害组织器官，其也是多种自身免疫性疾病的重要致病因素。

由于TNFα信号传导途径异常是众多疾病的关键致病因素，因而多个针对TNFα或TNFR的抗体类药物已经成功用于多种疾病的临床治疗。如可溶性TNFR和抗体Fc片段融合而成的二聚体融合蛋白Etanercept(Enbrel)、重组嵌合IgG1单克隆抗体infliximab(Remicade)、重组全人源IgG1单克隆抗体golimumab(Simponi)和PEG化的重组人源化Fab片段certolizumab pegol(CIMZIA)等广泛应用于类风湿关节炎、银屑病、克罗恩氏病等自身免疫性疾病的临床治疗。但是上述药物仍然存在着如下缺陷：(1)单克隆抗体的分子过大，完整单克隆抗体为四聚体，其分子量为150KD，如此大的分子不容易进入或浸润到病灶的内部。(2)单克隆抗体的生产和制备需要大规模的哺乳动物细胞培养，造成工艺复杂、成本过高。

因此，有必要提供一种新的技术方案以克服上述缺陷。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可有效解决上述技术问题的TNFα结合肽以及其在制备包含有TNFα结合肽的生物药品中的应用，该TNFα结合肽是利用噬菌体随机肽库体外筛选技术得到，其能够和人TNFα蛋白特异结合、并能够拮抗TNFα与TNFR的结合。

为达到本发明之目的，采用如下技术方案：

本发明的一种TNFα结合肽，其氨基酸序列为TSLVPRV，其中T为苏氨酸、S为丝氨酸、L为亮氨酸、V为缬氨酸、P为脯氨酸、R为精氨酸。

编码所述TNFα结合肽的核苷酸序列、含有所述的核苷酸序列表达载体以及含有所述表达载体的宿主细胞也在本发明的保护范围之内。

进一步的，本发明还提出了TNFα结合肽在制备包含有TNFα结合肽的生物药品中的应用。

同时还提出了噬菌体展示技术、噬菌体随机肽库以及特异短肽的筛选方法在筛选TNFα结合肽中的应用以及制备短肽的方法在制备TNFα结合肽中的应用。

其中，噬菌体展示技术(phage display)是利用基因工程技术将外源基因片段插入噬菌体特定蛋白的编码基因,通过噬菌体表达外源基因与噬菌体基因编码的融合蛋白或多肽，并将此融合蛋白或多肽呈现于噬菌体表面。噬菌体随机肽库则是将编码随机短肽的基因库插入到噬菌体相应基因内，构建的能够表达随机多肽噬菌体库。特异短肽的筛选是经生物淘洗去除非靶蛋白结合的噬菌体,经过过3～5轮收集、扩增及富集获得高亲和力、高特异性的噬菌体克隆株,再采用基因测序鉴定这些噬菌体克隆编码的蛋白序列可用于进一步研究。噬菌体展示技术紧密相连表型与基因型,通过结合重组蛋白识别抗原能力与噬菌体扩增能力形成一项高效表达及筛选体系,广泛应用于人源单克隆抗体、肿瘤特异性多肽等的筛选。

制备短肽的方法包括人工化学合成法以及基因重组表达技术等，其具体操作工艺已在本领域中得到广泛应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明利用噬菌体肽库筛选得到的TNFα结合肽，其是由7个氨基酸组成短肽，分子量只有约0.8KD，其与现有单克隆抗体相比，分子质量小，更易于进入病灶的内部而发挥作用；同时其能够较强的结合TNFα，阻断TNFα的细胞毒活性，显示了良好的特异性，且其特异性以及阻断TNFα的细胞毒活性都成剂量依赖性；此外在生产制备方面，其既可以通过化学合成得到，也可以通过基因重组表达技术得到，大大的降低了工艺难度和成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为重组TNFα成熟蛋白在大肠杆菌的表达与纯化；其中：右侧3条带为SDS-PAGE电泳显示纯化后的目的蛋白，左侧为蛋白分子量标准；

图2为C1噬菌体与TNFα成熟蛋白的特异结合检测结果图；其中：C1为筛选的C1噬菌体，C0为噬菌体肽库。横坐标1-5为噬菌体滴度，分别代表0(空白对照)、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³pfu/ml。

图3为TNFα对L929细胞的细胞毒活性检测结果图。其中：横坐标为TNFα蛋白浓度，阴性对照为培养液。

图4为C1短肽对TNFα细胞毒活性的抑制作用检测结果图。在TNFα为1pg/ml的培养液中，分别加入不同滴度的短肽噬菌体。其中：C1为筛选的C1噬菌体，C0为噬菌体肽库。横坐标1-5为短肽噬菌体滴度，分别代表0(空白对照)、10¹⁰、10¹¹、10¹²和10¹³pfu/ml。

具体实施方式

为了使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。

本发明所涉及的基因工程重组技术、噬菌体肽库筛选技术、细菌/细胞培养技术、重组蛋白纯化技术均为常规技术。下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。下例实施例只是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明但并不对本发明作任何限制。

实施例一、TNFα成熟蛋白在大肠杆菌中的重组表达

1、TNFα成熟蛋白重组表达载体构建

首先，从NCBI数据库中查到TNFα成熟蛋白的编码序列。此序列全长471bp，编码157个氨基酸。

采用人工合成此基因。为利于后续的克隆操作，分别在5′端加入限制性酶切位点BamHⅠ(GGATCC)、3′端加入限制性酶切位点EcoRⅠ(GAATTC)。采用常规基因克隆技术将此基因插入到BamHⅠ/EcoRⅠ双酶切的原核表达载体pBVM上，构建表达载体pBVM-TNFα。将此表达载体转化到大肠杆菌DH5α，并提取纯化pBVM-TNFα重组质粒，经DNA测序证实，所克隆的人TNFα成熟蛋白编码基因与基因库(GenBank)中编号为X01394.1的人TNFαmRNA相应序列同源性为100％。

2.TNFα成熟蛋白的重组表达

将转化有pBVM-TNFα质粒的大肠杆菌DH5α经42℃温度诱导后，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)筛选表达目的蛋白的阳性菌株。将此菌株命名为DH5α/pBVM-TNFα。

(1)诱导表达：将DH5α/pBVM-TNFα菌株接种到LB(含有100μg/mL氨苄青霉素)液体培养基中，30℃、250rpm培养过夜。次日将上述种子按照1：50的体积比例接种到新鲜的含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃、250rpm震荡培养，每小时测一次OD₆₀₀(溶液在600nm波长处的吸光值)。当OD₆₀₀达到0.6时，将摇床迅速升温至42℃，继续250rpm诱导表达5小时。诱导结束后4℃、6000rpm离心10分钟收集菌体，并用适量预冷的破菌缓冲液重悬菌体(500mL的原菌液的菌体加入20mL的破菌缓冲液)。使用超声波细胞粉碎机在冰浴条件下破碎菌体，参数设置如下：探头Φ3，超声12s，间歇25s，总时间6分钟。超声结束后，4℃、12000rpm离心10分钟，分别收集上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳，以检测重组蛋白的表达情况。

3.重组TNFα成熟蛋白的纯化

SDS-PAGE电泳显示，所诱导表达的TNFα成熟蛋白存在于包涵体内。因此按包涵体的操作技术纯化目的蛋白。用含有8M尿素的变性液重悬包涵体，4℃放置过夜。次日，4℃、12000rpm离心20分钟，收集上清。按下列步骤纯化目的蛋白：

(1)用0.45μm的滤膜过滤上清，除去大颗粒杂质作为蛋白样品备用。

(2)镍纯化柱用变性液平衡。将上述蛋白样品上样于镍纯化柱中，自然流速。

(3)上样完成后，使用含有20mM咪唑的破菌缓冲液将镍纯化柱上残留的蛋白样品冲洗干净，一般需要10个柱体积。

(4)洗杂结束后，使用含有100mM、150mM和200mM咪唑的破菌缓冲液洗脱目的蛋白，用干净的1.5mL的离心管收集纯化样品，每管收集1mL样品，共20-40mL纯化样品。

(5)将上步得到的纯化样品通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。最后收集目的条带清晰且含量高的蛋白样品。

(6)包涵体复性

纯化后的包涵体采用逐步透析的方法，减少尿素的含量，达到复性的目的。根据蛋白的截留分子量选择合适孔径的透析袋。根据测定的浓度将要复性的重组蛋白浓度用溶解液稀释到0.1mg/mL-0.2mg/mL。

4.实验结果

(1)构建的TNFα成熟蛋白重组表达载体pBVM-TNFα，经DNA测序证实，所克隆的人TNFα成熟蛋白编码基因与基因库(GenBank)中编号为X01394.1的人TNFαmRNA相应序列同源性为100％，达到了设计要求。

(2)所筛选的阳性菌株DH5α/pBVM-TNFα经42℃温度诱导，成功高效表达了目的蛋白，其分子量约为16KD，表达量约为菌体蛋白的20％。

(3)经镍亲和层析纯化及复性，成功获得纯度>95％的TNFα成熟蛋白(如图1所示)

实施例二、噬菌体随机肽库筛选

一、测定噬菌体滴度(M13方法)

只有当噬菌体的感染复度MOI(multiplicity of infection)值远低于1时(即细胞过量时)，噬菌斑的数量才会随着加入噬菌体的量而呈线性增加。

1.接种ER2738单菌落于5-10ml LB培养基中，摇床培养至对数中期(OD₆₀₀＝～0.5)。

2.细胞生长时，微波炉融化培养基的上层琼脂，分成3ml等份于灭菌试管中，每个噬菌体稀释度一管。保存于45℃备用。

3.37℃预温LB/IPTG/Xgal平板，每个噬菌体稀释度取一个平板备用。

4.在LB中准备10倍系列稀释的噬菌体。

稀释范围：扩增的噬菌体培养物上清：10⁸-10¹¹；未扩增的淘选洗脱物：10¹-10⁴。5.当菌体培养物达对数中期，分成200μl等份于微量离心管中，每个噬菌体稀释度一管。

6.每管加入10μl不同稀释度的噬菌体，快速震荡混匀，室温温育1-5分钟。

7.将感染细胞加入45℃预温的上层琼脂培养管中，每次一管，快速混匀，立即倾注于37℃预温的LB/IPTG/Xgal平板上。适当倾斜平板将上层琼脂均匀铺开。

8.待平板冷却5分钟后，倒置于37℃培养过夜。

9.检查平板，计数有～10²个噬菌斑的平板上的斑数。然后用此数目乘以稀释因子即得到每10μl噬菌体的空斑形成单位(pfu)滴度。

二、生物淘选(Biopanning)步骤

第一天

准备100μg/ml的重组TNFα成熟蛋白溶液(溶于0.1M pH 8.6的NaHCO3)。

96孔的微孔板，每孔150μl上述溶液，反复旋转直到表面完全湿润。

在增湿容器(如：排列有湿纸巾的可封口塑料盒)中4℃轻微震荡，孵育过夜。

取出保存的ER2738菌种在LB-Tet平板上划线，37℃恒温培养箱培养。

第二天

挑取大肠杆菌ER2738单克隆菌株于10ml LB液体培养基中。同时，将ER2738接种于20ml LB液体培养基于250ml三角瓶中，37℃剧烈震荡培养。

倒掉每板中的包被液，板倒置在干净的纸巾上用力拍甩以除去残余溶液。每孔加满封闭液，4℃作用至少1小时。

吸出封闭液。再用TBST(TBS+0.1％[v/v]Tween-20)缓冲液快速洗板6次。每次均旋转以使板或孔的底部及边缘均被洗到，倾去缓冲液，倒置在干净纸巾上拍甩以除去残余溶液(或使用自动洗板机)。

用100μl的TBST缓冲液稀释4×10¹²的噬菌体(即10μl的原始文库)，然后加到已包被好的板上，室温温和摇动60分钟。

倾倒除去未结合噬菌体，倒置板在干净的纸巾上拍甩除去残余溶液。

按步骤7中所述方法用TBST缓冲液洗板10次。

用100μl0.2 M Glycine-HCl(pH 2.2),1mg/ml BSA的洗脱缓冲液洗脱结合的噬菌体。室温温和摇动30分钟，将洗脱液吸入另一干净微量离心管中，加入150μl1M HCl(pH9.1)溶液中和上述洗脱液。

按上述常规M13方法中的程序测定1μl洗脱物的滴度。如需要，可对第一或第二轮洗脱物滴度测定所得的噬菌斑进行测序，方法见下述。

剩余洗脱物应当被扩增：将洗脱物加入到20ml ER2738培养物中，37℃剧烈摇动培养4.5小时。

将培养物转入一离心管中，然后，4℃10,000rpm离心10分钟。上清液转入另一离心管中，再离心。

将上清的上部80％转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl。让噬菌体4℃沉淀过夜。

第三天

4℃10,000rpm离心PEG沉淀15分钟。倒掉上清液，再短暂离心，吸去残留上清液。

沉淀物重悬于1ml TBS中，悬液转入微量离心管中，4℃离心5分钟使残余细胞沉淀。

上清转入另一新鲜微量离心管，用1/6体积的PEG/NaCl再沉淀。冰上孵育60分钟。4℃离心10分钟，弃上清，再短暂离心，用微量移液器吸去残余上清。

沉淀物重悬于200μl TBS,0.02％NaN3中。离心1分钟，沉淀任何残余的不溶物。上清转入新鲜管中。此即为扩增后的洗脱物。

根据上述常规M13方法用LB/IPTG/Xgal平板滴定扩增后的洗脱物。4℃贮存。

再包被一个板或孔准备第二轮淘选时用。

第四和第五天

计数板上蓝斑数确定滴度。用这个值来计算相应于1-2×10¹¹pfu的加入量。如果滴度太低，接下来的几轮淘选可用低至109pfu的噬菌体加入量进行试验。

进行第二轮淘选：用第一轮淘选扩增的洗脱物中1-2×10¹¹pfu的噬菌体量重复步骤4-18，在清洗步骤中将Tween的浓度增至0.5％(v/v)。

在LB/IPTG/Xgal平板上测定第二轮淘选所得洗脱物扩增后的滴度。

再包被一个微孔准备第三轮淘选时用，见步骤1-3。

第六天

进行第三轮淘选：用第二轮淘选扩增的洗脱物中2×10¹¹pfu的噬菌体量重复步骤4-11。

在LB/IPTG/Xgal平板上测定第三轮淘选所得洗脱物未扩增时的滴度。滴度测定时得到的噬菌斑可做测序用。其余洗脱物4℃贮存。

三、实验结果

按标准操作程序，繁殖、纯化单个噬菌斑克隆，并提取DNA测序做编码短肽的序列分析。将第三轮淘洗所获得的单个噬菌斑进行DNA测序，推导出其编码的短肽氨基酸序列，共进行39个噬菌斑的分析。测序的39个样品，共编码8种(C1-C8)短肽，其中TSLVPRV序列出现的频次最高，为20个，提示此短肽可能是PD-L1结合的主要短肽。

具体序列及频次结果如下表：

分组	氨基酸序列	克隆数
			C1	TSLVPRV	20
C2	HSLVYYF	8
			C3	AHHLKVS	4
C4	YFGSVWH	2
			C5	ESRVMSR	2
C6	HTEASRN	1
			C7	NLLDSLH	1
C8	NNAFDLF	1

实施例三、高效价表达特异短肽噬菌体C1株的制备

为鉴定所筛选短肽与TNFα成熟蛋白结合的特异性，需制备高效价的C1株噬菌体。制备过程如下：

1.在1ml的LB培养基中，加入10μl的过夜培养细菌ER2738。

2.用无菌木制牙签挑取单个C1噬菌体噬菌斑，接种上述1ml细菌培养液，37℃、250rpm振摇培养5小时。

3.将培养液转到1.5ml离心管中，14000rpm离心30秒。将80％的上清液转到另一新离心管内，此为C1株的贮存液，4℃存放。

4.在20ml LB培养基中，加入0.2ml的过夜培养细菌ER2738和5μl步骤4制备的C1株贮存液，37℃、250rpm振摇培养5小时。

5.将培养液转到一离心管中，4℃、12000g离心10分钟。将上清转到另一新离心管中，重新离心一次。

6.将80％的上清转到一新离心管中，加入1/6体积的噬菌体沉淀剂(20％PEG、2.5MNaCl)，4℃条件下沉淀至少2小时。

7.4℃、12000g离心15分钟，倒掉上清液。

8.将沉淀重悬于1ml的TBS缓冲液，并转移到1.5ml离心管内，4℃、14,000rpm离心5分钟。

9.将上清转到新离心管内，加入1/6体积的噬菌体沉淀剂(20％PEG、2.5M NaCl)，冰上沉淀至少1小时。4℃、14,000rpm离心10分钟，倒掉上清。

10.将沉淀重悬于50μl的TBS缓冲液。测定噬菌体滴度并4℃保存。

11.结果：经上述的噬菌体扩增、PEG沉淀纯化，所获得的C1株噬菌体滴度为1.2x10¹⁴⁽pfu)

实施例四、C1噬菌体短肽与TNFα成熟蛋白的特异性结合

利用TNFα成熟蛋白作为筛选分子，经过3轮生物淘洗所筛选到的C1噬菌体表面表达有短肽TSLVPRV，理论上，此短肽可以在液相中与TNFα成熟蛋白发生特异性结合，并呈现剂量-效应关系。

试验过程如下：

微孔板包被本发明实施例二所纯化的TNFα成熟蛋白，蛋白浓度为1μg/ml，每孔包被100μl，4℃过夜。

倒掉包被液，用TBST缓冲液(50mM Tris HCl,pH 7.4,150mM NaCl,0.1％Tween)洗涤2次。加入150μl封闭液(含2％BSA的TBST)，37℃孵育1小时。倒掉封闭液，再用TBST洗涤2次。

用TBST缓冲液稀释本发明实施例三所制备的高效价C1噬菌体，滴度(pfu)分别为每ml含10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³。上述封闭后的微孔内加入100μl的各个稀释度的C1噬菌体，37℃孵育1小时。同时以相同滴度的噬菌体库作为对照。

各微孔倒掉反应液，用TBST缓冲液洗涤6次，每孔加入100μl辣根或氧化物酶(HRP)标记的抗噬菌体M13抗体(anti-M13),37℃孵育1小时。

各微孔倒掉反应液，用TBST缓冲液洗涤6次，每孔加入100μl的TMB底物液，37℃孵育10分钟。终止反应，测定OD₄₅₀吸光度。

结果：在C1噬菌体与TNFα的特异结合试验中，随着C1滴度的提高，其OD₄₅₀吸光度随之增高，而作为对照的噬菌体库则无明显的反应，提示C1噬菌体可以和TNFα特异结合，而且呈现剂量-效应反应关系。(如图2所示)

实施例五、C1噬菌体短肽对TNFα细胞毒活性的抑制效应。

为证实本发明所筛选的C1噬菌体短肽是否能够阻断TNFα的细胞毒活性，设计了L929细胞毒活性抑制试验。

TNFα对一些肿瘤细胞有细胞毒杀伤作用，而对正常细胞则无此效应。根据这一特点，可以检测TNFα的细胞毒活性水平。最常用的方法是体外检测TNFα对小鼠成纤维瘤细胞(L929细胞)的细胞毒效应。TNFα对L929细胞有细胞毒作用，如同时加用转录抑制剂放线菌素D，则可提高L929细胞对TNFα的敏感性10～100倍。然后利用染料结晶紫可使活细胞染色，再用脱色液将染料脱出，测定其吸光度OD值，即可反应细胞的存活状态。

试验过程如下：

取对数生长期的L929细胞，用0.25％胰蛋白酶消化2-3分钟，然后洗涤细胞2次，以去除消化液及原生长培养液，用RPMI-1640培养液调L929细胞浓度为2×10⁵/ml。

将上述细胞悬液加至96孔培养板，100ul/孔，37℃，5％CO2培养箱中培养24小时。

吸去细胞培养上清液后，各孔分别加入不同浓度的100ul标准品或待测样品，各设双复孔，并设培养液阴性对照。

同时向各孔均加入10ul放线菌素D(0.5μg/孔)，37℃，5％CO2培养箱中培养12小时。甩弃上清，用RPMI-1640培养液洗细胞1次。

每孔加入100μl的0.25％结晶紫，室温下染色10分钟。甩弃上清，再用PBS洗板3次。

室温下凉干，加入100μl/孔的柠檬酸钠缓冲液脱色，充分混匀后，用酶标仪以检测波长490nm检测各孔OD490值。

根据上述结果，选择合适的TNFα蛋白浓度(1pg/ml)作为细胞毒活性抑制的试验浓度,分别加入不同滴度的C1短肽噬菌体(10¹⁰、10¹¹、10¹²和10¹³/ml)，并以筛选前的噬菌体库作为阴性对照，按上述步骤4-6操作，检测C1短肽对TNFα细胞毒活性的抑制作用。

结果：在匹克(pg)级浓度下，TNFα对L929细胞即具有明显的毒性(如图3所示)，并且具有明显的剂量-效应关系。选取TNFα浓度为1pg/ml作为试验浓度，在加入不同浓度的C1短肽噬菌体(10¹⁰、10¹¹、10¹²和10¹³/ml)后，其细胞毒活性得到明显的抑制，而且也呈现明显的剂量-效应关系，即随着C1浓度的逐步增高，其对TNFα的抑制作用也随之增强，而作为阴性对照的噬菌体肽库则没有这种作用(如图4所示)，证明C1短肽具有抑制TNFα细胞毒活性的功能。

所述对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。

Claims

1.一种TNFα结合肽，其特征在于：TNFα结合肽的氨基酸序列为TSLVPRV。

2.编码权利要求1所述的TNFα结合肽的多核苷酸。

3.一种表达载体，其特征在于：含有权利要求2所述的多核苷酸。

4.一种宿主细胞，其特征在于：含有权利要求3所述的表达载体。

5.权利要求1所述的TNFα结合肽在制备包含有TNFα结合肽的生物药品中的应用。

6.噬菌体展示技术在筛选如权利要求1所述的TNFα结合肽中的应用。

7.噬菌体随机肽库在筛选如权利要求1所述的TNFα结合肽中的应用。

8.特异短肽的筛选方法在筛选如权利要求1所述的TNFα结合肽中的应用。

9.制备短肽的方法在制备如权利要求1所述的TNFα结合肽中的应用。