CN112105647A - 生产Hu14.18K322A单克隆抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了一种通过将哺乳动物细胞培养物在包含植物蛋白水解物和稳定葡萄糖浓度的培养基中培养来生产Hu14.18K322A单克隆抗体的分批补料方法，其中所述方法产生滴度和非岩藻糖基化百分率提高的Hu14.18K322A单克隆抗体群体。

Description

生产Hu14.18K322A单克隆抗体的方法
引言
本申请是2018年2月15日提交的美国申请系列号62/630,971的部分接续申请案，所述美国申请的内容整体通过引用并入本文。
背景技术
产品质量属性对于治疗性抗体的功能和可制造性来说至关重要。它们可能受到大量生产过程参数例如细胞培养基的显著影响。生长和补料培养基的组成，包括氨、谷氨酰胺、葡萄糖和金属离子的浓度，可以影响抗体的糖基化。因此，在培养基开发和优化过程中，至关重要的是监测和考虑培养基对糖基化的影响。对于其作用机制包括抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的治疗性抗体来说，降低已知影响ADCC活性的N-聚糖岩藻糖基化是特别重要的。参见例如Shinkawa等，(2003)J.Biol.Chem.278(5):3466-73；Niwa等，(2004)Cancer Res.64:2127-2133；Jefferis等，(1998)Immunol Rev.163:59-76；Shields等，(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740。因此，对于获得高抗体滴度和适合的岩藻糖基化以提高治疗性抗体的功效，存在着极大兴趣。
解决岩藻糖基化的一种方法聚焦于使用产生去岩藻糖基化抗体的优化的宿主细胞系。参见例如Kanda等，(2006)Biotechnol.Bioeng.94:680-688；Yamane-Ohnuki等，(2004)Biotechnol.Bioeng.87:614-622；WO 2017/079165和US 2009/0214528。另外，过程参数例如pH、克分子渗透压重量浓度、温度以及氨基酸、脂质和离子(例如锰)的增补等可以调节抗体的糖基化。参见例如Konno等，(2012)Cytotechnology64:249-26；Hossler等，(2009)Glycobiology 19:936-949；Trummer等，(2006)Biotechnol.Bioeng.94:1033-44；Miller等，(1988)Biotechnol.Bioeng.32:947–965；WO 2013/114165；WO 2015/140700；US2016/0362714；WO 2007/070315；US 2015/0344579和WO 2017/120347。
尽管对细胞培养过程来说存在着提供特定岩藻糖基化谱的必要性，但更重要的是，对于特定重组蛋白来说应该选择用于调节岩藻糖基化聚糖含量的条件，以便不影响或显著改变任何其他聚糖谱的量或水平。此外，用于获得特定岩藻糖基化谱的条件的组合应该对所述过程的滴度和/或生产率没有显著影响。因此，本发明提供了一种用于提高抗体的量和所述抗体的非岩藻糖基化两者的细胞培养方法。
发明内容
提供了一种在哺乳动物细胞培养物中生产基本上非岩藻糖基化的Hu14.18K322A单克隆抗体的分批补料方法。这种方法包括将带有编码Hu14.18K322A单克隆抗体的核酸并被选择用于生产基本上非岩藻糖基化的Hu14.18K322A单克隆抗体的哺乳动物宿主细胞在包含植物蛋白水解物和0.5g/L至1.5g/L的稳定葡萄糖浓度的细胞培养基中培养，由此在哺乳动物细胞培养物中生产Hu14.18K322A单克隆抗体的步骤。在一个实施方式中，所述分批补料方法还包括纯化所述Hu14.18K322A单克隆抗体的步骤，例如通过将包含所述Hu14.18K322A单克隆抗体的哺乳动物细胞培养基与蛋白A树脂相接触并洗脱所述Hu14.18K322A单克隆抗体。还提供了一种Hu14.18K322A单克隆抗体群体，其具有例如至少约400mg/L的抗体滴度，其中所述抗体是非岩藻糖基化的(例如至少55％非岩藻糖基化)并表现出增强的ADCC活性。在某些实施方式中，所述Hu14.18K322A单克隆抗体群体被提供在药物组合物中，其中将所述抗体与生理上可接受的稀释剂、载体或赋形剂混合。本发明还提供了一种哺乳动物宿主细胞，其带有编码Hu14.18K322A单克隆抗体的核酸并被选择用于生产基本上非岩藻糖基化的Hu14.18K322A单克隆抗体(例如至少55％非岩藻糖基化)，还提供了一种哺乳动物宿主细胞，其于2019年2月13日保藏在美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)登记号XXXXX下。
附图说明
图1示出了通过本发明的方法生产的Hu14.18K322A单克隆抗体与Hu14.18K322A单克隆抗体的常规制备物相比的聚糖分布。样品1和样品2代表了Hu14.18K322A抗体的两个独立的澄清收获物。
图2示出了单克隆抗体Hu14.18K322A与ch14.18(一种嵌合抗GD2抗体)相比的ADCC活性对非岩藻糖基化％(％AF)的图。
发明详述
Hu14.18K322A是一种抗体，其含有免疫球蛋白G1重链和κ轻链的完整人类氨基酸序列，以及与鼠类14.18抗体的抗原结合序列相对应的互补决定区。得到的Hu14.18抗体大约98％源自于人类基因，因此其免疫原性较低。此外，Hu14.18K322A具有被设计成用于防止补体级联反应的激活的单个点突变(K322A)(参见US 7,432,357、US8,835,606和US 9,617,349，其整体通过引用并入本文)。体外分析显示，Hu14.18K322A保留了ch14.18的结合特异性和ADCC能力，基本上没有补体依赖性裂解。此外，在大鼠中的体内分析证明，与ch14.18相比使用Hu14.18K322A的触物感痛较低。因此与ch14.18相比，Hu14.18K322A具有引起更少的补体介导的疼痛和更少的超敏反应的潜力。
现在已开发了一种生产Hu14.18K322A抗体的方法，其产生高抗体浓度和可比或更好的体内活性。所开发的分批补料方法包括将生产克隆在植物蛋白水解物中培养并控制葡萄糖的浓度，这两者的组合提供了产品数量(即滴度和最高ADDC活性)和产品质量(即非岩藻糖基化的抗体的最低百分率，例如至少55％的非岩藻糖基化)两者的提高。
因此，本发明提供了用于改善Hu14.18K322A抗体在细胞培养物、特别是哺乳动物细胞培养物中的表达的方法和组合物。具体来说，本发明包括通过向基础培养基添加培养基增补物例如植物蛋白水解物来促进Hu14.18K322A单克隆抗体生产的改进的分批补料方法和组合物。具体来说，本发明提供了一种在分批补料方法中生产Hu14.18K322A单克隆抗体的方法，所述方法包括将带有编码Hu14.18K322A的重组核酸的哺乳动物宿主细胞在Hu14.18K322A表达期间在含有植物蛋白水解物和0.5至1.5g/L的稳定葡萄糖浓度的细胞培养基或基础培养基中培养，从而在哺乳动物细胞培养物中生产Hu14.18K322A单克隆抗体。本发明还包括这种抗体的纯化和配制。
正如本文中所述，“Hu14.18K322A”是指具有被设计成用于防止补体级联反应的激活的单个点突变(K322A)的14.18抗体(参见US7,432,357、US 8,835,606和US 9,617,349)。本发明的Hu14.18K322A抗体可以是任何同种型或亚类的糖基化或非糖基化的免疫球蛋白，并包括其与完整抗体竞争特异性结合的抗原结合区。所述Hu14.18K322A抗体优选是人类或人源化的，并包括嵌合、多特异性和单克隆抗体或其抗原结合片段。出于本发明的目的，术语“抗体”包括但不限于通过重组手段制备、表达、产生或分离的抗体，例如从用编码Hu14.18K322A抗体的核酸转染的宿主细胞分离的抗体。在特定的实施方式中，所述Hu14.18K322A抗体是人源化单克隆抗体。
尽管可以使用各种不同的宿主细胞来生产所述Hu14.18K322A抗体，但哺乳动物宿主细胞是优选的，并且源自于灵长类动物例如人、猴等的动物细胞或源自于啮齿动物例如小鼠、大鼠、仓鼠等的动物细胞是更加优选的。所述属于哺乳动物的细胞优选为骨髓瘤细胞、卵巢细胞、肾细胞、血细胞、子宫细胞、结缔组织细胞、乳腺细胞、胚胎视网膜母细胞瘤细胞或源自于它们的细胞，更优选为选自骨髓瘤细胞、骨髓瘤细胞来源的细胞、卵巢细胞和卵巢细胞来源的细胞的细胞。
哺乳动物宿主细胞的实例包括人类细胞系例如HL-60(ATCC No.CCL-240)、HT-1080(ATCC No.CCL-121)、HeLa(ATCC No.CCL-2)、293(ECACC No.85120602)、Namalwa(ATCCCRL-1432)、Namalwa KJM-1(Hosoi等，(1988)Cytotechnology 1:151)、NM-F9(DSMACC2605，WO 2005/017130)和PER.C6(ECACC No.96022940，US6,855,544)，猴细胞系例如VERO(ATCC No.CCL-1651)和COS-7(ATCC No.CRL-1651)，小鼠细胞系例如C1271(ATCCNo.CRL-1616)、Sp2/0-Ag14(ATCC No.CRL-1581)和NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)、NS0(ATCCNo.CRL-1827)，大鼠细胞系例如Y3 Ag 1.2.3.(ATCC No.CRL-1631)、YO(ECACCNo.85110501)和YB2/0(ATCC No.CRL-1662)，仓鼠细胞系例如CHO-K1(ATCC No.CCL-61)、CHO/dhfr-(ATCC No.CRL-9096)、CHO/DG44(Urlaub&Chasin(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216)和BHK21(ATCC No.CRL-10)，狗细胞系例如MDCK(ATCCNo.CCL-34)等。
骨髓瘤细胞或骨髓瘤细胞来源的细胞的实例可以包括Sp2/0-Ag14、NS0、Y3 Ag1.2.3.、Y0或YB2/0等。卵巢细胞或卵巢细胞来源的细胞的实例可以包括CHI-K1、CHO/dhfr-、CHO/DG44等。此外，肾细胞的实例可以包括293、VERO、COS-7、BHK21、MDCK等。血细胞的实例可以包括HL-60、Namalwa、Namalwa KJM-1、NM-F9等。子宫细胞的实例可以包括HeLa等。结缔组织细胞的实例可以包括HT-1080、NIH3T3等。乳腺细胞的实例可以包括C12711等。胚胎视网膜母细胞瘤细胞的实例可以包括PER.C6等。
具有生产本发明的抗体的能力的哺乳动物宿主细胞可以包括被制备成用于生产所述抗体的融合细胞等。此外，被突变成用于生产所述抗体的哺乳动物细胞、被突变成具有所述抗体的提高的表达水平的哺乳动物细胞等，也包括在本发明的哺乳动物细胞中。
生产本发明的抗体的哺乳动物宿主细胞优选地包括重组哺乳动物宿主细胞，其用编码所述Hu14.18K322A抗体的重组核酸(例如载体)转化。编码所述Hu14.18K322A抗体的重组核酸在本领域中是已知的，并包括例如在通过引用并入本文的US 7,432,357中所公开的表达质粒pdHL7s-hu14.18。用于表达所述抗体的转化细胞可以通过用常规方法将所述重组载体引入到所述哺乳动物宿主细胞中来获得。参见例如Kaufman(1990)《大规模哺乳动物细胞培养》(Large Scale Mammalian Cell Culture)，pp.15-69。使用可商购试剂例如阳离子脂质试剂LIPOFECTAMINETM LIPOFECTAMINETM-2000或LIPOFECTAMINETM-plus的其他流程，也可用于转染细胞(Feigner等，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413-7417)。此外，电穿孔或用核酸包被的微弹丸进行轰击，也可用于转染哺乳动物细胞，其使用例如在Sambrook等，(1989)《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第二版，Vol.1-3,Cold Spring Harbor Laboratory Press中的程序。稳定转化体的选择可以使用本领域中已知的方法，例如使用对化合物如G418和潮霉素B的抗性来进行。
本发明还提供了带有编码Hu14.18K322A单克隆抗体的核酸并被选择用于生产基本上非岩藻糖基化的Hu14.18K322A单克隆抗体的哺乳动物宿主细胞。在某些实施方式中，由所述哺乳动物宿主细胞产生的抗体是至少55％非岩藻糖基化的。示例性的哺乳动物宿主细胞系(克隆134)于2019年2月13日被美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection,10801University Blvd.,Manassas,VA 20110)保藏在ATCC登记号XXXXX下。
正如所指示的，本发明的方法使用分批补料方法来进行。当在本文中使用时，“分批补料方法”是通过在细胞培养基或基础培养基中接种细胞来开始培养并在培养期间进行各种不同添加剂的添加的方法。分批补料培养是用于从哺乳动物细胞大规模生产蛋白质的广泛采用的培养方法。参见例如Chu&Robinson(2001)Current Opin.Biotechnol.12:180-87。哺乳动物细胞的分批补料培养是其中用浓缩的基础培养基和各种不同的添加剂连续或周期性地对培养进行补料的培养。补料可以按预定的时间表进行，例如每天、每两天一次、每三天一次等。与不进行补料的分批培养相比，分批补料培养可以生产更大量的蛋白质。参见例如US 5,672,502。在某些实施方式中，本发明方法的分批补料培养产生至少1.5g/L的抗体滴度。在另一个实施方式中，产生至少2g/L的滴度。在另一个实施方式中，产生至少4g/L的所述抗体。在又一个实施方式中，产生至少5g/L的所述抗体。在其他实施方式中，本发明提供了生产约6g/L抗体的方法。
根据本发明的方法可以在单阶段过程或多阶段过程中进行。与单阶段过程相比，多阶段过程是指将所述细胞在两个或更多个不同的阶段中进行培养。例如，可以首先将细胞在使细胞增殖和存活力最大化的环境条件下在一个或多个生长阶段中培养，然后转移到在使蛋白质生产最大化的条件下的生产阶段。当在本文中使用时，“生长阶段”是指培养的细胞快速分裂并增加数量的时期。在生长阶段中，通常可以将细胞在培养基中和在被设计成使细胞增殖最大化的条件下培养。“生产阶段”是指细胞生产最大量的重组蛋白的时期。生产阶段的特征在于与生长阶段中相比细胞分裂更少，并且也可以包括使用被设计成使多肽生产最大化的培养基和培养条件。
在通过哺乳动物细胞生产蛋白质的商业化过程中，在最终的生产阶段之前通常存在多个例如至少约2、3、4、5、6、7、8、9或10个在不同的培养容器中进行的生长阶段。所述生长阶段和生产阶段之前可以是一个或多个过渡阶段，或者所述生长阶段和生产阶段可以被一个或多个过渡阶段隔开。在多阶段方法中，本发明的方法至少可以在生产阶段中使用，尽管它也可以在先前的生长阶段中使用。生产阶段可以大规模进行。通常，在生物反应器中，在无菌、受控的温度和大气条件下进行细胞培养。生物反应器是用于培养细胞的装置，在其中可以监测、调节和控制环境条件例如温度、大气、搅拌和/或pH。大规模过程可以在至少约100、500、1000、2000、3000、5000、7000、8000、10,000、15,000、20,000升的体积中进行。
在某些实施方式中，所述生长阶段在约33℃至约38℃范围内的温度(优选为约37℃)下进行。同样地，所述生产阶段在约28℃至约38℃范围内、优选地约33℃至约37℃范围内的温度下进行。在特定实施方式中，所述培养的温度为37℃。
所述培养步骤可以任选地包括蛋白质生产的化学诱导剂，例如咖啡因、丁酸酯和六亚甲基双乙酰胺(HMBA)。如果添加诱导剂，它们可以在所述生产阶段开始后一小时到五天添加。
根据本发明的分批补料方法，所述哺乳动物细胞被最小限度地提供包括基础培养基、葡萄糖、和植物蛋白水解物的组合的组合补料溶液，所述组合补料溶液。出于本发明的目的，“基础培养基”或“细胞培养基”是适合于在体外细胞培养中生长动物细胞例如哺乳动物细胞的培养基。基础培养基制剂在本领域中是公知的。通常，基础培养基提供标准的无机盐例如锌、铁、镁、钙和钾以及微量元素、维生素、能源、缓冲系统和必需氨基酸。基础培养基可以含有或不含血清、蛋白胨和/或蛋白质。各种不同的基础培养基，包括无血清和限定培养基，是可商购的。例如，可以使用下述细胞培养基中的任一种或组合：RPMI-1640培养基，RPMI-1641培养基，Dulbecco's改良的Eagle's培养基(DMEM)，最小基本培养基(MEM)，Eagle基础培养基(BME)，Eagle最小基本培养基，F-12K培养基，Ham's F12或F-10培养基，DME/F12，α-最小基本培养基(α-MEM)，Glasgow's最小基本培养基(G-MEM)，PF CHO(SAFCBiosciences)，POWERCHOTM2(Lonza)，ZAP-CHO(Invitria)，CD CHO、CD OptiCHOTM和CHO-S-SFMII(Invitrogen)，ProCHOTM(Lonza)，CDM4CHO(Hyclone)，Iscove's改良的Dulbecco's培养基，McCoy's 5A培养基，Leibovitz's L-15培养基，以及无血清培养基例如杂交瘤无血清培养基(HSFM)和EX-CELLTM300系列(JRH Biosciences,Lenexa,KS)等。
取决于待培养的细胞的要求和/或所需的细胞培养参数，基础培养基可以用另外的或高浓度的成分补充。术语“成分”是指可以在细胞培养基中用于维持或促进细胞的生长或增殖的任何化合物，无论是化学还是生物学来源的。术语“组分”、“营养物”和“成分”可互换使用，并且都打算是指此类化合物。在细胞培养基中使用的典型成分包括氨基酸、盐、金属、糖、脂质、核酸、激素、维生素、脂肪酸、蛋白质等。其他促进或维持离体细胞培养的成分可以由本领域技术人员在本发明的范围内并且根据具体需要选择。
在优选实施方式中，本发明的细胞培养基是无血清、无蛋白质和/或无蛋白胨的。当细胞培养基不含血清(例如胎牛血清(FBS)、马血清、山羊血清或本领域技术人员已知的任何其他动物来源的血清)时，所述培养基被认为“无血清”。“无蛋白质”适用于不含外源添加的蛋白质例如转铁蛋白、蛋白质生长因子IGF-1或胰岛素的细胞培养基。无蛋白质培养基可以含有或不含蛋白胨。“无蛋白胨”适用于不包含外源蛋白水解物例如动物和/或植物蛋白水解物的基础培养基。
在某些实施方式中，所述基础培养基被改良以除去在标准或常规基础培养基中存在的某些非营养组分，例如各种不同的无机或有机缓冲剂、表面活性剂和氯化钠。从基础细胞培养基除去这些组分允许提高剩余营养组分的浓度，并且可能改善总体细胞生长和蛋白质表达。在某些实施方式中，改良的基础培养基排除了下述成分中的任一者，如果不是全部的话：碳酸氢钠，缓冲剂，磷酸二氢钠，磷酸氢二钠和表面活性剂。参见US 9,234,032。这些成分通常存在于商品化基础细胞培养基中，并且可以由商品化培养基供应商例如SAFC(以前的JRH Bioscience)、Invitrogen、Atlanta Biologicals和Lonza除去。可选地，本领域普通技术人员可以根据制造基础细胞培养基的标准方法制备改良的基础细胞培养基，其中碳酸氢钠、缓冲剂、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和表面活性剂中的一者或多者被省略。
当使用改良的基础培养基时，优选地在生长和/或生产阶段中将所述从基础培养基省略的一种或多种组分添回到所述细胞培养基。当添加到所述改良的基础培养基时，优选地使用下述组分量：约1至3g/kg的碳酸氢钠；约1至3g/kg的缓冲剂(例如N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-[2-乙磺酸](HEPES))；约0.01至0.1g/kg的NaH2PO4-H2O；约0.1至0.1g/kg的Na2HPO4-7H2O；和约0.1至2g/kg的表面活性剂(例如在商标
Figure BDA0002630991950000101
F-68下销售的基于氧化乙烯和氧化丙烯的嵌段共聚物)。
值得注意的是，包括所述缓冲剂是为了帮助将所述细胞培养基维持在所需pH。在一个实施方式中，所述细胞培养基的pH在6.0至8.0、6.5至7.5或6.8至7.3的范围内。在这些pH值中间的数值例如6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9和8.0以及本文中叙述的所有其他数值，也打算作为本发明的一部分。正如适用于本文中公开的任何范围，使用任何上面叙述的值作为上限和/或下限的组合的值的范围，打算被包含在本发明的范围之内。
在某些实施方式中，所述基础培养基省略了克分子渗透压浓度调节剂。当在本文中使用时，术语“克分子渗透压重量浓度”被定义为每千克溶剂中溶质的重量克分子渗透压的量度(mOsm/kg)，并且可以包括离子化或非离子化的分子。在细胞培养过程中，通过例如添加补料、盐、添加剂或代谢物，克分子渗透压重量浓度可能改变。优选地，在抗体生产时(即在生产阶段中)所述细胞培养基的克分子渗透压重量浓度在约300至500mOsm/kg或更优选地约400至430mOsm/kg的范围内，以及它们中间的数字。在某些实施方式中，所述克分子渗透压浓度调节剂是NaCl、KCl或KNO3。在某些实施方式中，所述克分子渗透压浓度调节剂是NaCl。在一个实施方式中，克分子渗透压浓度调节剂以0g/L至10g/L之间的终浓度添加到所述细胞培养基。在另一个实施方案中，所述克分子渗透压浓度调节剂的终浓度为0g/L至6.5g/L。使用任何上面叙述的值作为上限和/或下限的组合的值的范围，打算被包含在本发明的范围之内。
根据本发明，所述分批补料方法包括向所述基础培养基添加至少一种植物蛋白水解物。术语“水解物”包括任何酶消化物，特别是通过用至少一种酶处理植物组分而制备的特殊类型的提取物，所述酶能够将所述植物的组分分解成更简单的形式(例如分解成包含单糖或二糖和/或单肽、二肽或三肽的制备物)。“水解物”可以例如通过木瓜蛋白酶被进一步酶消化，和/或通过自溶、热解和/或质壁分离来形成。在某些实施方式中，所述植物蛋白水解物是大豆、小麦、棉、乳清、豌豆、鹰嘴豆或棉的酶水解的蛋白水解物。在本发明的培养基中使用的水解物是可商购的，包括例如由来源例如Quest International(Norwich,NY)在商标
Figure BDA0002630991950000111
1510或
Figure BDA0002630991950000112
下销售的蛋白水解物、来自于SAFC Biosciences的大豆水解物UF、来自于HyClone Media的
Figure BDA0002630991950000113
大豆水解物，或大豆蛋白胨(大豆粉/面的酶消化物)例如大豆胨(soytone)、植物胨(phytone)、植物蛋白胨(phytone peptone)或其组合。优选地，植物蛋白水解物以约6至12g/L例如约8至10g/L的量包含在所述细胞培养基中。在一个实施方式中，所述细胞培养基包含约6至12g/L的大豆蛋白水解物，例如约8至10g/L的大豆蛋白水解物。在某些实施方式中，在补料中所述植物蛋白水解物以不超过25g/L的量添加到所述细胞培养基。在特定实施方式中，初始生长培养基包含2％的大豆胨和2％的植物胨。在其他实施方式中，在生产阶段中添加的培养基包含8-10％的大豆胨和8-10％的植物胨。
根据本发明，所述分批补料方法还可以包括向所述基础培养基添加半胱氨酸或半胱氨酸衍生物例如N-乙酰半胱氨酸。在特定实施方式中，半胱氨酸以约0.1至10mM或更优选地约1至7mM半胱氨酸的量包含在所述细胞培养基中。
在某些实施方式中，所述植物蛋白水解物和任选的半胱氨酸作为独立的补料提供。在其他实施方式中，所述植物蛋白水解物和半胱氨酸在作为独立补料添加的水解物富集溶液中一起提供。所述独立植物蛋白水解物和半胱氨酸补料或水解物富集溶液可以在所述抗体生产阶段即将开始之前或开始时开始。所述独立补料可以通过在与所述基础培养基相同或不同的天而分批补料到所述细胞培养基来实现。所述独立补料可以在一天或多天后添加到所述细胞培养基，并且也可以在所述生产阶段过程中重复地添加。例如，所述生产阶段可以持续7天至长达8、9、10、11、12、13或14天或更长时间，并且可以立即和/或在所述生产阶段的第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13天和/或更晚的天增补所述独立补料。
也可以向本发明的细胞培养基添加能源。优选地，所述能源是单糖。可以在所述细胞培养基中使用的单糖的实例包括葡萄糖(例如D-葡萄糖)、麦芽糖、甘露糖、半乳糖和果糖。在一个实施方式中，葡萄糖以0.5-4.0g/L范围内的终浓度添加到所述细胞培养基。在另一个实施方式中，葡萄糖以不超过4.0g/L的终浓度添加到所述细胞培养基。在某些实施方式中，葡萄糖以约0.5至1.5g/L、最优选地1.0g/L的终浓度添加到所述细胞培养基。在所述葡萄糖浓度中间的数值例如0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9和4.0以及它们中间的数值，也打算作为本发明的一部分。使用任何上面叙述的值作为上限和/或下限的组合的值的范围，也打算被包含在本发明的范围之内。优选地，在所述生产阶段中葡萄糖浓度被实时监测，并维持在约0.5g/L至1.5g/L范围内的稳定浓度下，或者更优选地维持在约1g/L±0.1g/L，以促进抗体生产并维持细胞存活。“稳定葡萄糖浓度”意味着葡萄糖浓度不低于约0.5g/L或高于约1.5g/L。值得注意的是，发现4至5g/L的葡萄糖浓度不利地影响存活性和Hu14.18K322A抗体生产率。理想情况下，使用基于不同培养阶段中已知的葡萄糖消耗速率的前馈算法，以便维持所需的葡萄糖浓度。优选地，所述前馈方法解释了100％的葡萄糖消耗和备用的闭环葡萄糖控制系统，其葡萄糖下限设定值≤0.5g/L，所述下限设定值会触发所述葡萄糖控制系统并维持在1g/L。所述葡萄糖控制系统可以根据需要打开或关闭。
本发明的细胞培养基还可以包含谷氨酰胺例如L-谷氨酰胺。L-谷氨酰胺的适合的来源可以从各种不同的商业化来源例如GIBCO获得。在某些实施方式中，谷氨酰胺以约0.1至0.5g/kg的量提供在所述细胞培养基中。
本发明的细胞培养基还可以包含谷胱甘肽。在一个实施方式中，向所述细胞培养基添加0.4mg/L至1.65mg/L的谷胱甘肽。
在另一个实施方式中，所述细胞培养基包含重组生长因子例如胰岛素或重组类似物IGF-1或胰岛素与IGF-1的组合。在一个实施方式中，添加4mg/L至13mg/L的胰岛素或重组类似物。在另一个实施方式中，添加25ng/L至150ng/L IGF-1。在又一个实施方式中，添加50ng/L至100ng/L IGF-1。在又一个实施方式中，将25ng/L至150ng/L IGF-1增补到胰岛素。在一个实施方式中，将50ng/L至100ng/L IGF-1增补到胰岛素。
在又一个实施方式中，所述细胞培养基包含无机离子源例如柠檬酸铁。在一个实施方式中，添加10mL/L或122mg/L的柠檬酸铁。在又一个实施方式中，将柠檬酸铁保持在122mg/L的浓度。
本发明的细胞培养基也可以包含非铁金属离子。非铁金属离子的实例包括但不限于氯化物和硫酸盐、钾、镁、铜、硒、锌、镍、锰、锡、镉、钼酸盐、钒酸盐和硅酸盐。
本发明的细胞培养基还可以包含维生素和酶的辅因子。这些维生素和酶的辅因子的实例包括但不限于PABA(对氨基苯甲酸)、维生素K(生物素)、维生素B5(D-泛酸钙)、叶酸、I-肌醇、烟酰胺(烟酸酰胺)、维生素B6(吡哆素HCl)、维生素B2(核黄素)、维生素B1(硫胺素)和维生素B12(氰基钴胺素)。可选地，可以向所述培养基添加维生素C(L-抗坏血酸)。也可以添加氯化胆碱，它通常被认为是维生素，但是它也可以被认为是脂质因子。
另外，本发明的细胞培养基还可以包含脂质样因子。脂质因子的实例包括氯化胆碱和磷脂酰胆碱。脂质生产中的助剂例如醇胺如乙醇胺，也可以被包含。
任选地，所述细胞培养基可以包含甲氨蝶呤。在所述细胞培养基中使用的甲氨蝶呤的量的实例包括约100nM至5000nM的甲氨蝶呤。在所述甲氨蝶呤摩尔浓度中间的数值例如100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2200、2400、2600、2800、3000、3200、3400、3600、3800、4000、4200、4400、4600、4800和5000nM以及它们中间的数值，也打算作为本发明的一部分。使用任何上面叙述的值作为上限和/或下限的组合的值的范围，也打算被包含在本发明的范围之内。
使用本发明的方法，已发现Hu14.18K322A抗体的滴度提高。在特定实施方式中，生产所述Hu14.18K322A抗体的方法提供的抗体滴度比对照哺乳动物细胞培养物高至少10％。在某些实施方式中，所述哺乳动物细胞培养物的抗体滴度相对于所述对照哺乳动物细胞培养物提高至少25％、40％、50％、75％或90％。在其他实施方式中，所述哺乳动物细胞培养物的抗体滴度比所述对照哺乳动物细胞培养物高至少90％、150％或250％。在其他实施方式中，所述抗体滴度为至少约400mg/L、约600mg/L、约800mg/L或更高。
使用本发明的方法，已发现非岩藻糖基化的Hu14.18K322A抗体的百分率与常规生产方法相比提高。值得注意的是，所述非岩藻糖基化的Hu14.18K322A抗体在存在或不存在岩藻糖基化抑制剂例如2F-全乙酰化-岩藻糖或甜菜碱的情况下生产。“非岩藻糖基化的Hu14.18K322A抗体”是指在其恒定区糖基化中缺少岩藻糖的Hu14.18K322A抗体。人类IgG1或IgG3的糖基化发生在Asn297处，作为被至多2个Gal残基封端的核心岩藻糖基化的双触角复合体寡糖糖基化。在某些实施方式中，非岩藻糖基化的抗体在Asn297处缺少岩藻糖。示例性的非岩藻糖基化的物质包括GO聚糖、Gla聚糖、Gib聚糖、G2聚糖、Man 3聚糖、Man 4聚糖、Man 5聚糖、Man 6聚糖、Man 7聚糖、Man 8聚糖和/或Man 9聚糖或其任何组合。优选地，所述非岩藻糖基化的物质是GO聚糖。在特定实施方式中，本发明的生产Hu14.18K322A抗体的方法与在对照哺乳动物细胞培养物中生产的Hu14.18K322A抗体相比提供了非岩藻糖基化的Hu14.18K322A抗体的提高的百分率，其中所述非岩藻糖基化的Hu14.18K322A抗体的提高为至少约5％、10％、15％、20％或25％。在其他实施方式中，含有多种Hu14.18K322A抗体的组合物被认为是“基本上非岩藻糖基化的”，如果由细胞表达的抗体的总量的至少55％、60％、65％、70％、75％、80％或85％是非岩藻糖基化的。测量岩藻糖的方法包括本领域中已知的任何方法。参见例如Wuhrer等，(2005)J.Chromatog.B 825(2):124-133；Ruhaak(2010)Anal.Bioanal.Chem.397:3457-3481；和Geoffrey等，(1996)Anal.Biochem.240:210-226。
出于本发明的目的，“对照哺乳动物细胞培养物”包括将带有编码Hu14.18K322A单克隆抗体的核酸的哺乳动物细胞，在不存在植物蛋白水解物和半胱氨酸的情况下，在常规细胞培养基中，在培养条件和克分子渗透压重量浓度下培养。
理想情况下，根据本发明的方法生产的Hu14.18K322A抗体具有增强的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。具有“增强的ADCC活性”的抗体是指与母体抗体相比在体外或体内更有效地介导ADCC的抗体，其中所述抗体与母体抗体在至少一个结构方面有差异，并且此时在测定法中使用的这种抗体和母体抗体的量基本上相同。在某些实施方式中，所述抗体和母体抗体具有相同的氨基酸序列，但所述抗体是非岩藻糖基化的，而母体抗体是岩藻糖基化的。在某些实施方式中，使用体外ADCC测定法来确定ADCC活性，但也可以考虑用于确定ADCC活性的其他测定法或方法例如在动物模型中等。
在生产所述Hu14.18K322A单克隆抗体之后，使用已知方法将所述抗体从培养物(例如培养基或细胞提取物)回收或收集并纯化或部分纯化。分离程序可以包括但不限于过滤、离心、沉淀、相分离、亲和纯化、凝胶过滤、离子交换层析、疏水相互作用层析(HIC，使用诸如苯基醚、丁基醚或丙基醚的树脂)、HPLC中的一个或多个步骤，或上述步骤的某些组合。
例如，所述Hu14.18K322A单克隆抗体的纯化可以包括与所述多肽结合的蛋白A或蛋白G树脂，以及涉及洗脱的一个或多个步骤。多肽可以使用常规技术例如在高盐洗脱缓冲液中从亲和柱移除，然后在较低盐缓冲液中透析以备使用，或根据所使用的亲和基质通过改变pH或其他组分来移除，或者可以使用所述亲和组成部分的天然存在的底物竞争性移除。所需的最终纯度水平取决于目标用途。本发明的方法和组合物适合于治疗用途。因此，当所述抗体将要体内给药时，相对高的纯度水平是合乎需要的。在这种情况下，纯化所述抗体，使得在通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析后，检测不到对应于其他多肽的多肽条带。相关领域的技术人员将会认识到，由于不同的糖基化、不同的翻译后加工等，通过SDS-PAGE可以观察到对应于所述抗体的多个条带。最优选地，将本发明的抗体纯化至基本上均质，正如在通过SDS-PAGE分析后的单一多肽条带所指示的。所述多肽条带可以通过银染色、考马斯亮蓝染色或(如果所述多肽被放射性标记的话)放射自显影来可视化。
本发明还任选地涵盖了将所述Hu14.18K322A单克隆抗体进一步配制成药物组合物。术语“配制”意味着可以对所述抗体进行缓冲液更换、灭菌、散货包装和/或包装以用于最终用户。这些药物组合物可以包含有效量的所述Hu14.18K322A单克隆抗体与其他组分例如生理上可接受的稀释剂、载体或赋形剂的组合。术语“生理上可接受的”意味着不干扰所述活性成分的生物活性的有效性的无毒材料。
根据本文中为Hu14.18K322A单克隆抗体的生产所呈现的发现，本领域普通技术人员将会认识到，本发明的方法也可用于生产具有与所述Hu14.18K322A单克隆抗体相似的特征的其他抗体。
为了进一步说明本发明，提供了以下非限制性实施例。
实施例1：Hu14.18K322A抗体的表达
表达Hu14.18K322A的重链和轻链的表达质粒被描述在US7,432,357中。简单来说，所述Hu14.18K322A表达质粒pdHL7-hu14.18:pdHL7源自于pdHL2(Gillies等，(1989)J.Immunol.Methods 125:191-202)，并使用巨细胞病毒增强子-启动子来转录免疫球蛋白轻链和重链基因两者。
使用电穿孔将编码上述Hu14.18K322A抗体的DNA引入到中华仓鼠卵巢(CHO)细胞或大鼠杂交瘤细胞YB2/0中。为了进行电穿孔，将细胞在增补有10％热失活的胎牛血清、2mM谷氨酰胺和青霉素/链霉素的Dulbecco's改良Eagle's培养基中生长。将约5×106个细胞用PBS洗涤一次并重悬浮在0.5ml PBS中。然后将10微克线性化的编码所述修饰的Hu14.18K322A抗体的质粒DNA与所述细胞在基因脉冲仪杯(电极间隙0.4cm，BioRad，Hercules,CA)中，在冰上温育10分钟。使用基因脉冲仪(BioRad,Hercules,CA)，使用0.25V和500μF的设置来进行电穿孔。允许细胞在冰上恢复10分钟，然后将它们重悬浮在生长培养基中并在两块96孔板上铺板。
稳定转染的克隆通过它们在甲氨蝶呤(MTX)存在下的生长来选择。具体来说，通过有限稀释法从亚克隆鉴定到母体克隆#108-334。通过将细胞以8、4、2、1、0.5和0.25个细胞/孔的密度在含有增补有10％FBS、1mM丙酮酸钠、2mM谷氨酰胺、青霉素/链霉素和50nM MTX的DMEM的96孔板中铺板来进行亚克隆。当亚克隆在含有0.25个细胞/孔、0.5个细胞/孔和1个细胞/孔的板上出现时，含有至少2个细胞/孔的板被舍弃。在显微镜下检查所述孔中的亚克隆，以确保在所述孔中仅存在一个可见的克隆。从含有0.25个细胞/孔的六块96孔板、含有0.5个细胞/孔的六块96孔板和含有1个细胞/孔的六块96孔板挑取总共112个亚克隆，并通过抗人类Fc ELISA测定上清液中的抗体表达水平。最好的亚克隆是#108-4和#108-334，在75-cm2 T摇瓶中分别生产大约89μg/ml和106μg/ml(通过rPA分析)。通过逐渐减少血清，使克隆#108-334适应于无血清培养基即HSFM和52nM MTX。通过将克隆#108-334在含有52nMMTX的HSFM培养基中传代，并将所述细胞以1x 107个细胞/mL的密度配制在RecoveryTM细胞培养基中并储存在液氮的蒸气相中，生产了主细胞库。
通过在4周时间内将母体克隆#108-334用逐步提高至终浓度为1,000nM的MTX浓度进行处理，获得了基于YB2/0的生产克隆#134。将克隆在含有1,000nM MTX的培养基中维持另外4至5周并根据需要补入培养基。这个在1,000nM MTX下存活的细胞群体的样品被用于下一轮的克隆选择。
下一步是筛查3,360个1,000nM MTX抗性克隆在含有6mM GlutamaxTM、2g/L大豆胨和2g/L植物胨的HSFM中在1000nM MTX中的单细胞选择下存活的能力。正是这个选择过程产生了生产克隆#134。
通过将细胞在含有6mM GlutamaxTM、2g/L大豆胨和2g/L植物胨的HSFM中在1000nMMTX中生长，产生了生产克隆#134的主细胞库。将细胞融化，离心，重悬浮在生长培养基中，并以2-3x 105个细胞/mL的密度接种到悬浮摇瓶中。在细胞密度达到1-2x 106个细胞/mL时将细胞传代，并将传代继续到存在1-2x 109个细胞。将细胞离心并以1x 107个细胞/mL的密度重悬浮在含有6mM GlutamaxTM、2g/L大豆胨和2g/L植物胨以及1000nM MTX和5％DMSO的新鲜HSFM中。然后使用CryoMedTM控速冷冻机将所述细胞冷冻，并储存在液氮的蒸气相中。
实施例2：通过分批补料方法生产Hu1418 K322A
将Hu14.18K322A生产细胞维持在增补有6mM GlutamaxTM、2g/L大豆胨和2g/L植物胨水解物以及对于母体克隆#108-334来说52nM MTX或对于生产克隆#134来说1000nM MTX的HSFM中。在Hu14.18K322A的生产中的第一步是标准的接种种液培养，以产生用于接种生产反应器的细胞。将来自于主细胞库的小管融化，并将细胞以0.2-0.3x 106个细胞/mL的活细胞密度接种在悬液中。在达到1-1.5x 106个细胞/mL的活细胞密度后，将这些细胞用于以0.2-0.3x 106个细胞/mL的细胞密度接种后续的生物反应器。用于产生接种生产生物反应器的细胞的生物反应器的范围从CO2培养箱中的小的50mL摇瓶到完全控制的生物反应器。在将生产生物反应器以0.2-0.3x 106个细胞/mL的密度接种后，将所述反应器培养72小时，然后开始分批补料阶段。所有的接种种子培养物在37℃下生长，并将溶解氧(DO)水平设定到50％的空气饱和度。将pH维持在6.9±0.03。
大豆胨和植物胨对抗体生产的影响。在72小时后，通过脉冲调节补料开始补料。所述补料仅由HSFM培养基和6mM GlutamaxTM构成(即不含大豆胨或植物胨)，并以3.5-4.5mL补料/小时/L生物反应器起始体积的恒定速率提供。允许葡萄糖通过细胞代谢降低到1g/L，并通过单独的葡萄糖补料维持在该值；补料和葡萄糖两者的添加由生物反应器控制系统算法控制。在始于接种物被转移到生产生物反应器中时的210个小时的总培养时间(TECT)后，对于克隆#108-334来说获得130mg/L的hu14.18K322A滴度，非岩藻糖基化百分率(％AF)为54％。通过深层过滤然后除菌(0.2mm)过滤使反应器澄清，并用于下游加工。
大豆胨的g/L和植物胨的g/L(在补料和克隆中)对hu14.18K322A产量、％AF和TECT的影响概述在表1中。
表1
Figure BDA0002630991950000201
当细胞存活率下降到低于1x 106个细胞/mL时，终止生物反应器的运行。这些结果显示，提高补料中大豆胨和植物胨的量对hu14.18K322A产量和质量具有直接影响。细胞培养上清液的氨基酸分析显示，对于较低的大豆胨/植物胨浓度即≤6g/L，几种必需氨基酸例如半胱氨酸的水平低，而高于8g/L、即10g/L和15g/L的大豆胨/植物胨水平在运行结束时具有足够的必需氨基酸水平。所述结果显示，对于hu14.18K322A生产来说存在最佳的大豆胨/植物胨水平。
温度改变对抗体生产的影响。在TECT的第4、5、和6天，在24小时内将生物反应器的温度从37℃降低到33℃。补料培养基被设定为10g/L的大豆胨和植物胨，并使用克隆#134实现抗体生产。温度改变对抗体生产的影响被概述在表2中。
表2
温度改变的日期 hu14.18K322A(mg/L) ％AF TECT(h)
无温度改变 871 82.0 308
第4天 698 80.6 308
第5天 820 80.6 308
第6天 856 78.8 308
实施例3：聚糖分布
进行了糖谱分析以调查在从分批补料培养物收获后抗体产物的寡糖分布。澄清的样品的N-聚糖谱通过常规方法来确定，例如蛋白水解消化和基质辅助激光解吸/电离质谱术(MALDI-MS)或电喷雾电离-质谱ESI-MS。参见例如Reusch等，(2013)Anal.Biochem.432:82-9；Selman等，(2010)Anal.Chem.82:1073-81；Shah等，(2014)J.Am.Soc.MassSpectrom.25:999-1011；Wuhrere等，(2005)Anal Chem.77:886-94；Chevreux等，(2011)Anal.Biochem.415(2):212-4。调查了具有与N-聚糖亚型G0、G0F、G0+GlcNac、G1+GlcNac、G1(1,6)、G1(1,3)、G1F(1,6)、G1F(1,3)、G1F+GlcNac、G2(NA2)、G2F对应的质量的Fc片段信号，并从所述信号的强度估算了它们的相对丰度比率。该分析的结果呈现在图1中。
实施例4：Hu14.18K322A的纯化和配制
Hu14.18K322A抗体的纯化通过下述过程来实现：使用深层过滤器(例如Sartorius
Figure BDA0002630991950000211
PB1Drum L过滤器)或通过离心(分批或连续的)除去细胞和细胞碎片，以使细胞培养液澄清。然后将所述澄清的培养液装载到第一个柱即蛋白A柱(例如MabSelectTMPrismA)上。在所述装载步骤后，将蛋白A柱用包含1.5M NaCl和0.1M柠檬酸钠的pH 6.0的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤，所述磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗脱了宿主蛋白和宿主核酸。用pH3.0的0.5M柠檬酸钠洗脱Hu14.18K322A。收集Hu14.18K322A洗脱峰并将其在室温下保持30分钟(即低pH病毒失活步骤)，然后用pH 4.5的35mM乙酸钠(NaAc)稀释一倍。将产物装载到CaptoTM SP ImpRes柱上，用pH 4.5的35mM NaAc和35mM NaAc pH4.5+225mM NaCl洗涤，并用35mM NaAc pH4.5+600mM NaCl洗脱Hu14.18K322A。将所述Hu14.18K322A产物合并物用pH6.8的20mM Bis Tris Propane稀释到7mg/mL，并使用截留分子量为30,000的超滤膜通过恒定体积切向流过滤(TFF)将缓冲液更换为pH 6.8的20mM BIS-TRIS Propane。将所述Hu14.18K322A通过例如在商标
Figure BDA0002630991950000221
NFP下销售的纳米滤器过滤(除去病毒)，然后用例如在商标
Figure BDA0002630991950000222
Q下销售的离子交换膜过滤以除去残留的宿主核酸和宿主细胞蛋白质。将所述Hu14.18K322A产物合并物在最终配制缓冲液即含有100mM精氨酸盐酸盐的PBS(pH 6.0)中使用8倍渗滤体积渗滤，并浓缩到10.5mg/L。添加聚山梨酸酯80至终浓度为0.03％w/w。通过UV280nm测量hu14.18K322A浓度并稀释到10.0mg/L。随后，将所述稀释的抗体通过在商标
Figure BDA0002630991950000223
下销售的0.1mm除菌级滤膜过滤到生物加工袋中，并储存在2-8℃下。
实施例5：Hu14.18K322A抗体的ADCC活性
抗体制备。使用PROMEGA ADCC报告物生物测定法来评估ADCC活性。通过将抗体用ADCC测定法缓冲液1:1000稀释来制备稀释的抗体储用液。对于测试来说，使用ADCC测定法缓冲液将所述稀释的储用液进一步稀释到1μg/mL。
细胞制备。在接种后20小时，从组织培养箱中取出M21细胞。从每个孔取出95μL培养基并用25μL预加温的ADCC测定法缓冲液代替。向含有靶M21细胞的每个孔添加25μL稀释的抗体。
效应细胞。将效应细胞在37℃水浴中融化2-3分钟，然后吸取630μL细胞到3.6mL预加温的ADCC测定法缓冲液中。通过轻柔地吸取1-2次将所述细胞在测定法缓冲液中混合。将效应细胞转移到无菌试剂储库，随后吸取25μL到含有靶细胞±抗体的孔中。将所述板放回到组织培养箱并温育6小时。
生物发光萤光素酶试剂的制备。将萤光素酶测定法缓冲液在室温下融化并用于萤光素酶试剂粉末的重构。在6小时温育后，将板从组织培养箱取出并在室温下放置15分钟。向每个孔添加75μL所述室温的重构的生物发光试剂。将细胞与所述生物发光试剂在室温温育15分钟。所述板在暗处温育。
数据获取。使用发光ELISA，在Spectromax L SOFTMAX Pro 5.4程序上在527nm处获取发光数据(RLU)。将RLU对测试的抗体剂量(ng/mL)作图。在背景减除后，将数据绘图并拟合到SOFTMAX PRO中的四参数逻辑模型方程。EC50(ng/mL)从所述方程计算并由方程中的“C”拟合参数表示。
使用这种测定法，ADCC数据显示96％岩藻糖基化的hu14.18K322A(从NSO细胞表达)具有146ng/mL的ADCC活性。作为比较，92-94％岩藻糖基化的ch14.18(一种嵌合抗GD2抗体)具有8-10ng/mL之间的ADCC活性。在同一测定法中，具有75至85％的非岩藻糖基化的抗体具有1.2至1.5ng/mL的EC50；已显示55至60％的非岩藻糖基化表现出2.1至2.3ng/mL的ADCC活性；并且已显示具有22％至30％的非岩藻糖基化的抗体表现出3.5-4ng/mL的ADCC活性。ADCC活性针对非岩藻糖基化％的图呈现在图2中。

Claims (12)

1.一种在哺乳动物宿主细胞培养物中生产Hu14.18K322A单克隆抗体的分批补料方法，所述方法包括将带有编码Hu14.18K322A单克隆抗体的核酸并被选择用于生产基本上非岩藻糖基化的Hu14.18K322A单克隆抗体的哺乳动物宿主细胞在包含植物蛋白水解物和0.5g/L至1.5g/L的稳定葡萄糖浓度的细胞培养基中培养，由此在哺乳动物细胞培养物中生产Hu14.18K322A单克隆抗体。
2.权利要求1的分批补料方法，其还包括纯化所述Hu14.18K322A单克隆抗体的步骤。
3.权利要求2的分批补料方法，其中通过将包含所述Hu14.18K322A单克隆抗体的细胞培养基与蛋白A树脂相接触并洗脱所述Hu14.18K322A单克隆抗体来纯化所述Hu14.18K322A单克隆抗体。
4.权利要求1的分批补料方法，其中所述Hu14.18K322A单克隆抗体是至少55％非岩藻糖基化的。
5.一种基本上非岩藻糖基化的Hu14.18K322A单克隆抗体群体，其通过权利要求1的方法来生产。
6.权利要求5的基本上非岩藻糖基化的Hu14.18K322A单克隆抗体群体，其中所述抗体是至少55％非岩藻糖基化的。
7.权利要求5的Hu14.18K322A单克隆抗体群体，其中所述群体具有至少约400mg/L的抗体滴度。
8.权利要求5的Hu14.18K322A单克隆抗体群体，其中所述Hu14.18K322A单克隆抗体表现出增强的ADCC活性。
9.一种药物组合物，其包含与生理上可接受的稀释剂、载体或赋形剂混合的权利要求5的Hu14.18K322A单克隆抗体群体。
10.一种哺乳动物宿主细胞，其带有编码Hu14.18K322A单克隆抗体的核酸并被选择用于生产基本上非岩藻糖基化的Hu14.18K322A单克隆抗体。
11.权利要求10的哺乳动物宿主细胞，其中所述抗体是至少55％非岩藻糖基化的。
12.一种哺乳动物宿主细胞，其于2019年2月13日保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)登记号XXXXX下。
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