CN112105366A - 保护哺乳动物组织抵抗冷和其他代谢应激的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

提供了一种保持低温下的细胞、组织或器官的活力的组合物。该组合物包含线粒体解偶联剂、至少一种蛋白酶抑制剂和还原剂。还提供了保护细胞、组织或器官免受暴露于冷和其他代谢应激的影响的方法。

Description

保护哺乳动物组织抵抗冷和其他代谢应激的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年8月21日提交的美国临时申请号62/547,945的优先权和权益，该临时申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
技术领域
本发明涉及使非休眠的哺乳动物能够承受严酷的寒冷条件的组合物和方法，更具体地涉及保护非休眠的哺乳动物的例如细胞、组织和器官抵抗寒冷和其他代谢应激的组合物和方法。
背景技术
治疗性失温是一种手术管理技术，可在手术过程中保护脑部损伤或外伤免于炎症和自由基的损害，可以通过有目的地降低核心体温来实现。治疗性诱导的失温通过稳定钙和谷氨酸释放来抵消脑细胞的神经兴奋，从而降低细胞死亡的程度。它还可以稳定血脑屏障并抑制炎症过程、减少脑水肿。随着大脑新陈代谢的下降，大脑需要更少的氧气。
当核心体温为34-35℃时，出现轻度的失温；当核心体温为31-33℃时，出现中度的失温。尽管在实践中可以实现轻度失温和中度失温，但是已经认识到了许多与之相关的并发症，包括例如体液和电解质失衡、心律不齐、胰岛素抵抗、发抖和凝血问题。因此，据推测，对于缓解手术过程中的上述不利影响，4-5℃左右的重度治疗性失温将是更有利且优选的。然而，当前在患者中诱导重度治疗性失温的方法可能引起不可逆的损害并增加并发症。
同时，神经移植疗法替代受损的神经元是一种新的有前途的用于治疗进行性神经退行性疾病的方法，例如由于缺乏多巴胺而影响患者运动的帕金森氏病。最有效且先进的治疗方法之一是移植未受损的新细胞，以补充丢失或垂死的细胞。在此过程中，来自发育中的胎儿膜的细胞已被移植到患者的纹状体中，到达多巴胺正常起作用的部位。尽管受损神经元的替换在临床上取得了显著成功，但在移植前在低温下保持分离的神经细胞或组织移植物的体外存活活性仍然是一个挑战。
由于温暖的缺血状态会损害肾脏等供体器官，因此通常会对其进行冷藏。然而，已经表明，长时间冷藏会诱发轻度的氧化应激和相关的细胞损伤。为此，已经表明，抗氧化剂在大鼠、狗和猪的肾脏中可以减轻寒冷诱发的氧化损伤。因此，作为器官保存中使用的标准冷藏溶液，所谓的威斯康星大学(UW)溶液富含抗氧化剂成分。然而，即使使用UW溶液或其他生理溶液，仍然会发生冷诱发的微管破坏和降解。
因此，需要一种既可以用于低温治疗性失温又可以用于移植的、在4-5℃左右的温度下保存器官、组织或细胞的改进的组合物和方法。相信本发明是该需求的答案。
发明内容
在一个实施方案中，本发明涉及一种用于在暴露于低温环境期间保持细胞、组织或器官的活力的组合物。该组合物包含线粒体解偶联剂、至少一种蛋白酶抑制剂和还原剂。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种处理哺乳动物细胞、组织或器官以承受治疗、处理或医学程序期间暴露于低温环境的方法，所述方法包括以下步骤：提供将要暴露于低温环境的哺乳动物细胞、组织或器官；提供一种组合物，所述组合物包含线粒体解偶联剂、至少一种蛋白酶抑制剂和还原剂；以及使所述哺乳动物细胞、组织或器官与所述组合物接触，以使所述哺乳动物细胞、组织或器官能够承受暴露于低温环境。
附图说明
结合附图，在下面的详细描述中，本公开的上述以及其他方面和特征将变得更加明显，附图中：
图1A至1G描绘了针对长时间冷暴露的微管稳定性和转录组响应的物种依赖性差异；
图2A至2F描绘了人iPSC神经元中冷诱导的线粒体超极化、氧化应激和溶酶体膜透化(LMP)；
图3A至3D描绘了具有式3的化合物/PI预处理针对长时间的冷应激对人iPSC神经元的形态学保护；
4A至图4E描绘了具有式3的化合物/PI预处理针对长时间的冷应激对大鼠视网膜外植体和小鼠肾脏的保护；
图5A至5C描绘了地松鼠的诱导的多能干细胞(GS iPSC)的多能性表征；
图6A和6B描绘了TUBB3过表达和紫杉醇对保护人iPSC神经元的神经元微管免受冷应激的损害的影响。
图7A至7G描绘了对GS和人iPSC神经元的生物信息学分析；
图8A至8C描绘了冷应激的人iPSC神经元的微管上蛋白质氧化和聚集的关联。
图9A至9E描绘了冷应激的人iPSC神经元中的PQC系统的关键成分的评估。
图10A和10B描绘了具有式3的化合物/PI部分拯救了人iPSC-神经元微管免受过夜冷应激的损害。
图11A和11B描绘了在休眠期间GS视网膜神经元微管形态几乎未改变；
图12描绘了在小鼠肾脏的冷藏期间具有式3的化合物/PI抑制了由脂质过氧化引起的损害；和
图13A至13H描绘了在GS iPSC-神经元的转录组中鉴定的微管蛋白基因的预测蛋白序列的比对。
具体实施方式
术语
使用标准命名法描述化合物。除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。
术语“一”和“一个”不表示数量限制，而是表示存在至少一个所引用的项目。术语“或”表示“和/或”。术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释是开放式术语(即，意思是“包括但不限于”)。
除非本文另外指出，否则数值范围的列举仅旨在用作分别指代落入该范围内的每个单独值的简略表达方法，并且每个单独值都被并入本说明书中，就如同它在本文中被单独叙述一样。所有范围的端点都包含在该范围内并且可以独立组合。
除非本文另外指出或与上下文明显矛盾，否则本文中描述的所有方法均可以以合适的顺序执行。除非另外要求，否则任何示例和所有示例或示例性语言(例如“例如”)的使用均仅旨在更好地说明本发明，并且不对本发明的范围构成限制。说明书中的任何语言都不应被解释是表示任何未要求保护的要素对于如本文所使用的本发明的实施是必不可少的。除非另有定义，否则本文中使用的技术和科学术语具有与本公开领域的技术人员通常所理解的相同的含义。
此外，本公开包含其中将来自一个或多个所列权利要求的一个或多个限制、要素、从句和描述性术语引入另一权利要求中的所有变型、组合和置换。例如，可以将从属于另一权利要求的任何权利要求修改为包括从属于同一基本权利要求的任何其他权利要求中存在的一个或多个限制。在元素以列表表示的情况下，例如以马库什(Markush)组格式，还公开了元素的每个子组，并且可以从组中删除任何元素。
所有化合物应被理解为包括化合物中存在的原子的所有可能的同位素。同位素包括具有相同原子序数但质量数不同的那些原子，并且涵盖重同位素和放射性同位素。作为一般示例，但不限于此，氢的同位素包括氚和氘，碳的同位素包括11C、13C和14C。因此，本文公开的化合物可以在化合物的结构中或作为与其连接的取代基包括重同位素或放射性同位素。可用的重同位素或放射性同位素的实例包括18F、15N、18O、76Br、125I和131I。
开放式术语“包括”包括中间术语和封闭式术语“基本上由...组成”和“由...组成”。
不在两个字母或符号之间的破折号(“-”)用于指示取代基的连接点。
“药物组合物”是指包含至少一种活性剂，例如具有式3的化合物或盐，和至少一种其他物质，例如载体的组合物。药物组合物符合美国FDA关于人类或非人类药物的GMP(良好生产规范)标准。
“患者”是指需要医学治疗的人类或非人类动物。医学治疗可以包括对现有病况的治疗，例如疾病或失调或诊断性治疗。在一些实施方案中，患者是人类患者。
“提供”是指给予、施用、出售、分发、转让(无论是否盈利)、制造、配制或分配。
“治疗”是指以足以在某种程度上(measurably)减轻任何疾病症状、减慢疾病进展或引起疾病消退的量向患者提供活性化合物。在某些实施方案中，疾病的治疗可以在患者出现疾病症状之前进行治疗。
药物组合物的“生理有效量”是指当施用于患者时有效提供治疗益处，例如改善症状、减少疾病进展或引起疾病消退的量。
“治疗活性成分”是指可用于诊断或治疗疾病的化合物。化合物可以是小分子、肽、蛋白质或其他种类的分子。
显著变化是指在统计显著性的标准参数测试中，例如学生T检验，在统计上具有显著性的任何可检测的变化，其中p＜0.05。
实施方式
非休眠的哺乳动物的神经系统本质上无法承受严酷的寒冷条件，因为低温不可逆转地损害了至关重要的神经元活动所依赖的神经元微管。出乎意料地发现，通过用本文描述的新型组合物靶向线粒体的活性和蛋白质降解机制，对冷敏感的哺乳动物组织可以在一定时期的冷应激下存活并恢复。
因此，本发明的实施方案涉及一种用于在暴露于低温环境期间保持细胞、组织或器官的活力的组合物。该组合物包含线粒体解偶联剂、至少一种蛋白酶抑制剂和还原剂。
根据一个实施方案，该组合物可以包含线粒体解偶联剂。线粒体是细胞代谢的关键。它们既提供能量来维持生物活性，又提供代谢中间体，例如丙酮酸、甘油和脂肪酸以进行生物合成。丙酮酸是通过葡萄糖的糖酵解形成的代谢物。丙酮酸进入线粒体，在其中转化为乙酰辅酶A(“乙酰CoA”)。甘油三酸酯水解的结果是形成甘油和脂肪酸。这些代谢物进入线粒体，在其中被氧化为乙酰CoA。然后，在线粒体基质中，乙酰CoA通过三羧酸被氧化(“TCA循环”)，氧化释放的能量以高能电子的形式存储在烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(“NADH”)和黄素腺嘌呤二核苷酸(“FADH2”)的分子中。来自NADH和FADH2的电子又被送入位于线粒体内膜上的线粒体电子传输链中。随着电子穿过电子传输链到达电子受体(即氧分子)，能量被释放并用于将质子从线粒体基质泵送穿过线粒体内膜，从而在整个膜上形成质子梯度。最后，质子通过F0F1-ATP合酶穿过线粒体内膜并驱动ATP的合成，ATP是可以被各种细胞组分直接利用的能量分子。线粒体氧化还提供并调节生物合成RNA、DNA和脂质所需的代谢中间体的可用性。
通常，响应于细胞能量需求，乙酰CoA的线粒体氧化和ATP合成是偶联的。但是，线粒体氧化可以通过线粒体解偶联剂从ATP合成脱偶联。线粒体解偶联剂促进质子跨线粒体内膜向内移位，从而消散或降低质子梯度而不会产生ATP。
在一个实施方案中，线粒体解偶联剂可以是由式1表示的化合物：
式1
Figure BDA0002457254030000071
其中：
R1和R2可以各自独立地是氢、氘、-F、-Cl、-Br、-I、羟基基团、氰基基团、硝基基团、氨基基团、脒基、肼基、腙基、羧酸基团或其盐、磺酸基团或其盐、磷酸基团或其盐、取代或未取代的C1-C30烷基基团、取代或未取代的C2-C30烯基基团、取代或未取代的C2-C30炔基基团、取代或未取代的C1-C30烷氧基基团、取代或未取代的C3-C30环烷基基团、取代或未取代的C1-C30杂环烷基基团、取代或未取代的C3-C30环烯基基团、取代或未取代的C1-C30杂环烯基基团、取代或未取代的C6-C30芳基基团、取代或未取代的C6-C30芳氧基基团、取代或未取代的C6-C30芳硫基基团、取代或未取代的C7-C30芳烷基基团、取代或未取代的C1-C30杂芳基基团、取代或未取代的C2-C30杂芳氧基基团、取代或未取代的C2-C30杂芳硫基基团、取代或未取代的C3-C30杂芳烷基基团和-Si(Q1)(Q2)(Q3)，其中Q1-Q3各自独立地选自氢、C1-C30烷基基团、C1-C30烷氧基基团、C3-C30环烷基基团、C1-C30杂环烷基基团、C3-C30环烯基基团、C1-C30杂环烯基基团、C6-C30芳基基团和C1-C30杂芳基基团；并且
n1和n2各自独立地是1至5的整数。
在另一个实施方案中，线粒体解偶联剂可以是由式2表示的化合物：
式2
Figure BDA0002457254030000081
其中R1和R2与结合式1描述的那些相同。
在一个实施方案中，R1和R2可以各自独立地为氢、-F、-Cl、-Br或-I。例如，线粒体解偶联剂可以是具有式3的化合物：
式3
Figure BDA0002457254030000082
该组合物可以进一步包含至少一种蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂是通过与蛋白酶选择性地结合并阻断蛋白前体的蛋白水解裂解(它们是产生感染性病毒颗粒所必需的)而阻止病毒复制的物质。据一个实施方案，蛋白酶抑制剂可以是半胱氨酸蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、亮氨酸氨基肽酶抑制剂或这些抑制剂的组合，但不限于此。
例如，半胱氨酸蛋白酶抑制剂可以是(1S,2S)-2-(((S)-1-((4-胍基丁基)氨基)-4-甲基-1-氧代戊-2-基)氨基甲酰基)环丙烷羧酸(“E-64”)，其具有以下结构：
Figure BDA0002457254030000083
天冬氨酸蛋白酶抑制剂可以是具有序列Iva-Val-Val-Sta-Ala-Sta(“PepstatinA”)的肽，其具有以下结构：
Figure BDA0002457254030000091
丝氨酸蛋白酶抑制剂可以是4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟(“AEBSF”)，其具有以下结构：
Figure BDA0002457254030000092
亮氨酸氨基肽酶抑制剂可以是(2S)-2-[[(2S,3R)-3-氨基-2-羟基-4-苯基丁酰基]氨基]-4-甲基戊酸(“Bestatin”)，其具有以下结构：
Figure BDA0002457254030000093
该组合物可以进一步包含还原剂，所述还原剂可以是天然存在的或非天然存在的。例如，天然还原剂可以是谷胱甘肽、维生素E或抗坏血酸，抗坏血酸具有以下结构：
Figure BDA0002457254030000094
非天然还原剂的实例可以包括1,4-二硫苏糖醇(“DTT”)和β-巯基乙醇。
组合物中线粒体解偶联剂的浓度可以为约50至200纳摩尔(nM)，例如，约75至约150nM，或约100nM。
组合物中至少一种蛋白酶抑制剂的浓度可以为约0.1至约50微摩尔(μM)，例如约1至约25μM，或约10至约20μM。
组合物中还原剂的浓度可以为约50至300μM，例如，约100至约200μM，或约150μM。
该组合物可以进一步包含药学上可接受的赋形剂。如本文所用，药学上可接受的赋形剂是指用于配制药物产品的非活性药物成分(“API”)物质，例如崩解剂、粘合剂、填充剂和润滑剂。根据已制定的政府标准(包括美国食品和药物管理局(“FDA”)颁布的那些标准)，这些物质中的每一种通常对于施用给人类都是安全的。
本文所用的崩解剂是指琼脂、褐藻、碳酸钙、羧甲基纤维素、纤维素、粘土、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、交联聚维酮、树胶、硅酸镁铝、甲基纤维素、波拉克林钾(polacrilin potassium)、褐藻酸钠、低取代羟丙基纤维素和交联聚乙烯吡咯烷酮羟丙基纤维素、羟乙酸淀粉钠和淀粉中的一种或多种，但不限于此。
本文所用的粘合剂是指微晶纤维素、羟甲基纤维素和羟丙基纤维素中的一种或多种，但不限于此。
本文所用的填充剂是指碳酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、三碱式硫酸钙、羧甲基纤维素钙、纤维素、糊精衍生物、糊精、右旋糖、果糖、乳糖醇、乳糖、碳酸镁、氧化镁、麦芽糖醇、麦芽糖糊精、麦芽糖、山梨糖醇、淀粉、蔗糖、糖和木糖醇中的一种或多种，但不限于此。
如本文所用，润滑剂是指琼脂、硬脂酸钙、油酸乙酯、月桂酸乙酯、甘油、棕榈硬脂酸甘油酯、氢化植物油、氧化镁、硬脂酸镁、甘露醇、泊洛沙姆、乙二醇、苯甲酸钠、月桂基硫酸钠、硬脂酸钠、山梨糖醇、硬脂酸、滑石粉和硬脂酸锌中的一种或多种，但不限于此。
可在手术期间施用组合物以保护患者并改善患者治疗性失温的影响。可以通过口服、肠胃外(例如，肌内、腹膜内、静脉内、ICV、脑池内注射或输注、皮下注射或植入)、通过吸入喷雾、鼻、舌下或局部施用途径将组合物施用给患者，并且可以将组合物单独或一起以适合的剂量单位制剂配制，该制剂含有适合每种施用途径的常规无毒药学上可接受的载体、佐剂和溶媒。施用方法可以根据需要变化。例如，对于一般施用，可以发现输注是优选的施用方法。对于进行脑外科手术的患者，脑池内注射可能是最有效的方法。本发明的化合物适合于治疗温血动物(例如，小鼠、大鼠、马、牛、绵羊、狗、猫、猴子等)，并有效地用于人类。如本文所用，术语“施用”化合物应理解为是指向需要治疗的个体提供本发明的化合物或本发明的化合物的前药。
可以根据本领域已知的制造药物组合物的任何方法来制备用于口服的组合物，并且这种组合物可以包含一种或多种剂，所述剂包括例如甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂，以便提供药学上优雅且可口的制剂。片剂含有与适于制备片剂的无毒的药学上可接受的赋形剂混合的治疗活性成分。片剂可以是未包衣的，也可以通过已知技术进行包衣，以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，从而在更长的时间内提供持续的作用。口服组合物还可以以硬明胶胶囊剂形式存在，其中将治疗活性成分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或者以软明胶胶囊剂形式存在，其中将治疗活性成分与水或油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油混合。可以通过本领域已知的标准方法来制备水性悬浮液、油性悬浮液、可分散的粉剂或颗粒剂、水包油乳剂以及无菌注射水性或油性悬浮液。含有本发明化合物或其药学上可接受的盐的组合物也可以制备成粉末或液体浓缩物的形式。
在另一个实施方案中，本发明还涉及一种处理哺乳动物细胞、组织或器官以承受治疗、处理或医学程序期间暴露于低温环境的方法。该方法包括以下步骤：(1)提供将要暴露于低温环境的哺乳动物细胞、组织或器官；(2)提供一种组合物，所述组合物包含线粒体解偶联剂、至少一种蛋白酶抑制剂和还原剂；以及(3)使所述哺乳动物细胞、组织或器官与所述组合物接触，以使所述哺乳动物细胞、组织或器官能够承受低温环境。该方法可用于涉及将细胞、组织或器官暴露于低温环境的任何治疗、处理或医学程序。这样的治疗、处理或医学程序的示例包括但不限于器官或细胞移植、失温、休眠或器官、组织或细胞的储存等。
根据该方法，使哺乳动物细胞、组织或器官与组合物接触，所述组合物包含线粒体解偶联剂、至少一种蛋白酶抑制剂和还原剂，这已在上面详细描述。
可以通过将单独制备的线粒体解偶联剂、至少一种蛋白酶抑制剂和还原剂的混合物在溶剂介质中混合来获得组合物。溶剂介质可以是水或任何医用水性缓冲液，例如人工泪液、人工脑脊髓液和盐水，但不限于此。
线粒体解偶联剂可以是由式1表示的化合物：
式1
Figure BDA0002457254030000121
其中：
R1和R2各自独立地是氢、氘、-F、-Cl、-Br、-I、羟基基团、氰基基团、硝基基团、氨基基团、脒基、肼基、腙基、羧酸基团或其盐、磺酸基团或其盐、磷酸基团或其盐、取代或未取代的C1-C30烷基基团、取代或未取代的C2-C30烯基基团、取代或未取代的C2-C30炔基基团、取代或未取代的C1-C30烷氧基基团、取代或未取代的C3-C30环烷基基团、取代或未取代的C1-C30杂环烷基基团、取代或未取代的C3-C30环烯基基团、取代或未取代的C1-C30杂环烯基基团、取代或未取代的C6-C30芳基基团、取代或未取代的C6-C30芳氧基基团、取代或未取代的C6-C30芳硫基基团、取代或未取代的C7-C30芳烷基基团、取代或未取代的C1-C30杂芳基基团、取代或未取代的C2-C30杂芳氧基基团、取代或未取代的C2-C30杂芳硫基基团、取代或未取代的C3-C30杂芳烷基基团和-Si(Q1)(Q2)(Q3)，其中Q1-Q3各自独立地选自氢、C1-C30烷基基团、C1-C30烷氧基基团、C3-C30环烷基基团、C1-C30杂环烷基基团、C3-C30环烯基基团、C1-C30杂环烯基基团、C6-C30芳基基团和C1-C30杂芳基基团；并且
n1和n2各自独立地是1至5的整数。
所述至少一种蛋白酶抑制剂可以包括半胱氨酸蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、亮氨酸氨基肽酶抑制剂或其组合。所述还原剂可以是抗坏血酸。
在一个实施方案中，线粒体解偶联剂可以是具有式3的化合物：
式3
Figure BDA0002457254030000131
所述至少一种蛋白酶抑制剂可以是E-64、Pepstatin A、AEBSF和Bestatin的组合，并且
所述还原剂可以是抗坏血酸。
可以通过如下方法来使用用于细胞、组织和器官保存的组合物：在接触哺乳动物细胞之前，溶解在认为适合于靶细胞、组织和器官的任何生理溶液中，或者可以与可商购的冷冻保存剂混合。可商购的冷冻保存剂的实例可以包括Optisol GS和用于人类角膜冷藏的类似剂、威斯康星大学(UW)溶液和用于肝脏和肾脏冷藏的类似剂以及
Figure BDA0002457254030000132
但不限于此。在一个实施方案中，可在接触细胞之前，将组合物与这些市售溶液混合。当不可商购获得时，可以通过如下方法来制备处理溶液：将组合物(本发明中的)直接溶解于已知的或实验的冷冻保存剂中至待为靶细胞、组织或器官优化的浓度。
可以根据本发明的组合物和方法处理的哺乳动物细胞、组织或器官包括神经元细胞、视网膜细胞、角膜、视网膜、皮肤、心脏、肺、胰腺、肾脏、肝脏、肠、干细胞、血液或任何其他适合移植的细胞、组织或器官。这些细胞/组织/器官是可移植的，通常在移植前储存在0-5℃。可以在22℃至37℃，例如25℃至37℃或22℃至35℃的温度下使细胞与组合物接触。示例性的接触时间可以包括5分钟至5周(对于角膜而言)，例如30至60分钟，1小时至35天，4小时至35天，8小时至35天，16小时至35天，1天至35天，2天至35天，3天至35天，或4天至35天。
然后可以将接触后的细胞维持在5℃或更低，例如4℃或更低，3℃或更低，或2℃或更低的温度，以保存细胞用于移植。在一些实施方案中，可以将接触后的细胞维持在1℃至5℃，例如1℃至2℃，2℃至3℃，3℃至4℃，或4℃至5℃的温度。
可以将接触后的细胞维持4至72小时，例如4至6小时，8至24小时，或24至72小时。接触后的组织或器官与这些剂一起施用，并可以在目前临床实践中使用的合适的储存溶液中，在1℃至5℃的温度下，维持1至35天的活力。
在一个实施方案中，将接触后的细胞在2℃至5℃的温度下维持6小时可以导致保持约80％至100％的细胞神经元形态。在另一个实施方案中，将接触后的细胞在2℃至5℃的温度下维持24小时可以导致保存约30％至40％的细胞神经元形态。
在另一个实施方案中，提供了用于哺乳动物细胞、组织或器官移植的方法。
该方法包括以下步骤：
提供一种组合物，所述组合物包含线粒体解偶联剂、至少一种蛋白酶抑制剂和还原剂；
使哺乳动物细胞、组织或器官与组合物接触；
将接触的细胞、组织或器官维持在5℃或更低的温度，以保存细胞、组织或器官；以及
进行保存的细胞、组织或器官的移植。
在另一个实施方案中，提供了一种保护哺乳动物抵抗失温的方法。该方法包括以下步骤：
提供一种组合物，所述组合物包含线粒体解偶联剂、至少一种蛋白酶抑制剂和还原剂；
对哺乳动物施用生理有效量的组合物；以及
将哺乳动物暴露于温度为5℃或更低的环境中。
在另一个实施方案中，提供了一种诱导非休眠哺乳动物休眠的方法。该方法包括以下步骤：
提供一种组合物，所述组合物包含线粒体解偶联剂、至少一种蛋白酶抑制剂和还原剂；
对哺乳动物施用生理有效量的组合物；以及
诱导哺乳动物休眠。
在另一个实施方案中，提供了一种在治疗诱导的失温过程中保护哺乳动物细胞、组织或器官的方法。该方法包括以下步骤：
提供一种组合物，所述组合物包含线粒体解偶联剂、至少一种蛋白酶抑制剂和还原剂；
对哺乳动物施用生理有效量的组合物；以及
在哺乳动物中诱导治疗性失温。
在另一个实施方案中，提供了一种在治疗性失温期间保存患者的神经细胞、组织或器官的方法。根据一个实施方案，该方法包括在诱导治疗性失温之前向患者施用生理有效量的组合物。
参考以下非限制性实施例，对本发明进行了说明和进一步详细描述。
实施例
方法和材料
组合物的制备
将式3表示的化合物在合适的培养基中的0.05至0.2μM的溶液、E-64在该培养基中的3至5μM的溶液、Pepstatin A在该培养基中的2至4μM的溶液、AEBSF在该培养基中的100至200μM的溶液、Bestatin在该培养基中的10至20μM的溶液和抗坏血酸在该培养基中的50至200μM的溶液混合，形成组合物。
动物
根据我们机构的动物审查委员会的要求，在国家眼科研究所的动物设施中饲养了成年的十三条纹地松鼠(GS)群体。威斯康星州-奥什科什大学的Dana Merriman教授提供了妊娠的松鼠和新生幼崽。死后大鼠视网膜获自2-6个月大的健康成年Sprague Dawley大鼠，并由美国国立卫生研究院(NIH)国家神经疾病和中风研究所(NINDS)的动物设施提供。死后小鼠肾脏获自2-12个月大的健康成年C57BL/6J小鼠，并由NINDS的动物设施提供。所有动物程序均已获得美国国家眼科研究所机构动物护理和使用委员会的批准，并符合《动物福利法》(NIH/DHHS)的规定。
细胞分离
解剖出生后第0-2天的GS幼崽的皮质组织，然后使用神经组织解离试剂盒(Miltenyi Biotech，San Diego，CA)解离。然后，使用磁性抗PSA-NCAM微珠、髓磷脂去除珠和FcR阻断剂(Miltenyi Biotech，San Diego，CA)用磁激活细胞分选法纯化神经前体细胞。扩增纯化的细胞，然后转导。按照(Meberg，2003)中描述的方案维持大鼠和GS皮质神经元的原代培养。
细胞培养和重编程
除非另有说明，否则所有细胞培养基试剂均按照制造商的说明使用；表1中列出了这些试剂。GS细胞培养方案来自以下描述人类细胞培养方案的来源(https://stemcells.nih.gov/research/nihresearch/scunit/protocols.htm)，并作了以下修改：将纯化的GS NPC在5％基质胶包被的培养皿中在神经祖细胞(NPC)培养基中培养，直到达到70-80％融合。然后将NPC用Cytotune-iPS 2.0Sendai重编程试剂盒(Thermo FisherScientific，Waltham，MA)转染24小时。转染的NPC用细胞消化液(accutase)解离，并在iPSC维持培养基中以1：3的比例传代到新的5％基质胶包被的孔中。5-7天后，出现扁平的集落，将集落用分散酶(dispase)消化手动挑选或取下，通过用移液器温和地吹打(gentlepipetting)进行机械解离，然后传代到新的基质胶包被的培养孔中。
表1.抗体和试剂、相关方法
Figure BDA0002457254030000171
Figure BDA0002457254030000181
Figure BDA0002457254030000182
Figure BDA0002457254030000191
威斯康星大学溶液 浓度(g/L)
羟乙基淀粉(Pentafraction) 50.0
乳果糖酸(内酯) 35.83
磷酸二氢钾 3.4
七水硫酸镁 1.23
五水棉子糖 17.83
腺苷 1.34
别嘌呤醇 0.136
总谷胱甘肽 0.922
氢氧化钾 5.61
氢氧化钠/盐酸 调整到pH 7.4
GS iPSC的多能性验证
通过碱性磷酸酶染色和OCT3/4/NANOG免疫染色来表征GS iPSC集落的多能性。这些抗体列于表1。还使用https://stemcells.nih.gov/research/nihresearch/scunit/protocols.htm上发现的方案，通过GS iPSC在体外分化为所有3个胚层的能力来评估GSiPSC的多能性状态。还使用标准畸胎瘤形成测定法(Applied StemCell，CA，USA)在体内验证了多能性。
人和地松鼠iPSC的神经元分化
三种不同的人iPSC衍生的神经祖细胞(NPC)系获自Barbara Mallon博士的美国国立卫生研究院的干细胞部门。如https://stemcells.nih.gov/research/nihresearch/scunit/protocols.htm中所述培养人iPSC衍生的神经元。由上述人细胞培养方案改编了用于培养GS iPSC衍生的神经元培养物的方案。首先将人和GS NPC在NPC培养基中扩增3天，然后切换到神经分化培养基(NDM)(表2)中至少7天，从而形成一群成熟的神经元和支持细胞。在所有三种人NPC系中验证了实验结果。对于GS神经元分化，前2天需要GS NDM，然后将培养基更改为人NDM。
表2.细胞培养基配方和试剂。
Figure BDA0002457254030000201
Figure BDA0002457254030000211
Figure BDA0002457254030000212
Figure BDA0002457254030000221
Figure BDA0002457254030000222
Figure BDA0002457254030000223
Figure BDA0002457254030000231
Figure BDA0002457254030000232
评估神经元微管响应寒冷的稳定性
本研究中的温度依赖性实验是在环境CO2浓度下进行的，这需要使用休眠-培养基(表2)来维持生理pH值。首先将培养的神经元(人iPSC衍生的、GS iPSC衍生的、GS原代或大鼠原代培养物)在休眠-培养基中在室温下孵育30分钟，以进行实验。在这段时间(预孵育)中，引入药物处理(请参阅表1中的其他试剂)来测试耐寒性和微管稳定性。然后将细胞培养皿放在环境温度37℃的培养箱中或4℃的冰箱中。观察到在冰箱中孵育的培养基的温度在5分钟内从22℃降低到12℃，并在20分钟内降低到4℃。休眠-培养基的pH值稳定，即使在4℃孵育16小时后，其pH也保持在7.0至7.4之间。
多电极阵列(MEA)测量
所有实验均在暗红色光下进行。取出大鼠视网膜外植体并在休眠-培养基中切成小块，分成不同的处理组，与促进微管稳定性的药物或DMSO溶媒对照在室温下预孵育30分钟。将冷暴露的组在冰箱中孵育，而将新鲜的对照样品在黑暗中于室温下在工作台上孵育。研究表明，将摘出的眼睛保持在失温和缺血条件下可以在体外延长视网膜活力(Reinhard，2016；Schultheiss，2016)，因为限制对氧气和营养物质的接触可能会降低线粒体代谢并因此降低ROS的产生。在本文，所有实验组的大鼠视网膜都被允许与营养物质和氧气充分接触，因此，低温是我们实验中造成应激的唯一原因。孵育4或24小时后，将冷暴露的视网膜外植体放在工作台上10-15分钟，并用新鲜的休眠-培养基洗涤两次。然后将所有组的视网膜外植体转移至室温下的含氧(95％O2/5％CO2)碳酸氢盐缓冲的AMES培养基中。将巩膜和RPE去除，然后将神经视网膜平坦地封片，使神经节细胞(RGC)一侧朝下放在MEA上。
在MEA记录过程中，在37℃下用95％O2/5％CO2平衡的AMES灌注液灌注神经视网膜，以测量15分钟内大鼠RGC的自发放电活性。为了评估大鼠视网膜外植体的光响应性，将组织暴露于亮白色LED(Mightex，Pleasanton，CA)或卤素灯(OSRAM，德国)的大约1s的闪光。对于每个视网膜，响应于六次闪光(间隔大约10或15-s)，均引发了光驱动的神经节细胞活动(动作电位激发)。记录后，将大鼠视网膜外植体用4％多聚甲醛固定2小时，然后对神经元微管蛋白进行免疫染色。对于MEA数据处理和分析，首先对RGC的激发尖峰进行滤波并记录在MC机架中，将高通滤波器设置为200Hz，将低通滤波器设置为3000Hz，并将尖峰检测阈值的自动标准偏差设置为-6。为了消除假阳性并将尖峰分组到与单个单元相对应的簇中，使用Plexon Offline Sorter v.3.3.5(Plexon Inc.，Dallas，TX)对尖峰波形进行了分类。使用内置的K均值聚类算法，尖峰被自动聚类为每个电极最多八个单元(细胞)。在MATLAB 2015a版本(The Mathworks，Natick，MA)中进行光响应性的分析和鉴定。简而言之，将尖峰时间以200ms的间隔进行分档，并将在每次闪光的第一个bin期间对给定细胞观察到的激发速率与未受刺激的间隔进行统计比较。如果A)刺激的尖峰速率大于平均基线激发速率，并且B)这些尖峰速率的双尾不等方差t检验的结果产生p值<0.01，则认为该细胞具有光响应性。此测试低估了光响应细胞的数量，因为它检测到ON光响应，但检测不到OFF光响应。OFF响应在大多数MEA记录中清晰可见，但它们构成了少数细胞类型，此处未进行量化。
蛋白质印迹和免疫染色
表1列出了所有抗体。使用RIPA缓冲液来裂解细胞并提取蛋白质(Thermo Fisher，Waltham，MA)。在SDS-PAGE上运行总蛋白质或在标准离心去除沉淀物和碎片后在可溶性部分中的蛋白。使用标准方案进行蛋白质印迹和免疫染色。为了对氧化的蛋白质进行免疫染色，首先将固定的细胞与2,4-二硝基苯肼(DNPH)一起孵育，然后用识别DNPH-蛋白质复合物的抗体(蛋白质氧化检测试剂盒，参见表1)染色。所有的免疫染色和活细胞共聚焦图像均在Zeiss LSM 5100系统(Zeiss，Oberkochen，德国)上捕获。用ImageJ凝胶分析工具对蛋白质印迹定量。
RNA-seq样品制备
如上所述，维持并制备了GS和人iPSC衍生的神经元培养物的两个不同系。实验通过如下进行：首先用新鲜的休眠-培养基代替NDM，并让培养物在室温下静置30分钟。将样品分为两组：一组在冰箱(4℃)中孵育，另一组在环境温度37℃的培养箱中孵育。选择两个孵育时间点1小时和4小时。收集细胞并在TRIzol(Thermo Fisher，Waltham，MA)中裂解，用RNeasy试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)纯化总RNA，并进一步处理以进行RNA测序(Illumina，San Diego，CA；参见表1)。
RNA-seq数据的定位、量化和差异表达分析
在调整接头后，使用FastQC工具集(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc)评估原始读取(reads)。使用TopHat v2.1.1(Trapnell，2009)将不同细胞系的读取分别与GS基因组(Ensembl spetri2)(Yates，2016)或与人类基因组(UCSChg19)(Speir，2016)(http://genome.ucsc.edu/)进行比对，并且对于最终的读取比对，每次读取最多允许两个错配。为了量化基因表达，使用R Subread软件包(Liao，2013)仅对与外显子唯一比对的读数进行计数。如果任何包括的样本中的每百万最大计数>3，则将该基因包括在进一步分析中。考虑到实验的成对设计，使用DESeQ2(Love，2014)中的嵌入式功能通过控制不同细胞系的效果对处理效果进行了负二项式GLM拟合和测试。使用Benjamini-Hochberg程序调整差异表达测试的P值，以进行多重假设测试。
修改的转录本功能富集分析
使用Piano程序包(Varemo，2013)基于超几何测试进行基因本体(GO)分析，将目的基因列表作为前景，将所有已识别的基因作为背景。从Ensembl数据库中检索并定位GO术语的基因注释。
微管蛋白蛋白序列同源性分析
从Uniprot数据库(2015)获得人、小鼠、大鼠和十三条纹地松鼠的基因(TUBA1C、TUBB2A、TUBB2B、TUBB/TUBB5、TUBA4A、TUBB3、TUBB4A和TUBB6)的微管蛋白蛋白序列，并使用CLUSTAL Omega程序(McWilliam，2013)进行比对。当多种同工型可用时，使用标准蛋白质序列。
微管蛋白的乙酰化预测分析
对于上述所有微管蛋白，分别使用NetAcet(Kiemer，2005)和ASEB(Wang，2012)进行N-末端和赖氨酸乙酰化事件的预测。在预测过程中，直接提交完整的蛋白质序列。在ASEB分析中，探索了所有可用的赖氨酸乙酰化转移酶(KAT)家族。P＜0.05的K位点被鉴定为乙酰化的。
线粒体膜电位(TMRE)的活细胞成像
如上所述制备GS和人iPSC衍生的神经元培养物。通过如下方法进行实验：首先去除神经分化培养基，并将其替换为含有50nM TMRE的休眠培养基(Thermo Fisher，Waltham，MA；参见表1)。此时，将1)0.1μM的具有式3的化合物或2)1：500稀释的蛋白酶抑制剂混合物III(Millipore-Sigma，Darmstadt，德国)递送至两个药物处理组。将细胞放回培养箱中，并在37℃下再培养25分钟。将符合这些处理条件的其他休眠培养基储存在50mL锥形管中，放在45℃水浴中或冰上，以作为灌注培养基储库。在成像之前，将含有TMRE的培养基丢弃，并用新鲜的预热的休眠培养基代替。在Z堆栈延时共聚焦成像过程中，连续灌注培养皿；首先用来自45℃储库的培养基灌注5分钟，然后切换为冰冷的储库。该操作将培养皿中培养基的温度降低到10℃(灌注系统可以达到的最低温度)。重新聚焦视野中的细胞，并另外拍摄5分钟的相同的Z堆栈延时共聚焦图像。产生Z堆栈图像的最大强度投影用于数据分析。假设在10分钟的成像时间内，吸收到每个细胞中的总TMRE分子应保持相对恒定，在该假设之下，校正温度依赖性TMRE荧光的增加。因此，最初将整个细胞区域选择为目标区域(ROI)，以估计TMRE染料荧光的温度依赖性贡献。为此，从10℃记录的10帧计算平均TMRE荧光强度，然后将其除以从37℃记录的10帧的平均TMRE荧光强度(FC-10/FC-37)。然后选择来自相同细胞的线粒体区域作为ROI，以测量37℃(FC-37)和10℃(Fm-10)时的线粒体TMRE强度。使用以下等式计算10℃下的校正的线粒体TMRE强度：FC.m-10＝Fm-10/(FC-10/FC-37)。因此，在10℃下线粒体TMRE强度的变化百分比计算为：(FC.m-10-Fm-37)/Fm-37x 100％。每个实验至少测量5个不同的聚焦良好的成像细胞。
使用细胞CellROX-green进行氧化应激的活细胞成像
一式两份制备GS和人iPSC衍生的神经元培养物，并用1μM CellROX-green(ThermoFisher，Waltham，MA；见表1)用上述适当的药物处理或溶媒进行预处理。为了探索冷应激对ROS产生的影响，将细胞维持在37℃(用作正常对照)或暴露于4℃。将细胞在37℃保持30分钟，在工作台上适应室温5分钟，然后将其置于4℃冰箱中30分钟。然后将细胞在室温下在工作台上逐渐重新加热5分钟，然后放回37℃。然后在37℃下从两组获得Z-堆栈共聚焦图像。具体而言，由于CellROX-green仅在氧化并与DNA结合后才发出荧光，因此该方法避免了在记录ROS累积产生的同时，在不同温度下成像时同时发生的温度依赖性染料荧光伪影。产生Z堆栈图像的最大强度投影用于数据分析。每个实验至少测量5个不同的聚焦良好的成像区域。初步实验还表明，在37℃或4℃孵育之前，两组培养物的CellROX-green荧光强度没有差异(数据未显示)。
使用MagiCRed和DND-26进行溶酶体的活细胞成像
一式两份制备GS和人iPSC衍生的神经元培养物，并在37℃下与含有Magic Red的休眠培养基(1:1000；ImmunoChemistry Technologies，Bloomington，MN)孵育25分钟，然后加入LysoTracker Green DND-26(50nM；Thermo Fisher，Waltham，MA；参见表1)5分钟。然后将含染料的培养基替换为新鲜的休眠培养基，将一组培养物在4℃下孵育1、4或16小时，而另一组培养物维持在37℃下作为正常对照。冷暴露组在各种温度(10℃、室温或37℃)下进行共聚焦成像，而对照组在室温或37℃下成像。这些成像条件不会显著影响溶酶体膜透化(LMP)的测量。Magic Red在被溶酶体蛋白酶组织蛋白酶B裂解后发荧光，而DND-26则是在酸性溶酶体囊泡中积累的嗜酸性探针。当发生LMP时，Magic Red和DND-26信号扩散到受影响细胞的细胞质内。如果细胞包含单个直径>5μm(这是神经元细胞核的大小)的Magic Red染色颗粒，则可以确定该细胞具有LMP。
微管追踪
将接受或未接受处理的培养的神经元或大鼠视网膜外植体用4％多聚甲醛固定，透化并用0.1％Triton X-100的磷酸盐缓冲盐水溶液洗涤，并用抗TUBB3抗体染色。使用ImageJ中的“Simple Neurite Tracer”插件追踪人iPSC衍生的神经元培养物的188.94x188.94μm2图像和大鼠整个封片视网膜的67.48x 67.48μm2图像中的TUBB3+微管路径。
蛋白质聚集体的检测
处理后，将培养的神经元用4％多聚甲醛固定10分钟，然后透化并用0.1％TritonX-100的磷酸盐缓冲盐水溶液洗涤。蛋白质的聚集体可以通过染料显现，该染料插入变性且聚集的蛋白质中并变为荧光(Proteostat聚集体检测试剂盒，Enzo，Farmingdale，NY；参见表2)(Shen，2011)。为了使蛋白质聚集体在神经元微管上积累，将细胞用TUBB3抗体和蛋白质聚集体染料染色，并拍摄图像(188.94μm x 188.94μm)。在每个图像中，计数微管中存在的蛋白质聚集体的数量，并将其除以TUBB3+微管路径的总长度。
冷藏后对小鼠肾脏的评估
首先用温热的0.9％NaCl溶液温和灌注健康的成年C57BL/6J小鼠，从而处死，然后对小鼠进行第二次灌注：在对照组中，用人体器官冷藏的标准威斯康星大学溶液(UW溶液；见表1)，或在处理组中，用补充有0.2μM具有式3的化合物/1：200稀释的蛋白酶抑制剂混合物III的UW溶液。为了评估冷藏期间的脂质过氧化作用，将两组小鼠的肾脏取出并转移至12孔板中，12孔板含有UW溶液或具有式3的化合物/PI的UW溶液，和亚油酰胺炔烃(来自Click-iT脂质过氧化成像试剂盒；Thermo Fisher，参见表1)，在20℃下放置30分钟。在此阶段之后，将新鲜对照用4％多聚甲醛固定，然后将冷对照组和处理组的肾脏在4℃下孵育24小时。为了评估冷藏后微管蛋白的再聚合，将肾脏在20℃下放置10分钟，用新鲜的温热的UW溶液(不含具有式3的化合物/PI)冲洗两次，然后在37℃培养箱中再加热30分钟。然后将肾脏用4％多聚甲醛固定2小时，进行冷冻切片处理，然后按照制造商的说明使被脂质过氧化修饰的蛋白质/DNA可视化，并对α-微管蛋白TUBA进行免疫染色(参见表1)。
数据分析
使用学生t检验分析了所有数据的统计显著性。
附图详细说明
图1A至1G描绘了如所示在4℃下孵育0、4或16小时的(图1A)培养的大鼠原代皮质神经元、(图1B)人的诱导的多能干细胞衍生的神经元(iPSC-神经元)、(图1C)培养的十三条纹地松鼠(GS)原代皮质神经元和(图1D)分化的GS iPSC神经元中针对长时间冷暴露的微管稳定性和转录组响应的物种依赖性差异：TUBB3(红色)、聚谷氨酰化的微管蛋白(poly-ET；绿色)或δ2-微管蛋白(Δ2-T；蓝色)免疫荧光。(图1E)GS皮质原代神经元的微管长度不受寒冷影响，并且与GS iPSC神经元在数量上没有区别(p>0.05；学生t检验)。手动追踪的TUBB3阳性微管的累积长度图：GS皮质原代神经元(n＝5；37℃和4℃)和GS iPSC神经元(n＝6；37℃和4℃)。误差线：SEM。(图1F)在有或没有TUBB3过表达的情况下，4或16小时冷暴露后，GSiPSC神经元和人iPSC神经元中TUBB3、poly-ET和Δ2-T的蛋白质印迹分析(n＝5；学生t-检验；**p＜0.01；***p＜0.001)。(图1G)由4℃孵育1小时或4小时诱导的温度特异性改变的热图突出了两种不同的表达类别：与线粒体功能有关的基因，以及编码热休克蛋白和蛋白降解途径的基因。强调了在GS和人类神经元培养物之间表现出不同的冷诱导表达模式的基因。比例尺：40μm。
图2A至2F描绘了人iPSC神经元中冷诱导的线粒体超极化、氧化应激和溶酶体膜透化(LMP)。(图2A)在处理的(具有式3的化合物：线粒体解偶联剂或PI：溶酶体蛋白酶抑制剂)或未处理的冷暴露的GS iPSC神经元和人iPSC神经元中用TMRE进行线粒体膜电位(Δψm)的活细胞成像：(学生t检验；**p<0.01；***p<0.001)。(图2B)在4℃下30分钟后，GS和人iPSC神经元中ROS产生的定量图像分析(CellROX-green)(学生t检验；*p<0.05；**p＜0.01)。(图2C)在4℃下16小时后，氧化蛋白的蛋白质印迹分析(n＝5；学生t检验；*p<0.05)。(图2D)在GS TUBB3+处理(品红色)上检测到的最小蛋白质氧化(绿色)。具有式3的化合物显著减轻了人神经元中残留TUBB3+微管上的氧化蛋白。见图13A至13H。(图2E)在4℃下1小时后，在GS和人iPSC神经元中对溶酶体进行的实时成像显示，在人类神经元(箭头)中存在弥散性细胞质荧光(DND-26：绿色和Magic Red：品红色)，表明存在LMP。包含弥散性Magic Red的细胞数(学生t检验；***p<0.001)。(图2F)具有式3的化合物或抗氧化剂(维生素C)减轻了在4℃下处理4小时的人神经元中的LMP。包含弥散Magic Red的细胞数(学生t检验；*p<0.05；***p<0.001)。关于PQC参与参见8A至8C。比例尺：50μm(图2D)；20μm(图2E-2F)。
图3A至3D描绘了具有式3的化合物/PI预处理针对长时间的冷应激对人iPSC神经元的形态学保护。(图3A)用具有式3的化合物(0.1μM；n＝17)、PI(1：500；n＝24)或两者的组合(n＝9)进行预处理，在4℃下孵育4小时后，保存了人iPSC神经元的长神经突(poly-ET：绿色；TUBB3：红色；Δ2-T：蓝色)。另参见9A至9E。(图3B)TUBB3+微管长度的积累图和定量(具有式3的化合物：n＝6；PI：n＝5；具有式3的化合物&PI：n＝6；学生t检验；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。(图3C)蛋白质印迹和定量(n＝5)证实，即使在4℃下孵育4小时后，具有式3的化合物或PI预处理仍维持人iPSC-神经元中微管蛋白的蛋白水平(学生t检验；**p<0.01)。(图3D)所提出的模型描述了具有式3的化合物和PI预处理保护人iPSC-神经元免受冷应激损害的机制。比例尺：40μm。
4A至图4E描绘了具有式3的化合物/PI预处理针对长时间的冷应激对大鼠视网膜外植体和小鼠肾脏的保护。(图4A)对TUBB3(红色)免疫染色的大鼠(n＝10)的视网膜神经节细胞(RGC)中的微管形态。(图4B)大鼠视网膜中TUBB3+RGC树突长度的积累图(n＝6；学生t检验；*p<0.05；**p<0.01)。(图4C)在4℃下0h、4h或24h后，自发RGC活性的多电极阵列(MEA)记录。所应用的处理和相应的颜色代表如所示。左上：MEA检测到的活性RGC数量。右上：检测到的RGC的平均激发速率。下：检测到的RGC的激发速率分布。(图4D)4小时冷暴露后，未经处理的或用具有式3的化合物(n＝5)、PI(n＝6)或紫杉醇(n＝6)处理的大鼠RGC的代表性光响应。定量表示为检测到的具有光响应性的RGC的百分比(学生t检验；**p<0.01；***p<0.001)。(图4E)在所示条件下对α-微管蛋白(TUBA；绿色)和DAPI(蓝色)免疫染色的野生型小鼠肾脏的横切面。注意：在标准威斯康星大学溶液中于4℃储存24小时的小鼠肾脏的肾小球和肾小管上皮中的微管蛋白信号(箭头)降低。比例尺：20μm(图4A)；(图4E，上)：25μm；(图4E，中/下)：5μm。见图10A和10B。
图5A至5C描绘了地松鼠的诱导的多能干细胞(GS iPSC)的多能性表征。(图5A)GSiPSC集落的形成和表征(参见方法)。对多能性标记物：碱性磷酸酶(AP)、OCT3/4(绿色)和NANOG(红色)染色呈阳性的GS iPSC集落。(图5B)GS iPSC畸胎瘤的苏木精和曙红染色横截面(参见方法)显示了3-胚层分化能力(箭头)。(图5C)(左图)GS iPSC分化为肝细胞(内胚层的标志性细胞类型)，并被抗肝细胞标记物的抗体染色：白蛋白(绿色)、HFN4(红色)和细胞核染料DAPI(蓝色)。(右图)GS iPSC分化为肌肉细胞(中胚层的标志性细胞类型)，并被抗肌肉细胞标记物的抗体染色：肌钙蛋白T(TNNT，绿色)、DESMIN(红色)和DAPI(蓝色)。比例尺：150μm(图5A和5B)；50μm(图5C)。
图6A和6B描绘了TUBB3过表达和紫杉醇对保护人iPSC神经元的神经元微管免受冷应激的损害的影响。(图6A)在有或没有TUBB3过表达的情况下，4或16小时冷暴露后，人iPSC神经元中总TUBB3、poly-ET和Δ2-T蛋白的蛋白质印迹和定量(n＝5；学生t检验；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。(图6B)在4℃下孵育4或16小时的人iPSC神经元中TUBB3(红色)、poly-E-T(绿色)或Δ2-T(蓝色)的免疫荧光。注意：TUBB3的过表达仅在4h冷应激组中改善了微管的形态；紫杉醇是结合微管并使之稳定的已知药物。冷暴露16小时后，低剂量紫杉醇(0.1μM)不能保护人iPSC神经元微管。比例尺：40μm。
图7A至7G描绘了对GS和人iPSC神经元的生物信息学分析。(图7A)缩放的mRNARPKM值的主成分分析(PCA)的阶乘图。使用了顶部变体mRNA。括号中表示了由主成分解释的方差的比例。(图7B)Venn图，显示了差异表达基因(DEG)的比较。(图7C)M-A图，显示了GS和人iPSC-神经元中基因表达的变化。M：log2 mRNA倍数变化，A：log2百万平均计数(CPM)。红点：显著上调的基因，调整后的P<0.05；蓝点：显著下调的基因，调整后的P<0.05。右上方的彩色数字对应于DEG的数量(上调：红色；下调：蓝色)。(图7D)具有相似表达倍数变化的DEG同源序列的聚类分析。子类的颜色为红色(785个基因)、黄色(1150个)、灰色(598个)、绿色(359个)、紫色(167个)、粉红色(278个)、天蓝色(682个)、蓝色(499个)、黑色(549)、橙色(971)和紫红色(785)(从上到下)。使用DEG倍数变化矩阵的Log2。(图7E)(图7D)的黄色子类中的DEG的GO术语或KEGG途径分析。(图7F)(图7D)的橙色子类中的DEG的GO术语或KEGG途径分析。(图7G)TUBB3预测的乙酰化位点的实例。比对了人类、小鼠、大鼠和地松鼠的TUBB3蛋白序列。多重比对中相同对应位置的相同氨基酸用红色标记。
图8A至8C描绘了冷应激的人iPSC神经元的微管上蛋白质氧化和聚集的关联。(图8A)在人iPSC神经元中，在4℃下孵育4h足以引起蛋白质聚集体沿着微管进程的积累，而用MG-132(一种已知可以诱导细胞蛋白质聚集体形成的蛋白酶体特异性抑制剂)没有显示聚集的任何进一步增加(学生t检验；n.s.不显著；***p<0.001)。该结果与我们的发现相符，即在人iPSC神经元中，调节泛素介导的蛋白质降解的含有vasolin的蛋白(vasolin-containing protein，VCP)和伴侣蛋白(HSP)在4℃下调，从而损害了受损蛋白通过VCP向蛋白酶体的传递。(图8B)GS iPSC-神经元中TUBB3(蓝色)、氧化蛋白质(绿色)和蛋白质聚集体结合染料(红色；参见方法)的免疫荧光。(图8C)人iPSC-神经元中TUBB3(蓝色)、氧化蛋白质(绿色)和蛋白质聚集体结合染料(红色)的免疫荧光。比例尺：20μm。
图9A至9E描绘了冷应激的人iPSC神经元中的PQC系统的关键成分的评估。(图9A)在4℃孵育4小时期间，用蛋白泛素化抑制剂PYR-41预处理没有改善微管形态(poly-E-T：绿色；TUBB3：红色；Δ2-T：蓝色)。(图9B)在4℃孵育16小时后，人和GS iPSC-神经元中含有vasolin的蛋白(VCP)和分子伴侣(HSP60和HSP90)的蛋白质印迹和定量。(n＝5；学生t检验；**p<0.01；n.s.p>0.05，不显著)。(图9C)在4℃孵育4小时后，人和GS iPSC神经元中蛋白酶体亚基PSMB2和PSMB5的蛋白质印迹和定量(n＝5；学生t检验；n.s.不显著；***p<0.001)。(图9D)在4小时冷暴露后，GS和人iPSC-神经元中关键自噬体组分的蛋白质水平保持不变。(图9E)TUBB3(品红色)和LAMP1(绿色；溶酶体标记物)的免疫荧光显示了溶酶体在人iPSC-神经元的微管进程中定位的证据。比例尺：30μm(图9A)；20μm(图9E)。
图10A和10B描绘了具有式3的化合物/PI部分拯救了人iPSC-神经元微管免受过夜冷应激的损害。(图10A)在4℃下孵育16小时的人iPSC神经元中TUBB3(红色)、poly-E-T(绿色)或Δ2-T(蓝色)的免疫荧光。注意：高浓度的具有式3的化合物(5μM；n＝5)表现出差的微管形态。(图10B)4和16小时的冷应激后，人iPSC-神经元的TUBB3+微管的积累图和长度的量化(0.1μM的具有式3的化合物：n＝6；1：500PI：n＝5；0.1μM的具有式3的化合物&1：500PI：n＝6)(学生t检验；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001)。比例尺：40μm。
图11A和11B。在休眠期间，GS视网膜神经元微管形态几乎没有变化。(图11A)夏季活动性GS的视网膜切片上的TUBB3(红色)、poly-E-T(绿色)或Δ2-T(蓝色)的免疫荧光。(图11B)冬季休眠季节期间处于深度蛰伏下的GS的视网膜切片上的TUBB3(红色)、poly-E-T(绿色)或Δ2-T(蓝色)的免疫荧光。活动性和休眠性GS之间的视网膜截面的总体解剖结构没有明显差异。细胞核用DAPI(品红色)染色。ONL-外核层；OPL-外丛状层；INL-内核层；IPL-内丛状层；GCL神经节细胞层。比例尺：50μm。
图12描绘了在小鼠肾脏的冷藏期间具有式3的化合物/PI抑制了由脂质过氧化引起的损害。将健康的野生型小鼠的肾脏切片，并使被脂质过氧化修饰的蛋白质可视化(绿色；参见方法)。比例尺：50μm。
图13A至13H描绘了在GS iPSC-神经元的转录组中鉴定的微管蛋白基因的预测蛋白序列的比对。在人类、小鼠、大鼠和GS的预测微管蛋白蛋白序列中未发现任何物种特异性片段。
讨论
本发明的发明人(以下称为“发明人”)使用抗神经元特异性β-微管蛋白III同种型(TUBB3)和神经元中富含的两种α-微管蛋白同种型(Δ2-T、Poly-ET)的抗体，在4℃下比较了新生GS和大鼠(非休眠者)的培养的皮质神经元中的微管形态。在4℃下四小时诱导了大鼠神经元中的微管碎裂，而在16小时后，大多数微管消失，留下异常的微管蛋白聚集体(图1A)。此外，人类神经元(衍生自iPSC)表现出相似的冷诱导的微管不稳定性(图1B)。与之形成鲜明对比的是，即使在冷暴露16h时，GS神经元也没有显示出退化的迹象，因此似乎含有耐寒微管(图1C)。
为了克服GS神经元的原代培养物的有限可及性并促进体外微管耐寒的机理研究，发明人从新生儿GS皮层建立了GS iPSC系并验证了其多能性(图5A至5C)。与GS皮质原代神经元一样，GS iPSC神经元的微管在37℃和4℃孵育16小时之间几乎没有差异(图1D和1E)，这表明GS iPSC神经元保留了这种内源抗寒性。一致地，TUBB3、poly-ET和Δ2-T的蛋白水平在4℃孵育16小时后保持不变，而在人iPSC神经元中，在4℃孵育4小时之后，微管蛋白水平显著降低(图1F和图6A)。
为了测试冷诱导的微管失稳是否是由于微管蛋白合成受损导致的，使人iPSC神经元中的TUBB3过表达。这种过表达是暂时有效的，在4小时冷暴露期间维持所有三种蛋白质(TUBB3、poly-ET和Δ2-T)的水平并改善微管稳定性(图1F和图6B)，这可能是通过募集poly-E-T和Δ2-T以形成更稳定的聚合物而实现的。然而，这种拯救作用并未扩展到16-h组(图6B)，表明其最终被与微管降解有关的细胞活性超过了。
多种机制可能有助于GS和人iPSC神经元之间的微管稳定性差异。发明人探索了常见的机制，发现：1)微管蛋白的同种型或氨基酸序列是相似的(图7A至7G和8A至8C)；2)常见的神经元富集的翻译后修饰相似(poly-E-T和Δ2-T；图1A至1G)；以及3)在人与GS iPSC神经元中，使微管稳定的MAP(即MAP6)不受温度差异调节。然而，通过检查冷触发的差异表达基因(DEG)的谱并根据其推定的功能和途径将它们聚类(图7A至7G)，鉴定出了两个主要的基因簇：1)线粒体相关基因和2)参与蛋白质质量控制(PQC)的基因，包括蛋白酶相关基因(图1G)。这些差异影响途径促使我们研究在活细胞中线粒体和PQC对寒冷的反应。
为了检查人和GS iPSC神经元中的线粒体对冷暴露的反应是否不同，使用四甲基若丹明乙酯(tetramethylrhodamine ethyl ester，TMRE)荧光在活的培养神经元中监测了线粒体膜电位(Δψm)的变化。温度从37℃降至10℃后，在人iPSC神经元中观察到TMRE荧光强度增加了3％，表明Δψm的超极化(图2A)。相反，在相同条件下，GS iPSC神经元显示出2％的降低，表明去极化(图2A)。由于在正常Δψm范围附近，线粒体的Δψm和ROS产生之间存在陡峭的非线性关系(Starkov，2003)，因此TMRE信号的这些看似适度的变化将对应于活性氧物质(ROS)产生的显著变化。确实，在30分钟的冷暴露后，用CellROX Green在人类中观察到了比GS iPSC-神经元明显更高的冷诱导的ROS产生(图2B)。有趣的是，在分离的小鼠皮质线粒体中，轻度失温具有相似的效果，这表明非休眠者对寒冷有共同的反应(Ali，2010)。此外，当通过添加具有式3的解偶联剂化合物逆转线粒体超极化时，观察到ROS生产显著降低至与寒冷中GS iPSC-神经元相当的水平(图2B)。
据报道，ROS会氧化微管并使之不稳定(Wilson，2015年)。一致地，发现在人iPSC-神经元中氧化蛋白质的水平增加，但在GS iPSC-神经元中没有增加(图2C)。氧化的蛋白质易发生蛋白质-蛋白质交联，从而形成聚集体(Grune，1997；Gregersen，2010)。确实，氧化蛋白的免疫标记揭示了在冷暴露后，在人GS iPSC-神经元中沿着残留微管存在聚集体，但在GS iPSC-神经元中没有(图2D和图8A至8C)。此外，具有式3的化合物防止了氧化的蛋白质沿着微管的积累(图2D)。因此，休眠者可能已经进化为通过使线粒体超极化最小化来逃避氧化应激。一致地，在冬季，与阵间觉醒(inter-bout arousal)期间(37℃)相比，GS脑线粒体在蛰伏期间(5℃)的最大Δψm略微更去极化(Ballinger，2017年)。有趣的是，在两种冬季状态下，Δψm都比春季更极化，这表明可能进行了季节性预调节。从机理上讲，休眠期间增强的脂质代谢所产生的游离脂肪酸(Dedukhova，1991；Skulachev，1991)或内在解偶联蛋白的表达(Staples，2016)可能会导致更高的质子泄漏，从而针对冷诱导的ROS损伤提供保护。
过量的氧化蛋白通常需要泛素-蛋白酶体依赖性PQC系统来去除(Zhang，2014；Goldberg，2003)，溶酶体提供了另一种途径(Iwata，2005；Dunlop，2009；Lee，2012)。然而，在冷处理的人iPSC神经元中，观察到了PQC失调(图1G以及图9B和9C)，并且令人惊讶地发现了溶酶体完整性受损的证据(即溶酶体膜透化，LMP)。在37℃的GS和人iPSC神经元中，MagicRed和DND-26标记离散点(表示溶酶体囊泡)，但在冷暴露的人神经元中更弥漫(图2E；箭头)，这是LMP和细胞质环境酸化的典型迹象。因此，从溶酶体泄漏的蛋白酶准备非故意地消化附近的胞质蛋白，例如相邻的微管(图9E)。
据报道，溶酶体功能障碍会损害微管结构(Fukuda，2006)。相反，不稳定的微管和增强的ROS均已显示可触发LMP(Groth-Pedersen，2007；Boya，2008；Roberg，1998)。确实，用具有式3的化合物或抗氧化剂维生素C降低ROS都减轻了冷暴露的人iPSC-神经元中的LMP(图2F)。综上所述，受损的PQC成分与应激的线粒体引起的ROS过度生产联合可能形成恶性循环，从而在寒冷中导致不可逆的微管损伤和聚集。值得注意的是，GS iPSC神经元对这种不利的细胞反应具有免疫力，这可能是由于在寒冷中独特的脂质重新分布使得细胞器膜完整性增强(Azzam，2000)。
鉴于生物信息学和实验结果，发明人检查了靶向受影响途径的药理干预措施是否可以使非休眠哺乳动物获得GS的微管抗寒性。实际上，在4℃下长时间孵育后，用具有式3的化合物或蛋白酶抑制剂混合物(PI)针对从LMP泄漏的蛋白酶对人iPSC-神经元进行预处理在很大程度上稳定了微管(图3A和3B以及图10A和10B)。此外，两种处理均维持了冷暴露的人细胞中的微管蛋白(图3C)。值得注意的是，PI没有改变Δψm超极化或ROS产生(图2A和2B)，这与线粒体活性下游作用的LMP诱导一致。值得注意的是，具有式3的化合物和PI的组合进一步将微管维持在接近正常水平(图3B)，表明除了触发LMP之外，ROS还可以直接破坏微管，如先前所证明的(图3D，Neely 1999；Landino 2004)。
鉴于这些结果，发明人进一步测试了具有式3的化合物/PI在极端低温下是否也可以保护非休眠者的神经组织。使用了大鼠视网膜制剂，该制剂具有完整的离体神经结构，并且在健康条件下对光有反应。像人iPSC神经元一样，大鼠视网膜中冷暴露的视网膜神经节细胞(RGC)表现出可观的微管破坏，丧失了其大部分树突状微管并沿着其轴突形成了许多微管蛋白聚集体(图4A和4B)。相反，冷暴露的GS的视网膜组织在微管形态上没有显示变化(图11A和11B)。令人惊讶地，将大鼠视网膜与具有式3的化合物和PI一起预孵育大大减少了这些缺陷(图4A和4B)。
然后使用多电极阵列(MEA)记录来测量RGC活性。在4℃下孵育4小时会在很大程度上使RGC沉默，而用具有化学式3的化合物和/或PI进行预处理可显著维持正常的RGC激发速率分布，但10μM紫杉醇(一种微管稳定剂)则不能维持RGC活性(图4C)，即使它在低温下维持了微管(图6B)。重要的是，在正常视网膜中检测到的RGC约有70％是光响应性的(图4D)，相比之下，在4℃下4h后未处理的视网膜中只有5％；然而，具有式3的化合物或PI(但不是紫杉醇)预处理的视网膜显示光响应性增加了7-11倍(图4D)。综上所述，这些结果表明，解偶联的线粒体和/或抑制泄漏的溶酶体蛋白酶不仅增加了微管的稳定性，而且实质上使非休眠的大鼠神经组织耐冷。
发明人进一步测试了这种保护是否可以扩展到非神经组织，例如通常储存在类似于休眠的条件下的等待移植的器官。如以前的报道(Breton，1998；Mangino，2008)，发现在4℃的威斯康星大学(UW)溶液中储存24小时的小鼠肾脏表现出微管损伤，微管蛋白标记急剧减少(尤其是在肾小球中)，并且重新加热后再聚合受限(图4E)。值得注意地，将具有式3的化合物和PI添加至UW溶液中显著改善了寒冷中的微管蛋白信号，并使微管形态在重新加热后显著恢复(图4E)。另外，具有式3的化合物和PI还大大减少了由脂质过氧化引起的蛋白质/DNA损伤(图12)，这是冷藏的已知不利作用(Cotterill，1989；Richer，2000)。这些结果表明，具有式3的化合物/PI处理可以对非神经组织和器官提供冷保护，从而延长其保存期限用于移植。这对于推进失温治疗的应用是有希望的，例如在心脏骤停、局部缺血性中风或颅脑外伤中，在这些治疗中克服冷诱导的细胞损伤已成为主要挑战(Marion，1997)。如本公开中所证明的，GS iPSC可用于进一步阐明休眠者中冷适应的细胞机制，以在降低伤害的同时利用失温的保护作用。
已经根据示例性原理和实施方案描述了本发明构思，但是本领域技术人员将认识到，在不脱离所定义的本公开的范围和精神的情况下，可以做出变化并且用等同物代替所描述的内容。

Claims (20)

1.一种用于在暴露于低温环境期间保持细胞、组织或器官的活力的组合物，所述组合物包含：
线粒体解偶联剂；
至少一种蛋白酶抑制剂；和
还原剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述线粒体解偶联剂是由式1表示的化合物：
式1
Figure FDA0002457254020000011
其中：
R1和R2各自独立地是氢、氘、-F、-Cl、-Br、-I、羟基基团、氰基基团、硝基基团、氨基基团、脒基、肼基、腙基、羧酸基团或其盐、磺酸基团或其盐、磷酸基团或其盐、取代或未取代的C1-C30烷基基团、取代或未取代的C2-C30烯基基团、取代或未取代的C2-C30炔基基团、取代或未取代的C1-C30烷氧基基团、取代或未取代的C3-C30环烷基基团、取代或未取代的C1-C30杂环烷基基团、取代或未取代的C3-C30环烯基基团、取代或未取代的C1-C30杂环烯基基团、取代或未取代的C6-C30芳基基团、取代或未取代的C6-C30芳氧基基团、取代或未取代的C6-C30芳硫基基团、取代或未取代的C7-C30芳烷基基团、取代或未取代的C1-C30杂芳基基团、取代或未取代的C2-C30杂芳氧基基团、取代或未取代的C2-C30杂芳硫基基团、取代或未取代的C3-C30杂芳烷基基团和-Si(Q1)(Q2)(Q3)，其中Q1-Q3各自独立地选自氢、C1-C30烷基基团、C1-C30烷氧基基团、C3-C30环烷基基团、C1-C30杂环烷基基团、C3-C30环烯基基团、C1-C30杂环烯基基团、C6-C30芳基基团和C1-C30杂芳基基团；并且
n1和n2各自独立地是1至5的整数。
3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述线粒体解偶联剂是由式2表示的化合物：
式2
Figure FDA0002457254020000021
其中：
R1和R2各自独立地是氢、氘、-F、-Cl、-Br、-I、羟基基团、氰基基团、硝基基团、氨基基团、脒基、肼基、腙基、羧酸基团或其盐、磺酸基团或其盐、磷酸基团或其盐、取代或未取代的C1-C30烷基基团、取代或未取代的C2-C30烯基基团、取代或未取代的C2-C30炔基基团、取代或未取代的C1-C30烷氧基基团、取代或未取代的C3-C30环烷基基团、取代或未取代的C1-C30杂环烷基基团、取代或未取代的C3-C30环烯基基团、取代或未取代的C1-C30杂环烯基基团、取代或未取代的C6-C30芳基基团、取代或未取代的C6-C30芳氧基基团、取代或未取代的C6-C30芳硫基基团、取代或未取代的C7-C30芳烷基基团、取代或未取代的C1-C30杂芳基基团、取代或未取代的C2-C30杂芳氧基基团、取代或未取代的C2-C30杂芳硫基基团、取代或未取代的C3-C30杂芳烷基基团和-Si(Q1)(Q2)(Q3)，其中Q1-Q3各自独立地选自氢、C1-C30烷基基团、C1-C30烷氧基基团、C3-C30环烷基基团、C1-C30杂环烷基基团、C3-C30环烯基基团、C1-C30杂环烯基基团、C6-C30芳基基团和C1-C30杂芳基基团。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中R1和R2各自独立地为氢、-F、-Cl、-Br或-I。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中所述线粒体解偶联剂是具有式3的化合物：
式3
Figure FDA0002457254020000031
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述至少一种蛋白酶抑制剂包括半胱氨酸蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、亮氨酸氨基肽酶抑制剂或其组合。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中
所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂是(1S,2S)-2-(((S)-1-((4-胍基丁基)氨基)-4-甲基-1-氧代戊-2-基)氨基甲酰基)环丙烷羧酸(“E-64”)，
所述天冬氨酸蛋白酶抑制剂是具有序列Iva-Val-Val-Sta-Ala-Sta(“Pepstatin A”)的肽，
所述丝氨酸蛋白酶抑制剂是4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟(“AEBSF”)，并且
所述亮氨酸氨基肽酶抑制剂是(2S)-2-[[(2S,3R)-3-氨基-2-羟基-4-苯基丁酰基]氨基]-4-甲基戊酸(“Bestatin”)。
8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述还原剂是抗坏血酸。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中
所述线粒体解偶联剂是具有式3的化合物：
式3
Figure FDA0002457254020000041
所述至少一种蛋白酶抑制剂是E-64、Pepstatin A、AEBSF和Bestatin的组合，并且
所述还原剂是抗坏血酸。
10.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物与冷冻保存剂组合。
11.一种处理哺乳动物细胞、组织或器官以承受治疗、处理或医疗程序期间暴露于低温环境的方法，所述方法包括以下步骤：
提供将要暴露于低温环境的哺乳动物细胞、组织或器官；
提供一种组合物，所述组合物包含线粒体解偶联剂、至少一种蛋白酶抑制剂和还原剂；
使所述哺乳动物细胞、组织或器官与所述组合物接触，以使所述哺乳动物细胞、组织或器官能够承受暴露于低温环境。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述线粒体解偶联剂是由式1表示的化合物：
式1
Figure FDA0002457254020000042
其中：
R1和R2各自独立地是氢、氘、-F、-Cl、-Br、-I、羟基基团、氰基基团、硝基基团、氨基基团、脒基、肼基、腙基、羧酸基团或其盐、磺酸基团或其盐、磷酸基团或其盐、取代或未取代的C1-C30烷基基团、取代或未取代的C2-C30烯基基团、取代或未取代的C2-C30炔基基团、取代或未取代的C1-C30烷氧基基团、取代或未取代的C3-C30环烷基基团、取代或未取代的C1-C30杂环烷基基团、取代或未取代的C3-C30环烯基基团、取代或未取代的C1-C30杂环烯基基团、取代或未取代的C6-C30芳基基团、取代或未取代的C6-C30芳氧基基团、取代或未取代的C6-C30芳硫基基团、取代或未取代的C7-C30芳烷基基团、取代或未取代的C1-C30杂芳基基团、取代或未取代的C2-C30杂芳氧基基团、取代或未取代的C2-C30杂芳硫基基团、取代或未取代的C3-C30杂芳烷基基团和-Si(Q1)(Q2)(Q3)，其中Q1-Q3各自独立地选自氢、C1-C30烷基基团、C1-C30烷氧基基团、C3-C30环烷基基团、C1-C30杂环烷基基团、C3-C30环烯基基团、C1-C30杂环烯基基团、C6-C30芳基基团和C1-C30杂芳基基团；并且
n1和n2各自独立地是1至5的整数。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述至少一种蛋白酶抑制剂包括半胱氨酸蛋白酶抑制剂、天冬氨酸蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、亮氨酸氨基肽酶抑制剂或其组合。
14.根据权利要求11所述的方法，其中所述还原剂是抗坏血酸。
15.根据权利要求11所述的方法，其中
所述线粒体解偶联剂是具有式3的化合物：
式3
Figure FDA0002457254020000051
所述至少一种蛋白酶抑制剂是E-64、Pepstatin A、AEBSF和Bestatin的组合，并且
所述还原剂是抗坏血酸。
16.根据权利要求11所述的方法，其中在与所述哺乳动物细胞接触之前，使所述组合物与作为溶液的冷冻保存剂组合。
17.根据权利要求11所述的方法，其中提供组合物的步骤包括：将单独制备的具有式3的化合物、E-64、Pepstatin A、AEBSF、Bestatin和抗坏血酸的混合物在溶剂介质中混合，其中
溶剂介质中具有式3的化合物的浓度为0.05至0.2μM；
溶剂介质中E-64的浓度为3至5μM；
溶剂介质中Pepstatin A的浓度为2至4μM；
溶剂介质中AEBSF的浓度为100至200μM；
溶剂介质中Bestatin的浓度为10至20μM；以及
溶剂介质中抗坏血酸的浓度为50至300μM。
18.根据权利要求11所述的方法，其中所述哺乳动物细胞、组织或器官选自由以下组成的组：神经元细胞、视网膜细胞、角膜、视网膜、皮肤、心脏、肺、胰腺、肾脏、肝脏、肠、干细胞和血液。
19.根据权利要求11所述的方法，其还包括以下步骤：将所述接触的细胞、组织或器官暴露于2℃至5℃的温度下6至24小时。
20.根据权利要求11所述的方法，其中所述治疗、处理或医学程序是器官或细胞移植、失温、休眠或器官、组织或细胞的储存。
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