CN112080443A - 一种高产有机硒的微生物及其用于制备有机硒的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种高产有机硒的微生物及其应用。该微生物用于制备有机硒的方法包括下述步骤，将活菌数为1.0‑2.0x108个/ml的YTH芽孢杆菌种子培养液按照0.2‑5％的接种量接种至起始培养基中，于30‑40℃，100‑300rpm，培养12‑24h后，加入浓度为1‑20％的亚硒酸钠水溶液以及与亚硒酸钠水溶液等体积的液体培养基，反应12‑200h后，制得含有机硒的发酵液。该方法具有有机硒转化率高，发酵时间短，稳定性好等优点。

Description

一种高产有机硒的微生物及其用于制备有机硒的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高产有机硒的微生物及其用于制备有机硒的应用。
背景技术
硒是动物和人体必需的微量元素，广泛存在于人体各组织内。已有研究表明，人体缺硒会引起癌症、艾滋病、心血管疾病、肝脏和胰脏疾病、高血压、糖尿病、贫血、克山病、大骨节病等病症。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHG-Px)是体内广泛存在清除过氧化物和自由基的酶，是人体抗氧化防御系统的重要组成部分。硒是这些酶的重要组分和活性中心，具有保护细胞膜的结构和功能免受过度氧化损伤，具有抗癌、解毒、保肝和提高免疫力等生理功能。硒的重要生理作用是增强人体免疫能力和抗氧化能力，良好的硒状态可维持人的免疫活性和正常的氧化还原调控能力，这也是硒用来治疗预防各种疾病的作用基础。
研究表明，硒对肿瘤细胞生长和存活有明显抑制作用，对非瘤变组织细胞存活无明显影响，低剂量硒具有促进正常细胞增殖作用，具有抗肿瘤的特异性。美国癌症中心已有研究表明，适量的硒几乎可以防止一切癌变。硒抑制肿瘤发生机制极为复杂，包括抗氧化损伤、抑制转录因子、调控癌基因、防止肿瘤蛋白合成、刺激细胞凋亡、增强机体免疫系统(包括细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫等)，拮抗化学致癌物质，促进DNA损伤修复等。硒可显著提高癌症患者的肌体免疫力，缩小肿块，消除抑郁，调节情绪，明显缓解晚期癌症病人的剧痛，并可逆转癌细胞为正常细胞，阻断复发转移，加速其凋亡。
硒的生化效应与其浓度密切相关，美国科学院FNB研究表明，成人硒的需要量为50-200ug/d，硒摄入量超过0.1-0.2mg/(kg·d)会有中毒现象。而硒在发挥抗癌作用时需要较高浓度，无机硒化物的治疗窗极窄，使得硒的临床应用受到较大限制。因此，开发高效、低毒的含硒药物成为本领域重要的研究课题。
CN1995328A公开了一种嗜硒ZM短杆菌及其用于制备生物红硒的方法。将嗜硒ZM短杆菌(保藏号CGMCC1694)接种至含亚硒酸钠溶液的发酵培养基中培养，发酵液经浓缩处理后，制得具有很高药理活性的生物红硒，显著提高机体免疫力，增强食欲，改善睡眠等作用，且安全有效。但其硒产量及其稳定性有待提升。
发明内容
本发明的目的在于提供一种YTH芽孢杆菌，其分类命名为芽孢杆菌属Bacillussp.，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.20180。
本发明优选的技术方案，所述YTH芽孢杆菌的菌体长1-2um，优选菌体长1.5um。
本发明优选的技术方案，所述YTH芽孢杆菌的菌体宽0.6-0.8um，优选菌体宽0.7um。
本发明优选的技术方案，所述YTH芽孢杆菌具有菌落紧密程度高，有光泽，菌体大，上端略平，分裂速度快，隔膜清晰，对人体无毒副作用的特点。
本发明优选的技术方案，所述YTH芽孢杆菌能将无机硒转化为有机硒，实现对肿瘤组织的特异性杀伤作用。
本发明的另一目的在于提供一种有机硒的制备方法，包括如下步骤：将活菌数为1.0-2.0x108个/ml的YTH芽孢杆菌种子培养液按照 0.2-5％的接种量接种至每100ml培养基中含有1-2％的鱼蛋白胨和 0.1-0.2％K2HPO4的起始培养基中，于30-40℃，100-300rpm，培养12-24h 后，加入浓度为1-20％的亚硒酸钠水溶液以及与亚硒酸钠水溶液等体积的液体培养基，其中，起始培养基：亚硒酸钠水溶液的体积比为2:1，于30-40℃，100-300rpm，发酵培养12-200h后，制得含有机硒的发酵液。
本发明的优选技术方案中，YTH芽孢杆菌种子培养液的制备包括下述步骤，将YTH芽孢杆菌接种于每100ml液体培养基中含有1-2％的鱼蛋白胨和0.1-0.2％K2HPO4的液体培养基中，于30-40℃，100-300rpm,培养4-30h,即得。
本发明的优选技术方案中，所述每100ml液体培养基或每100ml起始培养基中含有1.5％鱼蛋白胨和0.15％K2HPO4。
本发明优选的技术方案中，所述YTH芽孢杆菌种子活化培养时间为 12-24h。
本发明优选的技术方案中，所述YTH芽孢杆菌种子培养液的接种量为1-3％，优选为1.5-2％。
本发明优选的技术方案中，发酵培养的反应温度为35-38℃，优选为36-37℃。
本发明优选的技术方案中，在发酵培养中间隔补料，优选补料次数为1-6次，更优选为2-4次，补料间隔为12-24h。
本发明优选的技术方案中，所述补料包括下述步骤，每间隔12-24h，在发酵体系中加入浓度为1-20％的亚硒酸钠水溶液以及与亚硒酸钠水溶液等体积的液体培养基，于30-40℃，100-300rpm，发酵培养12-24h，其中，起始培养基与亚硒酸钠水溶液的体积比为2:1。
本发明优选的技术方案中，发酵培养时间为24-168h，优选为 36-144h，更优选为48-120h。
本发明优选的技术方案中，发酵体系中的有机硒转化率不低于96％时终止培养，优选有机硒转化率不低于98％时终止培养。
本发明的优选技术方案中，以硒元素计，所述含有机硒的发酵液中的有机硒含量10-40mg/mL，优选为15-30mg/mL。
本发明的另一目的在于提供一种有机硒，所述有机硒由如下步骤制得：将活菌数为1.0-2.0x108个/ml的YTH芽孢杆菌种子培养液按照 0.2-5％的接种量接种至每100ml培养基中含有1-2％的鱼蛋白胨和 0.1-0.2％K2HPO4的起始培养基中，于30-40℃，100-300rpm，培养12-24h 后，加入浓度为1-20％的亚硒酸钠水溶液以及与亚硒酸钠水溶液等体积的液体培养基，其中，起始培养基：亚硒酸钠水溶液的体积比为2:1，于30-40℃，100-300rpm，发酵培养12-200h后，制得含有机硒的发酵液。
本发明的优选技术方案中，YTH芽孢杆菌种子培养液的制备包括下述步骤，将YTH芽孢杆菌接种于每100ml液体培养基中含有1-2％的鱼蛋白胨和0.1-0.2％K2HPO4的液体培养基中，于30-40℃，100-300rpm,培养4-30h,即得。
本发明的优选技术方案中，所述每100ml液体培养基或每100ml起始培养基中含有1.5％鱼蛋白胨和0.15％K2HPO4。
本发明优选的技术方案中，所述YTH芽孢杆菌种子活化培养时间为 12-24h。
本发明优选的技术方案中，所述YTH芽孢杆菌种子培养液的接种量为1-3％，优选为1.5-2％。
本发明优选的技术方案中，发酵反应温度为35-38℃，优选为 36-37℃。
本发明优选的技术方案中，在反应中间隔补料，优选补料次数为1-6 次，更优选为2-4次，补料间隔为12-24h。
本发明优选的技术方案中，所述补料包括下述步骤，每间隔12-24h，再在发酵体系中加入浓度为1-20％的亚硒酸钠水溶液以及与亚硒酸钠水溶液等体积的液体培养基，于30-40℃，100-300rpm，发酵培养12-24h，其中，起始培养基与亚硒酸钠水溶液的体积比为2:1。
本发明优选的技术方案中，发酵培养时间为24-168h，优选为 36-144h，更优选为48-120h。
本发明优选的技术方案中，发酵体系中的有机硒转化率不低于96％时终止反应，优选有机硒转化率不低于98％时终止反应。
本发明的优选技术方案中，以硒元素计，所述含有机硒的发酵液中的有机硒含量10-40mg/mL，优选为15-30mg/mL。
本发明的另一目的在于提供一种药物组合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将活菌数为1.0-2.0x108个/ml的YTH芽孢杆菌种子培养液按照0.2-5％的接种量接种至每100ml培养基中含有1-2％的鱼蛋白胨和 0.1-0.2％K2HPO4的起始培养基中，于30-40℃，100-300rpm，培养12-24h 后，加入浓度为1-20％的亚硒酸钠水溶液以及与亚硒酸钠水溶液等体积的液体培养基，其中，起始培养基：亚硒酸钠水溶液的体积比为2:1，于30-40℃，100-300rpm，培养发酵12-200h后，制得含有机硒的发酵液；
(2)将步骤(1)制得的含有机硒的发酵液与含活菌数为1.0-2.0x108个/ml的YTH芽孢杆菌种子培养液混合后，于30-40℃，反应12-24h后，即得。本发明优选的技术方案中，以Se元素计，所述药物组合物中的有机硒的含量为100-400ug/ml，优选为200-300ug/ml，更优选为 260-270ug/ml。
本发明的优选技术方案中，步骤(1)中，YTH芽孢杆菌种子培养液的制备包括下述步骤，将YTH芽孢杆菌接种于每100ml液体培养基中含有1-2％的鱼蛋白胨和0.1-0.2％K2HPO4的液体培养基中，于30-40℃， 100-300rpm,培养4-30h,即得。
本发明的优选技术方案中，步骤(1)中，所述每100ml液体培养基或每100ml起始培养基中含有1.5％鱼蛋白胨和0.15％K2HPO4。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，所述YTH芽孢杆菌种子活化培养时间为12-24h。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)或步骤(2)中，所述YTH芽孢杆菌种子培养液的接种量为1-3％，优选为1.5-2％。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，发酵反应温度为35-38℃，优选为36-37℃。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，在培养中间隔补料，优选补料次数为1-6次，更优选为2-4次，补料间隔为12-24h。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，所述补料包括下述步骤，每间隔12-24h，在发酵体系中加入浓度为1-20％的亚硒酸钠水溶液以及与亚硒酸钠水溶液等体积的液体培养基，于30-40℃，100-300rpm，培养发酵12-24h，其中，起始培养基与亚硒酸钠水溶液的体积比为2:1。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，发酵反应时间为24-168h，优选为36-144h，更优选为48-120h。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，发酵体系中的有机硒转化率不低于96％时终止反应，优选有机硒转化率不低于98％时终止反应。
本发明的优选技术方案中，步骤(1)中，以硒元素计，所述含有机硒的发酵液中的有机硒含量10-40mg/mL，优选为15-30mg/mL。
本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，在含有机硒的发酵液中加入0.1-2.0％的金属盐溶液，优选为0.5-1.5％的金属盐溶液。
本发明优选的技术方案中，所述金属盐选自钠盐、镁盐、锰盐、锌盐、硼酸、钼盐、钾盐、镍盐、钴盐、锡盐的任一种或其组合，优选为氟化钠、硫酸镁、乙酸镁、硫酸锰、硫酸锌、硼酸、钼酸铵、碘化钾、氯化镍、氯化钴、氯化锡的任一种或其组合。
本发明的另一目的在于提供一种药物组合物，所述组合物由下述步骤制备得到：
(1)将活菌数为1.0-2.0x108个/ml的YTH芽孢杆菌种子培养液按照0.2-5％的接种量接种至每100ml培养基中含有1-2％的鱼蛋白胨和 0.1-0.2％K2HPO4的起始培养基中，于30-40℃，100-300rpm，培养12-24h 后，加入浓度为1-20％的亚硒酸钠水溶液以及与亚硒酸钠水溶液等体积的液体培养基，其中，起始培养基：亚硒酸钠水溶液的体积比为2:1，于30-40℃，100-300rpm，培养发酵12-200h后，制得含有机硒的发酵液；
(2)将步骤(1)制得的含有机硒的发酵液与含活菌数为1.0-2.0x108个/ml的YTH芽孢杆菌种子培养液混合，于30-40℃，反应12-24h后，即得。
本发明优选的技术方案中，以Se元素计，所述药物组合物中的有机硒的含量为100-400ug/ml，优选为200-300ug/ml，更优选为 260-270ug/ml。
本发明的优选技术方案中，步骤(1)中，YTH芽孢杆菌种子培养液的制备包括下述步骤，将YTH芽孢杆菌接种于每100ml液体培养基中含有1-2％的鱼蛋白胨和0.1-0.2％K2HPO4的液体培养基中，于30-40℃，100-300rpm,培养4-30h,即得。
本发明的优选技术方案中，步骤(1)中，所述每100ml液体培养基或每100ml起始培养基中含有1.5％鱼蛋白胨和0.15％K2HPO4。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，所述YTH芽孢杆菌种子活化培养时间为12-24h。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)或步骤(2)中，所述YTH芽孢杆菌种子培养液的接种量为1-3％，优选为1.5-2％。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，发酵体系的反应温度为 35-38℃，优选为36-37℃。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，发酵体系在反应中间隔补料，优选补料次数为1-6次，更优选为2-4次，补料间隔为12-24h。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，所述补料包括下述步骤，每间隔12-24h，在发酵体系中加入浓度为1-20％的亚硒酸钠水溶液以及与亚硒酸钠水溶液等体积的液体培养基，于30-40℃，100-300rpm，培养发酵12-24h，其中，起始培养基与亚硒酸钠水溶液的体积比为2:1。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，发酵反应时间为24-168h，优选为36-144h，更优选为48-120h。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，发酵体系中的有机硒转化率不低于96％时终止反应，优选有机硒转化率不低于98％时终止反应。
本发明的优选技术方案中，步骤(1)中，以硒元素计，所述含有机硒的发酵液中的有机硒含量10-40mg/mL，优选为15-30mg/mL。
本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，在含有机硒的发酵液中加入0.1-2.0％的金属盐溶液，优选为0.5-1.5％的金属盐溶液。
本发明优选的技术方案中，所述金属盐选自钠盐、镁盐、锰盐、锌盐、硼酸、钼盐、钾盐、镍盐、钴盐、锡盐的任一种或其组合，优选为氟化钠、硫酸镁、乙酸镁、硫酸锰、硫酸锌、硼酸、钼酸铵、碘化钾、氯化镍、氯化钴、氯化锡的任一种或其组合。
本发明的另一目的在于提供一种有机硒的制备方法，包括如下步骤：离心收集活菌数为1.0-2.0x108个/ml的YTH芽孢杆菌种子培养液中的菌体，将收集菌体按照每克菌体与20ml的pH 8.0-9.0的磷酸盐缓冲溶液混合，搅拌混匀，超声破碎后，离心，取上清液，在制得的上清液中加入等体积的浓度为1-20％的亚硒酸钠溶液，于30-40℃，100-300rpm，反应12-200h后，制得含有机硒的发酵液。
本发明的优选技术方案中，YTH芽孢杆菌种子培养液的制备包括下述步骤，将YTH芽孢杆菌接种于每100ml液体培养基中含有1-2％的鱼蛋白胨和0.1-0.2％K2HPO4的液体培养基中，于30-40℃，100-300rpm,培养4-30h,即得。
本发明的优选技术方案中，所述超声功率1200-1600w，超声处理时间为20-30min。
本发明的优选技术方案中，浓度为1-20％的亚硒酸钠溶液用pH 8.0-9.0的磷酸盐缓冲溶液配置。
本发明优选的技术方案中，每100ml液体培养基中含有1.5％鱼蛋白胨和0.15％K2HPO4。
本发明优选的技术方案中，所述YTH芽孢杆菌种子培养液的培养温度为35-38℃，更优选为36-37℃。
本发明优选的技术方案中，发酵体系的反应时间为110h-180h，优选为120h-150h。
本发明优选的技术方案中，发酵体系的反应温度为30-45℃，优选为35-40℃，更优选为36-38℃。
本发明优选的技术方案中，发酵体系在反应中间隔补料，优选补料次数为1-6次，更优选为2-3次，补料间隔为12-24h。
本发明优选的技术方案中，所述补料包括下述步骤，每间隔12-24h，再在发酵体系中加入与上清液等体积的浓度为1-20％的亚硒酸钠溶液，于30-40℃，100-300rpm，反应12-24h。
本发明优选的技术方案中，发酵体系中的有机硒转化率不低于96％时终止反应，优选不低于98％时终止反应。
本发明的优选技术方案中，以硒元素计，所述含有机硒的反应液中的有机硒含量10-40mg/mL，优选为15-30mg/mL。
本发明的另一目的在于提供一种有机硒，所述有机硒由下述步骤制得：离心收集活菌数为1.0-2.0x108个/ml的YTH芽孢杆菌种子培养液中的菌体，将收集菌体按照每克菌体与20ml的pH 8.0-9.0的磷酸盐缓冲溶液混合，搅拌混匀，超声破碎后，离心，取上清液，在制得的上清液中加入等体积的浓度为1-20％的亚硒酸钠溶液，于30-40℃，100-300rpm，反应12-200h后，制得含有机硒的发酵液。
本发明的优选技术方案中，YTH芽孢杆菌种子培养液的制备包括下述步骤，将YTH芽孢杆菌接种于每100ml液体培养基中含有1-2％的鱼蛋白胨和0.1-0.2％K2HPO4的液体培养基中，于30-40℃，100-300rpm,培养4-30h,即得。
本发明的优选技术方案中，所述超声功率1200-1600w，超声处理时间为20-30min。
本发明的优选技术方案中，浓度为1-20％的亚硒酸钠溶液用pH 8.0-9.0的磷酸盐缓冲溶液配置。
本发明优选的技术方案中，每100ml液体培养基中含有1.5％鱼蛋白胨和0.15％K2HPO4。
本发明优选的技术方案中，所述YTH芽孢杆菌种子培养液的培养温度为35-38℃，更优选为36-37℃。
本发明优选的技术方案中，发酵体系的反应时间为110h-180h，优选为120h-150h。
本发明优选的技术方案中，发酵体系的反应温度为30-45℃，优选为35-40℃，更优选为36-38℃。
本发明优选的技术方案中，在发酵反应中间隔补料，优选补料次数为1-6次，更优选为2-3次，补料间隔为12-24h。
本发明优选的技术方案中，所述补料包括下述步骤，每间隔12-24h，再在发酵体系中加入与上清液等体积的浓度为1-20％的亚硒酸钠溶液，于30-40℃，100-300rpm，反应12-24h。
本发明优选的技术方案中，发酵中的有机硒转化率不低于96％时终止反应，优选不低于98％时终止反应。
本发明的优选技术方案中，以硒元素计，所述含有机硒的反应液中的有机硒含量10-40mg/mL，优选为15-30mg/mL。
本发明的另一目的在于提供一种药物组合物的制备方法，包括下述步骤：
(1)离心收集活菌数为1.0-2.0x108个/ml的YTH芽孢杆菌种子培养液中的菌体，将收集菌体按照每克菌体与20ml的pH 8.0-9.0的磷酸盐缓冲溶液混合，搅拌混匀，超声破碎后，离心，取上清液，在制得的上清液中加入等体积的浓度为1-20％的亚硒酸钠溶液，于30-40℃， 100-300rpm，反应12-200h后，制得含有机硒的发酵液；
(2)向步骤(1)制得的含有机硒的发酵液中再加入1-5％步骤(1) 制得的上清液，于30-40℃，反应12-24h后，即得，优选其中上清液接种到含有机硒的发酵液中的接种量为2-3％。
本发明优选的技术方案中，所述的药物组合物中以Se元素计有机硒的含量为100-400ug/ml，优选为200-300ug/ml，优选为260-270ug/ml。
本发明的优选技术方案中，步骤(1)中，YTH芽孢杆菌种子培养液的制备包括下述步骤，将YTH芽孢杆菌接种于每100ml液体培养基中含有1-2％的鱼蛋白胨和0.1-0.2％K2HPO4的液体培养基中，于30-40℃， 100-300rpm,培养4-30h,即得。
本发明的优选技术方案中，步骤(1)中，所述超声条件为 1200-1600w，超声处理20-30min。
本发明的优选技术方案中，步骤(1)中，所述浓度为1-20％的亚硒酸钠溶液采用pH8.0-9.0的磷酸盐缓冲溶液配置。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，每100ml液体培养基中含有1.5％鱼蛋白胨和0.15％K2HPO4。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，所述YTH芽孢杆菌种子培养液的培养温度为35-38℃，更优选为36-37℃。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，发酵体系的反应时间为 110h-180h，优选为120h-150h。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，发酵体系的反应温度为 30-45℃，优选为35-40℃，更优选为36-38℃。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，发酵体系在反应中间隔补料，优选补料次数为1-6次，更优选为2-3次，补料间隔为12-24h。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，所述间隔补料包括下述步骤，每间隔12-24h，再在发酵体系中加入与上清液等体积的浓度为 1-20％的亚硒酸钠底物溶液，于30-40℃，100-300rpm，反应12-24h。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，发酵体系中的有机硒转化率不低于96％时终止反应，优选不低于98％时终止反应。
本发明的优选技术方案中，步骤(1)中，以硒元素计，所述含有机硒的反应液中的有机硒含量10-40mg/mL，优选为15-30mg/mL。
本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，在含有机硒的发酵液中加入0.1-2.0％的金属盐溶液，优选为0.5-1.5％的金属盐溶液。
本发明优选的技术方案中，所述金属盐选自钠盐、镁盐、锰盐、锌盐、硼酸、钼盐、钾盐、镍盐、钴盐、锡盐的任一种或其组合，优选为氟化钠、硫酸镁、乙酸镁、硫酸锰、硫酸锌、硼酸、钼酸铵、碘化钾、氯化镍、氯化钴、氯化锡的任一种或其组合。
本发明的另一目的在于提供一种药物组合物，由如下方法制备而成：
(1)离心收集活菌数为1.0-2.0x108个/ml的YTH芽孢杆菌种子培养液中的菌体，将收集菌体按照每克菌体与20ml的pH 8.0-9.0的磷酸盐缓冲溶液混合，搅拌混匀，超声破碎后，离心，取上清液，在制得的上清液中加入等体积的浓度为1-20％的亚硒酸钠溶液，于30-40℃，100-300rpm，发酵培养12-200h后，制得含有机硒的发酵液；
(2)向步骤(1)制得的含有机硒的发酵液中再加入1-5％步骤(1) 制得的上清液，于30-40℃，反应12-24h后，即得，其中优选上清液接种到含有机硒的发酵液中的接种量为2-3％。
本发明优选的技术方案中，所述的药物组合物中以Se元素计有机硒的含量为100-400ug/ml，优选为200-300ug/ml，优选为260-270ug/ml。
本发明的优选技术方案中，步骤(1)中，YTH芽孢杆菌种子培养液的制备包括下述步骤，将YTH芽孢杆菌接种于每100ml液体培养基中含有1-2％的鱼蛋白胨和0.1-0.2％K2HPO4的液体培养基中，于30-40℃， 100-300rpm,培养4-30h,即得。
本发明的优选技术方案中，步骤(1)中，所述超声条件为 1200-1600w，超声处理20-30min。
本发明的优选技术方案中，步骤(1)中，所述浓度为1-20％的亚硒酸钠溶液采用pH8.0-9.0的磷酸盐缓冲溶液配置。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，每100ml液体培养基中含有1.5％鱼蛋白胨和0.15％K2HPO4。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，所述YTH芽孢杆菌种子培养液的培养温度为35-38℃，更优选为36-37℃。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，发酵体系的反应时间为 110h-180h，优选为120h-150h。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，发酵体系的反应温度为 30-45℃，优选为35-40℃，更优选为36-38℃。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，发酵体系在反应中间隔补料，优选补料次数为1-6次，更优选为2-3次，补料间隔为12-24h。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，所述间隔补料包括下述步骤，每间隔12-24h，再在发酵体系中加入与上清液等体积的浓度为 1-20％的亚硒酸钠溶液，于30-40℃，100-300rpm，反应12-24h。
本发明优选的技术方案中，步骤(1)中，发酵体系中的有机硒转化率不低于96％时终止反应，优选不低于98％时终止反应。
本发明的优选技术方案中，步骤(1)中，以硒元素计，所述含有机硒的反应液中的有机硒含量10-40mg/mL，优选为15-30mg/mL。
本发明优选的技术方案中，步骤(2)中，在含有机硒的发酵液中加入0.1-2.0％的金属盐溶液，优选为0.5-1.5％的金属盐溶液。
本发明优选的技术方案中，所述金属盐选自钠盐、镁盐、锰盐、锌盐、硼酸、钼盐、钾盐、镍盐、钴盐、锡盐的任一种或其组合，优选为氟化钠、硫酸镁、乙酸镁、硫酸锰、硫酸锌、硼酸、钼酸铵、碘化钾、氯化镍、氯化钴、氯化锡的任一种或其组合。
本发明的另一目的在于提供本发明的有机硒或含有本发明有机硒的药物组合物的任一种用于制备治疗癌症药物或艾滋病的任一种病症或其并发症的药物中的应用。
本发明优选的技术方案中，所述癌症选自肝癌、食道癌、胃癌、胰腺瘤、胆管细胞癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺癌、结肠癌、下咽癌、皮肤基底细胞癌、左乳癌、宫颈癌、上颌肿瘤、鼻咽癌的任一种或其并发症。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
除非另有说明，本发明的检测方法：
1、总硒、无机硒、有机硒的测定方法：参照《DBS 42/002—2014 富有机硒食品硒含量要求》中的分析方法。
2、有机硒转化率的计算方法
有机硒转化率＝(有机硒含量(mg/L)*含有机硒的发酵液终体积(L) /亚硒酸钠中硒元素总质量(mg))*100％
亚硒酸钠中硒元素总质量(mg)＝(加入的五水亚硒酸钠总质量(g) /五水亚硒酸钠分子量)*Se元素分子量*1000
与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：
1、本发明筛选的YTH芽孢杆菌用于制备有机硒，具有药理活性高且不具备硒的毒性，能用于治疗多种疾病，安全有效。
2、本发明制备的制备方法具有产量高、转化率高等优点，且操作简便，显著缩短生产周期，进而显著降低生产成本，适合于大规模工业化生产。
生物材料保藏
本发明所述的一种YTH芽孢杆菌，其分类命名为芽孢杆菌属 Bacillus sp.。该菌种已于2020年7月2日提交保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.20180。
附图说明
图1光照稳定性试验
图2高温稳定性试验
图3药物组合物中有机硒稳定性比较
图4加速条件下药物组合物中有机硒稳定性比较
具体实施方式
以下参照实施例说明本发明，但本发明不局限于实施例。
本发明中使用的ZM短杆菌为CN1995328A公开的嗜硒ZM短杆菌 (保藏号CGMCC1694)。
YTH芽孢杆菌种子培养液的制备：将YTH芽孢杆菌(保藏编号为 CGMCC No.20180)接种于液体培养基中，每100ml液体培养基中含有2％的鱼蛋白胨和0.2％K2HPO4，于37℃，200rpm,培养12h,菌株活化得到种子培养液，种子培养液中活菌数为2.0x108个/ml。
ZM短杆菌种子培养液的制备：将ZM短杆菌(保藏编号为CGMCC No.20180)接种于液体培养基中，每100ml液体培养基中含有2％的鱼蛋白胨和0.2％K2HPO4，于37℃，200rpm,培养12h,菌株活化得到种子培养液，种子培养液中活菌数为2.0x108个/ml。
实施例1本发明有机硒的制备
有机硒的制备方法，包括下述步骤：
(1)在200ml起始培养基中接种1.0％的YTH芽孢杆菌种子培养液，于37℃，200rpm，培养24h，其中，每100ml起始培养基中含有1.5％鱼蛋白胨和0.15％K2HPO4；
(2)间隔补料4次，间隔为24h，每次补料加入浓度为5％的亚硒酸钠水溶液100ml和100ml的液体培养基，培养24h，补料四次后，继续培养24h后，终止发酵，制得发酵液，其中，每100ml液体培养基中含有1.5％鱼蛋白胨和0.15％K2HPO4；
(3)离心分离制得的发酵液，制得上清液和菌体沉淀。
分别检测发酵液、上清液和菌体沉淀中有机硒含量。结果见表1。
表1
样品 有机硒(mg/ml) 无机硒(mg/ml) 总硒中的有机硒含量(％)
发酵液 16.4 未检出(<0.01) 99
上清液 15.9 未检出(<0.01) 97.0
菌体沉淀 0.307 未检出(<0.01)
实施例2本发明有机硒的制备
(1)将YTH芽孢杆菌种子培养液按1.0％的接种量，接种于含1.5％鱼蛋白胨和0.15％K2HPO4·3H2O的液体培养基中，置于37℃，200rpm条件下培养120h，离心收集菌体，按照每g菌体中加入pH8.0-9.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液20ml，搅拌混匀，1200w超声处理25min后，离心，收集上清液，备用；
(2)用pH8.0-9.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液配制浓度为5％的亚硒酸钠底物溶液200ml，加入步骤(1)制得的上清液200ml后，均匀混合；
(3)间隔补料3次，每次间隔24h，每次加入200ml亚硒酸钠底物溶液，于最后一次补料后，继续反应24h后，停止反应，制得发酵液。
检测发酵液中有机硒含量，结果见表2。
表2
样品 有机硒(mg/ml) 无机硒(mg/ml) 总硒中的有机硒含量(％)
发酵液 13 未检出(<0.01) 99
实施例3 YTH芽孢杆菌和ZM短杆菌有机硒制备效率研究
(1)将YTH芽孢杆菌种子培养液和ZM短杆菌种子培养液按1.0％接种量分别接种于200ml起始培养基中，于37℃，200rpm，培养24h，其中，每100ml起始培养基中含有2％的鱼蛋白胨和0.2％K2HPO4；
(2)间隔补料4次，间隔为24h，每次补料加入浓度为15％的亚硒酸钠水溶液100ml和100ml的液体培养基，培养24h，补料四次后，继续培养24h后，终止发酵，制得发酵液，其中，每100ml液体培养基中含有1.5％鱼蛋白胨和0.15％K2HPO4。
每隔24h取样检测发酵液中有机硒含量，计算有机硒转化率，结果见表3。
表3
Figure BDA0002634174040000211
实施例4本发明药物组合物的制备
(1)取实施例3利用YTH芽孢杆菌制得的发酵液100ml，接种3％的YTH芽孢杆菌种子培养液，混匀，置于37℃，200rpm条件下反应24h，制得反应液一；
(2)在步骤(1)制得的反应液一中加入0.02g氟化钠溶液后，37℃，反应24h后，制得反应液二；
(3)在步骤(2)制得反应液二中加入0.008g氯化锡溶液，37℃，反应24h，制得反应液三；
(4)在步骤(3)制得的反应液三中加入4.4ml的无机盐水溶液， 37℃，反应24h，其中，每1000ml无机盐溶液含1.6g的硫酸镁、1.6g 乙酸镁、1.4g硫酸锰、1.8g硫酸锌、0.32g硼酸、0.17g钼酸铵、0.12g 碘化钾、0.2g氯化镍和0.2g氯化钴，制得反应液四；
(5)在步骤(4)制得的反应液四中加入0.1g的山梨酸钾，即得。
实施例5本发明药物组合物的制备
(1)将YTH芽孢杆菌按1.0％的接种量，接种于含1.5％鱼蛋白胨和 0.15％K2HPO4·3H2O的液体培养基中，置于37℃，200rpm条件下培养 120h，收集菌体，按1g菌体加入20mlpH8.0-9.0磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液缓冲液后，搅拌混匀，1200w超声处理25min后，离心，收集上清液；
(2)取实施例3利用YTH芽孢杆菌制得的发酵液100ml，加入3％步骤(1)制得的上清液，混匀，置于37℃，200rpm条件下培养24h，即得反应液一。
(3)在步骤(2)制得的反应液一中加入0.02g的氟化钠溶液后， 37℃，反应24h后，制得反应液二。
(4)在步骤(3)制得反应液二中加入0.008g的氯化锡溶液，37℃，反应24h，制得反应液三。
(5)在步骤(4)制得的反应液三中加入4.4ml的无机盐水溶液， 37℃，反应24h，其中，每1000ml无机盐溶液含1.6g的硫酸镁、1.6g 乙酸镁、1.4g硫酸锰、1.8g硫酸锌、0.32g硼酸、0.17g钼酸铵、0.12g 碘化钾、0.2g氯化镍和0.2g氯化钴，制得反应液四。
(6)在步骤(5)制得的反应液四中加入0.1g的山梨酸钾，即得。
对比例1
(1)取酵母硒溶液100ml，加入3％的YTH芽孢杆菌种子培养液，混匀，置于37℃，200rpm条件下反应24h，制得反应液一。
(2)在步骤(1)制得的反应液一中加入0.02g的氟化钠溶液后， 37℃，反应24h后，制得反应液二。
(3)在步骤(2)制得反应液二中加入0.008g的氯化锡溶液，37℃，反应24h，制得反应液三。
(4)在步骤(3)制得的反应液三中加入4.4ml的无机盐水溶液， 37℃，反应24h，其中，每1000ml无机盐溶液含1.6g的硫酸镁、1.6g 乙酸镁、1.4g硫酸锰、1.8g硫酸锌、0.32g硼酸、0.17g钼酸铵、0.12g 碘化钾、0.2g氯化镍和0.2g氯化钴，制得反应液四。
(5)在步骤(4)制得的反应液四中加入0.1g的山梨酸钾，即得。
对比例2
(1)取硒代半胱氨酸溶液100ml，加入3％的YTH芽孢杆菌种子培养液，混匀，置于37℃，200rpm条件下反应24h，制得反应液一。
(2)在步骤(1)制得的反应液一中加入0.02g的氟化钠溶液后， 37℃，反应24h后，制得反应液二。
(3)在步骤(2)制得反应液二中加入0.008g的氯化锡溶液，37℃，反应24h，制得反应液三。
(4)在步骤(3)制得的反应液三中加入4.4ml的无机盐水溶液， 37℃，反应24h，其中，每1000ml无机盐溶液含1.6g的硫酸镁、1.6g 乙酸镁、1.4g硫酸锰、1.8g硫酸锌、0.32g硼酸、0.17g钼酸铵、0.12g 碘化钾、0.2g氯化镍和0.2g氯化钴，制得反应液四。
(5)在步骤(4)制得的反应液四中加入0.1g的山梨酸钾，即得。
对比例3
(2)取实施例3利用ZM短杆菌生产的含有机硒的发酵液100ml，加入0.3％的ZM短杆菌种子培养液，混匀，置于37℃，200rpm条件下培养24h，制得反应液一。
(2)在步骤(1)制得的反应液一中加入0.02g的氟化钠溶液后， 37℃，反应24h后，制得反应液二。
(3)在步骤(2)制得反应液二中加入0.008g的氯化锡溶液，37℃，反应24h，制得反应液三。
(4)在步骤(3)制得的反应液三中加入4.4ml的无机盐水溶液， 37℃，反应24h，其中，每1000ml无机盐溶液含1.6g的硫酸镁、1.6g 乙酸镁、1.4g硫酸锰、1.8g硫酸锌、0.32g硼酸、0.17g钼酸铵、0.12g 碘化钾、0.2g氯化镍和0.2g氯化钴，制得反应液四。
(5)在步骤(4)制得的反应液四中加入0.1g的山梨酸钾，即得。
试验例1光照、高温稳定性试验
将实施例1利用YTH芽孢杆菌生产的含有机硒的发酵液、与液体酵母硒、硒代半胱氨酸溶液相比，在光照(4500±500Lx)、高温60℃条件下放置10天，检测有机硒含量的变化情况。结果见图1-2。
试验例2时间稳定性试验
将实施例4与对比例3制得的药物组合物，在温度25±2℃，湿度 60±10％条件下，于0个月，3个月、6个月、12个月，分别检测药物组合物中有机硒的含量，结果见图3。
试验例3药物组合物在加速条件下的稳定性试验结果
取实施例4、实施例5、对比例1、对比例2获得的药物组合物，在加速试验条件下检测有机硒的含量变化情况，结果见图4。加速试验条件为温度为40℃±2℃、相对湿度为75％±5％。
试验例4药物组合物对肿瘤细胞的生长抑制作用
采用CCK法测定实施例4制备的药物组合物对肝癌H22细胞的生长抑制作用，并以索拉菲尼为阳性对照药物。
实验仪器：Thermo酶标仪、CCK8细胞增殖检测试剂盒、CCK培养基为含10％FBS的DMEM完全培养基。
实验方法为：
(1)使用0.25％的胰酶对肝癌H22细胞进行消化，吹打成单细胞悬浮液。将单细胞悬浮液按每孔100ul接种于96孔培养板内，细胞液浓度为25％，置于37℃、相对湿度为95％、5％CO2的培养箱中培养24h。
(2)使用10％胎牛血清的RPMI1640培养基配置含不同浓度的药物，索拉菲尼药物梯度(ug/ml)：1000、500、250、125、62.50、31.25、 15.63、7.81、3.91、0，实施例4的药物组合物药物梯度(ug/ml)：150、75、37.5、18.75、9.38、4.69、2.34、1.17、0.59、0。
(3)在每孔中分别加入100ul配置好的含不同浓度药物的RPMI1640 培养基，继续培养24小时，弃原始培养基。每孔加入100ul含10％CCK8 的培养基，在细胞培养箱内分别继续孵育1小时。
(4)用酶标仪测定在450nm处的吸光值。
结果表明，实施例4药物组合物IC50(3.51ug/ml)比索拉菲尼IC50 (5.86ug/ml)更低。
试验例5药物组合物对肿瘤患者的临床研究
10名肿瘤志愿患者自愿服用实施例4的药物组合物，日服10ml/天。检测肿瘤大小和AFP测定值。
表7患者服用药物组合物后的结果
Figure BDA0002634174040000261
以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明权利要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种YTH芽孢杆菌，其特征在于，其分类命名为芽孢杆菌属Bacillus.sp，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20180。
2.一种有机硒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1所述的YTH芽孢杆菌进行种子培养，将活菌数为1.0-2.0x108个/ml的YTH芽孢杆菌种子培养液按照0.2-5％的接种量接种至每100ml培养基中含有1-2％的鱼蛋白胨和0.1-0.2％K2HPO4的起始培养基中，于30-40℃，100-300rpm，培养12-24h后，加入浓度为1-20％的亚硒酸钠水溶液以及与亚硒酸钠水溶液等体积的液体培养基，其中起始培养基与亚硒酸钠水溶液的体积比为2:1，于30-40℃，100-300rpm，反应12-200h后，制得含有机硒的发酵液。
3.一种有机硒，由权利要求2所述的方法制得。
4.一种药物组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将活菌数为1.0-2.0x108个/ml的YTH芽孢杆菌种子培养液按照0.2-5％的接种量接种至每100ml培养基中含有1-2％的鱼蛋白胨和0.1-0.2％K2HPO4的起始培养基中，于30-40℃，100-300rpm，培养12-24h后，加入浓度为1-20％的亚硒酸钠水溶液以及与亚硒酸钠水溶液等体积的液体培养基，其中，起始培养基：亚硒酸钠水溶液的体积比为2:1，于30-40℃，100-300rpm，反应12-200h后，制得含有机硒的发酵液；(2)将含有机硒的发酵液和含活菌数为1.0-2.0x108个/ml的YTH芽孢杆菌种子培养液混合，于30-40℃，反应12-24h后，即得药物组合物；其中，YTH芽孢杆菌种子培养液接种到含有机硒的发酵液中的接种量为1-5％，优选为2-3％；优选的，以Se元素计，所述药物组合物中的有机硒的含量为100-400ug/ml，优选为200-300ug/ml，更优选为260-270ug/ml。
5.一种药物组合物，由权利要求4所述的方法制得。
6.一种有机硒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1所述的YTH芽孢杆菌进行种子培养，离心收集活菌数为1.0-2.0x108个/ml的YTH芽孢杆菌种子培养液中的菌体，将收集菌体按照每g菌体与20ml的pH 8.0-9.0的磷酸盐缓冲溶液混合，搅拌混匀，超声破碎后，离心，取上清液，在制得的上清液中加入等体积的浓度为1-20％的亚硒酸钠底物溶液，于30-40℃，100-300rpm，反应12-200h后，制得含有机硒的发酵液；优选的，以硒元素计，所述含有机硒的发酵液中的有机硒含量10-40mg/mL，优选为15-30mg/mL。
7.一种有机硒，由权利要求6所述方法制得。
8.一种药物组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)离心收集活菌数为1.0-2.0x108个/ml的YTH芽孢杆菌种子培养液中的菌体，将收集菌体按照每g菌体与20ml的pH 8.0-9.0的磷酸盐缓冲溶液混合，搅拌混匀，超声破碎后，离心，取上清液，在制得的上清液中加入等体积的浓度为1-20％的亚硒酸钠底物溶液，于30-40℃，100-300rpm，反应12-200h后，制得含有机硒的发酵液；(2)向步骤(1)制得的含有机硒的发酵液中再加入1-5％步骤(1)制得的上清液，于30-40℃，反应12-24h后，即得，其中优选上清液接种到含有机硒的发酵液中的接种量为2-3％；优选的，所述的药物组合物中以Se元素计有机硒的含量为100-400ug/ml，优选为200-300ug/ml，优选为260-270ug/ml。
9.一种药物组合物，由权利要求8所述方法制得。
10.权利要求3或7所述的有机硒或权利要求5或9所述的药物组合物的任一种用于制备治疗癌症药物或艾滋病的任一种病症或其并发症的药物中的应用，优选癌症选自肝癌、食道癌、胃癌、胰腺瘤、胆管细胞癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、甲状腺癌、结肠癌、下咽癌、皮肤基底细胞癌、左乳癌、宫颈癌、上颌肿瘤、鼻咽癌的任一种或其并发症。
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