CN112080541A - 一种利用羊胎盘制备抗氧化小分子多肽的方法 - Google Patents

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Abstract

一种利用羊胎盘制备抗氧化小分子多肽的方法，该方法采用羊胚胎作为原料，制备时，先将羊胚胎清洗后在冰水中隔水浸泡，并在浸泡过程中剪碎制成匀浆液，匀浆液过筛后，滤渣和滤液顺次加入过量复合酶，在低活性状态进行第一次酶解反应；反应后通过阳离子交换树脂并得到洗脱液，洗脱液进行超声辅助酶解，超声辅助酶解后的酶解产物过滤，过滤得到滤液和沉淀物分别处理后合并得到合并滤液；合并滤液用葡聚糖凝胶层析法进行分级后洗脱液，在低温条件下低温浓缩得到成品。本发明制备工艺能够具有较佳产率和较高抗氧化活性的天然小分子多肽，可作为化妆品中的功能原料使用。

Description

一种利用羊胎盘制备抗氧化小分子多肽的方法
技术领域
本发明涉及生物技术、医学美容和化妆品技术领域，具体涉及一种利用羊胎盘制备抗氧化小分子多肽的方法。
背景技术
目前市场上的美容养颜产品种类繁多，其主要功能成份和作用效果也多种多样，有化学类物质、动物提取成份以及植物提取成份，其中，羊胎素作为一种常用于化妆品中的有效成份，主要提取于羊胎盘，羊胎盘与人胎盘的结构和成分最为相似，而羊胎素作为其提取物，其成分复杂含有大量的表皮细胞生长因子、透明质酸刺激因子等生物活性因子等，具有提高机体免疫力、抗衰老、抗癌等作用，具有良好的营养价值。
目前，从羊胎盘中提取有效活性成分的方法主要有化学分离法以及酶解法，羊胎盘在通过除菌后通过粉碎处理、匀浆、低温离心、超滤等一系列物理处理工艺后提取到蛋白质类物质以及微量的活性的多肽及氨基酸类物质，然后将提取到的蛋白质类物质进行酸碱水解或者酶解得到相应的羊胎盘提取物产品后再进行二次加工得到相应的化妆品，其中，相对于化学法的酸碱水解，酶法水解制备活性肽具有成本低、安全性好、设备要求不高、便于工业化生产等优点。但是这种传统的酶解法制备羊胎素的工艺制得的羊胚胎提取物中抗氧化多肽类物质含量较低，皮肤质量改善效果有限，且在制成化妆品的过程中会添加较多的化学类物质以及化妆品添加剂来进行效果辅助，但是这类物质对皮肤的刺激很大，会导致出现色斑、过敏等问题，严重时还会损害消费者的健康。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供一种利用羊胎盘制备抗氧化小分子多肽的方法，以解决上述技术背景中的缺陷。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现：
一种利用羊胎盘制备抗氧化小分子多肽的方法，以羊胚胎作为原料制备，其具体包括以下制备步骤：
S1采用羊胚胎作为原料，用生理盐水冲洗，选出杂质后洗净，加蒸馏水，在冰水中隔水浸泡20～30min，浸泡过程中，剪碎后羊胚胎，并进行匀浆搅拌，匀浆液浸泡完成后取出；
S2用300～500目筛滤过匀浆液，滤液备用，并在滤渣中加入占羊胚胎原料质量1～3wt％的复合酶进行酶水解，拌匀后控制酶解反应的温度为35～42℃，pH为7.0～8.0，反应50～60min，然后加入滤液继续酶解30～50min；
S3酶解完成后将酶解产物通过阳离子交换树脂，并用30wt％～35wt％的乙醇水溶液进行洗脱，得到洗脱液；
S4将步骤S3获得的洗脱液进行超声辅助酶解，酶解时采用木瓜蛋白酶进行酶解，加入量为羊胚胎原料质量的0.8～1.5wt％，控制反应温度为45～48℃，pH为7.0～8.0，酶解时，配合超声功率为300～350W，频率为45～55kHz，处理60～80min；
S5将超声辅助酶解后的酶解产物用200～300目筛进行过滤，过滤得到滤液和沉淀物，将滤液通过阳离子交换树脂得到滤液I，而沉淀物进行抽滤，抽滤液用蛋白酶酶解后抽滤得水解液，将水解液通过阳离子交换树脂得到滤液II，将滤液I与滤液II合并得到合并滤液；
S6将合并滤液用葡聚糖凝胶层析法进行分级，将合并滤液用固定相Sephadex G-10型葡聚糖凝胶色谱进行分离，并利用2wt％的NaCl溶液进行洗脱，洗脱液为Sephadex G-10型葡聚糖凝胶色谱柱中的第2个吸收峰的洗脱组分，将其在0～5°的温度条件下低温浓缩得到成品。
作为进一步限定，所述步骤S2中，加入的复合酶为木瓜蛋白酶与胰蛋白酶的复合酶，且所述木瓜蛋白酶与所述胰蛋白酶的配比1：0.35～0.7。
作为进一步限定，所述步骤S2中，酶解反应的温度为38℃，pH为7.5。
作为进一步限定，所述步骤S4中，超声辅助酶解处理时，酶解反应的温度为45℃、pH为7.5、超声频率为50kHz。
有益效果：本发明的利用羊胎盘制备抗氧化小分子多肽的方法，完全脱离了传统的化工工艺，整个制备过程中不含残留重金属等有毒有害物质，生物安全性高，羊胚胎中的有效成份中的酶解率高，且酶解物中小分子多肽为具有高抗氧化活性的多肽，这些活性物多肽含有芳香环，并保留了羊胚胎中高含量的苯丙氨酸、缬氨酸、组氨酸和脯氨酸等多个疏水氨基酸，符合高抗氧化活性多肽的两个基本结构特征，因此具有高抗氧化活性，且便于人体全面吸收；同时其制成物中激素含量极低，可作为化妆品原材料进行使用。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
在实施例一中，制备抗氧化的小分子多肽时采用以怀孕2～8周的羊胚胎作为原料制备，其具体包括以下制备步骤：
将取得的羊胚胎原料用生理盐水冲洗，选出杂质后洗净，滤水，并加入小容器中，在小容器中加入蒸馏水，蒸馏水覆盖羊胚胎原料，同时准备一个大容器，在大容器中加入冰水，将小容器放入大容器中，隔冰水浸泡15min后直接在小容器中利用食品级料理机将羊胚胎原料打碎，然后进行匀浆搅拌，匀浆液继续浸泡10min后取出；冰水浸泡的操作能有效保证胚胎细胞处于一个非活性的吸水状态。
将冰水浸泡的浆液用500目筛滤过匀浆液，将滤液备用，此时滤液有具有部分活性多肽及氨基酸类物质。而滤渣中加入羊胚胎原料质量2％的木瓜蛋白酶与胰蛋白酶的酶比例2:1的活性复合酶进行酶水解，这一次酶水解为第一次酶水解，酶解反应的温度为38℃，pH为7.5，反应50min，然后加入滤液继续酶解30min。这次酶水解的过程中通过加入过量的木瓜蛋白酶与胰蛋白酶的组合酶来进行第一次水解，第一次水解控制酶解反应在一个较低的活性条件下进行并降低了反应时间，并通过组合酶的过量加入来产生一个打开细胞组织的副酶解反应效果，这样的操作步骤在进行初步酶解反应的同时打开羊胚胎浆料，使得胚胎细胞部分水解并使得细胞组织尽量打开，而之前的冰水浸泡所造成的非活性的吸水状态能助于此步骤中细胞组织尽量打开。在此过程中，羊胚胎浆料的水解率约为15～18％，水解比例接近于传统的酶解法的羊胚胎水解率的2/3，但是结块型的组织物沉淀的量开始减少，形成浓浊的悬浊态浆液。
将该悬浮态的酶解产物浆液通过阳离子交换树脂，并用35wt％的乙醇水溶液进行洗脱，得到洗脱液保留了部分组织物和大分子多肽，将这部分洗脱液进行超声辅助酶解，酶解时采用木瓜蛋白酶，控制木瓜蛋白酶的加入量为适量，即加入量为羊胚胎原料质量的0.8～1.5wt％，在本实施例中，为1wt％，控制反应温度为45℃，pH为7.5，并控制酶解时超声辅助的超声功率为350W，频率为50kHz，处理70min.
此反应条件下的温度和pH值条件为木瓜蛋白酶的最适反应条件，而超声波技术因其独特的空化效应和机械效应对物质的提取、酶解反应及高分子降解等具有一定的促进作用，又因为胚胎细胞部分水解造成了细胞组织的打开，使得超声对悬浊态浆液的影响开始更加明显，但需要严格控制超声辅助的超声功率和超声频率，超声功率和评率的或者过低都会影响水解率，该条件下的木瓜蛋白酶水解度接近50％，明显优于传统酶解法状态下的羊胚胎酶解的水解率，且酶解产物中的大分子物比例明显减少，小分子物的比例明显增加。
此时，通过300目筛进行过滤，过滤得到滤液和沉淀物，将滤液通过阳离子交换树脂得到滤液I，而沉淀物进行抽滤，抽滤液用蛋白酶酶解后抽滤得水解液，将水解液通过阳离子交换树脂得到滤液II，将滤液I与滤液II合并得到的合并滤液即为原液。
对原液进行处理，处理时将合并滤液用葡聚糖凝胶层析法进行分级，将合并滤液用固定相Sephadex G-10型葡聚糖凝胶色谱进行分离，并利用2wt％的NaCl溶液进行洗脱，洗脱液为Sephadex G-10型葡聚糖凝胶色谱柱中的第2个吸收峰的洗脱组分，将其在0～5°的温度条件下低温浓缩即得到该抗氧化的小分子多肽，该小分子多肽的产率为17.5％，且制得的小分子多肽含有芳香环，并有苯丙氨酸、缬氨酸、组氨酸和脯氨酸等多个疏水氨基酸，具有高抗氧化活性。
而作为对比例，在实施例一的工艺条件下，对工艺步骤进行修改，并对修改后对比例的产物产率和产物抗氧化活性(DPPH法测定)进行测量后列表如下：
对比例1：所有其他步骤相同，取消冰水浸泡操作步骤，直接用常温水浸泡并在浸泡过程中进行剪碎和匀浆搅拌操作。
对比例2：所有其他步骤相同，取消操作步骤2、操作步骤3对应的第一次酶解，将经过步骤S1制备的匀浆液直接进入步骤S4。
对比例3：所有其他步骤相同，在步骤S4中进行第二次酶解操作时取消超声辅助。
对比例4：所有其他步骤相同，取消步骤S5中，对沉淀物进进行抽滤操作，并直接将滤液I作为步骤S6中的原料进行步骤S6的操作。
产率(％) DPPH清除率(％)
实施例 19.8 81.2
对比例1 17.8 82.5
对比例2 14.2 81.6
对比例3 12.4 86.5
对比例4 17.1 81.5
可以发现，虽然在实施例的条件下，其制得的小分子多肽物质的抗氧化活性有少量下降，但是其产率提升明显。而参考传统羊胎素提取工艺中羊胎素的产率一般为18～25％，因而，通过实施例的操作步骤能使羊胚胎中的大分子蛋白质进行有效降解，在其氨基酸组成和含量无明显差异，提高小分子多肽物质的产率；而这种小分子多肽物质的人体吸收性更好，是对羊胚胎的更有效利用。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (4)

1.一种利用羊胎盘制备抗氧化小分子多肽的方法，其特征在于，该方法具体包括以下制备步骤：
S1采用羊胚胎作为原料，用生理盐水冲洗，选出杂质后洗净，加蒸馏水，在冰水中隔水浸泡20～30min，浸泡过程中，剪碎后羊胚胎，并进行匀浆搅拌，匀浆液浸泡完成后取出；
S2用300～500目筛滤过匀浆液，滤液备用，并在滤渣中加入占羊胚胎原料质量1～3wt％的复合酶进行酶水解，拌匀后控制酶解反应的温度为35～42℃，pH为7.0～8.0，反应50～60min，然后加入滤液继续酶解30～50min；
S3酶解完成后将酶解产物通过阳离子交换树脂，并用30wt％～35wt％的乙醇水溶液进行洗脱，得到洗脱液；
S4将步骤S3获得的洗脱液进行超声辅助酶解，酶解时采用木瓜蛋白酶进行酶解，加入量为羊胚胎原料质量的0.8～1.5wt％，控制反应温度为45～48℃，pH为7.0～8.0，酶解时，配合超声功率为300～350W，频率为45～55kHz，处理60～80min；
S5将超声辅助酶解后的酶解产物用200～300目筛进行过滤，过滤得到滤液和沉淀物，将滤液通过阳离子交换树脂得到滤液I，而沉淀物进行抽滤，抽滤液用蛋白酶酶解后抽滤得水解液，将水解液通过阳离子交换树脂得到滤液II，将滤液I与滤液II合并得到合并滤液；
S6将合并滤液用葡聚糖凝胶层析法进行分级，将合并滤液用固定相Sephadex G-10型葡聚糖凝胶色谱进行分离，并利用2wt％的NaCl溶液进行洗脱，洗脱液为Sephadex G-10型葡聚糖凝胶色谱柱中的第2个吸收峰的洗脱组分，将其在0～5°的温度条件下低温浓缩得到成品。
2.根据权利要求1所述的利用羊胎盘制备抗氧化小分子多肽的方法，其特征在于，所述步骤S2中，加入的复合酶为木瓜蛋白酶与胰蛋白酶的复合酶，且所述木瓜蛋白酶与所述胰蛋白酶的配比1：0.35～0.7。
3.根据权利要求1所述的利用羊胎盘制备抗氧化小分子多肽的方法，其特征在于，所述步骤S2中，酶解反应的温度为38℃，pH为7.5。
4.根据权利要求1所述的利用羊胎盘制备抗氧化小分子多肽的方法，其特征在于，所述步骤S4中，超声辅助酶解处理时，酶解反应的温度为45℃、pH为7.5、超声频率为50kHz。
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