CN112105378A - 作为新生儿抗惊厥药的葡萄糖氧化酶组合物 - Google Patents

Abstract

新生儿癫痫发作与成人癫痫发作不同，在成人中有效的许多抗癫痫药物经常不能治疗新生儿癫痫发作。本文显示葡萄糖酸‑一种富含于水果和蜂蜜中的天然有机酸，和葡萄糖氧化酶酶在体外和体内均有效地抑制新生儿癫痫。证明葡萄糖酸钠在细胞培养物中可抑制癫痫样突发活动，并保护神经元免受红藻氨酸诱导的细胞死亡。葡萄糖酸钠还能以在新生动物比老龄动物中远远更有效的方式抑制脑切片中的癫痫样突发活动。葡萄糖酸钠在新生动物比成年动物中以远更有效的方式抑制癫痫发作活动。一致地，体内EEG记录还揭示，葡萄糖酸钠在新生动物比成年动物中以远更有效的方式抑制癫痫发作活动。在机理上，葡萄糖酸钠在神经元培养物和海马切片中抑制电压依赖性CLC‑3 C1^‑通道。总之，这些数据提出一种新的抗癫痫药物葡萄糖酸盐，其通过阻断CLC‑3 C1^‑通道有效抑制新生儿癫痫发作。

Description

作为新生儿抗惊厥药的葡萄糖氧化酶组合物

政府支持声明

本发明是在国家卫生研究院颁发的政府资助金No.MH083911和AG045656完成的。政府对本发明有一定的权利。

发明领域

本发明涉及神经障碍领域。特别地，预防和治疗惊厥性障碍，包括但不限于肌肉紧张/阵挛性惊厥、癫痫、杰克逊氏癫痫病症和/或不自主的震颤。例如，一些实施方案涉及治疗和预防新生儿和/或婴儿中的惊厥性障碍。已发现葡萄糖酸基础和葡萄糖氧化酶组合物对治疗和/或预防新生儿和/或婴儿中惊厥性障碍有选择性的有效性。

背景

癫痫发病率在生命的第一年是最高的，在美国报道的发生率在约1.8-3.5/1,000活产婴儿。Silverstein等人,“Neonatal seizures”Annals Of Neurology 62:112-120(2007)；和Jensen F.,“Neonatal seizures:An update on mechanisms and management”Clinics In Perinatology 36:881-900(2009)。虽然在过去几十年中已经开发了许多抗癫痫药物(AED)，但相对目前的AED新生儿癫痫发作通常是难治的，该药物对大龄儿童或大人更有效。Painter等人,“Phenobarbital compared with phenytoin for the treatmentof neonatal seizures”The New England Journal Of Medicine 341:485-489(1999)；van Rooij等人,“Treatment of neonatal seizures”Seminars In Fetal&NeonatalMedicine 18:209-215(2013)；和Dzhala等人,“NKCC1 transporter facilitatesseizures in the developing brain”Nature Medicine 11:1205-1213(2005)。

在某些情况下，即使在AED应用后，脑电图(EEG)记录显示出新生儿持续的皮质癫痫活动，这可能会损害认知发育，并后来导致癫痫。Connell等人，“Clinical and EEGresponse to anticonvulsants in neonatal seizures”Archives Of Disease InChildhood 64:459-464(1989)；Glykys等人,“Differences in cortical versussubcortical GABAergic signaling:a candidate mechanism of electroclinicaluncoupling of neonatal seizures”Neuron 63:657-672(2009)；和Puskarjov等人,“Pharmacotherapeutic targeting of cation-chloride cotransporters in neonatalseizures”Epilepsia 55:806-818(2014)。

癫痫发作通常由大脑电路的过度激活引起，这可以通过增强成人脑中主要的抑制性受体GABA_A受体(GABA_A-R)来抑制。因此，AED经常被开发以增加GABA_A-R功能，例如苯二氮类和巴比妥类药物。Bialer，M.&White，H.S.Key factors in the discovery anddevelopment of new antiepileptic drugs.Nature reviews.Drug discovery 9,68-82(2010)。然而，虽然GABA_A-R在成年人大脑中主要是抑制性的，但它们在发育中的大脑中是兴奋性的。Chen,G.,Trombley,P.Q.&van den Pol,A.N.Excitatory actions of GABA indeveloping rat hypothalamic neurones.The Journal of physiology 494(Pt 2),451-464(1996)；和Ben-Ari,Y.Excitatory actions of gaba during development:thenature of the nurture.Nature reviews.Neuroscience 3,728-739(2002)。

发育中的大脑兴奋性GABA能传递还解释了为什么GABA激动剂通常对控制新生儿癫痫发作无效，有时甚至可能加剧新生儿癫痫发作活动。Farwell,J.R.,等人Phenobarbital for febrile seizures--effects on intelligence and on seizurerecurrence.The New England journal of medicine 322,364-369(1990)。

经典地，GABA兴奋性与抑制性功能归因于Cl^-共转运蛋白NKCC1和KCC2的调节。10.Kaila,K.,Price,T.J.,Payne,J.A.,Puskarjov,M.&Voipio,J.Cation-chloridecotransporters in neuronal development,plasticity and disease.Naturereviews.Neuroscience 15,637-654(2014).Blaesse,P.,Airaksinen,M.S.,Rivera,C.&Kaila,K.Cation-chloride cotransporters and neuronal function.Neuron 61,820-838(2009)。以前的研究发现，NKCC1可能促进啮齿动物的新生儿癫痫发作¹²，但最近在婴幼儿的临床试验发现NKCC1阻断剂布美他尼的严重副作用，并且治疗新生儿癫痫发作的效果非常有限¹³。Dzhala,V.I.,等人NKCC1 transporter facilitates seizures in thedeveloping brain.Nature medicine 11,1205-1213(2005)；和Pressler,R.M.,等人Bumetanide for the treatment of seizures in newborn babies with hypoxicischaemic encephalopathy(NEMO):an open-label,dose finding,and feasibilityphase 1/2trial.Lancet Neurol 14,469-477(2015)。

不幸的是，到目前为止，还没有有效的药物可以成功地治疗新生儿癫痫发作，从而迫切地寻找新药来治疗新生儿癫痫。本领域需要的是一种简单、有效和安全的抗癫痫药物来治疗新生儿癫痫发作的独特特征。

发明概述

本发明涉及神经障碍领域。特别地，预防和治疗惊厥性障碍，包括但不限于肌肉紧张/阵挛性惊厥、癫痫、杰克逊病症和/或不自主的震颤。例如，一些实施方案涉及治疗和预防新生儿和/或婴儿的惊厥性障碍。已发现葡萄糖酸基础(gluconate-based)和葡萄糖氧化酶组合物对治疗和/或预防新生儿和/或婴儿中惊厥性障碍有选择性的有效性。

在一个实施方案中，本发明考虑一种方法，包括：a)提供；i)包含葡萄糖并出现惊厥的新生儿患者；和ii)包含葡萄糖氧化酶的组合物；和b)在所述惊厥减少的条件下向所述患者施用所述组合物。在一个实施方案中，所述条件包括所述葡萄糖向葡萄糖酸盐的转化。在一个实施方案中，施用还包括补充的葡萄糖。在一个实施方案中，所述组合物还包含补充的葡萄糖。在一个实施方案中，所述组合物和所述补充的葡萄糖是连续施用的。在一个实施方案中，所述组合物和所述补充的葡萄糖是同时施用的。在一个实施方案中，所述条件包括所述补充的葡萄糖转化为葡萄糖酸盐。在一个实施方案中，所述组合物是药学可接受的组合物。在一个实施方案中，所述施用进一步包括有效量的所述组合物。

在一个实施方案中，本发明考虑一种方法，其包括：a)提供：i)出现惊厥的新生儿患者，其中所述患者不需要基于二价阳离子的治疗；和ii)包含葡萄糖酸盐配合物的组合物；和b)在使所述惊厥减少的条件下将所述组合物施用所述患者。在一个实施方案中，葡萄糖酸盐配合物不含二价阳离子。在一个实施方式中，葡萄糖酸盐配合物是葡萄糖酸钠。在一个实施方案中，基于二价阳离子的治疗是钙基础的治疗。在一个实施方案中，基于二价阳离子的治疗是镁基础的治疗。在一个实施方案中，基于二价阳离子的治疗是锌基础的治疗。在一个实施方案中，葡萄糖酸盐配合物包含葡萄糖酸衍生物。

在一个实施方案中，本发明考虑一种方法，包括：

a)提供：i)出现惊厥的新生儿患者，其中所述患者不需要基于二价阳离子的治疗；ii)由葡萄糖酸盐配合物组成的组合物，其中所述配合物不含二价阳离子；和b)在使所述惊厥减少的条件下将所述组合物施用所述患者。在一个实施方案中，葡萄糖酸盐配合物是葡萄糖酸钠。在一个实施方案中，基于二价阳离子的治疗是钙基础的治疗。在一个实施方案中，基于二价阳离子的治疗是镁基础的治疗。在一个实施方案中，基于二价阳离子的治疗是锌基础的治疗。在一个实施方案中，葡萄糖酸盐配合物包含葡萄糖酸衍生物。

在一个实施方案中，本发明考虑包含葡萄糖酸盐衍生物的组合物，其中至少一个羟基部分或羧酸部分被基团取代，所述基团包括但不限于取代或未取代的芳基或杂芳基，未取代或取代的C1-C6-烷基，取代或未取代的5-6元饱和或不饱和稠环，取代或未取代的5-6元饱和或不饱和环，天然氨基酸残基或合成氨基酸残基，三卤代甲基，取代或未取代的C1-C6-烷氧基，NH₂，SH，硫代烷基，氨酰基，氨基羰基，取代或未取代的C1-C6-烷氧基羰基，芳基，杂芳基，取代或未取代的4-8元环烷基，任选含有1-3个杂原子，羧基，氰基，卤素，羟基，硝基，乙酰氧基，氨酰基，磺酰氧基，磺酰基，C1-C6-硫代烷氧基，C1-C6脂族烷基，取代或未取代的饱和环C4-C8-烷基任选地含有1-3个杂原子并且任选地与芳基或杂芳基稠合；取代或未取代的芳基，取代或未取代的杂芳基，其中所述芳基或杂芳基任选被如下取代：取代或未取代的C1-C6-烷基，如三卤甲基，取代或未取代的C1-C6-烷氧基，取代或未取代的C2-C6-烯基，取代或未取代的C2-C6炔基，氨基，氨酰基，氨基羰基，取代或未取代的C1-C6-烷氧基羰基，芳基，羧基，氰基，卤素，羟基，硝基，乙酰氧基，氨酰基，磺酰氧基，磺酰基，C1-C6-硫代烷氧基；或者R5和R6一起可以形成取代或未取代的4-8元饱和环烷基或杂烷基。

在一个实施方案中，本发明考虑一种方法，包括：a)提供i)表现出惊厥的新生儿患者，其中所述患者包括至少一个氯化物离子通道；ii)包含氯化物离子通道阻断剂的组合物；和b)在使所述惊厥减少的条件下将所述组合物施用所述患者。在一个实施方案中，氯化物离子通道阻断剂是不含二价阳离子的葡萄糖酸盐配合物。在一个实施方案中，氯化物离子通道阻断剂包括但不限于尼氟酸(NFA)，氟芬那酸，4,4'-二异硫氰酸酯-2,2'-芪二磺酸二钠盐(DIDS)和5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)苯甲酸(NPPB)。在一个实施方案中，葡萄糖酸盐配合物是葡萄糖酸钠。在一个实施方案中，患者不需要基于二价阳离子的治疗。在一个实施方案中，基于二价阳离子的治疗是钙基础的治疗。在一个实施方案中，基于二价阳离子的治疗是镁基础的治疗。在一个实施方案中，基于二价阳离子的治疗是锌基础的治疗。在一个实施方案中，葡萄糖酸盐配合物包含葡萄糖酸衍生物。

定义

为了便于理解本发明，下面定义了许多术语。本文定义的术语具有本领域普通技术人员在与本发明相关的领域中通常理解的含义。诸如“一种(a)”，“一种(an)”和“该/所述(the)”之类的术语不旨在仅指单个实体而且也指多个实体，并且还包括可以使用用于说明具体实例的一般类。本文中的术语用于描述本发明的具体实施方案，但是除了如权利要求中所概述之外，其用法不限定本发明。

本文所用的术语“葡萄糖酸”或“葡萄糖酸盐(gluconate)”是指包含五个羟基部分和一个羧酸部分的六个α-碳链。如本文所公开的，羟基和羧酸部分中的每一个可以被取代和/或衍生化，以提供与传统的二价阳离子治疗相比具有改善的临床有效性的抗惊厥葡萄糖酸盐衍生物。

术语“惊厥”或“发作”是指任何异常的暴力和非自愿的收缩或一系列的肌肉和/或身体表现的收缩，包括但不限于惊厥、感觉障碍和/或失去意识，由大脑异常放电引起。

本文所用的术语“初生婴儿(neonate)”或“新生(neonatal)”是指通常不到一个月大的新生婴儿。一般来说，新生儿年龄的参考用“P#”表征，其中“P”表示出生后，“#”表示天龄，P0表示出生日。

术语“二价阳离子”是指带正二价(如2+)的价电荷的任何离子。例如，离子Ca²⁺，Mg^{2 +}和/或Zn²⁺被认为是二价阳离子。

在本文中使用的术语“约”在任何测定测量的任何上下文中是指给定测量的+/-5％。

本文所用的术语“有效量”是指特定量的药物组合物，其包含达到临床有益结果(即例如症状减轻)的治疗剂。这些组合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药物程序来确定，例如用于确定LD₅₀(对50％人群致死的剂量)和ED₅₀(在50％人群中的治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，可以表示为LD₅₀/ED₅₀的比例。表现出较大治疗指数的化合物是优选的。从这些细胞培养测定和额外的动物研究获得的数据可用于配制一系列用于人类的剂量。这种化合物的剂量优选在包括具有很小的或没有毒性的ED₅₀的循环浓度范围内。根据使用的剂型、患者的敏感性和施用途径，剂量在该范围内变化。

本文使用的术语“症状”是指患者观察到的疾病或身体失调的任何主观或客观证据。例如，主观证据通常基于患者自我报告，并且可以包括但不限于疼痛、头痛、视觉障碍，恶心和/或呕吐。可选地，客观证据通常是医学测试的结果，包括但不限于体温、完全血液计数、脂质组(lipid panel)、甲状腺组(thyroid panel)、血压、心率、心电图、组织和/或身体成像扫描。

本文使用的术语“疾病”或“医学病症”是指活体动物或植物体的正常状态或其各个部分之一的任何损害，其干扰或改变重要功能的表现。通常由显著的迹象和症状表现出来，通常是对以下各项的响应：i)环境因素(营养不良，工业危害或气候)；ii)特定的感染因子(如蠕虫，细菌或病毒)；iii)生物体的固有缺陷(作为遗传异常)；和/或iv)这些因素的组合。

术语“减少”、“抑制”、“减小”、“遏制”、“降低”、“预防”和当涉及未经治疗的受试者相对于受治疗的受试者的任何症状的表达时，语法上的等同物(包括“较低的”，“较小的”等)意味着被治疗的受试者的症状的数量和/或幅度低于未经治疗的受试者的任何量，该任何量被任何经过医疗培训的人员认定为临床相关的量。在一个实施方案中，治疗受试者中的症状的数量和/或幅度比未经治疗的受试者的症状的数量和/或幅度要低至少10％，至少25％，至少50％，至少75％，和/或至少90％。

本文所用的术语“附着”是指介质(或载体)和药物之间的任何相互作用。附着可以是可逆的或不可逆的。这样的附着包括但不限于共价键、离子键、范德华力或摩擦力等。如果将药物浸渍、并入、包衣、与之成悬浮液、与之成溶液、与之成混合等，则药物附着到介质(或载体)上。

本文所用的术语“介质”是指任何材料或材料的组合,其作为用于将药物递送到治疗点(例如伤口，外科手术部位等)的载体或媒介物。因此，为了所有的实际目的，术语“介质”被认为是术语“载体”的同义词。本领域技术人员应当认识到，介质包含载体，其中所述载体附着于一种药物或药物，所述介质便于将所述载体递送至治疗点。此外，载体可以包含附着的药物，其中所述载体便于将所述药物递送到治疗点。优选地，介质选自包括但不限于泡沫、凝胶(包括但不限于水凝胶)、干凝胶、微粒(即微球、脂质体、微胶囊等)、生物粘合剂或液体。本发明特别要考虑的是一种介质，其包含微粒与水凝胶、生物粘合剂、泡沫或液体的组合。优选地，水凝胶、生物粘合剂和泡沫包括本文考虑的聚合物中的任何一种或组合。本发明考虑的任何介质可包含控释制剂。例如，在一些情况下，介质构成药物递送系统，其提供控制和持续的药物释放持续大约1天至6个月的时间段。

本文所用的术语“药物”或“化合物”是指能够施用以获得期望效果的任何药理活性物质。药物或化合物可以是合成的或天然存在的非肽、蛋白质或肽、寡核苷酸或核苷酸、多糖或糖。

如本文所用的术语“施用(administered)”或“施用(administering)”是指向患者提供组合物的任何方法，使得该组合物对患者具有它预期的效果。示例性的施用方法是通过直接机制例如局部(local)组织施用(例如，血管外放置)、口服摄取、静脉内注射、透皮贴剂、局部(topical)、吸入、栓剂等。

本文所用的术语“患者”或“受试者”是人或动物，不需要是住院病人。例如，门诊病人、疗养院的人是“患者”。患者可以包括人类或非人类动物的任何年龄，因此包括成年人和少年(即新生儿、婴儿和/或儿童)。术语“患者”并不旨在意味着需要医疗，因此，患者可以自愿或非自愿地成为临床或支持基础科学研究的实验的一部分。

本文所用的术语“有效量”是指特定量的药物组合物，其包含达到临床有益结果(即例如症状减轻)的治疗剂。这些组合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准药物程序来确定，例如用于确定LD₅₀(对50％人群致死的剂量)和ED₅₀(在50％人群中的治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，可以表示为LD₅₀/ED₅₀的比例。表现出较大治疗指数的化合物是优选的。从这些细胞培养测定和额外的动物研究获得的数据可用于配制一系列用于人类的剂量。这种化合物的剂量优选在包括具有很小的或没有毒性的ED₅₀的循环浓度范围内。根据使用的剂型、患者的敏感性和施用途径，剂量在该范围内变化。

如本文所用的术语“药学上”或“药学上可接受的”是指当施用于动物或人时不产生不利的、过敏的或其他不良反应的分子实体和组合物。

本文所用的术语“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、或分散介质，包括但不限于水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物，以及植物油、涂层、等渗和吸收延迟剂、脂质体、可商购的清洁剂等。补充的生物活性成分也可以并入这种载体中。

本文所用的术语“小有机分子”是指与通常用于药物中的那些有机分子相当的尺寸的任何分子。该术语不包括生物大分子(例如蛋白质、核酸等)。优选的小有机分子的尺寸范围为约10Da至多约5000Da，更优选至多2000Da，最优选至多约1000Da。

术语“生物学活性的”是指具有结构、调节或生化功能的任何分子。例如，可以例如通过恢复缺乏蛋白质活性的细胞中的野生型生长来确定生物学活性。缺乏蛋白质活性的细胞可以通过许多方法产生(例如，点突变和移码突变)。通过用表达蛋白质的表达载体、其衍生物或其部分转染缺乏蛋白质活性的细胞来实现互补。

术语“转染”或“被转染”是指将外源DNA引入细胞。

本文所用的术语“结合”包括可以是永久的或临时的任何物理附着或密切结合。通常，氢键、疏水力、范德华力、共价键和离子键等的相互作用便于目标分子和正在测量的分析物之间的物理附着。在结合导致发生化学反应的情况下，“结合”相互作用可以是简短的。当结合成分是酶并且分析物是酶的底物时，这是典型的。为了本发明的目的，由结合剂和分析物之间的接触产生的反应也在结合的定义之内。

如本文所用的术语“补充的葡萄糖”是指与葡萄糖氧化酶联合向小儿患者静脉内施用葡萄糖。例如，优选葡萄糖输注速率(GIR)为7.3mg/kg/分钟。

附图的简单说明

该专利的文件包含至少一幅以色彩制作的绘图。具有彩色附图的专利副本将由专利商标局根据要求提供，并支付必要的费用。

图1显示了显示葡萄糖酸盐在培养的神经元上的抗突发(anti-burst)活动的示例性数据。数据表示为平均值±s.e.m.，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图1A：通过应用20mM NaGcA(n＝10，来自3批次)立即停止培养的神经元中的自发性突发动作电位，NaGcA施用之前、之中和之后的延伸图显示在底部。

图1B：在培养的神经元(上图)中CTZ诱导的强烈的突发活动，并且被10mM NaGcA(底图)完全阻断。

图1C：NaGcA对CTZ诱导的突发活动的剂量依赖性抑制。黑色的条表示突发频率，灰色的条表示突发持续时间(n＝11，来自4批次，成对Student t检验)。

图1D：红藻氨酸的(1μM，2小时)诱导强烈的突发活动的代表性迹线(上图)，并且它还被10mM NaGcA显著抑制(底图)。

图1E：KA诱导的突发活动对NaGcA的剂量依赖性反应(n＝12，来自3批次，成对Student t检验)。

图1F：4-AP(50μM，2小时)诱导的强烈活动的典型迹线(上图)被10mM NaGcA显著抑制(底图)。

图1G：4-AP诱导的突发活动对NaGcA的剂量响应(n＝9，来自3批次，成对Student t检验)。

图1H：显示由10μM CTZ诱导的复发性癫痫样突发所显示的代表性迹线(上图)，且在CTZ和NaGcA(10mM)的共施用中没有突发活动。

图1I(a-c)：图面h的定量数据显示5和10mM NaGcA慢性共处理，其显著降低了显示突发活动的神经元的比例(图1I(a)，χ2检验)，突发频率(图1I(b)，单因素ANOVA)和突发持续时间(图1I(c)和图1I(b))单因素ANOVA。CTZ为n＝22，CTZ+5mM NaGcA为n＝16，CTZ+10mMNaGcA为n＝17，所有数据均来自5批，成对Student t检验。

图1J：存活/死亡测定图像显示不同组中的钙黄绿素-AM(绿色为存活)和乙啡啶同质二聚体-1(ethidium homodimer-1)(红色为死亡)。比例尺(scale bar)，100微米。

图1K：细胞存活/死亡测定的定量。结果表明，NaGcA具有抗红藻氨酸诱导的神经元兴奋性毒性的神经保护功能，其本身对神经元存活没有任何副作用。

图2显示葡萄糖酸盐抑制培养的皮质神经元中的氯化物电流的示例性数据。数据显示为平均值±s.e.m。

(a-f)NaGcA(10mM)对Na⁺电流(a，b)，K⁺电流(c，d)或Ca²⁺电流(e，f)没有影响。

(g)在10mM NaGcA施用之前(黑色)和之后(绿色)记录的典型Cl^-电流。

(h)I-V曲线显示对Cl^-电流的显著NaGcA抑制(n＝7，来自3批培养物,成对Student's t检验)。

(i，j)经典的Cl^-通道阻断剂NPPB(100μM)抑制培养的皮质神经元中的Cl^-电流。

(k，l)另一个常见的Cl^-通道阻断剂DIDS(100μM)对培养的皮层神经元中的Cl^-电流的抑制作用。注意在清除(washing off)DIDS后，DIDS对Cl^-电流的持续抑制。(m，n)NPPB(m)和DIDS(n)都有效抑制CTZ诱导的癫痫样活动，支持Cl^-通道参与癫痫发生。

图3示出了显示葡萄糖酸盐对海马切片中癫痫活动的年龄依赖性影响的示例性数据。数据显示为平均值±s.e.m。

(a)新生儿(P7)小鼠海马切片CA3锥体细胞层中的细胞外场电位记录。癫痫事件由不含Mg²⁺的aCSF诱导，并且在不含Mg²⁺的aCSF中存在20mM NaGcA时被抑制。NaGcA施用之前、之中和之后的扩展迹线显示在底部。

(b)在NaGcA施用之前、之中和之后的5分钟时间窗中的癫痫活动的功率谱。NaGcA施用后功率振幅(光谱跟踪下的积分面积)被显著抑制。

(c，d)在P12海马切片中检查了NaGcA的抗癫痫样活动的相当的功效。

(e)与新生儿切片相比，在P26海马切片中NaGcA具有中度的抗癫痫放电作用。NaGcA灌注之前、之前和之后，底图显示出延长的迹线。(f)在NaGcA应用过程中功率振幅略有降低，清除(wash out)NaGcA后几乎恢复。

(g)在NaGcA施用之前、之中和之后的连续5min窗口内，0Mg²⁺aCSF诱导癫痫活动的归一化功率。

NaGcA显著降低P6-8和P10-12组癫痫活动能力，但对P21-33组影响较小，对照组数据显示，额外的20mM NaCl加入0Mg²⁺aCSF后无明显改变在80分钟期间的细胞外场电位记录。

图4提供表示在不同的新生儿切片癫痫发作模型中测试NaGcA的抗癫痫活动的示例性数据。数据显示为平均值±s.e.m。

(a)在CA3锥体细胞层中的细胞外场电位记录，50μM 4-AP诱导的癫痫活动。响应于50μM 4-AP NaGcA减弱了癫痫样放电。各自的迹线在底部扩大。

(b)NaGcA施用之前、之中和之后在5分钟窗口内癫痫活动的功率谱。NaGcA施用后功率谱的振幅显著抑制。

(c)4-AP诱导的癫痫活动的平均功率被NaGcA的灌注显著地降低。

(d)NaGcA显著抑制新生儿高K⁺模型的突发活动。底图显示了NaGcA灌注之前、之中和之后的扩大的视区。

(e)NaGcA施用中，功率谱振幅显著降低。

(f)在NaGcA施用之前、之中和之后的连续5min窗口内，由高K⁺aCSF诱导的癫痫活动的归一化功率。NaGcA显著降低高K⁺诱导的癫痫活动的功效。

图5表示显示CA3锥体神经元中CLC-3通道介导的Cl^-电流被葡萄糖酸盐抑制的示例性数据。值是平均值±s.e.m.

(a)CA3锥体神经元中的代表性Cl^-流。通过20mM NaGcA施用(绿色)，Cl^-电流被显著抑制。

(b)I-V曲线绘制了显著的向外整流，具有反向电位接近0mV。NaGcA的存在显著降低Cl^-电流(绿色)。

(c)示例的Cl^-电流迹线来自CA3锥体神经元，其使用正常CsCl滴定溶液(左红色)，用抗ClC-3抗体(中间橙色)或对照兔IgG(右黑色)的细胞内透析(10分钟)。

(d)I-V图显示抗-ClC-3抗体透析(橙色)后显著降低，但在对照IgG透析(黑色)后无显著变化。

(e)用eGFP(左排)或ClC-3-eGFP融合蛋白质粒(右排)转染的HEK293T细胞的免疫染色图像。在ClC-3-eGFP转染的细胞(箭头)中强烈检测到ClC-3免疫反应性(红色)，而在非转染或eGFP转染的细胞中没有检测到免疫反应性。比例尺，40微米。

(f)用eGFP(上图)或ClC-3-eGFP质粒(底图)转染的HEK细胞中的典型Cl^-电流以及对20mM NaGcA的响应(中间绿色)。

(g)对于ClC-3-eGFP(右，n＝7，来自两批)感染细胞，在NaGcA之前、之中和清除的I-V关系，ClC-3介导的电流被NaGcA显著抑制。

图6表示显示CLC-3在新生儿癫痫切片中上调的示例性数据。数据表示为平均值±s.e.m.，***P<0.001。

(a)海马CA3上的ClC-3的相当的表达水平，在0Mg²⁺aCSF中切片孵育1小时后，ClC-3免疫反应性增加。星号表示放大的典型的神经元，CLC-3免疫信号(红色)在CA3区域中相重叠。比例尺＝20微米(放大图像中为5微米)。

(b)在0Mg²⁺aCSF中切片孵育1小时(对于对照n＝10片，来自4只小狗，对于0Mg²⁺：n＝11片，来自4只小狗，Student’s t-检验)之后，ClC-3免疫反应性强度的定量数据显示显著增加。

(c)来自对照和0Mg²⁺aCSF(1小时)处理的切片的海马ClC-3蛋白的蛋白质印迹。

(d)用0Mg²⁺aCSF处理海马切片后，定量数据显示CLC-3蛋白显著增加(每组n＝6只小狗，Student's t检验)。

(e)对照、Mg²⁺孵育1小时、Mg²⁺孵育1小时然后在20mM NaGcA中的记录代表性的Cl^-电流迹线。

(f)Cl^-电流的平均I-V图显示0Mg²⁺组显著增加，它也显著被NaGcA抑制。

图7A-G显示了显示葡萄糖酸盐是KA诱导的新生的癫痫发作的有效治疗的示例性数据。

图7(a)在注射KA(2mg/kg，腹膜内(i.p.))10分钟后注射盐水(0.1ml/10g，i.p.)的P12大鼠的代表性EEG迹线显示出复发性癫痫突发放电。

图7(b)来自图7a的框b中单个聚簇样癫痫性放电的扩展视图,显示典型的发作间的、强直发作的和阵挛发作的迹线。

图7(c)在KA注射10分钟后(2mg/kg，ip)注射NaGcA(2g/kg，ip)的P12大鼠的示例EEG，在NaGcA施用后显示出棘波活动(spike activity)增加但没有发展为强的突发放电。比例尺与图7a相同。

图7(d)图7c中框d中的放大区域。比例尺与图7b相同。

相比于两个侧边基线迹线，在扩展的迹线中观察到单个棘波放电。比例尺与图7c相同。

图7(e)图面a(黑色)和d(绿色)的1分钟时间窗口中的个体EEG功率。

图7(f)在1分钟的时间窗盐水(黑色，P10-12，n＝11)和NaGcA施用(绿色，P10-12，n＝11)中组平均EEG功率。黑色箭头表示KA注射点，红色箭头表示盐水或NaGcA注射点。在NaGcA存在下，由KA注射引起的癫痫活动的平均功率降低了70％。

图7(g)我们研究的工作模式。通过氯化物通道的Cl^-流通量将促进同步的网络活动(左)。但是由于GA对氯化物通道的抑制，这一过程被葡萄糖酸(GA)抑制(右)。

图8显示了显示葡萄糖酸盐对成年癫痫的作用的示例性数据。

(a-c)代表性的EEG记录，其显示注射戊四氮(PTZ)(50mg/kg，ip)，然后注射盐水(a)，NaGcA，1g/kg(b)或NaGcA，2g/kg(c)诱导的癫痫样活动。空三角表示第一个棘波，黑色小箭头表示第一个突发。

(d，e)柱状图显示NaGcA在延长由PTZ(50mg/kg，i.p.)诱导的癫痫样棘波(d)或癫痫样突发(e)的潜伏期的剂量依赖性作用。

(f)柱状图显示NaGcA对由PTZ(50mg/kg，i.p.)诱导的行为癫痫发作得分的轻度抑制作用。

(g)柱状图显示NaGcA剂量依赖性地延长了癫痫发作行为的潜伏期(Racine评分3以上)。

图9显示了表示各种氯化物离子通道抑制剂的作用的示例性数据：

(a)尼氟酸(NFA)(100μM)

(b)氟芬那酸(100μM)

(c)DIDS(100μM)

(d)NPPB(100μM)

图10显示了表示各种氯化物离子通道抑制剂对新生的海马切片中癫痫活动的影响的示例性数据：

(a)葡萄糖酸钠(20mM)(NaGcA)

(b)NFA(100μm)

(c)NPPB(100μm)

图11显示了表示CLC-3通道介导的Cl^-电流的发展变化的示例性数据。

图11A：在不同年龄动物获得的小鼠海马切片的CA3锥体神经元中记录的代表性Cl^-电流(顶行，黑色迹线)。中间行的绿色迹线显示在20mM NaGcA抑制后的Cl^-电流。下图显示不同年龄小鼠的对照和NaGcA处理后Cl^-电流的I-V曲线。

图11B：对照(黑色)或NaGcA处理(绿色)(HP＝+90mV)后的定量Cl^-电流密度。注意成年动物的Cl^-电流密度显著降低。***P<0.001。

图11C：NaGcA抑制对Cl^-电流的剂量响应曲线。

图11D：在对照(黑色)、抗CLC-3抗体(橙色)或预吸收对照抗体(灰色)下记录的典型Cl^-电流迹线。I-V曲线显示抗CLC-3抗体透析(橙色)后Cl^-电流显著降低。

图11E：免疫染色证实CLC-3敲除小鼠缺乏CLC-3信号。比例尺，10μm。

图11F：CLC-3 KO小鼠中电压依赖性外向整流Cl^-电流大部分不存在，支持CLC-3通道介导Cl^-电流。

图11G：NaGcA对CLC-3 KO小鼠中剩余的小Cl^-电流几乎没有抑制作用的I-V曲线，支持NaGcA是CLC-3通道抑制剂。

图11H：HEK293T细胞中CLC-3 Cl^-通道的表达。比例尺，40微米。

图11I：从表达CLC-3通道(底行)的HEK293T细胞记录的大Cl^-电流。20mM NaGcA的施用显著抑制了CLC-3通道介导的Cl^-电流(绿色迹线)。

图11J：显示NaGcA抑制CLC-3通道介导的Cl^-电流的I-V曲线(CLC-3,925±124pA，n＝7；CLC-3+NaGcA，544±59pA，n＝7；P<0.004，成对t检验；HP＝+90mV)。值是平均值±s.e.m。

图12显示了表示CLC-3氯化物通道与新生儿癫痫发生之间关系的示例性数据。

图12A：在0Mg²⁺人造脑脊液(aCSF)中诱导癫痫样活动(1小时)后海马CA3神经元中CLC-3通道表达上调(红色)。比例尺＝5微米。

图12B：在对照和0Mg²⁺aCSF中的定量CLC-3免疫强度(对照，n＝10片，来自4只小狗；0Mg²⁺，n＝11片，来自4只小狗；p<0.05，Student’s t检验)。

图12C和12D：蛋白质印迹分析也显示在用0Mg²⁺aCSF处理后海马中CLC-3蛋白水平显著增加(两组n＝6只小狗，p<0.001，Student’st检验)。

图12E：在对照0Mg²⁺(1小时)和0Mg²⁺+20mM NaGcA(1小时)条件下代表性的电压依赖性Cl^-电流迹线。

图12F：显示0Mg²⁺aCSF组(红色)中外向整流Cl^-电流显著增加和被NaGcA显著抑制(绿色)的I-V曲线。

图12G：显示在新生小鼠海马切片(出生后第7天，P7)中CA3锥体层中0Mg²⁺aCSF诱导的癫痫样活动及其被20mM NaGcA强烈抑制的细胞外场电位记录的。

图12H：NaGcA施用之前(红色)、之中(绿色)和之后(黑色)的癫痫样活动(5分钟时间窗)的功率谱。NaGcA施用后功率振幅(功率谱迹线下的积分面积)显著降低。

图12I和12J：NaGcA还显示出在P12海马切片中抗癫痫样活动的强效力。

图12K和12L：然而，在P26海马切片中，NaGcA仅显示对癫痫样活动中度的作用。

图12M：显示NaGcA抑制由0Mg²⁺aCSF诱导的癫痫样活动的时间过程的归一化功率。NaGcA显著降低了P6-8和P10-12组癫痫样活动的功率，但P21-33组的抑制作用要小得多。作为对照，灰线代表20mMNaCl对新生儿(P8-12)癫痫样活动的影响。

图12N和12O：来自WT、WT+20mM NaGcA和CLC-3 KO小鼠(均在P8-12)的海马切片中由0Mg²⁺aCSF诱导的癫痫样活动的代表性迹线。请注意，癫痫样活动在CLC-3 KO小鼠中持续时间不长。

图12P：显示来自WT、WT+20mM NaGcA和CLC-3 KO小鼠的海马切片中由0Mg²⁺aCSF诱导的突发潜伏期(左图)和突发频率(右图)的汇总数据。数据平均值±s.e.m.，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图13显示了表示NaGcA在新生的海马切片中各种癫痫模型中广谱的抗癫痫作用的示例性数据。

图13A：细胞外场电位记录，其显示新生的海马切片的CA3锥体细胞层中50μM 4-AP诱导的癫痫活动，以及其被NaGcA(20mM)的抑制作用。

图13B：NaGcA施用之前(红色)、之中(绿色)和之后(黑色)的5分钟时间窗中癫痫活动的功率谱。注意，NaGcA(绿色)显著降低了功率振幅。

图13C：显示NaGcA抑制由4-AP诱导的癫痫活动的时间过程的归一化功率。

图13D：NaGcA(20mM)显著抑制了新生的海马切片高K⁺癫痫模型中的癫痫样活动。

图13E：显示应用NaGcA过程中癫痫活动显著降低的功率谱。

图13F：说明NaGcA对高K⁺aCSF诱导的癫痫活动抑制的时间过程的归一化功率。

图13C和13F中的灰线表示对新生儿(P8-12)癫痫样活动的20mMNaCl对照作用。数据显示为平均值±s.e.m。

图14显示了CLC-3通道阻断剂葡萄糖酸盐在体内有效抑制新生的癫痫发作活动的示例性数据。

图14A：代表性EEG迹线，其显示KA注射(2mg/kg，腹膜内)随后间隔10分钟盐水注射(0.1ml/10g，i.p.)后，P12大鼠的复发性癫痫突发放电。

图14B：图14A框中癫痫突发放电的扩展视图。

图14C和14D：代表性的EEG迹线，其(P12大鼠)显示在注射KA(2mg/kg，i.p.)10分钟后，NaGcA注射(2g/kg，i.p.)显著抑制癫痫突发放电。

图14E和14F：代表性EEG迹线，其显示苯巴比妥(25mg/kg，i.p.)对新生大鼠癫痫突发活动(P12)的中度作用。

图14G和14H：代表性EEG迹线，其显示了布美他尼(2mg/kg，i.p.)对新生大鼠癫痫突发活动(P12)的影响。

图14I,14J，14K和14L：在成年小鼠中，KA注射(10mg/kg，i.p.)也诱发了强烈的癫痫突发活动，如EEG记录所示(14I和14J)，但NaGcA(2g/kg，i.p.)仅显示对KA诱导的癫痫突发活动(14K和14L)的中度作用。

图14M：新生动物中总结的数据，其显示KA注射前后，然后注射盐水(黑色)，NaGcA(绿色)，苯巴比妥(洋红色)或布美他尼(蓝色)的平均EEG功率(5min时间窗)。注意，NaGcA有效抑制KA诱导的EEG增加的功率。

图14N：在成年动物中，NaGcA(绿色)中度地抑制由KA诱导的EEG的功率。

在图14M和14N二者中，黑色箭头表示KA注射，红色箭头表示药物注射。数据是平均值±s.e.m。

图15显示了表示在新生大鼠中NaGcA对KA诱导的癫痫活动的急性作用的示例性数据。

图15A：通过i.p.注射KA诱导的典型癫痫EEG活动。记录稳定的癫痫活动(～1小时)后，向大鼠施用NaGcA(2g/kg，i.p.)(绿色)。注意NaGcA注射后癫痫活动逐渐减少。

图15B：来自图15A中片段的扩展迹线，显示出强的癫痫突发活动。

图15C：图15A中NaGcA注射后EEG记录的扩展视图。

图15D：图15B中片段的进一步展开的视图，显示了反复突发活动。

图15E：图15C中NaGcA注射后EEG的进一步扩展视图，显示了NaGcA对癫痫活动的显著抑制。

图15F：显示NaGcA施用(2g/kg i.p.，n＝6，P10-12大鼠，绿色)显著降低癫痫突发活动功率的总结数据。数据是平均值±s.e.m。

图16显示了表示CLC-3通道的活化改变发育中神经元中的胞内Cl^-内环境稳定的示例性数据。

图16A：新生儿CA3锥体神经元中由0Mg²⁺aCSF诱导的癫痫样突发活动显示长时间持续的膜去极化。

图16B：模拟癫痫样突发活动的长时间膜去极化脉冲(40mV，10s)显著增强了在短杆菌肽穿孔全细胞记录下由GABAA-R激动剂异四氢烟酸(100μM)诱导的GABAA-R电流。这种去极化诱导的增强在CLC-3KO小鼠中不存在，并被CLC-3通道阻断剂NaGcA(20mM)强烈抑制。

图16C：WT、CLC-3 KO和WT+NaGcA组中膜去极化对GABAA-R电流影响的总结数据。

图16D：在0Mg²⁺aCSF诱导癫痫样活动后，短杆菌肽穿孔记录显示CA3神经元中GABAA-R逆转电位(EGABA)的正位移。

图16E：NKCC1抑制剂布美他尼的浴应用诱导正常aCSF中EGABA的负向移位，但不消除由0Mg²⁺aCSF诱导的EGABA的正位移。

图16F：KCC2抑制剂VU0240551在正常aCSF下对EGABA没有影响，对0Mg²⁺aCSF诱导的正位移没有影响。

图16G：NaGcA完全消除由0Mg²⁺aCSF引起的正向EGABA位移。葡萄糖酸盐本身在正常aCSF中根本不影响EGABA。

图16H：在CLC-3 KO小鼠中，当用0Mg²⁺aCSF处理时，EGABA也没有改变。

图16I：显示在新生儿CA3锥体神经元(例如P8-9)中的各种条件下的EGABA变化的定量数据。

图16J：显示成人CA3锥体神经元中EGABA变化的柱状图。注意，NaGcA(20mM)在成年动物中没有改变EGABA位移。

图16K：细胞附着记录的典型迹线，其显示由新生动物(例如P8-9)中不同组别的异四氢烟酸(isoguvacine)(10μM，30s)诱导的棘波活动。

图16L：显示由异四氢烟酸激发的神经元百分比的总结数据。注意，NaGcA基本上消除了0Mg²⁺aCSF中的GABA兴奋性活动。数据显示为平均值±s.e.m.，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图17显示了表示与各种抗衡离子配合的葡萄糖酸抑制P8-12新生小鼠中的Cl^-电流的示例性数据。数据以平均值±s.e.m表示。

图17A：新生儿CA3锥体神经元(黑色，n＝12)中外整流(out-rectifying)Cl^-电流的代表性迹线。

图17B：存在20mM NaGcA(绿色，n＝7)时Cl^-电流的典型迹线。

图17C：存在10mM Mg(GcA)₂时的Cl^-电流的典型迹线。

图17D：存在20mM葡萄糖酸(蓝色，n＝6)时Cl^-电流的典型迹线。

图17E：I-V图显示了葡萄糖酸及其盐浴施用后Cl^-电流强度显著降低。

图18呈现了其中显示新生的海马切片中的癫痫样活动被葡萄糖氧化酶强烈抑制的示例性数据。

图18A:萄糖氧化酶(GOx)对由0Mg²⁺aCSF(具有20mM葡萄糖的人工脑脊髓液)诱导的癫痫样活动的剂量依赖性急性作用。请注意，>1U/ml GOx的急性应用可有效抑制癫痫活动。

图18B:由高K⁺诱导的癫痫样活动也被1U/ml GOx抑制。

图19呈现了其中显示在aCSF中长时间孵育后葡萄糖氧化酶对癫痫样活动的抑制作用增强的示例性数据。

图19A:癫痫样活动是由含有4mM葡萄糖的0Mg²⁺aCSF诱导。在将1U/ml GOx加入到0Mg²⁺aCSF(4mM葡萄糖)中并在室温下预孵育90分钟后，癫痫活性被显著抑制。

图19B.甚至用在0Mg²⁺aCSF(20mM葡萄糖)中预孵育90分钟的0.1U/ml GOx，其癫痫样活动也受到抑制。

图20呈现了葡萄糖氧化酶抑制癫痫样活动的示例性数据。

图20A:用于测试海马切片中GOx对癫痫样活动的急性作用的实验设置(setup)。将场电势记录置于CA3锥体细胞层中，由0Mg²⁺aCSF诱导癫痫样活动。在诱导稳定的癫痫样活动后，将GOx添加到0Mg²⁺aCSF中。

图20B:0.1U/ml Gox对0Mg²⁺aCSF诱导的癫痫样活动的急性作用。

图20C:0.3U/ml GOx对0Mg²⁺aCSF诱导的癫痫样活动的急性作用。

图20D:1U/ml GOx对0Mg²⁺aCSF诱导的癫痫样活动的急性作用。

图20E:1U/ml GOx对0葡萄糖；0Mg²⁺aCSF诱导的癫痫样活动的急性作用。用5mM乳酸盐和3mM丙酮酸盐代替葡萄糖。

图20F:将0.1U/ml GOx加入到0Mg²⁺aCSF并且在室温孵育超过1小时然后评价诱导的癫痫样活动。

图20G:在不同条件下场势功率的相对变化。注意，当从浴中除去葡萄糖时，几乎消除了1U/ml GOx对癫痫样活动的抑制作用。数据表示为平均值±s.e.m。

图21呈现了示例性数据，其表明葡萄糖氧化酶抑制了由下述诱导的癫痫样活动：i)高K⁺aCSF；或ii)4-氨基吡啶(4-AP)加上不含Mg²⁺的aCSF。

图21A:1U/ml GOx抑制由高K⁺(8.5mM)aCSF诱导的癫痫样活动。

图21B:1U/ml GOx抑制4-AP(50μM)+0Mg²⁺aCSF诱导的癫痫样活动。

图21C:在施用1U/ml GOx之前、期间和之后，由高K⁺aCSF(紫色)或4-AP(50μM)+0Mg^{2 +}aCSF(蓝色)诱导的归一化癫痫样活动功率。

具体实施方式

本发明涉及神经障碍领域。特别地，预防和治疗惊厥性障碍，包括但不限于肌肉紧张/阵挛性惊厥、癫痫、杰克逊病症和/或不自主的震颤。例如，一些实施方案涉及治疗和预防新生儿和/或婴儿的惊厥性障碍。已发现葡萄糖酸盐组合物对治疗和/或预防新生儿和/或婴儿中惊厥性障碍有选择性的有效性。

与成人癫痫相比，新生儿癫痫发作难以治疗。在一个实施方案中，本发明考虑使用抗癫痫药物葡萄糖酸盐，其通过靶向CLC-3Cl^-通道有效抑制新生儿癫痫。

葡萄糖酸是大的有机阴离子，通常以盐形式用作食品或药物添加剂，例如葡萄糖酸镁，葡萄糖酸钙或葡萄糖酸钾，其中葡萄糖酸盐用于输送离子。然而，葡萄糖酸盐本身的功能作用在很大程度上被忽视。本文提供的数据表明，葡萄糖酸本身充当Cl^-通道阻断剂并直接抑制癫痫样活动。此外，显示葡萄糖酸盐对于抑制新生儿癫痫发作特别有效，其效力优于其他目前可用的抗癫痫药物。由于葡萄糖酸盐对人类的消耗是安全的，所以该化合物代表了治疗新生儿癫痫的新平台。

葡萄糖酸根已被广泛用作许多医药用途药物中的阴离子，但通常被标记为无活性成分。在相关研究文献中，葡萄糖酸根本身从未与癫痫直接相关，因为这些研究的具体目标集中在诸如Ca²⁺和Mg²⁺之类的阳离子上。例如，一例病例报告说，癫痫患者接受了葡萄糖酸钙治疗，随后癫痫痉挛逐渐消失。Boulenguez等人，“Down-regulation of the potassium-chloride coransporter KCC2 contributes to spasticity after spinal cordinjury”Nature Medicine 16：302-307(2010)。该分析将改善效果归因于Ca²⁺，没有提及葡萄糖酸根的可能作用。葡萄糖酸镁可能具有抗癫痫作用的其他观察结果被提示是由于Mg²⁺的功能。

本文提供的数据表明，这些抗癫痫组合物中的活性成分更可能是葡萄糖酸根而不是二价阳离子。葡萄糖酸盐可以从葡萄糖的氧化产生，因此在天然食品如水果和蜂蜜中丰富。Anastassiadis等人，“Gluconic acid production”Recent Patents OnBiotechnology 1：167-180(2007)。在一个实施方案中，本发明预期葡萄糖酸盐具有抗癫痫作用并且可以支持某些对于癫痫的传统饮食治疗。

CLC-3通道是属于CLC超级家族的电压门控向外整流Cl^-通道。以前的研究表明，CLC-3通道对于调节胞内体酸化、突触前神经递质积聚、胰岛素分泌和胶质瘤细胞增殖至关重要。Hara-Chikuma等人，“ClC-3 chloride channels facilitate endosomalacidification and chloride accumulation”The Journal Of Biological Chemistry280:1241-1247(2005)；Riazanski等人,“Presynaptic CLC-3determines quantal sizeof inhibitory transmission in the hippocampus”Nature Neuroscience 14:487-494(2011)；Deriy等人,“The granular chloride channel ClC-3is permissive forinsulin secretion”Cell Metabolism 10:316-323(2009):Li等人,“Suppression ofsulfonylurea-and glucose-induced insulin secretion in vitro and in vivo inmice lacking the chloride transport protein ClC-3”Cell Metabolism 10:309-315(2009)；Cuddapah等人,“Bradykinin-induced chemotaxis of human gliomas requiresthe activation of KCa3.1 and ClC-3”The Journal Of Neuroscience:The officialjournal of the Society for Neuroscience 33:1427-1440(2013)；and Habela等人,“ClC3 is a critical regulator of the cell cycle in normal and malignant glialcells”The Journal Of Neuroscience:the official journal of the Society forNeuroscience 28:9205-9217(2008)。

虽然没有必要了解发明的机制，但据信CLC-3 Cl^-通道介导的大的向外整流的Cl^-电流，其在早期出生后大脑中突出但在成年大脑中大部分消失。因此，葡萄糖酸盐是治疗新生儿癫痫的更有效的抗癫痫药物。进一步认为，在癫痫发生过程中CLC-3 Cl^-通道的活化改变细胞内的Cl^-内环境稳定并使GABA功能更加兴奋。此外，本文提供的数据表明，CLC-3 Cl^-通道在新生儿癫痫中可能比以前认为的Cl^-转运蛋白发挥更大的作用。事实上，由于Cl^-通道和Cl^-转运蛋白的电压依赖性差异，Cl^-通道和Cl^-转运蛋白可能在控制细胞内Cl^-内环境稳定中起不同的作用。例如，在静息条件下，电压敏感的CLC-3 Cl^-通道是无活性的，因此，诸如NKCC1的Cl^-转运蛋白是维持细胞内Cl^-内环境稳定在发育中的神经元的主要扮演者。Ben-Ari,Y.,“Excitatory actions of gaba during development:the nature of thenurture”Nature Reviews.Neuroscience 3:728-739(2002)；Kaila等人,“Cation-chloride cotransporters in neuronal development,plasticity and disease”NatureReviews.Neuroscience 15:637-654(2014)；and Blaesse等人,“Cation-chloridecotransporters and neuronal function”Neuron 61:820-838(2009)。

然而，在癫痫发生期间，CLC-3 Cl^-通道被激活，大的Cl^-流入显著增加[Cl^-]_i，导致增强的兴奋性GABA能传递和加重的癫痫活动。在一些实施方案中，本发明考虑用葡萄糖酸盐阻断CLC-3通道破坏该阳性环路并抑制发育中的大脑中的新生儿癫痫。此外，CLC-3敲除小鼠不具有大的向外整流Cl^-电流，因此复反性突发活动显著减少。

通过比较葡萄糖酸盐与其他潜在的抗癫痫药物(AED)，本文提供的数据表明，葡萄糖酸盐在抑制新生的癫痫中比苯巴比妥或布美他尼更有效。葡萄糖酸盐与布美他尼的作用不同，其阻断NKCC1并在静息条件下影响EGABA，而葡萄糖酸盐在生理条件下不影响正常的EGABA，但在癫痫发生过程中阻断CLC-3通道激活。

由于葡萄糖酸盐是天然有机酸，并且已被用作食品和药物添加剂，具有最小副作用。在一个实施方案中，本发明考虑在不存在二价阳离子的情况下，葡萄糖酸盐组合物是可用于治疗对许多目前抗惊厥药具有抗性的新生儿癫痫的治疗药物。

I.惊厥性障碍

术语惊厥通常与癫痫发作互换使用。当一个人的身体快速和不受控制地摇动时，会发生惊厥。在惊厥期间，该人的肌肉重复收缩并放松。有许多不同类型的癫痫发作。有些症状轻微，无抖动。一些发作只会导致一个人盯着咒语。这些可能会被忽视。惊厥的具体症状可能取决于大脑的哪一部分。症状通常会突然发生，可能包括但不限于：短暂失忆，随后一段时间的混乱(该人在短时间内不能记忆)；行为变化，例如挑选衣服；嘴里流口水或起泡；眼动；呼噜声和嗅吸法；膀胱或排便控制失禁；情绪变化如突然的愤怒，不可解释的恐惧，恐慌，欢乐或笑声；摇晃整个身体；突然倒下，品尝苦味或金属味；牙齿咬紧；暂时停止呼吸，和/或无法控制的肌肉痉挛伴有颤搐和急动四肢。症状可能在几秒钟或几分钟后停止，或持续长达15分钟，但很少持续更长时间。

癫痫发作通常由大脑电路的过度兴奋引起，这可以通过增强成人脑中主要的抑制受体家族-GABA_A受体(GABA_A-R)来抑制。因此，通常开发抗癫痫药(AEDs)以增加GABAA-R功能，例如通常针对成年患者的苯二氮卓类和巴比妥类药物。Bialer等人,“Key factors inthe discovery and development of new antiepileptic drugs.Nature reviews.Drugdiscovery 9,68-82(2010)。然而，虽然GABA_A-R在成年大脑中主要是抑制性的，但是在新生儿和/或婴儿的发育中的大脑中，GABA_A-R主要是兴奋性的。Chen等人,“Excitatoryactions of GABA in developing rat hypothalamic neurones”The Journal OfPhysiology 494(Pt 2):451-464(1996)；以及Ben-Ari Y.,“Excitatory actions of gabaduring development:the nature of the nurture”Nature Reviews Neuroscience 3:728-739(2002)。发育中的大脑兴奋性GABA能传递也解释了为什么GABA激动剂通常对控制新生儿癫痫发作无效，有时甚至可能加剧新生儿癫痫发作活动。Farwell等人,“Phenobarbital for febrile seizures--effects on intelligence and on seizurerecurrence”The New England Journal Of Medicine 322:364-369(1990)。因此，一些AED可能通过增强发育中的大脑中的兴奋性GABA_A-R功能来加剧新生儿癫痫发作。

经典地，GABA_A-R在发育神经元中的兴奋性功能已经归因于氯离子(Cl^-)转运蛋白NKCC1和KCC2的调节。Ben-Ari等人,“GABA:a pioneer transmitter that excitesimmature neurons and generates primitive oscillations”Physiol Rev 87:1215-1284(2007)；Kahle等人,“Roles of the cation-chloride cotransporters inneurological disease”Nat Clin Pract Neurol 4:490-503(2008)；and Kaila等人,“Cation-chloride cotransporters in neuronal development,plasticity anddisease”Nature Reviews.Neuroscience 15:637-654(2014)。以前的研究发现，NKCC1可能促进啮齿动物的新生儿癫痫发作。Dzhala等人,“NKCC1 transporter facilitatesseizures in the developing brain”Nature Medicine 11:1205-1213(2005)。然而，最近的婴儿临床试验发现NKCC1阻断剂布美他尼的严重副作用，并且对新生儿癫痫发作的治疗效果非常有限。Pressler等人,“Bumetanide for the treatment of seizures innewborn babies with hypoxic ischaemic encephalopathy(NEMO):an open-label,dosefinding,and feasibility phase 1/2trial”Lancet Neurol 14:469-477(2015)。因为兴奋性GABA能传递在许多神经发育过程中起关键作用，阻断NKCC1可能在生理条件下显著改变GABA的功能，并增加破坏正常大脑发育的潜在风险。Ben-Ari,Y.,“Excitatory actionsof gaba during development:the nature of the nurture”Naturereviews.Neuroscience 3:728-739(2002)；Kaila等人,“Cation-chloridecotransporters in neuronal development,plasticity and disease”Naturereviews.Neuroscience 15:637-654(2014)；Wang等人,“Blocking early GABAdepolarization with bumetanide results in permanent alterations in corticalcircuits and sensorimotor gating deficits”Cerebral cortex 21:574-587(2011)；and Deidda等人,“Early depolarizing GABA controls critical-period plasticityin the rat visual cortex”Nature neuroscience 18:87-96(2015)。最近的研究表明，除了Cl^-共转运蛋白以外的因素也可能有助于Cl^-内环境稳定，例如不渗透阴离子、电压门控内向整流氯通道CLC-2和电压门控外向整流氯通道CLC-3。Glykys等人,“Local impermeantanions establish the neuronal chloride concentration”Science 343:670-675(2014)；Foldy等人,“Regulation of fast-spiking basket cell synapses by thechloride channel ClC-2”Nature neuroscience 13:1047-1049(2010)；Rinke等人,“ClC-2voltage-gated channels constitute part of the background conductance andassist chloride extrusion”The Journal of neuroscience:the official journal ofthe Society for Neuroscience 30:4776-4786(2010)；Kawasaki等人,“Cloning andexpression of a protein kinase C-regulated chloride channel abundantlyexpressed in rat brain neuronal cells”Neuron 12:597-604(1994)；and Wang等人,“CLC-3channels modulate excitatory synaptic transmission in hippocampalneurons”Neuron 52:321-333(2006)。

最近的研究表明，Cl^-通道，如CLC-3通道，也可能有助于细胞内Cl^-浓度([Cl^-]_i)变化。Zhou等人,“Regulation of intracellular Cl^-concentration through volume-regulated ClC-3chloride channels in A10 vascular smooth muscle cells”TheJournal Of Biological Chemistry 280:7301-7308(2005)。CLC-3通道属于电压依赖性向外整流Cl^-通道的亚族。Jentsch T.J.,“Chloride and the endosomal-lysosomalpathway:emerging roles of CLC chloride transporters”The Journal of Physiology578:633-640(2007)；Graves等人,“The Cl^-/H+antiporter ClC-7is the primarychloride permeation pathway in lysosomes”Nature 453:788-792(2008)；Picollo等人,“Chloride/proton antiporter activity of mammalian CLC proteins ClC-4andClC-5”Nature 436:420-423(2005)；Scheel等人,“Voltage-dependent electrogenicchloride/proton exchange by endosomal CLC proteins”Nature 436:424-427(2005)；and Hara-Chikuma等人,“ClC-3chloride channels facilitate endosomalacidification and chloride accumulation”The Journal Of Biological Chemistry280:1241-1247(2005)。CLC-3通道在整个脑中无所不在地表达，在海马和小脑中具有高表达水平。Duran等人,“Chloride channels:often enigmatic,rarely predictable”AnnualReview Of Physiology 72:95-121(2010)；Verkman等人,“Chloride channels as drugtargets”Nature Reviews.Drug discovery 8:153-171(2009)；and Kawasaki等人,“Cloning and expression of a protein kinase C-regulated chloride channelabundantly expressed in rat brain neuronal cells”Neuron 12:597-604(1994)。例如，CLC-3敲除小鼠在海马中显示选择性产后神经变性。Stobrawa等人,“Disruption ofClC-3,a chloride channel expressed on synaptic vesicles,leads to a loss ofthe hippocampus”Neuron 29:185-196(2001)；and Dickerson等人,“Altered GABAergicfunction accompanies hippocampal degeneration in mice lacking ClC-3voltage-gated chloride channels”Brain Research 958:227-250(2002)。然而，在癫痫发生过程中电压依赖性Cl^-通道的确切作用在很大程度上是未知的。

与成人癫痫相比，新生儿癫痫发作难以治疗。新生儿癫痫发作与成人癫痫发作不同，许多在成人中有效的抗癫痫药物(AEDs)通常不能治疗新生儿癫痫发作。例如，本文呈现的数据显示出在早期发育中的大脑中存在的由CLC-3 Cl^-通道介导的大的电压依赖的外向整流Cl^-电流，但在成年脑中却不存在。虽然没有必要了解本发明的机理，但据信葡萄糖酸盐(天然存在的有机酸)通过阻断CLC-3氯化物通道有效抑制新生儿癫痫发作。

有趣的是，CLC-3 Cl^-通道可能在癫痫发作期间上调，葡萄糖酸盐对CLC-3 Cl^-通道的抑制基本上消除了新生儿癫痫发作活动，与其他AED相比，效力明显提高。据信该结果可以通过观察到CLC-3敲除小鼠在发育中的大脑中没有外向整流Cl^-电流并且显示出减少的复发性癫痫样活动来解释。虽然没有必要了解本发明的机制，据信在癫痫发作期间CLC-3Cl^-通道的活化显著改变细胞内的Cl^-内环境稳定并增强GABA兴奋性功能，也可以用其他Cl^-调节剂观察到效果。本文提供的数据将葡萄糖酸盐鉴定为通过抑制CLC-3 Cl^-通道治疗新生儿癫痫发作的有效抗癫痫药物。在本文所述的一些实施方案中，鉴定出特别有效抑制新生儿癫痫发作的抗癫痫药物葡萄糖酸。

II.基于二价阳离子的惊厥治疗

已经报道了将葡萄糖酸钙、硫酸镁或苯巴比妥对患有与低钙血症相关的惊厥的4-7天龄的婴儿施用。虽然所有三种组合物似乎都降低惊厥的速率，但是内部治疗比较显示硫酸镁比葡萄糖酸钙或苯巴比妥更有效。但是，参考文献并未提供关于在不需要阳离子基础的治疗的婴儿中葡萄糖酸盐组合物的有效性的任何公开。Turner,T.,“Comparisons ofphenobarbitone,magnesium sulphate,and calcium gluconate in treatment ofneonatal hypocalcaemic convulsions”Paediatric Research Society Abstracts,pg244。

已经报道了对小于二十天的婴儿施用葡萄糖酸钙用于惊厥控制。在这种治疗之后，左腿发生肿胀、炎症、骨外钙化，以及血清钙水平测定在正常范围内。停止使用葡萄糖酸钙处理后，这些症状缓解，诱断为医源性皮肤钙质沉着症。但是，参考文献并没有提供关于葡萄糖酸盐组合物在不需要基于二价阳离子的治疗(例如钙)的婴儿中的有效性的任何公开。Arora等人,“Iatrogenic calcinosis cutis—a rare differential diagnosis ofsoft-tissue infection in a neonate:A case report”Journal of OrthopaedicSurgery 13(2):195-198(2005)。

已经报道了施用植物提取物用于治疗癫痫发作障碍和/或癫痫。例如，植物提取物已经与葡萄糖酸盐的各种制剂，例如葡萄糖酸钾、葡萄糖酸锌和/或葡萄糖酸铜组合，并使用已知的小鼠电击克隆模型筛选抗惊厥活动。此外，将市售的产品NutriiVeda^TM施用于年龄在四岁半(4.5)至三十七(37)岁之间的人类患者，以减少癫痫发作和/或癫痫。然而，应该注意的是，NutriiVeda^TM的详细组成分析并未被公开，因此，本产品中葡萄糖酸盐的确切含量及其与二价阳离子的关系是未知的。但是，参考文献并没有提供关于葡萄糖酸盐组合物在不需要基于二价阳离子的治疗如钙或锌的婴儿中的有效性的任何公开。Geng L.，“Methodsfor Treating Neurological Disorders Using Nutrient Compositions”美国专利号8,962,042(通过引用并入本文)。

提出了新生儿的病例，这些新生儿患有与低钙血症、高磷血症和升高的甲状旁腺激素相关的早期发生癫痫发作。婴儿没有任何假性甲状旁腺功能减退症的特征。低钙血症最初对钙治疗有抗性，但对维生素D类似物治疗有响应。诊断为“新生儿伪甲状旁腺功能减退症”；在3和8个月的随访期间，婴儿保持稳定和无癫痫发作，血清生化正常。Narang等人，“Neonatal pseudohypoparathyroidism”Indian J Pediatr.73(1):97-98(2006)；andManzar等人,“Transient pseudohypoparathyroidism and neonatal seizure”J TropPediatr.47(2):113-114(2001)。

已经报道了钙基础惊厥治疗的失败，当患者9岁时发展为广泛性强直阵挛性发作，并且这些与低钙血症相关。尽管用钙治疗，仍持续癫痫发作，且患者需要抗癫痫药物。她最终被奥卡西平控制。头部MRI正常。EEG显示出从左侧颞颥和右侧额叶区域发出独立尖峰和波浪放电。EEG上病灶发现的存在、缺乏对钙治疗的完全响应以及对抗癫痫药物治疗的需求表明，其中一些患者可能固有倾向于发展为癫痫。Gonzalez等人,“Seizures and EEGfindings in an adult patient with DiGeorge syndrome:a case report and reviewof the literature”Seizure 18(9):648-651(2009)。

低血钙症是婴儿和儿童中左心室功能不全的一个相对罕见但可逆的原因。一名30天的特发性低钙血症男孩呈现充血性心力衰竭和惊厥性癫痫发作。他没有潜在的心脏病证据。心脏衰竭对钙治疗有响应。建议应将低钙血症视为婴儿左心室功能障碍的可能原因。Karademir等人,“Left ventricular dysfunction due to hypocalcemia in a neonate”JPN Heart J.34(3):355-359(1993)。

如上这样的报告教导本领域技术人员，施用二价阳离子葡萄糖酸盐治疗的目的是提供二价阳离子(例如钙，镁，锌等)作为有效成分来控制惊厥性障碍。例如，“低钙血症”的病症被描述为惊厥症的预先存在的病症。另一方面，钙过量导致在葡萄糖酸钙治疗之后经历的惊厥治疗期间产生严重的副作用。因此，这些观察教导了向新生儿施用二价阳离子葡萄糖酸盐复合物的目的是因为：据信需要二价阳离子补充以进行惊厥控制，且葡萄糖酸盐仅仅是合适的抗衡离子。因此，本发明表明二价阳离子葡萄糖酸盐组合物在治疗惊厥病症方面令人惊奇地更有效。

III.葡萄糖酸盐基础的惊厥治疗

在一个实施方案中，本发明考虑电压依赖性CLC-3 Cl^-通道可能在控制细胞内Cl^-浓度([Cl^-]_i)中发挥作用，特别是在新生儿癫痫期间。例如，CLC-3通道可以介导能够被葡萄糖酸抑制的新生儿而不是成年大脑中的大的电压依赖性外向整流Cl^-电流。例如，数据显示，葡萄糖酸盐有效地抑制新生癫痫活动，对成年动物的影响较小。此外，CLC-3敲除小鼠显示在新生大脑中没有电压依赖性外向整流Cl^-电流，并且减少了复发性癫痫活动。EEG记录也证实，葡萄糖酸盐在抑制新生动物的癫痫发作突发活动方面更有效，但在成年动物中效果较差。最后，在新生儿癫痫期间观察到的CLC-3通道激活显著增加[Cl^-]_i，而使用葡萄糖酸盐阻断CLC-3通道则抑制[Cl^-]积累。在一个实施方案中，本发明考虑葡萄糖酸盐(天然有机化学品)是有效的CLC-3 Cl^-通道阻断剂，并且可能作为抗惊厥药物有效治疗新生儿癫痫。

葡萄糖酸是大的有机阴离子，通常以盐形式用作食品或药物添加剂，例如葡萄糖酸镁、葡萄糖酸钙或葡萄糖酸钾，其中葡萄糖酸盐用于帮助输送钙或镁或钾。然而，在过去葡萄糖酸盐本身的功能作用在很大程度上被忽视。本文提供的数据表明，葡萄糖酸本身作为Cl^-通道阻断剂并直接抑制癫痫样活动。在一些实施方案中，本发明提供了葡萄糖酸盐对于抑制新生儿癫痫发作特别有效，从而为治疗新生儿癫痫提供了选择性治疗。

葡萄糖酸盐是具有以下结构的烷酰基有机化合物：

应注意，各种羟基和羧酸基提供能够进行官能化和/或衍生化的活性种。这样的反应性基团可以被基团部分取代，包括但不限于取代或未取代的芳基或杂芳基、未取代或取代的C1-C6-烷基、取代或未取代的5-6元饱和或不饱和稠环、取代或未取代的5-6元饱和或不饱和环、天然氨基酸残基或合成氨基酸残基、三卤甲基、取代或未取代的C1-C6-烷氧基、NH₂、SH、硫代烷基、氨酰基、氨基羰基、取代或未取代的Cl-C6烷氧基羰基、芳基、杂芳基、取代或未取代4-8元环烷基，任选含有1-3个杂原子，羧基、氰基、卤素、羟基、硝基、乙酰氧基、氨酰基、磺酰氧基、磺酰基、C1-C6-硫代烷氧基、C1-C6-脂族烷基、任选含有1-3个杂原子且任选与芳基或杂芳基稠合的取代或未取代的饱和环状C4-C8-烷基；取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基，其中所述芳基或杂芳基任选被如下取代：取代或未取代的C1-C6-烷基，如三卤甲基、取代或未取代的C1-C6-烷氧基、取代或未取代的C2-C6-烯基、取代或未取代的C2-C6炔基、氨基、氨酰基、氨基羰基、取代或未取代的C1-C6-烷氧基羰基、芳基、羧基、氰基、卤素、羟基、硝基、乙酰氧基、氨酰基、磺酰氧基、磺酰基、C1-C6-硫代烷氧基；或者R5和R6一起可以形成取代或未取代的4-8元饱和环烷基或杂烷基。期望这些关注的葡萄糖酸盐衍生物的至少一种或多种具有抗惊厥效果，其优于传统使用的二价阳离子治疗。

葡萄糖酸根已被广泛用作许多医药用途的阴离子，通常被标记为无活性成分。报道了具有葡萄糖酸盐作为抗衡离子的抗惊厥药物的本领域技术人员，从未提出葡萄糖酸盐与任何抗癫痫作用有关。相反，如上所计论的，以前的研究主要集中在二价阳离子如Ca²⁺和Mg²⁺，作为介导抗惊厥作用。例如，一例病例研究报告了癫痫患者用葡萄糖酸钙治疗且癫痫痉挛逐渐消失。Boulenguez等人，“Down-regulation of the potassium chloridecotransporter kCC2 contributes to spasticity after spinal cord injury”NatureMedicine 16：302-307(2010)。作者把这种效应归因于Ca²⁺，完全忽略了葡萄糖酸根可能发挥任何作用的问题。类似地，本领域普遍接受的是镁相关的抗惊厥产品，例如葡萄糖酸镁，可能具有抗癫痫作用，但同样认为抗惊厥作用是由于Mg²⁺的功能。与这些普遍认为的信念相反，本文呈现的数据表明，葡萄糖酸根可能与单独的二价阳离子一样有效或更有效。

葡萄糖酸盐可以由葡萄糖的氧化产生，因此在天然食品如水果和蜂蜜中大量存在。Anastassiadis等人，“Gluconic acid production”Recent Patents OnBiotechnology 1：167-180(2007)。因此，葡萄糖酸盐的膳食来源也可能有助于抗癫痫治疗。由于葡萄糖酸盐是天然有机酸，已被用作食品和药物添加剂，具有最小副作用，葡萄糖酸盐衍生物可能产生新一代用于治疗新生儿癫痫的治疗药物。

在一个实施方案中，本发明考虑葡萄糖酸(例如，葡萄糖酸盐)有效抑制神经元培养物以及海马切片中的癫痫样突发活动。此外，海马切片中的场电势记录显示，葡萄糖酸钠有效抑制新生癫痫活动，对老龄动物的影响较小。脑电图(EEG)记录证实，葡萄糖酸钠在抑制新生动物癫痫发作中更有效，但在成年动物中效果较差。全细胞膜片钳记录表明，葡萄糖酸钠显著抑制主要由CLC-3通道介导的海马锥体神经元中的电压依赖性Cl^-电流。本文提供的数据鉴定了天然有机化学品-葡萄糖酸及其衍生物，如以前未知的，是用于新生儿癫痫的有效的抗惊厥药物。

A.癫痫样活动的抑制

在癫痫发生过程中通过用诸如葡萄糖酸等大阴离子代替浴溶液中细胞外Cl^-(即，例如137mM Cl^-)来研究Cl^-的功能作用。令人惊奇的是，浴溶液中约5-20mM葡萄糖酸钠(NaGcA)之间的浓度抑制培养的皮质神经元中的自发性癫痫样活动。参见图1A。通过低浓度的NaGcA对癫痫样活动的这种有效抑制不能纯粹通过Cl^-浓度变化来解释，因为在浴液中仍然有>117mM Cl^-。为了确定NaGcA是否可能直接抑制癫痫样活动，使用环噻嗪(CTZ)在神经元培养物中引发强大的癫痫样突发活动。Qi等人，“Cyclothiazide induces robustepileptiform activity in rat hippocampal neurons both in vitro and in vivo”The Journal of Physiology 571：605-618(2006)。数据表明CTZ诱导的癫痫样活动被10mMNaGcA完全阻断，并且抑制是剂量依赖性的。分别参见图1B和图1C。NaGcA的作用是可逆的，因为在清除NaGcA后，突发活动恢复到对照水平。参见图1A和图1C。这些数据表明NaGcA对培养的神经元中的癫痫样突发活动具有有效的抑制作用。

为了确保NaGcA的这种抑制作用不限于CTZ癫痫模型，在另外两个额外的癫痫模型中进一步测试NaGcA。首先，用1μM红藻氨酸(KA)(一种有效的神经毒素)处理皮质神经元2小时以诱导癫痫突发活动。全细胞膜片钳记录显示，10mM NaGcA大大抑制了由KA诱导的癫痫样突发活动。参见图1D和图1E。其次，将皮质神经元在50μM 4-氨基吡啶(4-AP)中孵育2小时，这也诱导长时间持续的癫痫样突发活动。类似地，应用10mM NaGcA完全阻断了4-AP诱导的癫痫样活动。参见图1F和图1G。这些结果一起表明，NaGcA是对于培养神经元中的癫痫样活动的一种有效和一般的抑制剂。

然后测定NaGcA是否能抑制癫痫活动的诱导。为此目的，在诱导期间加入了NaGcA和CTZ的组合。单独CTZ处理的神经元表现出强烈的癫痫样活动；然而，用10μM CTZ和10mMNaGcA处理的神经元显示癫痫样活动的显著降低。参见图1H，参考上面部分到下面部分。几乎90％的对照神经元在CTZ处理后显示出癫痫样活动(例如，22个神经元中约19个)，而用10mM NaGcA共同处理的神经元只有18％(例如，17个神经元中约3个，p<0.001，χ2检验)显示癫痫样活动。参见图1I(a)。癫痫样突发的平均频率和持续时间在用NaGcA共同处理的神经元中也显著减少。参见图1I(b)和图1I(c)。总之，这些数据表明，急性和慢性NaGcA施用可抑制培养神经元中的癫痫样活动。

B.红藻氨酸诱导的细胞死亡保护

神经元死亡是癫痫的严重副作用。Sagar等人，“Hippocampal neuron loss intemporal lobe epilepsy：correlation with early childhood convulsions”Annals ofNeurology 22:334-340(1987)；以及Sass等人,“Verbal memory impairment resultingfrom hippocampal neuron loss among epileptic patients with structurallesions”Neurology 45:2154-2158(1995)。本文提供的数据表明，葡萄糖酸盐不仅具有抗癫痫作用，而且还对KA诱导的神经元死亡发挥神经保护作用。

癫痫活动可能在癫痫患者和动物模型中诱导细胞死亡。Chen等人，“Differentialroles of NR2A-and NR2B-containing NMDA receptors in activity-dependent brain-derived neurotrophic factor gene regulation and limbic epileptogenesis”TheJournal Of Neuroscience:the official journal of the Society for Neuroscience27:542-552(2007)；以及Naseer等人,“Maternal epileptic seizure induced bypentylenetetrazol:apoptotic neurodegeneration and decreased GABAB1 receptorexpression in prenatal rat brain”Molecular Brain 2:20(2009)。为了评价NaGcA的抗癫痫作用是否可能是神经保护性的，将红藻氨酸(KA)诱导的细胞死亡模型与LIVE/

活性/细胞毒性测定试剂盒(L3224，Life Technologies，Inc。)结合使用以分析神经元存活率。Wu等人，“Protective effect of resveratrol against kainate-inducedtemporal lobe epilepsy in rats”Neurochemical Research 34:1393-1400(2009)。在对照组中，大多数神经元在形态上看起来是健康的，并被钙黄绿素染色(绿色，活的)，但没并被乙啡啶同质二聚体-1染色(E thD-，红色，死亡)。参见图示1J左图。暴露于10μM KA 24小时后，大多数神经元死亡，如EthD-1染色所示。见图1J，中左)。有趣的是，通过共同施用20mMNaGcA，KA诱导的神经元死亡被消除。见图1J，右中。暴露于单独20mM NaGcA的神经元对它们的存活率没有副作用。见图1J，右。定量数据显示，NaGcA的神经保护作用也呈剂量依赖性。参见图1K。这些实验表明，葡萄糖酸盐不仅能抑制癫痫样活动，而且能发挥神经保护作用。

C.氯化物离子电流抑制

本文提出的研究表明葡萄糖酸阻断Cl^-通道。虽然不需要了解本发明的机理，但认为葡萄糖酸阻断这些通道，因为它是具有负电荷的大的有机化合物。例如，作为大阴离子，据信葡萄糖酸可能不像Cl^-离子本身那样容易地通过Cl^-通道。Cl^-通道与人类癫痫患者有关。在许多特发性癫痫患者中确定了CLC-1通道的突变。Chen等人，“Novel brainexpression of ClC-1 chloride channels and enrichment of CLCN1 variants inepilepsy”Neurology 80：1078-1085(2013)。CLC-2通道突变也在人类患者中发现，但一些研究表明，突变可能不会促成癫痫。Haug等人，“Mutations in CLCN2 encoding avoltage-gated chloride channel are associated with idiopathic generalizedepilepsies”Nat Genet 33：527-532(2003)；Kleefuss-Lie等人，“CLCN2 variants inidiopathic generalized epilepsy”Nat Genet 41：954-955(2009)；和Niemeyer等人，“Noevidence for a role of CLCN2 variants in idiopathic generalized epilepsy”NatGenet 42：3(2010)。CLC-3通道在不同的脑区域广泛表达，海马是表达最高的区域之一。Duran等人，“Chloride channels：oftenenigmatic，rarely predictable”Annual ReviewOf Physiology 72：95-121(2010)；Verkman等人，“Chloride channels as drug targets”Nature Reviews。Drug Discovery 8：153-171(2009)；和Kawasaki等人，“Cloning andexpression of a protein kinase C-regulated chloride channel abundantlyexpressed in rat brain neuronal cells”Neuron 12：597-604(1994)。

设计实验以回答关于葡萄糖酸盐的分子靶标是什么的问题。首先研究了NaGcA对钠、钾或钙通道进行比较的离子通道调节。数据显示，NaGcA处理后Na⁺、K⁺和Ca²⁺电流没有显著变化。参见图2A-2F。虽然不需要理解本发明的机理，但据信由于葡萄糖酸是有机阴离子，它可能会影响神经元阴离子通道。

本发明提供的数据显示，培养皮质神经元中的Cl^-电流是向外整流的，并且在10mMNaGcA存在下显著降低。参见图2G，H；对照，913±171pA；NaGcA，499±89pA；n＝7；P<0.007，成对t检验；记录在+90mV)。因此，NaGcA的一个靶标可能是Cl^-通道。为了巩固Cl^-通道和癫痫发生之间的紧密联系，检查了两种经典的Cl^-通道阻断剂的作用；5-硝基-2-(3-苯基丙基氨基)苯甲酸(NPPB)和4,4'-二异硫氰酸酯2,2'-芪二磺酸二钠盐(DIDS)。NPPB(100μM)或DIDS(100μM)的施用显著抑制培养神经元中的Cl^-电流。参见图2I，L。这还证明NPPB(100μM)和DIDS(100μM)均显著抑制CTZ诱导的癫痫样活动(10μM，24小时)。见图2M，N；n＝9。总之，这些结果表明NaGcA能抑制与癫痫发生有关的Cl^-通道。

D.新生的海马切片癫痫样活动抑制

上述葡萄糖酸盐对培养神经元的影响的可能性是伪像，在具有相对完整的神经元回路的海马切片中检查了NaGcA的抗癫痫活动。在CA3锥体层中记录场电位，并且在不含Mg²⁺的人造脑脊髓液(aCSF)中诱导癫痫突发活动。诱导稳定的癫痫突发活动(～30分钟)后，将20mMNaGcA施用于不含Mg²⁺的aCSF，以测试其对癫痫活动的影响。数据显示，NaGcA在P6-P12新生动物的脑切片中发挥抗癫痫作用(图2A和2c)，但在一个月左右的更老龄动物中发挥了中度的作用。参见图3A和3C，参见图3E。然后在NaGcA施用之前、之中和之后分析场电位的功率谱。在新生动物中施用NaGcA后，功率的振幅显著降低，但在更老龄动物(例如，P26)中仅略有降低。参见图3B和3D，参见图3F。定量地，NaGcA抑制了新生动物癫痫活动的平均功率的60％(P6-8,59.6±4.3％，来自5只小狗的n＝10片；P10-12,62.1±3.8％，来自5只小狗的n＝10片；P<0.001，成对t检验)，但在老龄动物中(P21-33,23.8±4.1％，来自4只小狗的n＝7片；p<0.005，成对t检验)仅减少20％。参见图3G。这些结果表明NaGcA可能在新生儿大脑中具有有效的抗癫痫活动。

进一步确定了NaGcA对癫痫活动的影响是否普遍适用于P6-P12新生动物中除0Mg²⁺模型以外的其他癫痫模型。例如，使用4-AP模型，其中K⁺通道阻断剂4-AP(50μM)的浴施用在CA3锥体层中诱导强烈的癫痫突发活动。进一步向含4-AP的浴溶液中加入20mM NaGcA显著降低癫痫活动，其在NaGcA清除后是可逆的。参见图4A。功率的振幅也显示在NaGcA存在时显著降低，总结的数据显示NaGcA导致功率振幅平均降低了70.2±5.3％(n＝9片，来自4只小狗；P<0.001，成对t检验)。分别参见图4B和图4C。也可以施用高K⁺模型，其中在CA3锥体层中高的细胞外K⁺(+8.5mM)诱发癫痫突发活动。参见图4D。类似地，在高K⁺aCSF中加入20mMNaGcA也阻断了癫痫突发活动并降低了功率振幅。见图4D,E。统计学分析显示，在高K⁺模型中，NaGcA显著降低功率振幅70.8±4.9％(n＝5片，来自2只小狗；P<0.001，成对t检验)。见图4F。总之，这些结果表明NaGcA可以有效抑制各种癫痫模型中的新生儿癫痫。

E.CLC-3氯化物离子通道抑制

如上所述，NaGcA抑制培养神经元中的Cl^-电流。见图2。以前的研究报道，海马培养的神经元具有电压依赖性CLC-3 Cl^-通道。Wang等人，“CLC-3 channels modulateexcitatory synaptic transmission in hippocampal neurons”Neuron 52：321-333(2006)。如本文所示，葡萄糖酸盐对由CLC-3通道介导的向外整流Cl^-电流具有强抑制作用。通过CLC-3通道的突触后Cl^-流入可以增强NMDA受体介导的兴奋性电流，并且NMDA受体的过度激活参与癫痫发作诱导的神经元细胞死亡。因此，葡萄糖酸盐的神经保护作用可能是间接抑制NMDA受体的功能。

虽然已知海马形成是啮齿动物脑中最常见的癫痫发生结构之一，但迄今为止，除了一个报道CLC-3敲除小鼠显示出显著抗PTZ诱导癫痫之外，几乎没有直接考察CLC-3通道与癫痫之间关系的研究。Dickerson等人,“Altered GABAergic function accompanieshippocampal degeneration in mice lacking ClC-3voltage-gated chloridechannels”Brain Research 958:227-250(2002)。本文提出的电生理研究发现CLC-3通道介导海马CA3锥体神经元中的Cl^-电流，葡萄糖酸钠强烈抑制CLC-3通道。此外，数据还显示，在诱导癫痫活动后，CLC-3通道在新生的海马切片中上调，葡萄糖酸钠可以消除增加的氯化物电流。

因此，CLC-3通道明显参与新生儿癫痫发生。支持这些观察，已经发现CLC-3通道在人神经胶质瘤细胞中高度表达，并且可被葡萄糖酸盐阻断。Olsen等人，“Expression ofvoltage-gated chloride channels in human glioma cells”The Journal ofNeuroscience：the official journal of the Society for Neuroscience 23：5572-5582(2003)。此外，据报道，神经胶质瘤和癫痫之间的高发病率是显然的，并且Cl^-内环境稳定的失调与胶质瘤相关性癫痫有关。Buckingham等人，“Glutamate release by primarybrain tumors induces epileptic activity”Nature Medicine 17：1269-1274(2011)；和Pallud等人，“Cortical GABAergic excitation contributes to epileptic activitiesaround human glioma”Sci Transl Med 6：244ra289(2014)。总之，这些研究结果表明，Cl^-通道与新生儿癫痫发生之间存在潜在联系。作为CLC-3通道的有效抑制剂，葡萄糖酸盐可能是以前未知的用于治疗新生儿癫痫的抗癫痫药物。

一致地，本文呈现的数据显示海马切片中CA3锥体神经元中电压依赖性的外向整流Cl^-电流。见图5A，左图。例如，在施加NaGcA(20mM)后，Cl^-电流显著降低。见图5A，右图。NaGcA前后Cl^-电流的I-V曲线的定量数据分析。参见图5B。为了直接测试电压敏感性Cl^-电流是否由CLC-3 Cl^-通道介导，将CLC-3特异性抗体引入滴定溶液中以阻断CLC-3通道。Wang等人，“Functional effects of novel anti-ClC-3 antibodies on native volume-sensitive osmolyte and anion channels in cardiac and smooth muscle cells”American Journal Of Physiology.Heart and circulatory physiology 285:H1453-1463(2003)；以及Duan等人,“Functional inhibition of native volume-sensitiveoutwardly rectifying anion channels in muscle cells and Xenopus oocytes byanti-ClC-3antibody”The Journal Of Physiology 531:437-444(2001)。

事实上，CLC-3抗体(1：100)透析10分钟后，外向整流的Cl^-电流大大降低，但对照IgG透析神经元无明显变化。参见图5C。定量地，在对照条件下Cl^-电流密度在90mV时为36.2±1.4pA/pF(n＝10个细胞，来自4只小狗)，IgG组为33.5±2.3pA/pF(n＝10个细胞，来自3只小狗)，但在CLC-3抗体组降低至13.7±2.3pA/pF(n＝11个细胞，来自4只小狗；P<0.001，采用Tukey事后检验(post hoc tests)的单因素ANOVA)。参见图5D。因此，CA3锥体神经元中的Cl^-电流主要由CLC-3通道介导，与以前在CLC-3-/-海马神经元中发现的一致。

还测试了NaGcA以确定该化合物是否可以特异性抑制CLC-3通道。用CLC-3-EGFP质粒转染HEK293T细胞，用CLC-3特异性抗体确认CLC-3通道的表达。参见图5E，和Matsuda等人,“Overexpression of CLC-3in HEK293T cells yields novel currents that are pHdependent”American Journal Of Physiology.Cell physiology 294:C251-262(2008)。全细胞记录也显示在CLC-3转染的HEK 293T细胞中大的外部整流电流(对照，在+90mV时为1012±123pA，来自2批培养物n＝7个细胞)，但在EGFP-转染的对照细胞中没有观察到电流。见图5F。此外，20mM NaGcA的施用显著降低了CLC-3介导的Cl^-电流(NaGcA，+90mV时为544±59pA，来自2批次n＝7个细胞；与对照相比，P<0.004，成对t检验)，其在NaGcA清除后也是可逆的(925±124pA，在+90mV，n＝7个细胞，两批次；与对照组相比P>0.4，成对t检验)。见图5F,G。总之，这些数据表明，NaGcA是CLC-3 Cl^-通道的有效抑制剂，其介导CA3锥体神经元中的主要外向整流Cl^-电流。

F.CLC-3通道的癫痫基因上调

为了确定CLC-3通道是否参与癫痫发生，在P8-P12新生儿脑切片中诱导癫痫活动前后，测定CLC-3表达水平。将海马切片在不含Mg²⁺aCSF中孵育1小时以诱导癫痫活动，然后进行CLC-3免疫染色以检测CLC-3表达水平。将对照切片在正常aCSF中相应地孵育1小时。有趣的是，与对照相比，海马CA3锥体层中的CLC-3免疫反应性显示在0Mg²⁺处理的切片中显著增加。参见图6A，B；对照，11.2±1.5a.u.，n＝10片，来自4只小狗；0Mg²⁺，20.4±2.8a.u.，n＝11切片，来自4只小狗；P<0.02，Student t检验。通过蛋白质印迹(Western印迹)进一步证实CLC-3的这种升高的表达水平。参见图6C，D。因此，CLC-3通道在新生儿癫痫切片中上调。

此外，膜片钳记录直接测量对照和0Mg²⁺处理的切片中CA3锥体神经元的Cl^-电流。与免疫染色和蛋白质印迹结果一致，全细胞记录也显示0Mg²⁺处理的神经元中Cl^-电流显著增加。见图6E，F；对照，在+90mV时为31.2±1.8pA/pF，来自3只小狗的n＝15个细胞；0Mg²⁺，42.2±2.4pA/pF，来自3只小狗的n＝15个细胞；P<0.001，采用Tukey事后检验的单因素ANOVA。此外，NaGcA显著抑制0Mg²⁺处理后大部分Cl^-电流，参见图6E，F；NaGcA，7.3±0.6pA/pF，来自2只小狗的n＝11个细胞；P<0.001，采用Tukey事后检验的单因素ANOVA。这些结果表明，CLC-3通道可能在新生儿癫痫发生过程中起作用。

G.新生儿癫痫发作抑制

为了诱导新生儿癫痫发作，使用常用的KA模型。将KA(2mg/kg，i.p.)注射到P10-P12新生小鼠中，引起强烈的癫痫发作，如通过体内EEG记录显示的。参见图7A，B。当KA注射后10分钟注射NaGcA(2g/kg，i.p.)时，基本上消除了癫痫发作活动。参见图7C，D。功率分析证实，NaGcA注射显著抑制了功率的振幅。参见图7E，F。这些数据显示NaGcA是一种有效的体内抗新生儿癫痫药物。

H.成年癫痫发作抑制

确定NaGcA是否也可以用于治疗成年癫痫。初步数据显示，KA惊厥模型死亡率高。然而，类似的PTZ模型导致成年小鼠中可靠的癫痫发作。参见图8A。数据显示，NaGcA延长了由PTZ诱导的癫痫发作突发的潜伏期，但并没有与新生动物一样有效地抑制癫痫突发活动。见图8。因此，NaGcA可能是独特的抗癫痫药物，其治疗新生癫痫发作比成年癫痫更有效。

I.氯化物离子通道阻断剂全细胞抑制

一个相关的问题是，抑制新生儿癫痫发作的其他Cl^-通道阻断剂，如NPPB和NFA，也阻止Cl^-离子通道相关活动。参见图9和图10。在一个实施方案中，本发明考虑包括但不限于葡萄糖酸盐，NPPB，尼氟酸，DIDS，氟芬那酸的化合物在抑制新生儿癫痫发作中可起类似的作用。尽管没有必要了解发明的机制，但据信通过氯化物离子通道抑制可能发生新生儿癫痫发作抑制。

IV.葡萄糖氧化酶为基础的惊厥疗法

在一个实施方案中，本发明考虑了可以将葡萄糖氧化酶用作抑制癫痫发作活动(seizure activity)的抗惊厥药。尽管没有必要理解本发明的机理，但是据信葡萄糖氧化酶将葡萄糖转化为葡糖酸盐(同上)，本文已显示其降低癫痫样活动。本文提供的数据表明，葡萄糖酸可能通过阻断CLC-3 Cl^-通道，对发育中的大脑的癫痫发作活动具有很强的抑制作用。数据还表明葡萄糖氧化酶(GOx)，一种将葡萄糖氧化为葡萄糖酸的酶，在新生小鼠的海马切片中也具有抗癫痫样活动。

世界人口中约有1％患有癫痫病。尽管癫痫患者的许多癫痫发作可以通过药物部分地得到控制，但约有三分之一的癫痫患者对抗癫痫药有抗药性。Sada等人，“Epilepsytreatment.Targeting LDH enzymes with a stiripentol analog to treat epilepsy”Science 347:1362-1367(2015)；和Juge等人,“Metabolic control of vesicularglutamate transport and release”Neuron 68:99-112(2010)。幸运的是，在过去几年中开发了几种新的抗癫痫药物，对那些耐药的患者显示出一些其他作用。Bialer等人，“Keyfactors in the discovery and development of new antiepileptic drugs”NatureReviews:Drug Discovery 9:68-82(2010)。不幸的是，没有专门开发用于抑制新生儿癫痫发作的新药。

例如，苯巴比妥，一种GABA受体激动剂，于1912年被发现，它是最古老的但现在仍是治疗新生儿癫痫的首选药物，但限于仅仅50％的疗效并且表现出多种副作用。Chamberlain等人，“Lorazepam vs diazepam for pediatric status epilepticus:arandomized clinical trial”JAMA 311:1652-1660(2014)；Painter等人,“Phenobarbitalcompared with phenytoin for the treatment of neonatal seizures”The NewEngland Journal Of Medicine 341:485-489(1999)；以及Khanna等人,“Limitations ofCurrent GABA Agonists in Neonatal Seizures:Toward GABA Modulation Via theTargeting of Neuronal Cl^(-)Transport”Front Neurol 4:78(2013)。视频-EEG(脑电图)研究表明，苯巴比妥抑制脑电图癫痫样活动的效力小于临床上明显的惊厥。临床症状和电子照相记录之间的差异称为“电子临床分离(electroclinical dissociation)”，在经过抗惊厥治疗后的新生儿中可以达到80％。Glykys等人，“Differences in cortical versussubcortical GABAergic signaling:a candidate mechanism of electroclinicaluncoupling of neonatal seizures”Neuron 63:657-672(2009)。

因此，一些研究表明，苯巴比妥可以解决由于镇静引起的癫痫发作的临床症状，而没有纠正发育中的大脑中潜在的异常癫痫样活动，这可能导致高估了苯巴比妥的真正功效。Boylan等人，“Phenobarbitone,neonatal seizures,and video-EEG”Arch Dis ChildFetal Neonatal Ed 86:F165-170(2002)。另外，禁食和生酮饮食疗法长期以来一直用于治疗癫痫发作，并且仍主要用于治疗儿童难治性癫痫。但是，对禁食/生酮饮食作用的机制尚未完全了解。Zupec-Kania等人,“An overview of the ketogenic diet for pediatricepilepsy”Nutr Clin Pract 23:589-596(2008)。

通常认为，禁食或生酮饮食疗法会迫使人体燃烧脂肪而不是碳水化合物。通常，碳水化合物(例如葡萄糖)是用来产生人体三磷酸腺苷(ATP)主要能源尤其是对于大脑的主要能量物质。但是，当缺乏碳水化合物时，据信脂肪会在肝脏中转化为酮体，其中酮体会进入大脑并取代葡萄糖作为能源。据报道，这些酮体还可以抑制脑癫痫样活动。Lima等，“Neurobiochemical mechanisms of a ketogenic diet in refractory epilepsy”Clinics(Sao Paulo)69:699-705(2014)。对于大多数癫痫患者，已经提议使用生酮饮食会导致多种不良反应。Wheless JW，“The ketogenic diet:an effective medical therapywith side effects”Journal Of Child Neurology 16:633-635(2001):和Neal等人,“Theketogenic diet for the treatment of childhood epilepsy:a randomisedcontrolled trial”Lancet Neurol 7:500-506(2008)。因此，有必要开发替代治疗方法来治疗小儿癫痫。

因为生酮饮食显然通过强行改变患者的饮食成分而达到了控制癫痫的作用，并且本文的数据显示葡萄糖酸盐在体外和体内均对新生儿癫痫样活动具有强抑制作用，因此一种可能的机制是葡萄糖酸盐可以通过葡萄糖氧化酶氧化葡萄糖而局部产生。葡萄糖氧化酶是一种常见于几种真菌和昆虫中的酶，广泛用作食品添加剂。葡萄糖氧化酶(GOx)催化其中葡萄糖产生过氧化氢和葡萄糖酸内酯的反应，其中葡萄糖酸内酯可水解为葡萄糖酸。本文的数据表明，葡糖酸(例如，葡糖酸盐)抑制癫痫样活动。

为了测试GOx对新生儿癫痫样活动的影响，在海马切片水平截面中在CA3中记录了基线场电位(P10-12)，然后在通过0Mg²⁺诱导稳定癫痫样活动至少持续20分钟后将GOx添加到浴中。图20A。该数据表明，癫痫样活动被0.3U/ml GOx和1U/ml GOx显著抑制，但未被0.1U/ml Gox抑制(n＝8，p<0.001)。图20B-20D。

为了确认葡萄糖参与了该GOx介导的抑制作用，将葡萄糖替换为乳酸盐(5mM)和丙酮酸盐(3mM)，然后在0Mg²⁺aCSF中孵育，其中观察到GOx对于新生儿癫痫样活动没有作用。图20E。

通常认为，细胞外溶液中葡萄糖产生的葡萄糖酸的可获得浓度取决于酶活性和反应时间。因此，在低剂量的GOx(例如0.1U/ml)的存在下增加反应时间可能产生足够剂量的葡萄糖酸以抑制发育中大脑的癫痫样活动。例如，将0.1U/ml GOx在0Mg²⁺aCSF中孵育一(1)小时以上。图2F；用95％O₂/5％CO₂鼓气泡。这些数据表明，在孵育一(1)小时后，0.1U/ml GOx对新生小鼠脑切片中的癫痫样活动表现出强烈的抑制作用。图20F；参考图20B。应该注意的是，这些各种GOx浓度将平均功率降低了64.3±8.2％(0.3U/ml，n＝9，p<0.001)，83.3±2.2％(1U/ml，n＝6，p<0.001)和81.4±2.0％(0.1U/ml孵育1小时，n＝5，p<0.001)。图20G。

除了评估GOx对0Mg²⁺aCSF诱导的癫痫样活动的影响外，还确定GOx(1U/ml)是否可以抑制i)高K⁺或ii)4-氨基吡啶(4-AP)+0Mg²⁺aCSF诱导的新生儿癫痫样活动。数据证实1U/ml GOx还显示出有效抑制发育中的大脑海马切片(P10-12)中K⁺aCSF或4-AP+0Mg²⁺aCSF诱导的癫痫样活动。图21A-21C。因此，这些数据证明GOx具有强烈抑制新生儿癫痫样活动的活性。

V.CLC-3 Cl^-通道调节在发展中的神经元中大的向外整流电流

GABA功能的改变与癫痫密切相关。GABA功能可以通过细胞内Cl^-浓度([Cl^-]_i))来确定，因为GABAA受体(GABAA-R)被认为是配体门控的Cl^-通道。例如，以前的研究已经广泛地研究了Cl^-转运蛋白(例如KCC2和NKCC1)在调节[Cl^-]_i和因此GABA功能中的作用。然而，其他Cl^-通道可能如何影响[Cl^-]_i和GABA功能尚未得到很好的理解。

本文提供的数据考察了电压依赖性Cl^-通道是否有助于[Cl^-]_i内环境稳定和/或调节GABA功能。以前，记录电压依赖性Cl^-电流，显示来自新生小鼠(例如P8-12)的海马切片的CA3锥体神经元中大的外向整流Cl^-电流(3.3±0.3nA)。图11A，左上方图面。令人惊讶的是，这种依赖于电压的向外整流Cl^-电流在成年大脑(例如，P60-62)中显著降低。图11A和11B。这些数据表明脑发育过程中Cl^-通道的发展变化。我们从CA3锥体神经元记录的Cl^-电流类似于以前在培养的海马神经元中报道的电压依赖性CLC-3 Cl^-电流。Wang等人，“CLC-3channels modulate excitatory synaptic transmission in hippocampal neurons”Neuron 52：321-333(2006)；Huang等人，“Calcium-activated chloride channels(CaCCs)regulate action potential and synaptic response in hippocampal neurons”Neuron74：179-192(2012)。

为了测试CLC-3 Cl^-通道是否介导新生儿CA3神经元中的Cl^-电流，测试CLC-3特异性抗体用于阻断CLC-3通道。Wang等人，“Functional effects of novel anti-ClC-3antibodies on native volume-sensitive osmolyte and anion channels in cardiacand smooth muscle cells”American Journal Of Physiology。心脏和循环生理学285：H1453-1463(2003)；和Duan等人，“Functional inhibition of native volume-sensitiveoutwardly rectifying anion channels in muscle cells and Xenopus oocytes byanti-ClC-3 antibody”The Journal Of Physiology 531：437-444(2001)。实际上，使用CLC-3抗体(1:100)透析10分钟后，外向整流Cl^-电流大大降低，但在用预吸收对照抗体透析时没有明显变化。图11D。

此外，在CLC-3敲除小鼠中直接检查Cl^-电流。Huang等人，“ClC-3 deficiencyprotects preadipocytes against apoptosis induced by palmitate in vitro and intype 2 diabetes mice”Apoptosis：An International Journal On Programmed CellDeath 19：1559-1570(2014)；Liu等人，“ClC-3 deficiency prevents apoptosis inducedby angiotensin II in endothelial progenitor cells via inhibition of NADPHoxidase”Apoptosis：An International Journal on Programmed Cell Death 18：1262-1273(2013)；和Zheng等人，“Deficiency of volume-regulated ClC-3 chloride channelattenuates cerebrovascular remodeling in DOCA-salt hypertension”Cardiovascular Research 100：134-142(2013)。免疫染色证实在CLC-3 KO小鼠的CA3区域不存在CLC-3信号。图11E。因此，在CLC-3 KO小鼠的CA3神经元中，基本上不存在向外整流的Cl^-电流(WT，33.1±1.3pA/pF，n＝10；CLC-3KO，9.0±1.6pA/pF，n＝6)。图11F和11G。这些结果一起表明，CLC-3 Cl^-通道介导新生大脑中的大的向外整流Cl^-电流，但是在成年大脑中这种Cl^-电流显著降低。

进一步测试发现葡萄糖酸钠(NaGcA)作为阻断新生儿脑中Cl^-电流的有效抑制剂。图11A-C；绿色踪迹。在成年大脑或CLC-3 KO小鼠中，NaGcA对Cl^-电流没有影响。图11A，11B和11G。这些数据表明NaGcA可能是CLC-3通道的抑制剂。Olsen等人，“Expression ofvoltage-gated chloride channels in human glioma cells”The Journal ofNeuroscience：The Official Journal Of The Society For Neuroscience 23：5572-5582(2003)。

为了直接测试这个想法，CLC-3通道在HEK293T细胞中过表达，并用CLC-3特异性抗体结合证实表达。图11H和Matsuda等人，“CLC-3的过表达HEK293T细胞产生pH依赖性的新型电流“American Journal Of Physiology”。Cell Physiology 294：C251-262(2008)。全细胞记录显示在CLC-3转染的HEK293T细胞(1012±123pA，n＝7)中大的外向整流Cl^-电流，但在EGFP转染的对照细胞中并不是这样。图11I。此外，20mM NaGcA的施用显著降低了CLC-3通道介导的Cl^-电流。图11I和11J。因此，本数据鉴定NaGcA为CLC-3 Cl^-通道的有效抑制剂。

在存在或不存在二价阳离子(例如钙或镁)的情况下，葡萄糖酸盐可以抑制Cl^-电流。本文提供的数据比较葡萄糖酸钠、葡萄糖酸镁和葡萄糖酸之间的Cl^-电流抑制的功效。数据表明，所有三个抗衡离子都观察到等效的Cl^-电流抑制。图17A-E。因此，这些数据表明，它是葡萄糖酸，而不是它所携带的阳离子，是有效成分。以前使用葡萄糖酸盐的研究经常将临床效果归因于其所携带的阳离子，葡萄糖酸被认为仅仅是食品/药物添加剂，而不是主效应物。数据表明，这样的解释在本领域中是不正确的，更具体地说，二价阳离子不是葡萄糖酸盐具有抗癫痫功效的必需组分。

VI.CLC-3通道和新生儿癫痫

为了理解CLC-3通道在新生儿癫痫中的功能作用，通过用0Mg²⁺人造脑脊髓液(aCSF)处理新生儿脑切片，在诱导癫痫样活动后测定CLC-3通道表达水平。

不含Mg²⁺aCSF诱导的癫痫活动显著上调新生儿脑切片中的CLC-3通道表达(例如P8-P12)。图12A和12B；对照：11.2±1.5人工单位(n＝10)；0Mg²⁺：20.4±2.8人工单位(n＝11)；P<0.02，Student’st检验。通过蛋白质印迹进一步证实了癫痫样活动后CLC-3通道表达的上调。图12C和12D。此外，膜片钳记录也显示诱导癫痫样活动后向外整流Cl^-电流显著增加，NaGcA的施用显著阻断了Cl^-电流。图12E和12F；对照：31.2±1.8pA/pF(n＝15)；0Mg²⁺：42.2±2.4pA/pF(n＝15)；NaGcA：7.3±0.6pA/pF(n＝11)；P<0.001，采用Tukey事后检验的单因素ANOVA。这些结果表明CLC-3通道可能在新生儿癫痫中起作用。

为了直接测试这一假设，用NaGcA抑制CLC-3通道，并检查对癫痫活动的影响。值得注意的是，数据显示，NaGcA对来自幼崽出生后动物(P6-12)的脑切片产生有效的抗癫痫作用。图12G，12H，12I和12J。然而，NaGcA的抗癫痫作用在老龄动物中变得远远更小，例如大约一个月龄的动物(例如，P26)。图12K和12L。定量上，NaGcA抑制了早期出生后动物癫痫样活动的平均功率的60％(P6-8：59.6±4.3％(n＝10)；P10-12：62.1±3.8％(n＝10)；P<0.001，成对t检验)。然而，在老龄动物中，断奶后功率仅减少20％(P21-33：23.8±4.1％(n＝7)；p<0.005，成对t检验)。图12M。NaGcA抑制新生儿和成年动物癫痫活动之间的这种显著差异与NaGcA对不同年龄动物CLC-3 Cl^-电流的相对抑制是一致的，这表明CLC-3通道可能在新生儿癫痫中起作用。

为了进一步考察CLC-3通道在癫痫样活动中的功能作用，癫痫样突发活动可由CLC-3 KO小鼠海马切片中不含Mg²⁺aCSF诱导，但与WT小鼠比较时保持更加短的时间期。有趣的是，当来自WT小鼠的海马切片用NaGcA预处理以阻断CLC-3通道时，癫痫样活动也没有持续很长时间，模拟了在CLC-3 KO小鼠中观察到的。图12N和12O。定量数据显示，当CLC-3通道被抑制或敲除时，突发潜伏期显著延长，总突发活动显著降低。图12P。总之，这些数据表明CLC-3 Cl^-通道可能在早期发育中的大脑中的癫痫发生过程中起作用。

还调查了NaGcA对新生癫痫活动的影响是否可以一般适用于除了0Mg²⁺模型的其他癫痫模型。例如，将K⁺通道阻断剂4-AP(50μM)加入到浴溶液中以在浸入的海马切片中诱导强烈的癫痫突发活动。图13A。将20mM NaGcA加入到4-AP溶液中显著降低癫痫活动，其在NaGcA清除后是可逆的。图13A，13B和13C。NaGcA降低功率振幅70.2±5.3％(n＝9)。(P<0.001，成对t检验)。还使用升高的细胞外K⁺(8.5mM)来引起癫痫突发活动。图13D。类似地，在高K⁺aCSF中加入20mMNaGcA也显著降低了癫痫突发活动。图13D，13E和13F。NaGcA使功率振幅降低了70.8±4.9％(n＝5)。(P<0.001，成对t检验)。总之，这些结果表明NaGcA可以有效抑制各种癫痫模型中的新生儿癫痫。

VII.葡萄糖酸盐抑制新生儿癫痫

在一个实施方案中，本发明考虑包括用葡萄糖酸盐化合物治疗新生儿癫痫的方法。在一个实施方案中，葡萄糖酸盐化合物被全身施用。

例如，新生大鼠服用葡萄糖酸盐以确定对新生和成年动物体内癫痫发作的影响。为了诱发癫痫发作，将神经毒素红藻氨酸(KA)(2mg/kg，i.p.)注射到新生大鼠(P10-12)中以引发强烈的发作活动，如体内EEG记录所揭示的。图14A和14B；Dzhala等人，“NKCC1transporter facilitates seizures in the developing brain”Nature Medicine 11:1205-1213(2005)。此外，当KA注射后10分钟注射NaGcA(2g/kg，腹膜内)时，在新生动物中基本上消除了癫痫发作活动。图14C和14D。

葡萄糖酸盐的抗癫痫作用也与先前报道的抗惊厥药物如苯巴比妥和布美他尼在新生动物中进行了比较。苯巴比妥是目前治疗新生儿癫痫发作的首选药物，尽管只有约50％的功效和潜在的负面神经发育后果。Slaughter等人，“Pharmacological treatmentof neonatal seizures：asystematic review”Journal of Child Neurology 28：351-364(2013)。布美他尼是一种有效的袢利尿剂，目前正在作为前瞻性抗癫痫药物进行评估。Loscher等人,“Cation-chloride cotransporters NKCC1 and KCC2 as potentialtargets for novel antiepileptic and antiepileptogenic treatments”Neuropharmacology 69:62-74(2013)。虽然苯巴比妥和布美他尼都能在新生动物中以一定程度抑制癫痫活动，但其抑制作用并不如葡萄糖酸那样有效。参看图14E-14H与图14C和14D。定量地，当在注射KA后2小时记录期间的最后30分钟内计算EEG功率时，分别地，NaGcA组的相对功率降低了72.3％，苯巴比妥组中降低了35.5％，布美他尼组降低了54.3％。图14M。因此，葡萄糖酸盐似乎是一种有效的抗癫痫药物，用于治疗新生儿癫痫发作。

在成年动物中也比较了葡萄糖酸盐的抗癫痫作用。与新生动物癫痫发作的强烈抑制不同，葡萄糖酸盐对成年癫痫发作活动的抑制作用较小。图14I-14L和14N。这些数据与脑切片记录结果一致。图14G-14M。另外，测试了新生动物，关于NaGcA对KA诱导的稳定性癫痫活动的影响，发现在注射KA后1小时，NaGcA仍然抑制癫痫发作活动。图15。因此，这些数据可以得出NaGcA是治疗新生儿癫痫发作的有效药物的结论。

VIII.CLC-3通道调节癫痫发生过程中的Cl^-内环境稳定

虽然没有必要了解本发明的机制，但据信[Cl^-]_i的变化可能代表新生儿癫痫中CLC-3通道的至少一种分子机制，因为CLC-3通道是电压依赖性的向外整流Cl^-通道。例如，癫痫突发活动经常持续10多秒。图16A。

为了研究这种持续性癫痫样突发对GABA功能的影响，进行短杆菌肽穿孔全细胞记录，以保持新生动物中细胞内的Cl^-完整。在模拟癫痫样突发活动的膜去极化移位(40mV，10s)之前和之后由受体激动剂异四氢烟酸(isoguvacine)(100μM,50ms)诱导的GABAA受体(GABAA-R)电流。有趣的是，GABAA-R电流在WT的膜去极化移位后显著增加，但在CLC-3 KO神经元中不增加，也不存在CLC-3通道阻断剂NaGcA。图16B和16C。这些数据表明，CLC-3通道可能调节新生动物癫痫发生过程中的GABA功能。

为了进一步测试这一想法，用新生小鼠脑切片(例如P8-P9)中的短杆菌肽穿孔全细胞记录直接测量了控制GABA兴奋性与抑制功能的GABAA-R逆转电位(EGABA)。正如预期的那样，用0Mg²⁺aCSF处理海马切片1小时(aCSF：-59.2±2.0mV，n＝13；0Mg²⁺：-48.2±1.1mV，n＝10)后，癫痫样活动诱导EGABA的大的去极化移动。图16D。与对照EGABA(虚线)相比，使用布美他尼(Bum，10μM)，在低浓度下的NKCC1的特异性阻断剂，诱导EGABA的超极化移位(蓝线)。图6E。这些结果与NKCC1将Cl^-导入神经元细胞的报道一致。Kaila等人，“Cation-chloride cotransporters in neuronal development,plasticity and disease”NatureReviews.Neuroscience 15:637-654(2014)；Dzhala et al.,“NKCC1 transporterfacilitates seizures in the developing brain”Nature Medicine 11:1205-1213(2005)；and Loscher et al.,“Cation-chloride cotransporters NKCC1 and KCC2 aspotential targets for novel antiepileptic and antiepileptogenic treatments”Neuropharmacology 69:62-74(2013)。然而，在布美他尼的存在下，癫痫样活动仍然引起EGABA的去极化移位，这表明在癫痫发生期间不是NKCC1的因子调节着EGABA。图16E，黄线；Bum，-68.0±1.7mV(n＝9)；0Mg²⁺+Bum，-50.2±1.4mV(n＝9)；(p<0.002)。

用KCC2阻断剂VU0240551(10μM)治疗不影响新生动物的EGABA。图16F，紫线；-60.8±1.9mV(n＝6)。这些数据可能被解释为由于早期KCC2的低表达水平。癫痫活动也引发了EGABA的正位移。图16F，橙线；-48.9±1.3mV(n＝8)。因此，新生动物中癫痫样活动诱导的EGABA位移不受NKCC1或KCC2的控制。

另一方面，当用NaGcA(20mM)抑制CLC-3 Cl^-通道时，当暴露于0Mg²⁺aCSF时，EGABA不进一步改变。图16G；0Mg²⁺+NaGcA：-59.3±1.7mV(n＝6)。此外，在CLC-3 KO小鼠中，EGABA在0Mg²⁺aCSF中也没有变化。图16H；CLC-3 KO+0Mg²⁺：-55.6±2.1mV(n＝10)。另外，在CLC-3KO小鼠中施用NaGcA对0Mg²⁺aCSF的EGABA无影响(-56.6±2.4mV，n＝5)。用NaGcA抑制CLC-3通道或敲除CLC-3，在正常条件下没有改变正常的EGABA。图16G；NaGcA：-60.3±0.9mV(n＝5)；CLC-3 KO：-55.4±2.9mV(n＝9)。

因此，这些结果表明，CLC-3 Cl^-通道在新生动物癫痫发生过程中起控制EGABA的作用。然而，在老龄动物(例如，P30-90)中，在NaGcA存在下，0Mg²⁺aCSF仍然诱导EGABA的大的去极化位移。图16J。这些数据与成年动物中CLC-3通道介导的外向整流Cl^-电流实质降低的观察结果一致。图16A。

除EGABA外，在新生动物(例如P8-9)中考察了不同药物对癫痫发生过程中GABA诱导的神经元活动的影响。为了精确测量GABA诱导的神经元活动，通过局部施用GABAA-R激动剂异四氢烟酸(10μM，30s)引发细胞附着的记录监测的棘波发射。Tyzio等人，“Maternaloxytocin triggers a transient inhibitory switch in GABA signaling in thefetal brain during delivery”Science 314：1788-1792(2006)。大多数静息CA3锥体神经元对异四氢烟酸没有反应。图16K，对照，(n＝32)。然而，在0Mg²⁺处理后，68％的神经元在异四氢烟酸施用时显示出棘波活动。图16K，0Mg²⁺(n＝19)。用布美他尼阻断NKCC1或用VU0240551阻断KCC2没有改变由异四氢烟酸引发的刺激活动。图16K；0Mg²⁺+Bum(n＝19)；和0Mg²⁺+VU(n＝21)。相比之下，施用NaGcA抑制CLC-3 Cl^-通道基本上消除了在0Mg²⁺处理后由异四氢烟酸诱导的刺激活性。图16K；0Mg²⁺+NaGcA(n＝18)。这些观察结果的量化数据如图4L所示。

这些数据表明新生动物中CLC-3 Cl^-通道的激活增加了癫痫发生过程中的GABA兴奋性活动，阻断CLC-3通道是通过减少兴奋性GABA活动来抑制新生儿癫痫发作的有效途径。

IX.药物制剂和/或组合物

本发明还提供药物组合物(例如，包含上述化合物)。本发明的药物组合物可以以多种方式施用，这取决于是否需要局部或全身治疗以及待治疗的区域。施用可以是局部的(包括眼睛和粘膜，包括阴道和直肠递送)，肺部(例如通过吸入或吹入粉末或气溶胶，包括喷雾器，气管内，鼻内，表皮和透皮)，口服或肠胃外施用。肠胃外施用包括静脉内，动脉内，皮下，腹膜内或肌内注射或输注；或颅内，例如鞘内或脑室内施用。特别地，葡萄糖酸钠的肌内注射和/或静脉内注射可在无菌盐水溶液中以1-100mM葡萄糖酸盐的近似浓度范围递送。尽管不需要理解本发明的机理，但据信这些浓度范围是可以实现的，因为葡萄糖酸钠是高度水溶性的。

用于局部施用的药物组合物和制剂可以包括透皮贴剂，软膏剂，洗剂，霜剂，凝胶剂，滴剂，栓剂，喷雾剂，液体和粉剂。常规的药物载体，水性，粉末或油性基质，增稠剂等可能是必需或需要的。

用于口服施用的组合物和制剂包括粉末或颗粒，水或非水介质中的悬浮液或溶液，胶囊，小药囊或片剂。增稠剂，调味剂，稀释剂，乳化剂，分散助剂或粘合剂可能是期望的。

用于肠胃外，鞘内或心室内施用的组合物和制剂施用可以包括无菌水溶液，其也可以含有缓冲剂，稀释剂和其它合适的添加剂，例如但不限于渗透促进剂，载体化合物和其它药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明的药物组合物包括但不限于溶液，乳剂和含脂质体制剂。这些组合物可以由各种组分产生，包括但不限于预成型液体，自乳化固体和自乳化半固体。

可以方便地以单位剂量形式存在的本发明的药物制剂可以根据制药工业中熟知的常规技术制备。这些技术包括使活性成分与药物载体或赋形剂结合的步骤。通常，制剂通过如下制备：将活性成分与液体载体或细分散的固体载体或两者均匀且直接地结合，然后如果需要，使产品成形。

本发明的组合物可以配制成许多可能的剂型中的任何一种，例如但不限于片剂，胶囊，液体糖浆，软凝胶，栓剂和灌肠剂。本发明的组合物也可以配制成水性，非水性或混合介质中的悬浮液。水性悬浮液可以进一步含有增加悬浮液粘度的物质，包括例如羧甲基纤维素钠，山梨糖醇和/或葡聚糖。悬浮液还可以含有稳定剂。

在本发明的一个实施方案中，药物组合物可以配制并用作泡沫。药物泡沫包括制剂，例如但不限于乳剂，微乳液，霜剂，果冻和脂质体。虽然本质上类似，这些制剂在最终产品的成分和一致性方面不同。

增强细胞水平的寡核苷酸吸收的试剂也可以加入到本发明的药物和其它组合物中。例如，阳离子脂质，例如阳离子脂质体(lipofectin)(美国专利号5,705,188)，阳离子甘油衍生物和聚阳离子分子如聚赖氨酸(WO 97/30731)也增强了细胞摄取寡核苷酸。

本发明的组合物可以另外含有通常在药物组合物中发现的其它助剂组分。因此，例如，组合物可以含有额外的，相容的药物活性物质，例如止痒药，收敛剂，局部麻醉剂或抗炎剂，或可含有用于物理配制本发明组合物的各种剂型的其它物质，如染料，调味剂，防腐剂，抗氧化剂，遮光剂，增稠剂和稳定剂。然而，当添加时，这些材料不应该不适当地干扰本发明组合物的组分的生物活性。制剂可以灭菌，并且如果需要，与助剂(例如润滑剂，防腐剂，稳定剂，润湿剂，乳化剂，用于影响渗透压的盐，缓冲剂，着色剂，调味剂和/或芳族物质等)混合，其不同与制剂的核酸有害地相互作用。

剂量取决于要治疗的疾病状态的严重性和反应性，治疗过程持续数天至数月，或直至实现治愈或实现疾病状态减少。最佳剂量计划可以通过患者体内药物积累的测量来计算。给药医师可以容易地确定最佳剂量，施用方法和重复率。取决于各个寡核苷酸的相对效力，最佳剂量可以变化，并且通常可以基于在体外和体内动物模型中发现有效的EC_50S或基于本文所述的实施例来估计。通常，每kg体重的剂量为0.01μg至100g，并且可以每天，每周，每月或每年施用一次或多次。治疗医师可以基于体液或组织中测定的药物停留时间和浓度来估计施用的重复率。成功治疗之后，可能需要使受试者进行维持治疗以预防疾病状态的复发，其中所述化合物以维持剂量施用，每公斤体重0.01μg至100g，每天一次或多次，至每20年一次。

X.药物输送系统

本发明考虑到几种药物递送系统，其提供大致均匀的分布，具有可控的释放速率。以下描述了在制备药物递送系统中有用的各种不同的介质。任何一种介质或载体都不意在限制本发明。注意，任何介质或载体可以与另一介质或载体组合；例如，在一个实施方案中，与化合物附着的聚合物微粒载体可以与凝胶介质组合。

本发明考虑的载体或介质包括选自明胶，胶原，纤维素酯，硫酸葡聚糖，多聚硫酸戊糖，壳多糖，糖，白蛋白，纤维蛋白密封剂，合成聚乙烯吡咯烷酮，聚环氧乙烷，聚环氧丙烷，聚氧乙烷和聚氧丙烷的嵌段聚合物，聚乙二醇，丙烯酸酯，丙烯酰胺，甲基丙烯酸酯，包括但不限于甲基丙烯酸2-羟乙酯，聚(原酸酯)，氰基丙烯酸酯，明胶-间苯二酚-醛型生物粘合剂，聚丙烯酸及其共聚物和嵌段共聚物。

本发明的一个实施方案考虑了包括本文所述的治疗剂的药物递送系统。

微粒

本发明的一个实施方案考虑了包含微粒的介质。优选地，微粒包括脂质体，纳米颗粒，微球，纳米球，微胶囊和纳米胶囊。优选地，本发明考虑的一些微粒包括聚(丙交酯-共-乙交酯)，脂族聚酯，包括但不限于聚乙醇酸和聚乳酸，透明质酸，改性多糖，壳聚糖，纤维素，葡聚糖，聚氨酯，聚丙烯酸，伪-聚(氨基酸)，聚羟基丁酸酯相关共聚物，聚酐，聚甲基丙烯酸甲酯，聚(环氧乙烷)，卵磷脂和磷脂。

脂质体

本发明的一个实施方案考虑了能够附着和释放本文所述治疗剂的脂质体。脂质体是由两亲分子如磷脂制成的包围水性核心的微观球形脂质双层。例如，脂质体可以在磷脂胶束的疏水尾部之间捕获治疗剂。水溶性药剂可以被捕获于核心中，脂溶性药剂可以溶解在壳状的双层中。脂质体具有特殊的特征，因为它们使得水溶性和水不溶性化学物质能够一起使用在介质中而不使用表面活性剂或其它乳化剂。脂质体可以通过在水介质中强力混合磷脂来自发形成。将水溶性化合物溶于能够水合磷脂的水溶液中。因此，在形成脂质体时，这些化合物被捕获在脂质体水溶液中心。作为磷脂膜的脂质体壁保持脂溶性物质如油。脂质体提供掺入的化合物的受控释放。此外，脂质体可以用水溶性聚合物如聚乙二醇包衣以增加药代动力学半衰期。本发明的一个实施方案考虑了超高剪切技术来改善脂质体生产，从而产生具有特定设计结构特征的稳定的单层的(单层)(unilamellar(singlelayer))脂质体。这些独特的脂质体属性，允许通常不混溶化合物的同时存储及它们的控制释放的能力。

在一些实施方案中，本发明考虑阳离子和阴离子脂质体以及具有中性脂质的脂质体。优选地，阳离子脂质体通过混合材料和脂肪酸脂质体组分并允许它们进行电荷缔合而包含带负电的材料。显然，阳离子或阴离子脂质体的选择取决于最终脂质体混合物的所需pH。阳离子脂质体的实例包括lipofectin，lipofectamine和lipofectace。

本发明的一个实施方案考虑了包含提供至少一种治疗剂的受控释放的脂质体的介质。优选地，能够控制释放的脂质体：i)是可生物降解和无毒的；ii)携带水和油溶性化合物；iii)溶解顽固化合物；iv)防止化合物氧化；v)促进蛋白质稳定；vi)控制水合；vii)通过双层组成的变化控制化合物释放，例如但不限于脂肪酸链长度，脂肪酸脂质组成，饱和和不饱和脂肪酸的相对量和物理形态；viii)具有溶剂依赖性；iv)具有pH依赖性，v)具有温度依赖性。

脂质体的组成大致分为两类。常规的脂质体通常是稳定的天然卵磷脂(PC)的混合物，其可以包含合成的同系链磷脂，其可以含有或可以不含有糖脂。特殊的脂质体可以包括：i)双极性脂肪酸；ii)附着用于组织靶向治疗抗体的能力；iii)涂覆有材料，例如但不限于脂蛋白和碳水化合物；iv)多重包封和v)乳液相容性。

脂质体可以通过诸如但不限于超声和振动的方法在实验室中容易地制备。或者，化合物-递送脂质体可商购。例如，Collaborative Laboratories,Inc.已知可制造定制设计的脂质体用于特定的交付要求。

微球、微粒和微胶囊

微球和微胶囊是有用的，因为它们具有维持大致均匀分布的能力，提供稳定的受控化合物释放，并且经济地生产和分配。优选地，相关联的递送凝胶或化合物浸渍的凝胶是透明的，或者，可选地，所述凝胶被着色以便于医务人员容易地观察。

微球可商购获得(

，Alkerme's：Cambridge，Mass.)。例如，将包含至少一种治疗剂的冷冻干燥的介质在合适的溶剂中匀化并喷雾以制备在20至90微米范围内的微球。然后遵循技术，以在净化，封装和储存阶段保持持续的释放完整性。Scott等人，Improving Protein Therapeutics With Sustained Release Formulations，NatureBiotechnology，第16卷：153-157(1998)。

通过使用可生物降解的聚合物改性微球组合物可以提供控制治疗剂释放速率的能力。Miller等人，Degradation Rates of Oral Resorbable Implants{Polylactatesand Polyglycolates:Rate Modification and Changes in PLA/PGA Copolymer Ratios,J.Biomed.Mater.Res.,Vol.II:711-719(1977)。

可选地，使用水中干燥法制备持续或控释微球制剂，其中首先制备可生物降解的聚合物金属盐的有机溶剂溶液。随后，向该可生物降解的聚合物金属盐溶液中加入溶解或分散的治疗剂的介质。治疗剂与可生物降解的聚合物金属盐的重量比可以为例如约1:100000至约1:1，优选约1:20000至约1:500，更优选约1:10000至约1:500。接下来，将含有可生物降解的聚合物金属盐和治疗剂的有机溶剂溶液倒入水相中以制备油/水乳液。然后将油相中的溶剂蒸发掉以提供微球体。最后，回收这些微球，洗涤并冻干。此后，可以在减压下加热微球以除去残留的水和有机溶剂。

用于制备与可生物降解的聚合物金属盐和治疗剂混合物相容的微球的其它方法是：i)逐渐加入凝聚剂期间的相分离；ii)水中干燥方法或相分离方法，其中加入抗絮凝剂以防止颗粒聚集，和iii)通过喷雾干燥方法。

在一个实施方案中，本发明考虑包含能够在约1天至6个月的持续时间内递送受控释放的治疗剂的微球或微胶囊的介质。在一个实施方案中，微球或微粒可以是着色的，以允许医师在分配时清楚地看到该介质的能力。在另一个实施方案中，微球或微胶囊可以是透明的。在另一个实施方案中，微球或微粒用不透射线的荧光染料浸渍。

可以通过使用已知的包封技术如离心挤出，锅包衣和空气悬浮来制备控释微胶囊。这样的微球体和/或微胶囊可被设计以实现期望的释放速率。例如，

(Macromed)是一种控释微球系统。这些特定的微球体可以均匀尺寸在5-500微米之间获得，由生物相容性和可生物降解的聚合物组成。微球的特定聚合物组合物可以控制治疗剂释放速率，使得定制的微球体是可能的，包括有效地管理突发效应。

(EpicTherapeutics，Inc.)是一种蛋白质-基质递送系统。该系统本质上是水性的，并且适用于标准药物递送模型。特别地，

是可递送小分子药物和大分子药物的生物可降解蛋白质微球体，并且可以针对微球体尺寸和期望的释放特性进行定制。

在一个实施方案中，微球或微粒包含在小于内部肠系膜pH的pH值下稳定的pH敏感的包封材料。内部肠系膜的典型范围是pH 7.6至pH 7.2。因此，微胶囊应保持在小于7的pH值。然而，如果预期pH变化，则可以基于微胶囊溶解所需的不同pH标准来选择pH敏感材料。因此，包封的化合物将被选择用于需要溶解并存储在预先选择的pH以保持稳定性的pH环境中。可用作胶囊用材料的pH敏感材料的实例为Eudragit L-100或S-100(Rohm GMBH)，羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯，羟丙基甲基纤维素乙酸酯琥珀酸酯，聚乙酸乙烯酯邻苯二甲酸酯，乙酸邻苯二甲酸纤维素和醋酸偏苯三酸纤维素。在一个实施方案中，脂质包含微胶囊的内涂层。在这些组合物中，这些脂质可以是但不限于脂肪酸和己二酸酐(hexitiolanhydride)的偏酯，以及食用脂肪如甘油三酯。Lew C.W.，Controlled-Release pHSensitive Capsule And Adhesive System And Method。美国专利号5,364,634(通过引用并入本文)。

在一个实施方案中，本发明考虑包含明胶或与明胶(即聚-L-赖氨酸)具有相似电荷密度的其它聚合阳离子的微粒，并且用作复合物以形成初级微粒。作为以下成分的混合物生产初级微粒：i)明胶(60布鲁姆(bloom)，来自猪皮的A型)，ii)硫酸软骨素4-硫酸盐(0.005％-0.1％)，iii)戊二醛(25％，1级)和iv)1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC盐酸盐)和超纯蔗糖(Sigma Chemical Co.，St.Louis，Mo.)。明胶的来源不被认为是关键的；它可以来自牛、猪、人或其他动物来源。通常，聚合阳离子为19,000-30,000道尔顿。然后将硫酸软骨素与硫酸钠或乙醇作为凝聚剂加入到配合物中。

在形成微粒之后，治疗剂直接结合到微粒表面，或者利用“桥”或“间隔基”间接附着。明胶赖氨酸基团的氨基易于衍生化，从而提供化合物直接偶联的位点。或者，间隔基(即，连接分子和靶向配体上的衍生化部分)例如抗生物素蛋白-生物素也可用于将靶向配体间接结合到微粒。微粒的稳定性由EDC盐酸盐诱导的戊二醛间隔物交联量控制。受控释放介质也由戊二醛-间隔物交联的最终密度经验确定。

在一个实施方案中，本发明考虑通过将包含纤维蛋白原或凝血酶与治疗剂的组合物喷雾干燥而形成的微粒。优选地，这些微粒是可溶的，并且所选择的蛋白质(即纤维蛋白原或凝血酶)产生微粒的壁。因此，将治疗剂掺入微粒的蛋白质壁内和之间。Heath等人，Microparticles And Their Use In Wound Therapy.美国专利号6,113,948(通过引用并入本文)。

在将微粒施加到活组织之后，纤维蛋白原和凝血酶之间的后续反应产生组织密封剂，从而将引入的化合物释放到直接周围区域。

本领域技术人员将理解，微球的形状不必是精确的球形；只能作为能够喷洒或扩散到外科手术部位(或打开或闭合)中的非常小的颗粒。在一个实施方案中，微粒由选自聚丙交酯，聚乙交酯和丙交酯/乙交酯(PLGA)的共聚物，透明质酸，改性多糖和任何其它公知材料的生物相容性和/或可生物降解材料组成。

试验

根据美国国家卫生研究院护理和使用实验动物的健康指南(the NationalInstitutes of Health Guide for the Care and use of Laboratory Animals)，美国宾夕法尼亚州立大学IACUC批准了细胞培养和脑切片的动物方案。对于成年小鼠或新生大鼠的体内实验，所有程序均按照动物研究伦理指导方针，分别由复旦大学或华南师范大学动物使用研究与教育委员会批准。动物室自动控制在12小时光/黑暗循环，水和食物随意可用。

实施例I

细胞培养和转染

如先前所述，从新生C57BL/6小鼠制备小鼠皮质神经元。Qi等人，“Cyclothiazideinduces robust epileptiform activity in rat hippocampal neurons both in vitroand in vivo”The Journal Of Physiology 571:605-618(2006)。简言之，将新生小鼠大脑皮质在冰冷的HEPES缓冲盐水溶液中切开，洗涤并用0.05％胰蛋白酶-EDTA在37℃下消化20分钟。在用含血清培养基灭活胰蛋白酶后，将细胞离心，重新悬浮，并以10,000个细胞/cm²的密度在24孔板中接种在单层皮层星形胶质细胞上。神经元培养基含有MEM(500ml，Invitrogen)，5％胎牛血清(Atlanta Biologicals)，10ml B-27补充剂(Invitrogen)，100mg NaHCO3，2mM Glutamax(Invitrogen)和25单位/ml青霉素&链霉素。加入AraC(4μM，Sigma)以抑制星形胶质细胞的过度增殖。将细胞培养物在37℃下保持在5％CO₂加湿的培养箱中14-21天。

将人胚肾(HEK)293T细胞维持在补充有10％FBS和25单位/ml青霉素/链霉素的DMEM中。PEI试剂盒(分子量25,000，Polysciences，Inc.)用于HEK细胞转染。简言之，将1μgDNA稀释到50μl的OptiMEM(Invitrogen)中，然后与4μl PEI(1μg/μl)混合，孵育5分钟，逐滴加入到含有500μl培养基的培养孔中。孵育5小时后，用新鲜培养基洗涤掉转染试剂。转染两天后，HEK293T细胞用于电生理研究。与eGFP质粒(pCLC3sGFP)融合的大鼠CLC-3短转录物购自Addgene(质粒#52423)。Li等人，“The ClC-3 chloride channel promotesacidification of lysosomes in CHO-K1 and Huh-7 cells”American Jjournal ofPhysiology“Cell Physiology 282：C1483-1491(2002)。

实施例II

细胞活力测定

使用含有乙啡啶同质二聚体-1(ethidium homodimer-1)和钙黄绿素-AM的LIVE/

Viability/Cytotoxicity Assay Kit(L3224,Life Technologies)来检测细胞活力。乙啡啶同质二聚体-1与细胞DNA结合，通常以红色荧光标记死亡细胞，而钙黄绿素-AM可以通过活细胞中的酯酶切割，产生强烈的绿色荧光。药物处理后，将神经元在含有1μM钙黄绿素-AM和4μM乙啡啶同质二聚体-1的浴溶液中在室温下孵育40分钟。通过量化绿色和红色荧光细胞的百分比来分别测量细胞存活和死亡率。对于每个组，每个盖玻片的至少5个区域被成像用于数据分析。

实施例III

小鼠脑切片准备

从C57BL/6小鼠(雄性和雌性)制备脑切片。将动物用Avertin(三溴乙醇，250mg/kg)麻醉并断头。通过Leica VT1200S振动切片机在冰冷人造脑脊髓液(aCSF)((mM)：125NaCl，26NaHCO₃，10葡萄糖，2.5KCl，2.5CaCl₂，1.25NaH₂PO₄和1.3MgSO₄，渗透压为290-300mOsm，用95％O₂/5％CO₂充气)中，制备海马水平切片(400μm)。然后将切片转移到含有用氧和二氧化碳的混合气体(carbogen)(95％O₂/5％CO₂)饱和的正常aCSF的培养箱中，在33℃下30分钟，然后在使用前在室温下回收1小时。将单个切片转移到浸没的记录室中，其中在31-33℃，它们用被95％O₂/5％CO₂饱和的aCSF持续灌注(2-3ml/min)(TC-324B，WarnerInstruments Inc)。使用装备有DIG光学器件的Olympus显微镜，用红外光学器件可视化切片。

实施例IV

电生理学

细胞培养

将培养的神经元置于记录室中，连续灌注浴溶液，该浴溶液的由如下组成(mM)：128NaCl，10葡萄糖，25HEPES，5KCl，2CaCl₂，1MgSO₄，用NaOH调节pH7.3且渗透压浓度为约300mOsm。为了记录电流钳模式下的自发射击，移液管内装有内标溶液，其含有(mM)：125K葡萄糖酸盐，5Na-磷酸肌酸，5EGTA，10KCl，10HEPES，4Mg-ATP，0.3Na-GTP，280-290mOsm，用KOH调节pH 7.3。培养的神经元中的癫痫样活动由10μM CTZ诱导24小时，或1μM KA诱导2小时或50μM 4-AP诱导2小时。突发活动如前所述定义。Qi等人，“Cyclothiazide induces robustepileptiform activity in rat hippocampal neurons both in vitro and in vivo”The Journal of Physiology 571：605-618(2006)。简而言之，在大去极化移位(≥10mV去极化和持续时间≥300ms)之上，至少有五个连续的动作电位叠加。

对于Cl^-电流记录，0Ca²⁺滴定溶液含有(mM)：125CsCl，5Na-磷酸肌酸，10HEPES，5EGTA，5TEACl,4MgATP(pH 7.3，用CsOH调节，280-290mOsm)。

为了分离Cl^-电流：(1)细胞外Na⁺被NMDG⁺代替，电压依赖性Na⁺通道被河豚毒素(TTX)阻断；(2)K⁺和Ca²⁺从浴溶液中除去；(3)在滴定溶液中用Cs⁺和四乙基铵(TEA)阻断K⁺通道，并在浴溶液用4-AP阻断；(4)将CdCl₂加入浴溶液中阻断Ca²⁺通道；(5)还包括印防己毒素(50μM)以阻断GABAA受体。因此，外部溶液含有以下(以mM计)：135NMDG-Cl，20HEPES，20葡萄糖，5 4-AP和2MgSO₄，补充有1μM TTX，200μM CdCl₂和50μM印防己毒素，渗透压～300mOsm，用95％O₂/5％CO₂充气后pH7.3-7.4。从0mV(ECl^-～0mV)的保持电位施加从-80到+90mV(10mV增量)的电压步长。使用MultiClamp 700A放大器和pCLAMP9软件(Molecular Devices)收集数据。

脑切片记录

用填充有外部溶液的玻璃电极(2-4MΩ尖端电阻)进行场电位记录。将玻璃电极放入CA3锥体层。对于电流钳(I＝0)记录，放大器设置为100x，带通滤波器为0.1-5KHz。所有记录在31-33℃进行。癫痫活动是通过不含Mg²⁺的aCSF诱发，或在aCSF中加入50μM 4-AP或8.5mM K⁺。

功率谱分析前采用Hamming窗功能。通过在药物施用之前、之中和之后的连续5分钟时间窗中将信号的均方根值在0.1至1000Hz的频带内积分来计算功率。为了避免切片到切片和电极接触的变化，在每个切片的药物施用之前将功率值归一化为对照条件，然后在不同切片之间进行平均以进行统计分析。

实施例V

免疫染色和蛋白质印迹(Western-Blot)

根据上述电生理学方案制备脑切片，以200微米厚用于免疫染色和以400微米厚用于蛋白质印迹。通常，将切片在室温下回收1小时，然后随机分成两组。将一组切片在正常aCSF中在33℃孵育1小时。将另一组切片在0Mg²⁺aCSF中在33℃孵育1小时。然后将切片在4℃下通过4％PFA固定过夜。

免疫染色

对于CLC-3染色，将切片用封闭溶液(0.3％Triton-X和0.1M PBS中的5％正常驴和山羊血清)预处理2小时，然后用CLC-3初级抗体孵育72小时(兔，1：200，Alomone，ACL-001)。将一些切片与兔IgG孵育作为对照。在含有0.01％triton-X的PBS中洗涤三次后，将脑切片与缀合Cy3的山羊抗兔二抗(1：500，Jackson ImmunoResearch)在室温下孵育2小时。将脑切片安装在具有抗褪色封片剂(mounting solution)(Invitrogen)的载玻片上。在奥林巴斯共焦显微镜系统(FV1000)上获得荧光图像。对于每个切片，CA3的至少2-3个区域成像。为了定量CA3锥体层中的CLC3荧光强度，使用NIH Image J软件分析共聚焦图像。

蛋白质印迹

在室温下回收1小时后，将400μm厚的海马切片随机分为两组，其与上述相同用于免疫染色。在冰冷的aCSF中解剖海马。用RIPA裂解缓冲液(含有1:100苯基甲基磺酰氟和1:200蛋白酶抑制剂)提取蛋白质。然后，将lx加载染料缓冲液(NuPAGE LDS样品缓冲液(4x))和1％β-ME加入到蛋白质样品中，并充分混合。将蛋白质提取物(每个泳道2μg/μ1，15μl)在55℃下煮沸20分钟，加载在10％凝胶上，使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在室温分离(70V，50分钟，然后切换到90V持续2小时)。然后将凝胶印迹到PVDF膜上。使用5％牛奶在含1％Tween-20的Tris缓冲溶液(1xTBS)中的溶液在室温下封闭印迹1小时。在4℃在旋转器上，在含有5％牛奶和1％Tween-20于1xTBS的封闭溶液中施用对CLC3(兔，1：300，Alomone，ACL-001)和GAPDH(兔，1：20000，Sigma，G9545)初级抗体过夜。然后将印迹与抗兔二抗在1:20000稀释下在室温下孵育1.5小时，使用1xTBS洗涤三次，然后用Odyssey扫描仪系统(Li-Cor Biosciences)对信号进行成像。

实施例VI

脑电图(EEG)记录

为测试葡萄糖酸盐在新生儿和成年啮齿动物中体内的抗癫痫作用，将P8-12Sprague-Dawley大鼠或2个月大的雄性C57BL/6小鼠用戊巴比妥钠(新生大鼠为50mg/kg，成年小鼠为100mg/kg，腹膜内注射)深度麻醉。将两根不锈钢螺丝(直径1毫米)插入脑皮层上方的头骨上，作为EEG记录电极，一个接地电极以及一个参比电极位于前边缘+1.8毫米，中线横向±0.5毫米，皮质表面下方1mm。将所有电极连接到微型连接器上并用牙科粘合剂固定在颅骨上。手术后，将新生大鼠返回它们的母亲，并在随后的脑电EEG记录前恢复2天。将成年小鼠单独装入住所，以防止植入电极的损伤，并允许在EEG记录前恢复至少5天。

记录EEG的基线0.5-1小时，使动物适应环境。腹膜内(i.p.)施用红藻氨酸(2mg/kg)用于新生儿癫痫诱导。KA施用后10分钟将D-葡萄糖酸钠盐(2g/kg)或0.9％生理盐水在i.p.注射。腹膜内注射戊四氮(PTZ)用于在成年小鼠中诱导稳定的癫痫突发活动，PTZ施用前10分钟，i.p.注射D-葡萄糖酸钠盐(1g/kg和2g/kg)或0.9％盐水。PTZ注射后监测癫痫样活动1小时。Qian等人，“Epileptiform response of CA1 neurones to convulsantstimulation by cyclothiazide，kainic acid and pentylenetetrazol inanaesthetized rats”Seizure 20：312-319(2011)。实验后，动物注射地西泮以保护动物免于复发性癫痫。

通过使用NeuroLog System(Digitimer Ltd，Hearts，UK)扩增(1000×)电生理信号并过滤(0-500Hz)，并通过D-A转换器，CED 1401micro(Cambridge Electronic Design，英国剑桥)可视化并储存于PC中。

EEG分析

通过功率谱分析揭示新生儿EEG信号中不同频率成分的功率水平。通过积分1～100Hz(EEG频带)的主频带的功率，在1分钟时间窗中计算功率。

通过spike 2软件分析成人EEG信号(CED 1401的分析程序，英国剑桥)。EEG棘波被定义为超过基线振幅的两倍，EEG突发定义为具有高频(>1Hz)和持续超过10s的高振幅多重棘波值。棘波或突发的潜伏期定义为从PTZ注射到第一个棘波或第一次突发的时间。

实施例VII

癫痫发作行为测试

将雄性小鼠分为三组：载体对照组(盐水，n＝9)，1g/kg葡萄糖酸钠组(n＝10)，D-葡萄糖酸钠2g/kg组(n＝11)。在药物治疗后1小时腹膜内施用PTZ(50mg/kg)。PTZ注射后，监测并观察行为1小时。癫痫发作行为根据Racine分数进行分类：阶段0，无响应；阶段1，面部惊厥；阶段2，点头；阶段3，前肢阵挛，尾垂直；阶段4，站立伴前肢阵挛；阶段5，站立并倒下，跳，一般阵挛性发作，一般阵挛和强直性癫痫发作或死亡。Racine等人，“Modification ofseizure activity by electrical stimulation 3，Mechanisms”ElectroencephalogrClin Neurophysiol 32：295-299(1972)。

实施例VIII

数据分析

数据显示为平均值±s.e.m。进行两组比较的Student t检验(成对或不成对)，并使用χ2检验比较两组之间的百分比差异。为了比较多组，使用事后检验单因素ANOVA。统计学显著性设置为P<0.05。

实施例IX

由葡萄糖氧化酶产生的癫痫样活动降低

该实施例显示初步数据，其表明葡萄糖氧化酶可有效抑制癫痫样活动。

从新生小鼠制备海马切片。癫痫样活动是由不含Mg ²⁺的aCSF(人工脑脊液)或高K⁺(8.5mM)aCSF引起的。将葡萄糖氧化酶(GGx)急性地应用到切片上，或在应用到切片之前在aCSF中预孵育90分钟。

数据表明，葡萄糖氧化酶剂量依赖性地抑制了0Mg2+aCSF诱导的癫痫样活动。图18A。还发现葡萄糖氧化酶可以抑制高K+诱导的癫痫样活动。图18B。

还测试了从4mM到20mM的不同葡萄糖浓度。当提供1单位葡萄糖氧化酶/ml时，观察到癫痫样活动的抑制。图19A。相反，急性应用(acute application)0.1单位葡萄糖氧化酶/ml并没有显著效果。图18A，最上一行。但是，在预孵育九十(90)分钟后，0.1U/ml葡萄糖氧化酶也抑制了癫痫样活动。图19B。

这些结果表明，葡萄糖氧化酶可以用作抗癫痫药。

Claims (4)

1.一种方法，包括：

a)提供：

i)包含葡萄糖和表现出惊厥的新生儿患者；和

ii)包含葡萄糖氧化酶的组合物；和

b)在使所述惊厥减少的条件下将所述组合物施用给所述患者。

2.权利要求1的方法，其中所述条件包括将所述葡萄糖转化为葡萄糖酸盐。

3.权利要求1的方法，其中所述组合物是药学上可接受的组合物。

4.权利要求1的方法，其中所述施用进一步包括有效量的所述组合物。

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