CN112094805A - 一种脊髓成纤维细胞的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脊髓成纤维细胞的制备方法，1)取脊柱组织，用含双抗的磷酸盐缓冲液清洗至无血细胞，再用培养液冲洗至椎管中无脊髓；2)取步骤1)所得干净组织，剪成块，加含双抗的磷酸盐缓冲液离心，取下层组织块，加胰蛋白酶溶液消化，再加培养液离心，取下层固体，加培养液重悬；3)取步骤2)所得重悬细胞，接种于培养液中培养至细胞密度达85～95％，用胰蛋白酶溶液消化后重铺细胞，再培养30～40min，弃去培养液和未贴壁细胞，加培养液培养至细胞密度达85～95％，即得。本发明脊髓成纤维细胞的制备方法，简便高效，制备得到的脊髓成纤维细胞纯度高。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种脊髓成纤维细胞的制备方法。
背景技术
脊髓损伤(SCI)是脊柱损伤最严重的并发症，导致损伤节段以下肢体严重的功能障碍，不仅会给患者本人带来身体和心理的严重伤害，还会给整个社会造成巨大的经济负担，针对脊髓损伤的治疗和康复一直是当今医学界的研究热点和难点。
SCI后神经元轴突的再生是损伤后修复的细胞学基础和神经功能恢复的关键，其中提高轴突内生力、缩短轴突再生时间是SCI后神经功能恢复的保障。SCI后轴突的再生不仅要穿过损伤区域连通失神经支配的靶点，还要生成新的突触并形成有效的突触传递。以上再生过程主要与SCI后微环境中神经营养因子、髓磷脂相关抑制因子以及瘢痕形成有密切关系。研究证实，SCI后瘢痕形成对轴突再生和神经功能恢复起到主要的抑制作用，瘢痕的形成是一系列、动态、复杂的过程。在损伤后7天左右，成纤维细胞(fibroblasts)由损伤区域临近的硬脊膜和血管外周细胞的入侵，而后激活、增生肥大，最终形成纤维瘢痕，其对突触再生和功能恢复起着机械屏障和生物抑制作用：(1)活动性增生肥大且分泌细胞外基质(extracellular matrix,ECM)，包括：IV型胶原、纤维连接蛋白和层粘连蛋白等，形成阻碍突触生长的机械屏障；(2)分泌多种的突触生长抑制分子：NG2蛋白聚糖、肌腱蛋白C、semaphorin 3A和EphB2等，形成了阻碍功能恢复的生物障碍。通过抑制成纤维细胞的激活和增殖，实现抑制SCI后纤维瘢痕的形成，可以为轴突再生创造良好的微环境。
目前作为研究基础的脊髓成纤维细胞难以获得，市面上尚未有脊髓成纤维细胞系，亦未有见针对原代脊髓成纤维细胞的提取的公认、公开、可行的方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种脊髓成纤维细胞的制备方法，它包括如下步骤：
1)取脊柱组织，用含双抗的磷酸盐缓冲液清洗至无血细胞，再用培养液冲洗至椎管中无脊髓；
2)取步骤1)所得干净组织，剪成块，加含双抗的磷酸盐缓冲液离心，取下层组织块，加胰蛋白酶溶液消化，再加培养液终止消化，离心，取下层固体，加培养液重悬；
3)取步骤2)所得重悬细胞，接种于培养液中培养至细胞密度达85～95％，用胰蛋白酶溶液消化后重铺细胞，再培养30～40min，弃去培养液和未贴壁细胞，加培养液培养至细胞密度达85～95％，即得。
进一步地，步骤1)所述脊柱组织是包含脊髓的新鲜脊柱组织。
进一步地，所述含双抗的磷酸盐缓冲液是含1％双抗的磷酸盐缓冲液；所述磷酸盐缓冲液浓度为0.01mol/L，pH值7.4。
进一步地，所述培养液是含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM细胞培养基。
进一步地，步骤2)所述干净组织剪成0.5-1mm3的块状；所述干净组织与含双抗的磷酸盐缓冲液的质量体积比1～5g：10ml，优选1g：10ml；所述加含双抗的磷酸盐缓冲液离心的速度1000rpm/min，时间3min。
进一步地，步骤2)所述胰蛋白酶溶液的加入量为下层组织块的10倍量v/w，ml/g；所述加胰蛋白酶溶液消化时间10～20min，优选15min；所述终止消化的培养液加入量为胰蛋白酶溶液的2倍量v/v，ml/ml；所述离心的速度1000rpm/min，时间5min。
更进一步地，步骤2)所述胰蛋白酶溶液浓度为0.1～0.15％，优选0.125％。
进一步地，步骤2)所述加培养液重悬至细胞密度1.2-1.6×105个/ml。
进一步地，步骤3)所述培养条件为温度37℃，CO2浓度5％；所述重悬细胞接种于培养液培养24h后换液，再持续培养至细胞密度达85～95％期间，每48h换液一次。
更进一步地，所述重悬细胞接种于培养液中培养至细胞密度达90％。
进一步地，步骤3)所述胰蛋白酶溶液的加入量为每5×105个细胞加1ml胰蛋白酶；所述胰蛋白酶溶液浓度为0.2～0.3％，优选0.25％；所述消化至细胞回缩变圆、透亮、轻拍瓶壁呈流沙样脱落。
进一步地，步骤3)所述加培养液至覆盖培养容器底部；所述加培养液培养期间每2～3天换液一次。
本发明脊髓成纤维细胞的制备方法，简便高效，制备得到的脊髓成纤维细胞纯度高。基于本发明方法制备的原代脊髓成纤维细胞建立机械损伤模型，可用以检测损伤前后相关纤维化指标的变化，为临床寻找检验指标和最佳治疗时间窗提供了帮助。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1光学显微镜结果
图2细胞免疫荧光鉴定结果
图3以脊髓成纤维细胞(小鼠来源)为基础的机械损伤模型的研究结果
图4以脊髓成纤维细胞(小鼠来源)为基础的药物刺激模型的研究结果
具体实施方式
实施例1、本发明脊髓成纤维细胞的制备
使用的试剂：
培养液为：含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM细胞培养基；
含1％双抗的1×PBS(pH＝7.4)为：pH7.4的不含Ca2+和Mg2+，含1％双抗的0.01mol/L磷酸盐缓冲液；
制备方法：
1.超净工作台中，将包含脊髓的新鲜脊柱组织300mg，置于无菌的培养皿中用含1％双抗的1×PBS(pH＝7.4)清洗至无血细胞；
2.在干净的培养皿中，用注射器吸取培养液注入椎管将脊髓冲出；
3.将清洗好的组织剪成0.5mm3大小，加入10倍量(v/w，ml/g)的含1％双抗的1×PBS(pH＝7.4)，在1000rpm/min条件下离心3min，倾去液体，加入10倍量(v/w，ml/g)的0.125％胰蛋白酶，37℃震荡消化15min，再加入2倍于胰蛋白酶溶液体积的培养液中和，1000rpm/min离心5min，弃上清，加入培养液重悬细胞至密度1.2～1.6×105个/ml，并接种于装有培养液的T-25培养瓶中，T-25培养瓶放置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，24h后换液，再持续培养细胞一周，期间每48h换液一次，细胞密度达90％时，每瓶加入1ml 0.25％胰蛋白酶溶液消化至细胞回缩变圆、透亮、轻拍瓶壁呈流沙样脱落，再加入2ml培养液终止消化，重铺细胞，铺瓶后在培养箱中放置30min，吸出培养液，弃去未贴壁细胞，每瓶加入4ml培养液，放置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，每2天换液，至细胞密度达85～95％即得脊髓成纤维细胞。
实施例2、本发明脊髓成纤维细胞的制备
使用的试剂：
培养液为：含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM细胞培养基；
含1％双抗的1×PBS(pH＝7.4)为：pH7.4的不含Ca2+和Mg2+，含1％双抗的0.01mol/L磷酸盐缓冲液；
制备方法：
1.超净工作台中，将包含脊髓的新鲜脊柱组织500mg，置于无菌的培养皿中用含1％双抗的1×PBS(pH＝7.4)清洗至无血细胞；
2.在干净的培养皿中，用注射器吸取培养液注入椎管将脊髓冲出；
3.将清洗好的组织剪成1mm3大小，加入10倍量(v/w，ml/g)的含1％双抗的1×PBS(pH＝7.4)，在1000rpm/min条件下离心3min，倾去液体，加入10倍量(v/w，ml/g)的0.125％胰蛋白酶，37℃震荡消化15min，再加入2倍于胰蛋白酶溶液体积的培养液中和，1000rpm/min离心5min，弃上清，加入培养液重悬细胞至密度1.2～1.6×105个/ml，并接种于装有培养液的T-25培养瓶中，T-25培养瓶放置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，24h后换液，再持续培养细胞一周，期间每48h换液一次，细胞密度达90％时，每瓶用1ml0.25％胰蛋白酶溶液消化至细胞回缩变圆、透亮、轻拍瓶壁呈流沙样脱落，再加入2ml培养液终止消化，重铺细胞，铺瓶后在培养箱中放置40min，吸出培养液，弃去未贴壁细胞，每瓶加入4ml培养液，放置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，每3天换液，至细胞密度达85～95％即得脊髓成纤维细胞。
以下通过试验例来说明本发明的有益效果。
试验例1
由于脊髓神经细胞不可再生的特点，关于脊髓的医学基础研究伦理上无法从灵长类活体取得脊髓组织，故医学基础研究通常用鼠源类细胞代替，一般常用SPF级实验大鼠或小鼠的乳鼠新鲜脊髓组织。
一、细胞来源
小鼠/大鼠的正常乳鼠新鲜脊髓组织
二、实验试剂
1.培养液：DMEM细胞培养基+10％FBS+1％P/S
2.冻存液：DMEM细胞培养基+20％FBS+10％DMSO
3.洗涤液：不含Ca2+和Mg2+的1×PBS+1×P/S，pH7.4
4.消化液：0.125％胰蛋白酶，0.25％胰蛋白酶
5.双抗：青链霉素混合液
三、实验器械
1.细胞培养皿
2.细胞培养瓶T25
3.手术刀、解剖剪、眼科剪
4.解剖镊、眼科镊
5.离心管(15ml、50ml)
四、实验步骤
1.超净工作台中，将包含脊髓的新鲜脊柱组织，置于无菌的培养皿中用洗涤液清洗若干次至无血细胞。
2.在干净的培养皿中，用1ml注射器吸取培养液注入椎管将脊髓冲出。
3.将清洗好的组织剪成0.5-1mm3大小，加入洗涤液清洗。
4.用无菌移液管将剪碎的组织块和洗涤液一起转入15ml离心管中。
5.1000rpm/min离心3min，小心倾去液体，加入10倍量(v/w，ml/g)的消化液，37℃震荡消化15min。
6.加入双倍于胰蛋白酶溶液(v/v，ml/ml)的培养液中和，1000rpm/min离心5min，弃上清。
7.加入新的培养液重悬细胞至密度1.2～1.6×105个/ml，接种于T-25培养瓶中，放置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，24h后换液。
8.持续培养细胞一周，每48h换液一次，细胞密度达85-95％。用1ml0.25％胰蛋白酶溶液消化至细胞回缩变圆、透亮、轻拍瓶壁呈流沙样脱落时，加入2ml培养液终止消化，重铺细胞，铺瓶后在培养箱中放置30-40min，吸出培养液，弃去未贴壁细胞。
9.另加入4ml(即T-25培养瓶底部面积)培养液后，放置于37℃、5％CO2的培养箱中培养，每2-3天换液，至细胞密度达85-95％，即得脊髓成纤维细胞。
五、脊髓成纤维细胞鉴定检测方法
①光学显微镜观察：使用光学显微镜观察制备得到的脊髓成纤维细胞，细胞呈长梭形，旋涡状生长，则符合成纤维细胞的特征；
②免疫荧光鉴定：对制备得到的脊髓成纤维细胞一型胶原的表达情况进行免疫荧光法鉴定，绿色为一型胶原表达，蓝色为核染。由于一型胶原是成纤维细胞最特征性表达的蛋白，所以其为最常用以鉴定成纤维细胞的指标。
免疫荧光法鉴定方法为：使用六孔板爬片培养脊髓成纤维细胞48h后取出爬片，固定，血清封闭，一型胶原一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育60min，PBS冲洗，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色，PBS洗涤封片后于荧光显微镜下观察并采集图像。
③以制备得到的脊髓成纤维细胞为基础进行机械划痕损伤，建立体外脊髓机械损伤模型，用以反映机械创伤对成纤维细胞活化及纤维瘢痕形成的影响。PCR检测成纤维活化指标(一型胶原和黏连蛋白)的mRNA，用以比较机械损伤对成纤维活化的影响；高通量测序检测机械损伤前后差异表达的miRNA，为损伤机制的研究和干预寻找靶点。
体外脊髓机械损伤模型构建方法为：
六孔板用马克笔在底部标记间距5mm，呈“#”字形格线后，P3/P4代成脊髓纤维细胞传代种植于六孔板中，待细胞生长至90％融合后，用无菌200μL移液器吸头沿预画线均匀划出横纵划痕，划痕宽度约1mm。PBS冲洗两遍后每孔加2ml培养液继续培养。
PCR检测一型胶原和黏连蛋白的mRNA方法为：
于损伤后48h取足量损伤位置处细胞及对照组细胞用Trizol法提取各组的总RNA，在紫外荧光光度计中进行吸光度A260/280和A260/230比值的测定以确定样品总RNA的纯度和浓度，后反转录为cDNA，取适量cDNA为模板配制20μL反应体系在PCR扩增仪中进行PCR反应。使用SYBR染料实时检测扩增情况，蛋白编码基因使用GAPDH为内参分析表达情况。一型胶原和黏连蛋白编码基因扩增条件为95℃预变性30s，随后95℃5s，退火延伸60℃34s(40个循环)实验重复3次，数据采用2-ΔΔCt法进行分析。
高通量测序差异表达的miRNA的方法为：
于损伤后48h取足量损伤位置处细胞及对照组细胞用Trizol法提取各组的总RNA，在紫外荧光光度计中进行吸光度A260/280和A260/230比值的测定以确定样品总RNA的纯度和浓度后，磁珠纯化，酶降解，PCR扩增即建立测序文库，使用HiSeq系统完成测序。
④以制备得到的脊髓成纤维细胞为基础进行药物(TGF-β1)刺激，模拟脊髓损伤后转录调控作用对纤维瘢痕形成的影响。使用TGF-β1刺激脊髓成纤维原代细胞后检测活化指标的表达情况，进一步使用lncRNA模拟物干预转录后调控作用。
TGF-β1刺激模型构建方法为：
六孔板培养脊髓成纤维细胞至60％–80％融合时，每孔加入10ng/ml TGF-β1，培养48h。
检测活化指标的表达情况的方法为：
取TGF-β1刺激模型实验组和对照组，提取蛋白质，免疫印迹试验设备中上样、电泳、转膜、洗膜、封闭，在一型胶原、黏连蛋白和Smad通路蛋白一抗中4℃孵育过夜，2抗室温孵育后曝光显色，获得图像。
使用lncRNA模拟物干预转录调控的方法为：
六孔板培养脊髓成纤维细胞至30％–40％融合时，加入lncRNA模拟物，待细胞增殖到60％–80％融合时，每孔加入10ng/ml TGF-β1，培养48h，即可获取细胞。
六、结果分析
实验制备的脊髓成纤维细胞的光学显微观察结果见图1，免疫荧光鉴定结果见图2，以脊髓成纤维细胞(小鼠来源)为基础的机械损伤模型的研究应用结果见图3。以脊髓成纤维细胞(小鼠来源)为基础的药物刺激模型的研究应用结果见图4。
从图1可见：本发明制备得到的细胞为原代小鼠脊髓成纤维细胞；从图2可见：本发明制备的脊髓成纤维细胞有极高的纯度；从图3可见：机械损伤后损伤部位脊髓成纤维细胞变形明显，且活化指标表达量升高，证明以脊髓成纤维细胞(小鼠来源)为基础的机械损伤模型成功构建，且有大量miRNA差异表达证明此种模型有广泛的应用价值。从图4可见：使用TGF-β1刺激脊髓成纤维原代细胞后，成纤维活化指标表达升高，证明脊髓成纤维细胞(小鼠来源)为基础的药物刺激模型成功构建。进一步使用lncRNA模拟物干预后，活化指标产生显著差异表达，证明此模型具有探究脊髓损伤后脊髓成纤维细胞的转录后调控机制和筛选靶向拮抗纤维瘢痕药物的巨大应用价值。
综上，本发明脊髓成纤维细胞的制备方法，简便高效，制备得到的脊髓成纤维细胞纯度高。基于本发明方法制备的原代脊髓成纤维细胞建立机械损伤模型，可用以检测损伤前后相关纤维化指标的变化，为临床寻找检验指标和最佳治疗时间窗提供了帮助。
Claims (12)
1.一种脊髓成纤维细胞的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
1)取脊柱组织，用含双抗的磷酸盐缓冲液清洗至无血细胞，再用培养液冲洗至椎管中无脊髓；
2)取步骤1)所得干净组织，剪成块，加含双抗的磷酸盐缓冲液离心，取下层组织块，加胰蛋白酶溶液消化，再加培养液终止消化，离心，取下层固体，加培养液重悬；
3)取步骤2)所得重悬细胞，接种于培养液中培养至细胞密度达85～95％，用胰蛋白酶溶液消化后重铺细胞，再培养30～40min，弃去培养液和未贴壁细胞，加培养液培养至细胞密度达85～95％，即得。
2.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于：步骤1)所述脊柱组织是包含脊髓的新鲜脊柱组织。
3.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于：所述含双抗的磷酸盐缓冲液是含1％双抗的磷酸盐缓冲液；所述磷酸盐缓冲液浓度为0.01mol/L，pH值7.4。
4.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于：所述培养液是含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM细胞培养基。
5.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于：步骤2)所述干净组织剪成0.5-1mm3的块状；所述干净组织与含双抗的磷酸盐缓冲液的质量体积比1～5g：10ml，优选1g：10ml；所述加含双抗的磷酸盐缓冲液离心的速度1000rpm/min，时间3min。
6.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于：步骤2)所述胰蛋白酶溶液的加入量为下层组织块的10倍量v/w，ml/g；所述加胰蛋白酶溶液消化时间10～20min，优选15min；所述终止消化的培养液加入量为胰蛋白酶溶液的2倍量v/v，ml/ml；所述离心的速度1000rpm/min，时间5min。
7.根据权利要求1或6所述提取方法，其特征在于：步骤2)所述胰蛋白酶溶液浓度为0.1～0.15％，优选0.125％。
8.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于：步骤2)所述加培养液重悬至细胞密度1.2-1.6×105个/ml。
9.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于：步骤3)所述培养条件为温度37℃，CO2浓度5％；所述重悬细胞接种于培养液培养24h后换液，再持续培养至细胞密度85～95％期间，每48h换液一次。
10.根据权利要求1或9所述提取方法，其特征在于：所述重悬细胞接种于培养液中培养至细胞密度达90％。
11.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于：步骤3)所述胰蛋白酶溶液的加入量为每5×105个细胞加1ml胰蛋白酶；所述胰蛋白酶溶液浓度为0.2～0.3％，优选0.25％；所述消化至细胞回缩变圆、透亮、轻拍瓶壁呈流沙样脱落。
12.根据权利要求1所述提取方法，其特征在于：步骤3)所述加培养液至覆盖培养容器底部；所述加培养液培养期间每2～3天换液一次。
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- 2020-08-24 CN CN202010858593.0A patent/CN112094805A/zh active Pending
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