CN112094748B - 一种底栖硅藻的半固体悬浮培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提出一种底栖硅藻的半固体悬浮培养方法，涉及藻类培养技术领域。该培养方法，包括如下步骤：(1)配制基质水溶液，其中，所述基质包括海藻酸钠和羧甲基纤维素钠；(2)配制营养盐混合物；(3)将上述营养盐混合物溶解于上述基质水溶液，得中间混合溶液；(4)将底栖硅藻接种到上述中间混合溶液中，得含有底栖硅藻的混合溶液；(5)将钙化剂溶解于上述含有底栖硅藻的混合溶液中，得底栖硅藻半固体培养液；(6)培养上述底栖硅藻半固体培养液。

Description

一种底栖硅藻的半固体悬浮培养方法
技术领域
本发明属于藻类培养技术领域，尤其涉及一种底栖硅藻的半固体悬浮培养方法。
背景技术
底栖硅藻是一类重要的微藻类群，作为最主要的初级生产者，是匍匐型贝类如鲍、蝾螺，埋栖型贝类如缢蛏、泥蚶，以及底栖动物如海参、海胆等名贵水产动物苗种的重要饵料。
底栖硅藻营底栖生活，底栖硅藻的生长受到了营养物质和附着面积的双重限制。目前，普遍采用的底栖硅藻的培养方法为先通过海区刮洗池底，擦洗大型海藻表面后过滤等方法获得底栖硅藻藻种，再采用固定化细胞培养方法进行育苗养殖。
然而，此种培养方式存在诸多问题。例如，藻种不纯，施肥后蓝藻等杂藻会与底栖硅藻争夺生长资源，导致底栖硅藻生长缓慢、密度低，甚至培养失败。又如，固定化培养时，固定化材料不利于藻种生长，如常用的固定化材料包括玻片，海绵等，玻璃的密度高，易堆叠，无法充分利用水体；海绵透光性差，且细胞洗脱困难。因此，上述问题导致底栖硅藻大规模培养十分困难，限制了底栖硅藻单种培养技术在育苗生产中推广应用。
发明内容
本发明提供一种底栖硅藻的半固体悬浮培养方法，以解决底栖硅藻无法大规模培养的技术问题。
本发明提出一种底栖硅藻的半固体悬浮培养方法，包括如下步骤：
(1)配制基质水溶液，其中，所述基质包括海藻酸钠和羧甲基纤维素钠；
(2)配制营养盐混合物；
(3)将上述营养盐混合物溶解于上述基质水溶液，得中间混合溶液；
(4)将底栖硅藻接种到上述中间混合溶液中，得含有底栖硅藻的混合溶液；
(5)将钙化剂溶解于上述含有底栖硅藻的混合溶液中，得底栖硅藻半固体培养液；
(6)培养上述底栖硅藻半固体培养液。
进一步地，基质水溶液中基质、营养盐混合物、钙化剂的质量比为20：(0.8～1.5)：0.5。
进一步地，步骤(1)中，基质与水的质量比为1：400～600；优选的，基质与水的质量比为1：500。
进一步地，步骤(1)中，所述海藻酸钠和羧甲基纤维素钠的质量比为1：1。
进一步地，步骤(1)具体为：40～60℃，将海藻酸钠和羧甲基纤维素钠溶于水中，冷却至室温，得基质水溶液。
进一步地，步骤(2)中，所述营养盐混合物由包括如下重量份数原料组成：硅酸钠20～40份；硝酸钠30～60份；磷酸二氢钾5～10份；硫酸镁10～20份；柠檬酸铁铵0.5～2份。
进一步地，步骤(4)中，底栖硅藻按照体积比为1：1接种；接种密度为(0.5～1.0)×106cell/mL。
进一步地，步骤(5)具体为，400～600r/min的条件下，钙化剂溶解于上述含有底栖硅藻的混合溶液；
优选的；所述钙化剂为氯化钙。
进一步地，步骤(6)中，培养时：温度为10～20℃，光暗比为(10～18)：(14-6)，光照强度为1000～2000LUX。
进一步地，步骤(6)中，所述底栖硅藻包括三角褐指藻、小环藻、舟形藻、菱形藻或卵形藻。
本发明具有以下优势：
本发明提出的底栖硅藻的半固体悬浮培养方法，充分考虑底栖硅藻附着生长的特性，将其均匀分散于固体悬浮液中，可使其高效利用营养物质和光照，使底栖硅藻快速生长。直接接种底栖硅藻，有效避免其他菌种的干扰，便于收集。该方法操作简易，可应用性强，利于规模化生产。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
底栖硅藻生长的重要特点是其附着性，不像浮游微藻能立体地利用水体，在悬浮状态下就可以高效利用营养物质。因此，要对底栖硅藻的培养条件进行研究和优化，进行高密度大规模的培养底栖硅藻的关键。
本发明一实施例提出一种底栖硅藻的半固体悬浮培养方法，包括如下步骤
(1)配制基质水溶液；
(2)配制营养盐混合物；
(3)将上述营养盐混合物溶解于上述基质水溶液，得中间混合溶液；
(4)将底栖硅藻接种到上述中间混合溶液中，得含有底栖硅藻的混合溶液；
(5)将钙化剂溶解于上述含有底栖硅藻的混合溶液中，得底栖硅藻半固体培养液；
(6)培养上述底栖硅藻半固体培养液。
本发明实施例提出的底栖硅藻的新型培养方法，首先，将基质水溶液与营养盐混合，然后，将藻种接种到混合溶液中，在搅拌状态下，再将钙化剂加入到基质水溶液中，钙离子与基质中的海藻酸钠反应，产生絮状凝胶，底栖硅藻细胞被包裹在絮状凝胶中，而羧甲基纤维素钠作为悬浮剂，使絮状凝胶虚浮于溶液中，如此，形成半固体悬浮培养。
该培养方法充分考虑底栖硅藻附着生长的特性，将其均匀分散于固体悬浮液中，可使其高效利用营养物质和光照，使底栖硅藻快速生长。直接接种底栖硅藻，有效避免其他菌种的干扰，便于收集。该方法操作简易，可应用性强，利于规模化生产。
优选的，营养盐混合物、钙化剂、基质水溶液中基质的质量比为20：(0.8～1.5)：0.5。
本发明一实施例中，步骤(1)中，基质与水的质量比为1：400～600；优选的，基质与水的质量比为1：500。
本发明一实施例中，步骤(1)中，所述基质包括海藻酸钠和羧甲基纤维素钠；优选的，所述海藻酸钠和羧甲基纤维素钠的质量比为1：1。
本发明一实施例中，步骤(1)具体为：40～60℃，将海藻酸钠和羧甲基纤维素钠溶于水中，冷却至室温，得基质水溶液。
本发明一实施例中，步骤(2)中，所述营养盐混合物由包括如下重量份数原料组成：硅酸钠20～40份；硝酸钠30～60份；磷酸二氢钾5～10份；硫酸镁10～20份；柠檬酸铁铵0.5～2份。所述营养盐混合物直接将各组分混合即可。
本发明一实施例中，步骤(4)中，底栖硅藻按照v/v为1：1接种；接种密度为(0.5～1.0)×106cell/mL。
本发明一实施例中，步骤(5)中，所述钙化剂为氯化钙。
具体地，400～600r/min的条件下，钙化剂溶解于上述含有底栖硅藻的混合溶液。优选的，将钙化剂溶解于含有底栖硅藻的混合溶液时，搅拌的速度为500r/min。
本发明一实施例中，步骤(6)中，培养时：温度为10～20℃，光暗比为(10～18)：(14-6)，光照强度为1000～2000LUX。
本发明一实施例中，步骤(6)中，所述底栖硅藻包括三角褐指藻、小环藻、舟形藻、菱形藻或卵形藻。
下面将结合实施例详细阐述本发明。
实施例1一种三角褐指藻的半固体悬浮培基配制方法，包括以下步骤：
(1)基质水溶液的配制：500r/min、50℃，将海藻酸钠和羧甲基纤维素钠(质量比为1：1)分别按照质量比为1：500溶于水后，冷却至室温，得基质水溶液。
(2)营养盐混合物的配制：硅藻营养盐由硅酸钠、硝酸钠、磷酸二氢钾、硫酸镁、柠檬酸铁铵组成(各组成分见表1)。
(3)培养基配制：将上述基质水溶液和营养盐混合物，混合，得培养基。
(4)接种：选生长旺盛、无污染、处于指数生长期的三角褐指藻接种到上述培养基中，底栖硅藻按照v/v为1：1接种，接种密度为1.0×106cell/mL。
(5)钙化：在500r/min条件下，将上述接种好的培养基中按重量比例分别加入氯化钙，得三角褐指藻的半固体悬浮培养液。
(6)培养：将三角褐指藻半固体悬浮培养液置于15℃、光暗比(10～18)：(14～6)、光照1500LUX条件下进行培养。
其中，基质水溶液中基质、营养盐混合物、钙化剂的添加量见表1。
实施例2同实施例1，不同之处在于，营养盐混合物的组分不同(各组成分见表1)，钙化时，在600r/min条件下进行。
实施例3同实施例1，不同之处在于，营养盐混合物的组分不同(各组成分见表1)。
对比例1同实施例1，不同之处在于，未添加基质和钙化剂(各组成分见表1)。
对比例2同实施例1，不同之处在于，未添加钙化剂(各组成分见表1)。
对比例3同实施例1，不同之处在于，未添加基质中的羧甲基纤维素钠(各组成分见表1)。
表1
Figure BDA0002703727670000051
试验例1
将上述实施例1～3和对比例1～2的藻液连续培养10天后，镜检三角褐指藻密度，结果见表2。
表2
Figure BDA0002703727670000052
经过连续培养10天后，半固体悬浮培养的三角褐指藻细胞密度远远大于游离态培养，半固体悬浮培养与游离态培养的细胞密度呈现显著差异(P<0.05)。
实施例1～3中，半固体悬浮培养使底栖硅藻载于悬浮的絮状凝胶中，使得底栖硅藻细胞分散于培养液中，底栖硅藻能更充分的得到光照和吸收营养盐，增加了其增殖速度。
相比于对比例1～3中，未添加氯化钙，使其处于游离态培养，底栖硅藻细胞沉降在底部，藻类沉积在一起，限制了其生长增殖。仅添加海藻酸钠，不添加羧甲基纤维素钠产生的絮状凝胶就会沉降，无法实现藻体的均匀分散。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种底栖硅藻的半固体悬浮培养方法，包括如下步骤：
(1)配制基质水溶液，其中，所述基质包括海藻酸钠和羧甲基纤维素钠；所述海藻酸钠和羧甲基纤维素钠的质量比为1：1；基质与水的质量比为1：400~600；
(2)配制营养盐混合物；所述营养盐混合物由如下重量份数原料组成：硅酸钠20~40份；硝酸钠30~60份；磷酸二氢钾5~10份；硫酸镁10~20份；柠檬酸铁铵0.5~2份；
(3)将上述营养盐混合物溶解于上述基质水溶液，得中间混合溶液；
(4)将底栖硅藻接种到上述中间混合溶液中，得含有底栖硅藻的混合溶液；
(5) 400~600 r/min的条件下，钙化剂溶解于上述含有底栖硅藻的混合溶液得底栖硅藻半固体培养液；底栖硅藻半固体培养液中基质、营养盐混合物、钙化剂的质量比为20：(0.8~1.5)：0.5；所述钙化剂为氯化钙；
(6)培养上述底栖硅藻半固体培养液。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤(1)中，基质与水的质量比为1：500。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤(1)具体为：40~60℃，将海藻酸钠和羧甲基纤维素钠溶于水中，冷却至室温，得基质水溶液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤(4)中，底栖硅藻按照体积比为1：1接种；接种密度为(0.5~1.0)×106 cell/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤(6)中，培养时：温度为10~20 ℃，光暗比为(10~18)：(14-6)，光照强度为1000~2000 LUX。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤(6)中，所述底栖硅藻包括三角褐指藻、小环藻、舟形藻、菱形藻或卵形藻。
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海产底栖硅藻的固定化培养研究;马志珍等;《中国水产科学》;19960630;第3卷(第2期);第14页第1-3段 *
马志珍等.海产底栖硅藻的固定化培养研究.《中国水产科学》.1996,第3卷(第2期),第14页第1-3段. *

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